JPWO2018203574A1 - オリゴヌクレオチドの製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
さらに、本発明者らは、トリチル基の少なくとも1のベンゼン環がアルキルオキシ基で置換された、新規なトリチル型擬似固相保護基を見出した。またヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドの3’位又は5’位ヒドロキシ基の保護基として該レブリニル型擬似固相保護基を用いる製造方法において、該トリチル型擬似固相保護基を併用することにより、さらに効率よく上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成させた。
R1は、それぞれ独立して、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基、C2−40アルキニル基又は、
式 −L7−O−R4
(式中、L7は、C1−40アルキレン基、C2−40アルケニレン基又はC2−40アルキニレン基であり、R4は、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基又はC2−40アルキニル基である)で表される基であり、少なくとも1つのR1の炭素数は10以上であり、sは、1から5の整数であり、
L11は、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L12は、単結合、−O−又は−N(R2)−(式中、R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)であり、
L13は、単結合、−C(O)−又はC1−6アルキレン基であり、L12が単結合のとき、L13は、単結合又は−C(O)−である)で表される保護基で置換されたヒドロキシ基であり、
5’位及び3’位の一方が一時保護基で置換されたヒドロキシ基であるオリゴヌクレオチドを、
溶媒中、ヒドラジン誘導体、ジアミン誘導体、ヒドロキシルアミン誘導体及びアミノアルコール誘導体から選択される少なくとも1つのアミノ化合物を反応させ、
前記式(II)で表される保護基を除去する工程を含む、
3’位及び5’位の一方がヒドロキシ基であり、5’位及び3’位の一方が一時保護基で置換されたヒドロキシ基であるオリゴヌクレオチドの製造方法。
4. 前記アミノ化合物が、ヒドラジン一水和物である、1.から3.のいずれか1つに記載の製造方法。
5. 前記アミノ化合物が、C1−6アルキルヒドラジンである、1.から3.のいずれか1つに記載の製造方法。
8. 前記極性溶媒が炭素数1から6のアルコール溶媒又は炭素数1から6のニトリル溶媒である、7.に記載の製造方法。
R1は、それぞれ独立して、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基、C2−40アルキニル基又は、
式 −L7−O−R4
(式中、L7は、C1−40アルキレン基、C2−40アルケニレン基又はC2−40アルキニレン基であり、R4は、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基又はC2−40アルキニル基である)で表される基であり、少なくとも1つのR1の炭素数は10以上であり、sは、1から5の整数であり、
L11は、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L12は、単結合、−O−又は−N(R2)−(式中、R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)であり、
L13は、単結合、−C(O)−又はC1−6アルキレン基であり、L12が単結合のとき、L13は、単結合又は−C(O)−である)で表される保護基で置換されたヒドロキシ基であり、
5’位及び3’位の一方が、反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基、又はヒドロキシ基であるn個重合オリゴヌクレオチドと、
3’位及び5’位の一方が、ヒドロキシ基又は反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基であり、5’位及び3’位の一方が、一時保護基で置換されたヒドロキシ基であるp個重合オリゴヌクレオチドとを反応させ、
n個重合オリゴヌクレオチドとp個重合オリゴヌクレオチドとの結合体を生成するカップリング工程を含み、
n及びpは、それぞれ独立して、1以上の整数であり、
n個重合オリゴヌクレオチドの5’位及び3’位の一方が、反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基であるとき、p個重合オリゴヌクレオチドの3’位及び5’位の一方が、ヒドロキシ基であり、
n個重合オリゴヌクレオチドの5’位及び3’位の一方が、ヒドロキシ基であるとき、p個重合オリゴヌクレオチドの3’位及び5’位の一方が、反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基である、オリゴヌクレオチドの製造方法。
12. 前記カップリング工程の前に、3’位及び5’位の一方が、前記式(II)で表される保護基で置換されたヒドロキシ基であり、5’位及び3’位の一方がヒドロキシ基であるヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドの当該5’位又は3’位のヒドロキシ基を、反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基へ変換し、n個重合オリゴヌクレオチドを生成する反応性リン化工程を含む、11.に記載のオリゴヌクレオチドの製造方法。
