KR20120062644A - 버크홀데리아 오염물질의 균주에 의해 생성된 신규한 항진균성 당펩티드인 옥시디오펑진 - Google Patents

버크홀데리아 오염물질의 균주에 의해 생성된 신규한 항진균성 당펩티드인 옥시디오펑진 Download PDF

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쉬엔 루
제임스 엘. 스미스
프랑크 오스틴
간유 구
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미시시피 주립대학
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Abstract

본 발명은, 동물과 식물의 진균 감염 또는 질병을 예방 또는 치료하는데 유용한 버크홀데리아 오염물질의 균주에 의해 생성된 신규한 항진균성 당펩티드 화합물과 그 염, 및 상기 화합물을 생성하는 균주에 관한 것이다.

Description

버크홀데리아 오염물질의 균주에 의해 생성된 신규한 항진균성 당펩티드인 옥시디오펑진{OCCIDIOFUNGIN, A UNIQUE ANTIFUNGAL GLYCOPEPTIDE PRODUCED BY A STRAIN OF BURKHOLDERIA CONTAMINANTS}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2009년 5월 26일자로 출원된 미국 가특허 출원 번호 61/217,026호로부터 우선권을 주장한다. 상기 가특허 출원의 전체 내용은 본원에 참조로 포함되어 있다.
본 발명은, Cooperative State Research, Education, and Extension Service, USDA에 의해 수여된 0204332 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명의 일정 권리를 가질 수 있다.
본 발명은, 항진균성 화합물과, 진균 감염과 질병의 예방 또는 치료시 이를 치료용으로 사용하는 방법의 분야에 관한 것이다. 본 발명은, 동물과 식물에 대한 약학 및 농업 살진균제로 신규한 항진균성 화합물을 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 신규한 항진균성 화합물을 생성하는 균주에 관한 것이다.
본 발명은, 진균 감염을 예방 또는 치료하기 위한 신규한 항진균성 당펩티드 화합물 및 이에 관련된 적어도 하나의 신규한 아미노산 잔기를 제공한다. 바람직한 실시예에서 본 발명은 또한 진균 감염을 치료 또는 예방하기 위한 신규한 화합물 및 이들의 염을 포함하는 약학 및 농업적 조성물을 제공한다. 추가 실시예에서 본 발명은 신규한 항진균성 화합물을 생성하는 신규한 균주를 제공한다.
현재의 항진균제네 대해 내성인 병원체의 증가된 유행을 고려하여 신규한 항진균제에 대한 요구가 증가하고 있다. 항진균제의 4가지 주요 치료군, 즉 폴리엔 항진균제, 아졸 항진균제, 알릴아민 항진균제 및 에키노칸딘이 현재 존재한다. 첫 번째 3가지 군은 주로 에르고스테롤 생성을 표적으로 하거나, 에르고스테롤에 결합하여 진균막을 차단한다. 포유류 세포에서 발견된 콜레스텔과 매우 유사한 에르고스테롤은 적저란 세포 투과성 및 유동성을 유지시키기 위해 중요하다. 4번째 군인 에키노칸딘은 아스페르질루스 니둘란스(Aspergillus nidulans)에 의해 생성되는 천연 화합물 에키노칸딘 B로부터 기원하는 합성적으로 변형된 리포펩티드이다. 균류에서, 2가지 공유 교차결합 다당류인 (1,3)-β-글루칸 및 키틴은 세포벽의 구조적 통합성 및 형태에 대해 반응성인 일차 스캐폴드를 생성한다. 에키노칸딘 부류의 항진균제는 우리딘 2인산 포도당을 (1,3)-β-글루칸 중합체으로 중합시키는 효소 착물인 (1,3)-β-글루칸 신타아제를 억제한다.
버크홀데리아(Burkholderia)의 일부 균주의 현저한 특징은 다양한 항진균성 화합물의 생성이며, 이는 생물을 진균병의 관리를 위해 유용할 수 있도록 만든다. 그러나, 낭포성 섬유증 환자로부터의 버크홀데리아 spp.의 단리는 이들을 기회감염 병원체로서 재분류하여. 결론적으로 진균병 관리를 위한 박테리아의 직접 사용을 방지하였다. 버크홀데리아 균주의 관찰된 식물병 억제 활성에 대해 반응성인 항진균제의 단리 및 확인은 박테리아를 직접 사용하는 것으로부터 가능한 건강위험을 제거하면서 생물학 기반 살진균제의 개발을 위한 중요한 방안을 제공할 것이다. 신규한 항진균제는 면역저하 환자에 있어서의 진균 감염의 중요성, 및 활성 및 독성의 이들의 범위에 관한 현재 이용할 수 있는 항진균제의 제한 때문에 필요하다. 또한, 신규한 항진균제는 식품 보존 및 충분하고 입수 가능한 식품 공급물의 생성을 위해 중요하다. 본 명세서에서는, 진균 킬러를 의미하는 옥시디오펑진(occidiofungin)으로 명명되는 신규한 항진균성 화합물의 구조 및 활성이 특징이다. 항진균제의 완전 공유결합 구조는 TOCSY, NOEY, ROESY 및 HSQC 2D NMR 분광학 실험에 의해 설명되었다. 다양한 동물 및 진균 병원체에 대한 옥시디오펑진의 항진균성 활성이 시험되고 입증되었다. 또한, 에키노칸딘 부류의 항진균제에 대해 보고된 것과 유사한 비정상 막 형태가 옥시디오펑진의 치사량에 가까운 농도에 대한 노출 후에 관찰되었으며, 이는 옥시디오펑진이 또한 세포외막을 표적으로 함을 제시하는 것이다. 상기 작용은 옥시디오펑진의 약학 및 농업적 가능성을 연구하면서 화합물의 작용방식을 이해하는 것을 목적으로 하는 미래의 실험에 대한 실질적 기본을 제공한다.
따라서, 살진균제 분야에서 일반적인 살진균제에 내성이 있는 동물과 식물 병원체에 효과적인 신규한 항진균성 화합물에 대한 필요성이 존재한다. 본 발명은 이러한 화합물과 조성물을 제공한다.
본 발명은, 옥시디오펑진으로 명명된 신규한 항진균성 고리형 당펩티드 화합물, 이에 부착된 신규한 아미노산, 및 이러한 화합물을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 사람, 동물과 식물에 영향을 주는 광범위한 진균 병원체에 대해 효과적이다. 더욱이, 본 발명은 정상 진균막 형태를 방해한다. 본 발명은 또한 신규한 항진균성 화합물을 생성하는 신규한 균주를 제공한다.
본 발명은 균주 버크홀데리아 오염물질(Burkholderia contaminants)로부터 정제되고, 8개의 아미노산 잔기를 포함한다. 하나의 아미노산에 아실기 및 자일로스 당이 부착된다. 항진균성 조성물은 피험자 투여를 위해 신규한 화합물(들) 및 이들의 염 및 적어도 하나의 허용될 수 있는 담체 또는 희석제를 포함한다. 진균 감염 또는 진균병을 치료하는 방법은 화합물 및 조성물을 감염을 제거하거나 경감시키기 위해 효과적인 시간 및 조건 하에 피험자에게 투여하는 것을 포함한다.