13. 前記反応性リン化工程の前に、3’位及び5’位の一方が、前記式(II)で表される保護基で置換されたヒドロキシ基であり、5’位及び3’位の一方が一時保護基で置換されたヒドロキシ基であるヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドの当該一時保護基を除去し、5’位及び3’位の一方にヒドロキシ基を生成する脱一時保護基工程を含む、12.に記載のオリゴヌクレオチドの製造方法。
p個重合オリゴヌクレオチドの3’位が、ヒドロキシ基である、11.から13.のいずれか1つに記載のオリゴヌクレオチドの製造方法。
p個重合オリゴヌクレオチドの3’位が反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基である、15.又は16.に記載のオリゴヌクレオチドの製造方法。
20. 前記カップリング工程の後に、前記亜リン酸ジエステル結合を、リン酸ジエステル結合、チオリン酸ジエステル結合、ボラノリン酸ジエステル結合、アミノリン酸ジエステル結合、リン酸トリエステル結合又はチオリン酸−O,O,S−トリエステル結合に変換することを含む亜リン酸ジエステル結合の変換工程を更に含む、19.に記載の製造方法。
22. 前記カップリング工程の後に、前記亜リン酸トリエステル結合を、リン酸トリエステル結合又はチオリン酸トリエステル結合に変換することを含む亜リン酸トリエステル結合の変換工程を更に含む、21.に記載の製造方法。
R1は、それぞれ独立して、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基、C2−40アルキニル基又は、
式 −L7−O−R4
(式中、L7は、C1−40アルキレン基、C2−40アルケニレン基又はC2−40アルキニレン基であり、R4は、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基又はC2−40アルキニル基である)で表される基であり、少なくとも1つのR1の炭素数は10以上であり、sは、1から5の整数であり、
L11は、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L12は、単結合、−O−又は−N(R2)−(式中、R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)であり、
L13は、単結合、−C(O)−又はC1−6アルキレン基であり、L12が単結合のとき、L13は、単結合又は−C(O)−である)で表される保護基で置換されたヒドロキシ基であり、
5’位及び3’位の一方が、下記式(VI)
(式中、*は、ヒドロキシ基との結合位置を示し、
Ar1は、下記式(VII)
(式中、*は、Ar1が結合する炭素原子を示し、
R1は、それぞれ独立して、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基、C2−40アルキニル基又は、
式 −L7−O−R4
(式中、L7は、C1−40アルキレン基、C2−40アルケニレン基又はC2−40アルキニレン基であり、R4は、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基又はC2−40アルキニル基である)で表される基であり、少なくとも1つのR1の炭素数は10以上であり、sは、1から5の整数である)で表される基であり、
Ar2及びAr3は、それぞれ独立して、前記式(VII)で表される基又は下記式(VIII)
(式中、*は、Ar2及びAr3が結合する炭素原子を示し、
R10は、置換基群Aから選択される置換基であり、
置換基群Aは、ハロゲン原子、C1−6アルキル基、C2−6アルケニル基、C2−6アルキニル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6ハロアルケニル基、C1−6アルコキシ基、C1−6ハロアルコキシ基、モノC1−6アルキルアミノ基、ジC1−6アルキルアミノ基、C1−6アルキルカルボニル基、C1−6ハロアルキルカルボニル基、C1−6ハロアルコキシカルボニル基、C1−6アルコキシカルボニル基、モノC1−6アルキルアミノカルボニル基、ジC1−6アルキルアミノカルボニル基、C1−6アルコキシC1−6アルキル基、C1−6アルキルスルホニル基及びC1−6ハロアルキルスルホニル基により構成される置換基群を意味し、
tは、0から5の整数であり、tが2から5のとき、R10は、同一でも異なっていてもよい)で表される基である)で表される保護基で置換されたヒドロキシ基であるオリゴヌクレオチドを、
溶媒中、ヒドラジン誘導体、ジアミン誘導体、ヒドロキシルアミン誘導体及びアミノアルコール誘導体から選択される少なくとも1つのアミノ化合物を反応させ、
前記式(II)で表される保護基を除去する工程を含む、
3’位及び5’位の一方がヒドロキシ基であり、5’位及び3’位の一方が前記式(VI)で表される保護基で置換されたヒドロキシ基であるオリゴヌクレオチドの製造方法。
28. 前記アミノ化合物が、ヒドラジン一水和物である、25.から27.のいずれか1つに記載の製造方法。
29. 前記アミノ化合物が、C1−6アルキルヒドラジンである、25.から28.のいずれか1つに記載の製造方法。
32. 前記極性溶媒が炭素数1から6のアルコール溶媒又は炭素数1から6のニトリル溶媒である、31.に記載の製造方法。
3’位及び5’位の一方が、前記式(II)で表される保護基で置換されたヒドロキシ基であり、
5’位及び3’位の一方が、ヒドロキシ基であるオリゴヌクレオチドと、下記式(IX)
(式中、Qは、脱離基を示し、
Ar1は、下記式(VII)
(式中、*は、Ar1が結合する炭素原子を示し、
R1は、それぞれ独立して、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基、C2−40アルキニル基又は、
式 −L7−O−R4
(式中、L7は、C1−40アルキレン基、C2−40アルケニレン基又はC2−40アルキニレン基であり、R4は、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基又はC2−40アルキニル基である)で表される基であり、少なくとも1つのR1の炭素数は10以上であり、sは、1から5の整数である)で表される基であり、
Ar2及びAr3は、それぞれ独立して、前記式(VII)で表される基又は下記式(VIII)
(式中、*は、Ar2及びAr3が結合する炭素原子を示し、
R10は、置換基群Aから選択される置換基であり、
置換基群Aは、ハロゲン原子、C1−6アルキル基、C2−6アルケニル基、C2−6アルキニル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6ハロアルケニル基、C1−6アルコキシ基、C1−6ハロアルコキシ基、モノC1−6アルキルアミノ基、ジC1−6アルキルアミノ基、C1−6アルキルカルボニル基、C1−6ハロアルキルカルボニル基、C1−6ハロアルコキシカルボニル基、C1−6アルコキシカルボニル基、モノC1−6アルキルアミノカルボニル基、ジC1−6アルキルアミノカルボニル基、C1−6アルコキシC1−6アルキル基、C1−6アルキルスルホニル基及びC1−6ハロアルキルスルホニル基により構成される置換基群を意味し、
tは、0から5の整数であり、tが2から5のとき、R10は、同一でも異なっていてもよい)で表されるトリアリール化合物を反応させ、
3’位及び5’位の一方が、前記式(II)で表される保護基で置換されたヒドロキシ基であり、
5’位及び3’位の一方が、前記式(VI)で表される保護基で置換されたヒドロキシ基であるオリゴヌクレオチドを生成する工程を含む、25.から32.のいずれか1つに記載の製造方法。
R1は、それぞれ独立して、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基、C2−40アルキニル基又は、
式 −L7−O−R4
(式中、L7は、C1−40アルキレン基、C2−40アルケニレン基又はC2−40アルキニレン基であり、R4は、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基又はC2−40アルキニル基である)で表される基であり、少なくとも1つのR1の炭素数は10以上であり、sは、1から5の整数であり、
L11は、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L12は、単結合、−O−又は−N(R2)−(式中、R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)であり、
L13は、単結合、−C(O)−又はC1−6アルキレン基であり、L12が単結合のとき、L13は、単結合又は−C(O)−である)で表される保護基で置換されたヒドロキシ基であり、5’位及び3’位の一方が、反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基、又はヒドロキシ基であるn個重合オリゴヌクレオチドと、
3’位及び5’位の一方が、ヒドロキシ基又は反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基であり、5’位及び3’位の一方が、下記式(VI)
(式中、*は、5’位又は3’位のヒドロキシ基との結合位置を示し、
Ar1は、下記式(VII)
(式中、*は、Ar1が結合する炭素原子を示し、
R1は、それぞれ独立して、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基、C2−40アルキニル基又は、
式 −L7−O−R4
(式中、L7は、C1−40アルキレン基、C2−40アルケニレン基又はC2−40アルキニレン基であり、R4は、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基又はC2−40アルキニル基である)で表される基であり、少なくとも1つのR1の炭素数は10以上であり、sは、1から5の整数である)で表される基であり、
Ar2及びAr3は、それぞれ独立して、前記式(VII)で表される基又は下記式(VIII)
(式中、*は、Ar2及びAr3が結合する炭素原子を示し、
R10は、置換基群Aから選択される置換基であり、