하기에 명백해질 본 발명의 상기 및 다른 목적, 특징 및 장점에 대해, 본 발명의 성질은 본 발명의 바람직한 실시예의 하기의 상세한 설명 및 첨부한 특허청구범위와 관련하여 더욱 명백히 이해될 수 있다.
본 발명은, 일반적인 살진균제에 내성이 있는 동물과 식물 병원체에 효과적인 신규한 항진균성 화합물을 제공하는 효과를 갖는다.
이들 도면은 본 발명의 상세한 설명을 동반하고, 본 발명과 그 장점을 추가 예시하도록 의도된다. 명세서에 통합되고 그 일부를 형성하는 도면은 본 발명의 특정 바람직한 실시예를 예시하고, 전체 명세서와 함께, 본 발명의 바람직한 실시예를 당업자들에 설명하는 것을 의미한다.
도 1은, 옥시디오펑진의 공유결합 구조의 실례이다. 패널 A에는, 옥시디오펑진 A 및 옥시디오펑진 B의 일반적인 구조가 도시되어 있다. 패널 B에는, 신규한 아미노산 NAA2의 일반적인 구조가 도시되어 있다. 이들의 각각의 원자들 다음에 화학적 이동 값(ppm)이 도시되어 있다. NOE 값은 원 다음에 기재되어 있고, 화살표는 양자 상호작용을 나타낸다.
도 2는, 자일로스의 표준물질(A)과 옥시디오펑진으로부터의 글리칸(B)의 GC 크로마토그램을 그래프로 예시한 것이며; 내부 표준물질이 두 샘플 모두에 첨가되었다. 자일로스 표준물질은 2개의 피크(Xyl1 및 Xyl2)를 나타내었고; 옥시디오펑진 글리칸은 두 피크 모두의 동일한 이행 시간을 기준으로 자일로스로서 확인되었다.
도 3은, 옥시디오펑진의 TOCSY 및 NOEY NMR 스펙트럼을 그래프로 예시한 것이다. 패널 A에서, TOCSY 2D NMR 스펙트럼의 확장은 알파에 대한 아미드, 및 옥시디오펑진A(흑색)와 옥시디오펑진B(회색) 중 각각의 할당된 잔기에 대한 측쇄 스핀 시스템에 대한 아미드를 나타낸다. 패널 B에서, NOEY 2D NMR 스펙트럼의 확장은 옥시디오펑진 중의 짧은 아실기 및 자일로스 당의 화학적 이동을 나타낸다. 아실 탄소 2 및 3의 양자와 NAA의 Hε 양자 사이의 NOE(회색)는 화살표에 의해 구별된다.
도 4는, 옥시디오펑진의 NOE Y NMR 스펙트럼을 그래프로 예시한 것이다. 확장은 알파에 대한 아미드, 및 측쇄 상호작용에 대한 아미드를 나타낸다. 각각의 아미노산 상호작용은 적색으로 나타낸 이들의 잔기간 NOE 다음에 표지된다. 옥시디오펑진 A 및 옥시디오펑진 B에 대한 잔기는 각각 흑색 및 회색으로 제공된다.
도 5는, 옥시디오펑진에 대한 활성의 스펙트럼을 도표 및 그림으로 예시하는 것이다. 패널 A에서, 수개의 식물 및 동물 병원체에 대한 MIC 값이 제공된다. MIC 및 MIC50는 각각 100% 성장 억제 및 >50% 성장 억제를 나타낸다. 패널 B에서는, 게오트리쿰 칸디둠(Geotrichum candidum)의 일반적인 생물검정판이 도시된다. 웰 A1에서의 초기 농도는 32 ㎍/㎖이고, 웰 C2는 62.5 ng/㎖의 최종 농도이다. 마지막 2개의 웰은 음성대조군(항진균성 화합물 부재)으로 작용한다. 웰 A4는 MIC50 MIC50의 우수한 표현이며, 진균류의 성장은 50% 초과까지 억제되었다.
도 6은, 광학현미경 관찰을 그림으로 예시하는 것이다. 패널 A 및 B에서, 대조군(패널 B)과 비교할 경우에 부분 억제 농도(패널 A)로 성장한 리조크토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)에서의 현저한 균사 형태 변형이 현저히 관찰되었다. 흑색 화살표는 세포내 내포물의 생성을 가리키며, 백색 화살표는 막 변형을 가리킨다. 패널 C 및 D에서, 48시간 동안 4 ㎍/㎖의 옥시디오펑진에 노출된 게오트리쿰 칸디둠(패널 C)은 대조군(패널 D)과 비교하여 세포의 현저한 팽윤을 발생시켰다.
도 7은, 투과전자현미경 관찰을 그림으로 예시한 것이다. 48시간 동안 4 ㎍/㎖의 옥시디오펑진에 노출된 게오트리쿰 칸디둠(패널 B)은 대조군(패널 A)과 비교하여 현저한 형태 변형을 발생시켰다. 세포벽 두께는 대조군과 비교하여 급격히 감소한다. 처리된 게오트리쿰 칸디둠의 외부 세포벽은 탈리된 것으로 보인다(흑색 화살표). 처리된 샘플 내측의 콘트라스트의 결여를 고려하면(백색 화살표), 세포는 용해되고 유출된 세포 성분을 갖는 것으로 제시된다. 패널 C는 옥시디오펑진에 노출된 수개의 분절포자를 함유하는 더 넓은 뷰를 나타낸다. 패널 A, B, 및 C에서의 화상은 8,000의 배율로 취하였다.
본 발명의 신규한 항진균성 고리형 당펩티드 화합물은 광스펙트럼한 진균 감염에 대해 효과적이다. 화합물 구조뿐만 아니라, 여기 부착된 적어도 하나의 신규한 아미노산의 구조가 본원에 기술되어 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 항진균성 조성물은 신규한 화합물(들) 및 이들의 염 및 치료 및 처리를 필요로 하는 사람, 동물 및/또는 식물 실험대상에 대한 투여를 위해 적어도 하나의 약학적으로 또는 농업적으로 허용될 수 있는 담체 또는 희석제를 포함한다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 본원에 기술된 신규한 항진균성 화합물을 포함하는 항진균성 화합물을 생성하는 신규의 단리된 균주를 제공한다.
본원의 목적상, 약칭은 하기와 같다: NMR, 핵자기공명; NOE, 핵 오버하우저 효과; NOEY, 핵 오버하우저 상승 분광학; TOCSY, 전상관 분광학; ROESY, 회전 프레임 핵 오버하우저 효과 분광학; HSQC, 이종핵 단일 양자 결맞음; ESI-MS, 전자분무이온화 질량분석기; MS/MS, 탄뎀 질량 분석기; GC, 기체 크로마토그래피-질량분석법; NRPS, 비-리보솜 펩티드 합성효소; NAA, 신규한 아미노산; 및 MIC, 최소 억제농도.
분자 용어는 다른 식으로 규정하지 않는 한은 이들의 공통적 의미를 갖는다. "아실"이라는 용어는, 알릴, 알케닐, 알키닐, 시클로알릴, 헤테로시클릴, 아릴 또는 헤테로아릴기에 부착된 카르보닐 라디칼로서 규정되며, 이들 예는 아세틸 및 벤조일과 같은 라디칼을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. "치료 유효량"이라는 표현은, 화합물 또는 조성물에 의해 접촉된 진균류에 대한 살균 효과를 유도하기에 충분한 투여량으로서 규정된다. 치료적으로 효과적인 약학 또는 농업적 조성물의 양은 조성물을 구성하는 성분 및 요소 및 치료 필로소피에 의존한다.
본 발명을 위해, 균주 버크홀데리아 오염물질 MS 14는 잔디의 갈색마름병을 억제하는 토양으로부터 단리되었다. 신규한 항진균성 화합물은 상기 박테리아의 액체 배양으로부터 정제되었다. 2개의 정제된 밀접하게 관련된 항진균성 화합물의 완전 공유결합 구조는 TOCSY, NOEY, ROESY, 13C HSQC 2D NMR, 및 ESI-MS 및 GC의 실험에 의해 결정되었다. 정제된 제조물의 단일동위원소 질량의 분석은 1199.543 Da 및 1215.518 Da인 것으로 결정된 2개의 관련된 화합물의 존재를 나타내었으며; 차이는 산소 원자의 질량에 상응한다. GC 분석은 항진균성 화합물에 부착된 자일로스 당을 확인하였다. NMR 실험은 화합물이 고리형이고 8개의 아미노산으로 구성되며, 이주 2개는 Tyr 및 Asn의 β-히드록시 유도체이고, 하나는 신규한 아미노산임을 나타내었다. 신규한 아미노산은 자일로스 당 및 짧은 아실 사슬의 부착을 위한 스캐폴드로서 작용한다. 항진균성 활성의 스펙트럼 및 농도는 미세적정판 검정을 사용하여 결정되었다. 항진균성 화합물은 진균 식물와 동물 병원체뿐만 아니라, 2개의 피슘(Pythium spp)의 넓은 패널에 대한 강한 항진균성 활성을 나타내었다. 현미경 관찰은 항진균성 화합물이 정상 막 형태를 방해함을 보여주었다. 진균 세포는 큰 봉입체로 채워지고, 막은 부분 억제 농도의 항진균성 화합물에 대한 노출 후에 불규칙적으로 형상화되고 팽윤된다. 본 발명자들의 데이터는 신규한 살진균제의 확인을 지지하고, 화합물은 진균 킬러를 의미하는 옥시디오펑진으로 명명되었다.
버크홀데리아 오염물질 균주 MS 14는 토양 병원체가 숙주 식물에 대한 손상을 거의 유발하지 않는 질환-억제성 토양으로부터 사전에 단리되었다. 상기 균주의 초기 특징화는 이것이 광스펙트럼한 진균 병원체의 성장.을 억제함을 보여주었다. 후속적으로, 전이인자 돌연변이유발은 항진균성 활성에 대해 반응성인 게놈 영역을 확인하였으며, 56-kb 유전적 DNA 단편은 서열화되고, 수납 번호: EU938698로 GenBank에 부분적으로 기탁되었다. 상기 게놈 영역은 수개의 오픈 리딩 프레임을 하며, 이중 일부 조절단백질, 고리형 펩티드 운반체, 당 전이 효소, 아미노기전이효소, 및 비-리보솜 펩티드 합성효소(NRPS) 촉매 분자를 부호화한다. 항진균성 화합물은 단리되고, 아미노산 분석은 항진균성 화합물의 백본이 NRPS 메커니즘을 통해 합성되는 올리고펩티드임을 확인하였다.
실험 절차
모든 화학물질을 다른 식으로 규정되지 않는 한은. Sigma(St. Louis, MO)로부터 구입하였으며, 최고 등급이었다. 옥시디오펑진을 사전에 기술된 바와 같이 생성하고 정제하였다.
질량분석법. 활성 분획 중의 항진균성 화합물을 Micromass Q-TOF II 질량분석계를 사용하여 전자 분무 질량분석법(ESI-MS)에 의해 분석하였다. 화합물을 0.1% 포름산을 갖는 50/50 아세토니트릴/물(v/v) 중에 용해시키고, Harvard 주사기 펌프를 사용하여 1 ㎕/분 흐름의 동일한 용매 내로 주입하였다. 흐름을 나노-LC 계면을 사용하여 분무하였다. 탄뎀 MS(MS/MS)를 표준 충돌에너지(34 V) 및 더 높은 충돌에너지(50 V)를 사용하여 단일 하전 이온으로 수행하였다.
단당류 조성 분석. 정제된 옥시디오펑진 중의 단당류를 기체-액체 크로마토그래피에 의해 메틸 글리코시드의 트리플루오로아세트산염으로서 결정하였다. 분석을 25-m 용융 실리카(0.22-㎜ 내부 직경) OV-1701 WCOT 칼럼(Chrompack, Bridgewater, NJ) 및 전자 포착 검출기가 장착된 가스 크로마토그래프(Model 5890, Hewlett-Packard, Sacramento, CA)에 의해 수행하였다. 당 표준물질(펜토오스, 헥소오스, N-아세틸아미노헥소오스)을 시험 화합물과 동시에 처리하고, 옥시디오펑진 중의 당을 이의 크로마토그래피 프로파일과 표준물질의 프로파일의 비교를 기준으로 결정하였다. 소르비톨을 내부 표준물질로서 사용하였다.
NMR 분광학. 옥시디오핑긴은 NMR에 필요한 농도에 수용액 중에 불용성이다. 따라서, 옥시디오펑진의 5 mM 샘플을 700 ㎕의 총부피 중의 50% 아세토니트릴-d3(Cambridge Isotopes) 및 50% 물 중에서 제조하였다. NMR 데이터를 800 MHz의 양자 주파수에서 조작하여 Cold Probe™ 분광계를 갖는 Varian NMR System 상에 수집하였다. 1H 공명을 TOCSY 및 NOEY 실험을 사용하는 표준 방법에 따라 할당하였다. ROESY 및 13C-HSQC 실험을 사용하여 TOCSY 및 NOEY 스펙트럼에서의 애매성의 일부 영역을 명료화시켰다. TOCSY, NOEY 및 13C HSQC NMR 실험을 25℃에서 수집하고, ROESY 실험을 4℃에서 수집하였다. 담체 주파수를 물 공명에 집중시키고, 이를 매우 효율적인 이중 펄스 필드 기울기 선택 반향 기법을 사용하여 억제하였다. 스캔 사이에 1.5초 이완 지연을 사용하였다. TOCSY 실험을 DIPSI-2 서열을 사용하여 60 ms 혼합 시간으로 획득하였다. NOEY 및 ROESY 실험을 각각 400 ms 및 100 ms 혼합 시간으로 수행하였다. HSQC 스펙트럼을 수집하기 위한 파라미터를 최적화시켜서 지방족 CH기(전달 지연 시간은 140Hz 결합상수 및 35 ppm 으로 설정된 13C 오프셋에 대해 조절됨)를 관찰하였다. TOCSY, NOEY 및 ROESY에 대한 스펙트럼 스위프 폭은 두 치수 모두에서 9000 Hz(11.25 ppm)이었다. HSQC에 대한 스펙트럼 스위프 폭은 양자 치수에서 9000.0 Hz(11.25 ppm) 및 탄소 치수에 대해 21,200.0 Hz(105.5 ppm)이었다. 모든 2D 데이터를 직접 및 간접 치수 각각에서의 1024 및 192 컴플렉스 포인트로 수집한 HSQC를 제외하고는, 획득 치수에서의 8192개의 컴플렉스 포인트 및 간접 치수에 대한 320개와 512개 사이의 컴플렉스 포인트로 수집하였다. NOEY, ROESY 및 TOCSY 실험에 대한 위상 감응 간접 검출을 States-TPPI의 방법을 사용하여 달성하였다. 기울기 선택 감수성 증강 펄스 시퀀스를 HSQC 스펙트럼을 수집하기 위해 사용하였다. 1H 화학적 이동은 아세토니트릴(1.93 ppm)에 관련된 것이다. 데이터를 먼저 디콘볼루션에 의해 잔류 물 신호를 제거하고, 두 치수 모두에서 데이터에 제곱 코사인 함수 또는 608 이동(HSQC의 1H 치수)을 갖는 제곱 코사인 함수에 의해 곱하고, 한번 0 채우기하고, 푸리에 변환, 및 기준선 조정함으로써 nmrPipe로 처리하였다. 데이터를 인터랙티브 컴퓨터 프로그램 NMR 뷰에 의해 분석하였다. NOE 크로스 피크 세기를 NMR 뷰에서 측정하였다. 거리를 관계식 rab 6 = rcal 6(Vcal/Vab)를 사용하여 교정하였으며, 여기에서, rab는 원자들 사이의 거리 a 및 b이고, Vab는 NOEY a 대 b 크로스 피크 볼륨이고, rcal은 공지된 거리이고, Vcal은 NOEY 교정 크로스 피크의 상응하는 용적이다. 교정을 위해 사용되는 거리는 β-히드록시 Tyr4 Hδ 및 Hε 방향족 양자(2.46 Å)이었다.
미생물. 진균 균주를 Mississippi State University's Veterinary Medical Research and Diagnostic Laboratory System and Entomology and Plant Pathology Department에서의 수집으로부터 얻거나, American Type Culture Collection(Manassas, Va.)으로부터 구입하였다. 본 연구에서 사용되는 진균 단리물은 알테르나리아 알테르나타(alternaria alternata), 아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 아스페르길루스 니가(Aspergillus niger), 시들음병균(Fusarium oxysporum f. sp . lycopersic) ATCC9848, 게오트리쿰 칸디둠 F-260, 마크로포미나 파세오리나(Macrophomina phaseolina) 61, 석고상소포자균(Microsporum gypseum), 저장병균(Penicillium sp .), 리조크토니아 솔라니 MSCOT-I, 및 남백선균속(Trichophyton mentagrophytes)이었다. 또한, 2개의 피슘(Pythium) 종, 즉 유주자낭(Pythium spinosum) 472-04 및 모잘록병균(Pythium ultimum) 671-04를 시험하였다.
항진균성 감수성 시험. 최소 억제농도를 한천 미량희석 시험에 의해 결정하였다. 옥시디오펑진을 살균수를 사용하여 연속으로 2배 희석시키고(32 ㎍/㎖로부터 62.5 ng/㎖), 바닥이 평평한 12웰 판에 첨가하였다. 1 ㎖의 사브로 덱스트로오스 한천 Difco™(BD Diagnostics, Franklin Lakes, NJ)을 각각의 웰에 첨가하였다. 한천이 고화되면, 사용시까지 판을 4℃에서 뒤집어서 저장하였다. 진균 배양물을 7일 동안 22℃에서 100×15㎜ 사브로 덱스트로오스 평면한천(Thermo Fisher Scientific Remel Products, Lenexa, KS) 상에서 성장시켰다. 평면한천으로부터의 진균류의 1㎝ 직경 플러그를 포함하는 원형 펀치를 진균류의 융합 성장을 갖는 판의 영역으로부터 제조하였다. 플러그를 3 ㎖의 PBS 중에 넣고, 텐-브록(Ten-brock)의 약 30 스트로크로 분쇄하였다. 5 ㎕의 상등액을 각각의 웰의 중심에 넣고, 22℃에서 미세적정판을 배양하기 전에 건조시켰다. 최소 억제 농도를 72시간에 측정하는 남백선균속(Trichophyton mentagrophytes)를 제외하고는, 각각의 종에 대해 48시간에 측정하였다. MIC를 가시적인 진균 성장을 억제하는 최저 농도로서 결정하였다. MIC50 값을 대조군과 비교하여 콜로니 성장을 50%(직경) 초과까지 가시적으로 감소시키는 농도로서 결정하였다.
현미경 관찰법. 상기 기술된 바닥이 평평한 12웰 판에서 성장한 진균류를 진균 균사 및 분절포자에 대한 옥시디오펑진의 효과의 시험을 위해 사용하였다. 진균류 각각에 대해, MIC 웰 다음에 성장한 48시간에서 관찰된 MIC50을 갖는 균사 또는 분절포자를 광학현미경 및 투과전자현미경(TEM) 슬라이드의 제조를 위해 사용하였다. 광학현미경 관찰을 위해, 락토페놀 무명 블루 용액(Sigma)을 슬라이드에 대한 양성 염색 및 봉입제로서 사용하였다. TEM을 위해, 게오트리쿰 칸디둠(G. candidum) 샘플을 0.1M 인산완충액(pH 7.2) 중의 2.5% 글루타르알데히드를 사용하여 4℃에서 고정시켰다. 완충액으로 세정한 후에, 시료를 인산완충액 중의 2% 사산화오스뮴을 사용하여 후고정시켰다. 인산완충액으로 세척한 시료를 등급차 에탄올 시리얼(50~100%) 중에서 탈수시킨 후, 스퍼 수지(Spurr's resin)에 삽입시켰다. Reichert-Jung Ultracut E Ultramicrotome(60~90 nm)의해 생성된 얇은 절편을 상기 기술된 바와 같이 아세트산 우라늄 및 시트르산납으로 이중 염색시켰다. 투과전자현미경 Jeol JEM-IOOCXII(Joel Ltd., Tokyo, Japan) 하에 그리드가 관찰되었다. 화상은 5,000 내지 8,000의 배율로 취하였다.
결과
옥시디오펑진은 고리형 당펩티드이다. 고분해능 질량분석법 데이터는 항진균성 펩티드의 2개의 구조적 변종의 존재를 나타내었으며; 하나는 1,199.543 Da의 단일동위원소 질량을 갖고, 나머지 하나는 제 1 화합물에 대한 산소의 첨가에 상응하는 1,215.518 Da의 단일동위원소 질량을 갖는다. 이들 질량은 도 1에 도시된 설명된 구조에 따른 것이다(1,199.5584 및 1,215.5533의 계산된 단일동위원소 질량). 2개의 구조적 변종의 존재를 고려하여, 항진균성 화합물의 변종은 옥시디오펑진 A (1,199.5584 Da) 및 옥시디오펑진 B (1,215.5533 Da)으로서 언급된다. 항진균성 화합물의 ESI-TOF MS/MS 분석은 표준 충돌에너지가 단지 글리칸의 손실을 발생시키고, 항진균성 화합물을 단편화시키기 위해 필요한 높은 충돌에너지가 복잡한 일련의 딸 이온을 생성하므로 결정적인 것이 아니다. 그러나, 고해리에너지가 단편화를 일으키기 위해 필요하다는 사실은 화합물이 고리형 펩티드임을 제시하는 것이다. 표준물질 해리 방법은 어미 이온으로부터 149 Da의 손실을 발생시키며, 이는 펜토오스 당의 존재를 나타내는 것이다. GC 분석은 올리고펩티드에 부착된 당이 자일로스임을 나타내었다(도 2). 사전에 보고된 바와 같이, 아미노산 분석은 리신의 존재를 나타내었다. 그러나, 펩티드를 트립신에 의해 분해하기 위한 시도는 아마도 화합물의 특이적 구조적 특징으로 인해 성공적이지 못하였다(데이터는 도시되지 않음). 항진균성 펩티드를 선형화시키는 것의 실패는 후속 ESI-MS 분석을 막았다.
NMR은 항진균성 올리고펩티드의 구조를 결정하기 위한 확정적 방법인 것으로 입증되었다. 항진균성 펩티드의 완전 공유결합 구조를 결정하기 위해, TOCSY, NOEY, ROESY, 및 HSQC 데이터를 수집하였다. TOCSY 및 NOEY 데이터 세트는 애매하지 않은 순차적 할당을 제공하였으며, ROESY 및 HSQC 데이터 세트는 양자 기본 할당에 대한 지지 증거로서 사용되었다. TOCSY/NOEY 데이터 세트는 스펙트럼의 아미드 양자 주파수에서 13개의 뚜렷한 스핀 시스템의 존재를 나타내었다. 스핀 시스템의 상기 수는 1199 및 1215 Da의 질량을 갖는 올리고펩티드에 대해 예측되는 것보다 많다. 데이터 세트의 추가 분석은 산화된 변종인 옥시디오펑진 B가 TOCSY 스펙트럼의 아미드 주파수에서의 수개의 뚜렷한 스핀 시스템을 가짐을 나타내었다(도 3의 A).
옥시디오펑진은 Asnl-신규한 아미노산 2(NAA2)-Trp3-β-히드록시-Tyr4-Lys5-Gly6-Asn7-Ser8로 구성된다(도 1의 A). 아미노산의 수치적 할당은 NRPS 착물에서 서열화 데이터 윤곽을 보여주는 티오에스테라아제 도메인의 위치로 인한 것이며; 티오에스테라아제 도메인의 위치는 일반적으로 올리고펩티드의 C-말단을 지정한다. 옥시디오펑진 A의 잔기 1 및 7은 Asn 잔기의 화학적 이동 패턴 특징을 갖는다(표 1). NAA2는 짧은 아실기 및 자일로스 당이 부착된 탈아미노화 리신의 화학적 이동 패턴 특징을 갖는다(도 1의 B와 도 3의 B). 상기 잔기의 뚜렷한 특징을 고려하여, 이의 구조는 하기에서 별도로 기술된다. 잔기 3은 Trp 잔기의 화학적 이동 패턴 특징을 갖는다 . NOE는 Trp의 베타 양자 및 화합물 중의 다른 잔기에 대해 인돌 고리 상의 양자들 사이에 존재하지 않는다. 이는 트립토판 고리가 용매 중에서 회전적으로 제한되지 않아서, 5Å보다 큰 구조적 평균 거리로 인해 신호의 상실을 발생시킴을 제시하는 것이다. 트립토판 인돌 고리의 용매 접근성에 대한 추가 증거는 Trp의 인돌 NH(엡실론)의 공명의 결여로부터 유래한다. 인돌의 NH 양자와 수성 환경과의 교환은 인돌 고리가 산성 pH 하에서 용매에 노출되는 경우에 가속되어, 선폭증대로 인한 신호의 상실을 발생시킨다. 잔기 4는 변형된 Tyr 잔기이다. 베타 탄소는 히드록실화되어, 5.16 ppm으로의 베타 양자의 현저한 다운필드 이동을 발생시킨다. NOE는 β-히드록시 Tyr의 베타 양자에 대한 방향족 고리의 델타 양자들 사이에서 관찰되어, 방향족 양자 주파수의 확정적 할당이 가능해진다. 잔기 5, 6, 및 8은 각각 Lys, GIy 및 Ser에 대한 일반적인 화학 이동 패턴을 갖는다. 옥시디오펑진 B는 Asn 1의 β-탄소가 히드록실화되어 위치 1에서 β-히드록시 Asn 잔기를 발생시킨다는 점에서 옥시디오펑진 A와 상이하다. 베타 탄소의 히드록실화는 2.67 ppm으로부터 4.24 ppm으로의 베타 양자 이동 다운필드를 발생시킨다. 더욱더, Asn1의 베타 탄소의 히드록실화는 NAA2, Trp3, Asn7, 및 Ser8의 아미드 양자 주파수에서의 화학적 이동의 현저한 변화를 발생시키며, 이는 옥시디오펑진 A 및 옥시디오펑진 B의 전반적인 생성의 차이를 제시하는 것이다. 항진균성 화합물에서 Asn 잔기 및 β-히드록시 Asn 잔기 모두의 확정적 할당은 이미노기의 베타 양자로부터의 델타 양자로의 ROE가 관찰되는 ROESY 데이터 세트로부터 유래한다(데이터는 도시되지 않음).
옥시디오펑진 A 및 옥시디오펑진 B 잔기 1 내지 8은 Hα i 및 Hβ i을 통해 HNi+1 순차적 이동으로 순차적으로 할당된다. NOE 연결은 옥시디오펑진 A 및 옥시디오펑진 B에 대해 도 4에 적색으로 도시되어 있다. 완전 순차적 이동은 옥시디오펑진의 변종 둘 모두에 대해 수행될 수 있다. NOE는 각각의 변종의 NAA2의 HN에 대해 Asn1의 Hα 및 Hβ와 β-히드록시 Asn1의 Hα 사이에 존재한다. NOE는 각각의 변종의 Trp3의 HN에 대해 NAA2의 Hα, Hβ, 및 Hγ 사이에 존재한다. Trp3는 β-히드록시 Tyr4의 HN에 대한 Hα 양자 NOE를 갖는다. NOE는 Lys5 및 Gly6의 HN에 대해 β-히드록시 Tyr4 및 Lys5의 Hα 및 Hβ 사이에 각각 존재한다. Gly6는 각각의 변종의 HN에 대한 Hα 양자 NOE를 갖는다. 추가적 NOE는 각각의 변종의 Asn7의 Hα 및 Hβ와 Ser8의 HN 사이에 존재한다. 더욱더, 올리고펩티드의 고리형 성질의 증거는 각각 Asn1의 HN 및 β-히드록시 Asn1의 HN에 대한 옥시디오펑진 A의 Ser8의 Hα 및 옥시디오펑진 B의 Ser8의 Hα 및 Hβ 사이의 NOE로부터 유래한다. HN i +1에 대한 HN i NOE는 옥시디오펑진 A 및 옥시디오펑진 B 둘 모두에 대해 Trp3에 대한 NAA2, Gly6에 대한 Lys5, Asn7에 대한 Gly6, 및 Ser8에 대한 Asn7 사이에서 관찰된다(데이터는 도시되지 않음). 추가적 HN i +1에 대한 HN i NOE는 각각 옥시디오펑진 A 및 옥시디오펑진 B에 대해 NAA2에 대한 Asn1 및 NAA2에 대한 β-히드록시 Asn1 사이에서 관찰된다.
독특한 구조 때문에, 잔기 2의 도식이 도 1의 B에 제공된다. NAA2의 구조적 기본은 탈아미노화 리신과 유사하다. 아마도, 상기 잔기는 항진균성 화합물의 합성데 대해 반응성인 게놈 영역에서 발견되는 케토아실 신타아제 및 아미노기전이효소에 의해 생성된다(Gu, Smith, and Lu, unpublished). 기준으로서 탈아미노화 리신의 원소 할당을 사용하여, 알파, 베타, 감마, 델타, 및 엡실론 양자에 대한 화학적 이동 할당은 NOE 데이터에 의해 지지된다. Trp3의 HN에 대한 NAA2의 Hα, Hβ 및 Hγ 사이의 NOE가 관찰된다. NOE의 세기는 Trp3의 HN에 대한 양자의 거리가 증가함에 따라 감소한다(도 1의 B). 더욱더, 탈아미노화 리신계 잔기 상의 말단 아미노기는 상기 기술된 NOE에 의해 관찰되는 바와 같이 상기 Asn 잔기의 카르보닐기에 공유결합된다. 상기 영역에서의 화학적 이동의 분석은 NAA2가 4개의 탄소 아실 사슬 및 자일로스 당을 부착시키기 위한 기재를 제공함을 제시한다(표 1). 데이터는 델타 탄소에 대한 아실 사슬의 부착 및 탈아미노화 리신계 잔기의 베타 탄소의 자일로스 당의 부착을 지지한다. 상기 영역에서 포화된 탄소 상의 양자에 대한 예측된 화학적 이동 값은 약 1.7 ppm이다. 베타 및 델타 양자는 각각 4.28 ppm 및 3.56 ppm으로 상기 예측된 값 아래로 현저히 이동한다. 이들 양자의 화학적 이동의 변화는 이들의 부근에서의 산소의 전자방출기의 존재를 제시한다. 케토아실 신타아제에 의한 지방산 합성의 일부로서 존재하는 델타 및 베타 탄소 상의 이중 결합된 산소가 히드록실기로 환원되고, 후속적으로 4개의 탄소 아실 사슬 및 자일로스 당이 축합 반응을 통해 부착됨이 예측된다. 탈아미노화 리신계 잔기의 Hε 양자에 대해 아실 탄소 2 및 3의 양자 사이의 NOE가 존재하며(도 1의 B), 이는 델타 탄소에 대한 아실기의 부착을 제시하는 것이다. 분자 중의 Ser8 잔기는 또한 자일로스의 부착을 지지할 수 있다. 그러나, 이의 예측된 화학적 이동 값의 임의의 현저한 변화의 결여는 NAA2에서 관찰된 Hβ 양자의 급격한 다운스트림 이동에 대한 유의성을 추가한다. 분자 중의 다른 잔기에 대한 자일로스의 부착은 자일로스 분자 상의 산소의 결여를 발생시켜서, 상기 기술된 질량분석법 데이터에서 관찰된 것보다 낮은 질량을 발생시킨다. 결론적으로, NAA2의 베타 탄소는 자일로스에 대한 가장 적절한 부착 자리이다. HSQC 데이터는 변형된 잔기의 탄소 공명에 대한 NAA2의 양자들 사이의 추가적 상관관계를 제공하였다. 예를 들어, 감마 탄소에 대한 탄소 공명은 1.89 및 1.39 ppm의 공명을 갖는 2개의 구별될 수 있는 양자를 가졌다(도 1).
옥시디오펑진은 광범위한 항진균성 활성을 갖는다. 옥시디오펑진은 광범위한 진균 식물 및 동물 병원체에 대한 현저한 항진균성 활성을 나타내었다(도 5). 잎집무늬마름병균(R. solani)은 2 ㎍/㎖의 MIC를 갖는 시험된 진균류 중 가장 민감하며, 0.5 ㎍/㎖의 농도에서 현저한 성장 억제를 나타내었다. 침습성 폐 아스페르길루스증의 공통적인 원인인 아스페르길루스 푸미가투스(A.fumigatus) 및 아스페르길루스 니가(A niger)는 둘 모두 각각 8 ㎍/㎖ 및 4 ㎍/㎖의 MIC를 갖는 옥시디오펑진에 대해 매우 민감하였다. 둘 모두 피부 사상균증과 관련된 2가지 관련 진균류, 즉 석고상소포자균 및 남백선균속은 4 ㎍/㎖의 MIC를 갖는 옥시디오펑진에 민감하였다. 추가적 병원체 진균류, 저장병균, 알테르나리아 알테르나타 및 마크로포미나 파세오리나은 각각 32 ㎍/㎖, 8 ㎍/㎖ 및 2 ㎍/㎖의 MIC를 갖는 옥시디오펑진에 민감한 것으로 입증되었다. 진균류 시드름병균(F. oxysporum)은 > 32㎍/㎖의 MIC를 갖는 옥시디오펑진에 최소로 민감하였다. 그러나, 현저한 성장 억제는 16 ㎍/㎖에서 관찰되었다. 식물 및 동물의 효모 병원체인 게오트리쿰 칸디둠(G. candidum)은 8 ㎍/㎖의 MIC에서 현저히 억제되었으며, 4 ㎍/㎖에서 성장 억제가 현저하였다(도 5의 B). 뿌리썩음병균(P. spinosum) 및 호박뿌리썩음병원균(P. ultimum)이 각각 1 ㎍/㎖ 및 2 ㎍/㎖의 MIC를 갖는 옥시디오펑진에 대해 가장 민감하였다. 이들 데이터는 옥시디오펑진이 식물 및 동물 진균 병원체에 대한 강한 광범위한 항진균제로서 응용이 가능함을 나타낸다.
옥시디오펑진은 막 무결성을 변경시킨다. 동등한 나이의 균사 및 세포를 이들 연구에 사용하였다. 부분 억제 농도의 옥시디오펑진(0.5 ㎍/㎖)에서 성장한 잎집무늬마름병균의 균사를 항진균성 화합물의 부재 하에 성장한 잎집무늬마름병균의 균사와 비교하였다. 상기 농도에서 잎집무늬마름병균의 성장이 50% 초과 감소하였다(도 5의 A). 옥시디오펑진은 현저한 균사 형태 변형을 유도하였으며, 가장 현저한 변화 중 하나는 세포내 내포물의 생성이다(도 6, 패널 A와 B, 흑색 화살표). 또 다른 현저한 차이는 옥시디오펑진에 대한 노출 후의 균사의 팁의 변형 및 세포 막의 파상 패턴이다(도 6, 패널 A와 B, 백색 화살표). 부분 억제 농도 하에 성장한 마크로포미나 파세오리나의 균사 형태에 대해 동일한 관찰이 이루어졌다(도시되지 않음). 48시간 동안 4 ㎍/㎖의 옥시디오펑진에 노출된 게오트리쿰 칸디둠의 분절포자는 비처리 세포와 비교할 경우에 노출 후의 세포 팽윤으로 인해 무정형 형태를 나타내었다 (도 6, 패널 C와 D). TEM 데이터는 48시간 동안 부분 억제 농도의 옥시디오펑진에 대한 노출 후에 게오트리쿰 칸디둠의 세포벽 두께의 급격한 감소를 나타낸다(도 7). 또한, 세포벽의 탈리인 것으로 보이는 것이 처리된 샘플 중에 존재하며(흑색 화살표), 이는 세포벽 무결성이 옥시디오펑진에 대한 노출에 의해 영향받음을 제시하는 것이다. 처리된 게오트리쿰 칸디둠 중의 내부 세포 콘트라스트의 결여는 또한, 세포가 용해되었음을 제시한다(백색 화살표). 아마도, 더 얇은 세포벽은 삼투압을 유지할 수 없다. TEM 데이터로부터 팽윤에 대한 어떠한 규정도 이루어질 수 없으며, 이는 분절포자가 원통형이며 이들을 횡단할 기회가 높음을 제공하는 것이다. 수 개의 분절포자를 보여주는 더 넓은 뷰는 분절포자의 일부가 원통형 외관을 유지함을 보여주지만(도 7, 패널 C); 이들은 모두 패널 B에 도시된 분절 포자에서 관찰되는 바와 같이 내부적으로 그리고 세포벽에서 동일한 형태 변형을 공유한다. 이들 관찰은 옥시디오펑진이 세포벽 생성을 방해함으로써 막 무결성을 표적으로 하며, 가시적인 봉입체의 생성이 일반적으로 기질 축적에 기인하므로, 옥시디오펑진이 효소 기능을 억제할 수 있음을 나타낸다.
고찰
상기 연구로부터의 발견은 신규한 아미노산을 함유하는 옥시디오펑진의 완전 공유결합 구조의 설명; 옥시디오펑진의 광범위한 항진균성 활성의 특징화; 및 항진균성 화합물에 대한 노출 후의 세포 내포물 및 막 불안정성의 생체내 관찰을 포함한다.
구조적 특징화는 옥시디오펑진이 뚜렷한 항진균제임을 확인한다. 상기에 제공된 질량분석법 및 NMR 데이터는 모두 완전히 일치하고, 도 1에 도시된 옥시디오펑진의 구조를 지지한다. 구조적 데이터는 애매하지 않은 아미노산 할당을 제공하여, 옥시디오펑진의 2개의 구조적 변종, 즉 옥시디오펑진 A와 옥시디오펑진 B 사이를 구별할 수 있게 한다. 각각의 분자의 백본을 가로지르는 완전 순차적 이동이 입증되었다. 더욱더, C-말단 잔기 Ser8로부터 옥시디오펑진 A의 Asn1 및 옥시디오펑진 B의 β-히드록시 Asn1의 NOE는 이전에 예상된 올리고펩티드의 고리형 성질을 확인하다.
신규한 아미노산은 NMR 데이터에 의해 확인되고 잘 특징화된다. 항진균성 활성에 대한 상기 뚜렷한 잔기의 중요성은 공지되어 있지 않지만, 본 발명자들의 매우 관심 있는 영역이다. 또한, 2개의 아미노산 유도체인 β-히드록시 Asn(옥시디오펑진 B에 대해 독점) 및 β-히드록시 Tyr이 NMR 데이터에서 확인된다(표 1). 각각의 변종의 크로마토그래피 분리는 아직 달성되지 않았다. 따라서, Asn1의 베타 탄소의 히드록실화가 화합물의 생물활성을 위해 중요한 지는 아직 알려지지 않았다. β-히드록시 Asn1 근처의 잔기의 아미드 주파수의 급격한 이동은 펩티드의 구조가 Asn1의 베타 탄소의 히드록실화 후에 변함을 제시한다.
옥시디오펑진의 활성의 정확한 메커니즘은 공지되지 않았지만, 상기 연구는 작용 메커니즘을 설명하기 위한 실험을 시작하기 위한 고형 기재를 제공한다. 옥시디오펑진은 2개의 피슘 종에 대한 강한 억제 활성을 나타내었다. 피슘은 진정한 진균류가 아니고, 에르고스테롤은 이들의 세포막에서 주요 스테롤로 존재하지 않으며; 결론적으로, 이는 에르고스테롤 표적화하는 항진균제에 대해 민감하지 않다. 따라서, 옥시디오펑진의 항진균성 활성은 에르고스테롤을 결합시키거나 에르고스테롤 합성을 억제하는 것을 수반하지 않는다. 또한, 피슘의 세포벽이 키틴을 함유하지 않고, 상기 난균성 균이 이의 세포벽에서 다량의 β-글루칸을 함유함을 유의하는 것이 중요하다. 따라서, 또한 옥시디오펑진이 키틴 합성을 표적화할 것을 예상되지 않는다.
옥시디오펑진에 노출된 진균류의 형태는 에키노칸딘에 노출된 진균류의 문헌에 보고된 형태와 유사하며, 이는 옥시디오펑진이 글루칸 합성을 표적화함을 제시하는 이다. 에키노칸딘인 억제 농도의 미카펀진(Micafungin)에 노출된 아스페르길루스 푸미가투스는 균사 파열을 나타내고, 부분 억제 농도에서 파상막 및 변형된 균사 팁을 보여주었다. 치명적 투여량의 에키노칸딘에 노출된 칸디다 알비칸스(candida albicans)는 팽윤을 포함하며, 부분 억제 투여량에서 비정상 형태 변형이 막에 대해 관찰되었다. 아스페르길루스 푸미가투스에서의 비정상 막 형태의 생성은 잎집무늬마름병균 및 마크로포미나 파세오리나이 부분 억제 농도 하에 성장하는 경우에 관찰되는 것과 유사하며, 칸디다 알비칸스의 세포 팽윤은 부분 억제 투여량의 옥시디오펑진에 노출된 게오트리쿰 칸디둠에 대해 관찰되는 것과 유사하다. 흥미롭게는, 푸사리움(Fusarium spp .)은 에키노칸딘에 대해 내성이다. 내성 메커니즘은 (1,3)-β-글루칸 신타아제 효소의 촉매소단위에서의 천연 돌연변이체 및 세포벽 구조의 천연적 차이에 기인하며, 특히, 푸사리움은 더 적은 1,3-β-글루칸을 갖는다. 상기 연구에서 시드름병균의 MIC는 > 32㎍/㎖이었지만, 옥시디오펑진은 16 ㎍/㎖에서 상기 균류의 성장을 급격히 지연시킨다. 추가 연구는 옥시디오펑진이 글루칸 진균 세포벽 합성을 억제하는 지의 여부, 특히 (1,3)-β-글루칸 신타아제를 억제하기 위한 이의 능력을 조사할 것이다. 세포벽 생성 및 세포벽 손상에 대한 반응은 합성 및 복구를 위해 생합성 효소에 대해 진균 세포벽 표면 사이의 소통을 조직하는 복잡한 세포 신호망을 수반한다. 결론적으로, 옥시디오펑진의 실제 작용 메커니즘은 완전히 새로운 표적을 수반할 수 있다.
본 발명을 구성하는 조성물은 감염 또는 질환의 심각도에 의존하여 치료 유효량으로 실험대상 동물 또는 식물에 투여되어, 진균 감염의 임의의 단기 또는 장기 효과를 방지 또는 감소시킬 수 있다.
본원은 항진균성 화합물을 생성하는 신규한 단리된 균주뿐만 아니라, 사람, 동물과 식물 실험대상에서의 광범위한 진균 감염을 예방 및 감소시키기 위한 응용을 위해 한 세트의 신규한 및 매우 효과적인 항진균성 화합물을 처음으로 기술하고 충분히 특징화하였다.
상기 상세한 설명은 임의의 당업자가 본 발명을 만들고 사용할 수 있도록 제공된다. 특정 상세가 본 발명의 포괄적 이해를 제공하도록 기술되었으며, 제공된 정보의 설명을 위해 사용된다. 그러나, 이들 특정 상세는 당업자에게 명백해지는 바와 같이 본 발명을 실시하기 위해 필요하지 않다. 특정 응용, 분석 및 계산의 설명은 단지 일반적인 예로 작용하는 것을 의미한다. 바람직한 실시예 및 추가적 또는 여러 가지 상호작용 및 재료 및 결과적인 장점에 대한 다양한 적합한 변화, 변형, 조합 및 등가물이 당업자에게 쉽게 명백해질 것이며, 본원에 규정된 일반적 원칙은 다른 실시예 및 응용에 적용될 수 있지만, 여전히 본 발명의 사상 및 범위 내에 있다. 특허청구범위 및 명세서는 본 발명이 부여한 보호의 완전 범위를 과도하게 좁게 하도록 구성되지 않아야 한다. 또한, 도면은 단지 예를 위해 제공됨이 이해되어야 한다. 본 발명에 대해 나타낸 실시예로 제한되도록 하는 의도는 없으며, 본 발명은 본원에 기술된 원리 및 특징과 일치하는 가장 넓은 가능한 범위에 부합되어야 한다.
화학 이동
아미노산 HN H α H β 다른 양자
Asn1 8.21 4.62(53.20) 2.67(39.98) 7.43*
[BHN1] 7.98 4.73(58.74) 4.24 7.49
NAA2 2.41(43.90) 4.23(47.36) 1.89(40.32), 1.44(40.32), 3.52(69,70), 3.17(76.88), 7.67
[NAA2] 2.41(43.90) 4.28(47.36) 1.89(40.32), 1.39(40.32), 3.56(69,70), 3.16(76.88), 7.40
Trp3 8.02 4.20(58.54) 3.49, 3.35 (64.05) 7.45, 7.04, 7.33, 6.65
[Trp3] 8.00 4.20(58.54) 3.47, 3.35 (64.05) 7.45, 7.04, 7.33, 6.65
BHT4 8.00 4.42(63.18) 5.16(74.06) 7.17, 6.76
Lys5 8.04 4.39(53.88) 2.15(31.29) 1.96(31.29), 2.90(39.75), 7.49
Gly6 7.93 3.94, 3.72 (45.06)
Asn7 8.18 4.63(53.13) 2.70, 2.63 (38.38) 7.40*
[Asn7] 8.21 4.62(53.13) 2.67(38.58) 7.43*
Ser8 8.00 4.35(58.27) 3.73(64.24)
[Ser8] 8.10 4.43(58.27) 3.76(64.24)
자일로스 4.30, 3.81(67.90), 3.48(72.08), 3.28(78.47), 3.14(67.97)
아실 사슬 3.84(78.59), 1.55(32.37), 1.23(27.60), 0.81(15.96)
양자 화학적 이동 값은 TOCSY 실험으로부터의 값이다. 소괄호 안의 화학적 이동은 HSQC 실험으로부터의 13C 값이다. 옥시디오펑진 B에 대한 뚜렷한 화학적 이동 값은 괄호 안에 나타내었다. *은 ROESY 실험으로부터의 화학적 이동 값을 나타낸다.
인용된 참조 문헌
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009

Claims (12)

  1. 진균 감염 또는 질병을 예방 또는 치료하기 위한, 하기 화학식(I)을 갖는 항진균성 고리형 당펩티드 화합물(antifungal cyclic glycopeptide compound)과, 약학적으로 허용 가능하고 농업적으로 허용 가능한 이들의 염으로서,
    옥시디오펑진(Occdiofungin) A
    C54N12O19H79
    단일동위원소 질량(Monoisotopic Mass) 1199.5584
    Figure pct00010
    (I)
    상기 화학식에서, Asn1, NAA2, Trp3, BHT4, Lys5, Gly6, Asn7, 및 Ser8은 아미노산 잔기인, 항진균성 고리형 당펩티드 화합물과, 약학적으로 허용 가능하고 농업적으로 허용 가능한 이들의 염.
  2. 진균 감염 또는 질병을 예방 또는 치료하기 위한, 하기 화학식(II)을 갖는 항진균성 고리형 당펩티드 화합물과, 약학적으로 허용 가능하고 농업적으로 허용 가능한 이들의 염으로서,
    옥시디오펑진 B
    C54N12O20H79
    단일동위원소 질량 1215.55331
    Figure pct00011
    (II)
    상기 화학식에서, BHN1, NAA2, Trp3, BHT4, Lys5, Gly6, Asn7, 및 Ser8은 아미노산 잔기인, 항진균성 고리형 당펩티드 화합물과, 약학적으로 허용 가능하고 농업적으로 허용 가능한 이들의 염.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 아미노산 잔기 NAA2는 부착 아실기와 자일로스 당을 더 포함하는, 항진균성 고리형 당펩티드 화합물과, 약학적으로 허용 가능하고 농업적으로 허용 가능한 이들의 염.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 아미노산 잔기 NAA2는 다음 구조를 갖는, 항진균성 고리형 당펩티드 화합물과, 약학적으로 허용 가능하고 농업적으로 허용 가능한 이들의 염.
    Figure pct00012
  5. 제 3항에 있어서, 상기 화합물은 진균 식물, 동물, 및 사람 병원체에 효과적인, 항진균성 고리형 당펩티드 화합물과, 약학적으로 허용 가능하고 농업적으로 허용 가능한 이들의 염.
  6. 제 3항에 있어서, 상기 화합물은 진균 식물, 동물, 및 사람 병원체의 세포막 형태를 방해하는, 항진균성 고리형 당펩티드 화합물과, 약학적으로 허용 가능하고 농업적으로 허용 가능한 이들의 염.
  7. 제 1항 또는 제 2항에 기재된 항진균성 화합물과, 약학적으로 허용 가능한 적어도 하나의 담체 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 적어도 하나의 담체 또는 희석제는 농업적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제인, 약학 조성물.
  9. 제 5항에 있어서, 상기 화합물은 진균 균주 버크홀데리아 오염물질(fungal bacterial strain Burkholderia contaminants)로부터 유도되는, 항진균성 고리형 당펩티드 화합물과, 약학적으로 허용 가능하고 농업적으로 허용 가능한 이들의 염.
  10. 단리된 균주 MS14로서,
    상기 균주는 종 버크홀데리아 오염물질에 속하고, 그 유전 DNA 단편은 서열화되고 수납 번호 EU 938698로 Genbank에 기탁되며, 상기 균주는 적어도 하나의 항진균성 화합물을 생성하기 위한 증가된 활성을 맡은 게놈 영역을 갖는, 단리된 균주 MS14.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 적어도 하나의 항진균성 화합물은 제 1항의 항진균성 고리형 당펩티드 화합물인, 단리된 균주 MS14.
  12. 제 10항에 있어서, 상기 적어도 하나의 항진균성 화합물은 제 2항의 항진균성 고리형 당펩티드 화합물인, 단리된 균주 MS14.
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