置換基群Aは、ハロゲン原子、C1−6アルキル基、C2−6アルケニル基、C2−6アルキニル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6ハロアルケニル基、C1−6アルコキシ基、C1−6ハロアルコキシ基、モノC1−6アルキルアミノ基、ジC1−6アルキルアミノ基、C1−6アルキルカルボニル基、C1−6ハロアルキルカルボニル基、C1−6ハロアルコキシカルボニル基、C1−6アルコキシカルボニル基、モノC1−6アルキルアミノカルボニル基、ジC1−6アルキルアミノカルボニル基、C1−6アルコキシC1−6アルキル基、C1−6アルキルスルホニル基及びC1−6ハロアルキルスルホニル基により構成される置換基群を意味し、
tは、0から5の整数であり、tが2から5のとき、R10は、同一でも異なっていてもよい)で表される基である)で表される保護基で置換されたヒドロキシ基であるp個重合オリゴヌクレオチドとを反応させ、
n個重合オリゴヌクレオチドとp個重合オリゴヌクレオチドとの結合体を生成するカップリング工程を含み、
n及びpは、それぞれ独立して、1以上の整数であり、
n個重合オリゴヌクレオチドの5’位及び3’位の一方が、反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基であるとき、p個重合オリゴヌクレオチドの3’位及び5’位の一方が、ヒドロキシ基であり、
n個重合オリゴヌクレオチドの5’位及び3’位の一方が、ヒドロキシ基であるとき、p個重合オリゴヌクレオチドの3’位及び5’位の一方が、反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基である、オリゴヌクレオチドの製造方法。
p個重合オリゴヌクレオチドの5’位が前記式(VI)で表される保護基で置換されたヒドロキシ基であり、3’位がヒドロキシ基である、34.に記載のオリゴヌクレオチドの製造方法。
37. 前記カップリング工程の前に、5’位が前記式(VI)で表される保護基で置換されたヒドロキシ基であり、3’位が前記式(II)で表される保護基で置換されたヒドロキシ基であるヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドの当該式(II)で表される保護基を除去し、3’位にヒドロキシ基を生成する工程を含む、34.から36.のいずれか1つに記載のオリゴヌクレオチドの製造方法。
40. 前記カップリング工程の後に、前記亜リン酸ジエステル結合を、リン酸ジエステル結合、チオリン酸ジエステル結合、ボラノリン酸ジエステル結合、アミノリン酸ジエステル結合、リン酸トリエステル結合又はチオリン酸−O,O,S−トリエステル結合に変換することを含む亜リン酸ジエステル結合の変換工程を更に含む、39.に記載の製造方法。
42. 前記カップリング工程の後に、前記亜リン酸トリエステル結合を、リン酸トリエステル結合又はチオリン酸トリエステル結合に変換することを含む亜リン酸トリエステル結合の変換工程を更に含む、41.に記載の製造方法。
Baseは、それぞれ独立して、核酸塩基又は基本保護基で置換された核酸塩基を示し、
Xは、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、基本保護基で置換されたヒドロキシ基又は4‘位炭素原子に架橋する有機基を示し、
Yは、それぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシ基、基本保護基で置換されたヒドロキシ基、スルファニル基、基本保護基で置換されたスルファニル基、水素化ホウ素基、モノC1−6アルキルアミノ基又はジC1−6アルキルアミノ基を示し、
Vは、それぞれ独立して、酸素原子又は硫黄原子を示し、
Z1が、水素原子、一時保護基、ヒドロキシホスフィニル基、又は置換されたヒドロキシ(ジアルキルアミノ)ホスフィノ基であるとき、Z2は、下記式(II)で表される保護基を示し、
Z1が、下記式(II)で表される保護基であるとき、Z2は、水素原子、一時保護基、ヒドロキシホスフィニル基又は置換されたヒドロキシ(ジアルキルアミノ)ホスフィノ基を示し、
式(II)が
R1は、それぞれ独立して、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基、C2−40アルキニル基又は、
式 −L7−O−R4
(式中、L7は、C1−40アルキレン基、C2−40アルケニレン基又はC2−40アルキニレン基であり、R4は、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基又はC2−40アルキニル基である)で表される基であり、少なくとも1つのR1の炭素数は10以上であり、sは、1から5の整数であり、
L11は、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L12は、単結合、−O−又は−N(R2)−(式中、R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)であり、
L13は、単結合、−C(O)−又はC1−6アルキレン基であり、L12が単結合のとき、L13は、単結合又は−C(O)−である)である]で表される化合物、該化合物の互変異性体又はその塩。
Baseは、それぞれ独立して、核酸塩基又は基本保護基で置換された核酸塩基を示し、
Xは、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、基本保護基で置換されたヒドロキシ基又は4‘位炭素原子に架橋する有機基を示し、
Yは、それぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシ基、基本保護基で置換されたヒドロキシ基、スルファニル基、基本保護基で置換されたスルファニル基、水素化ホウ素基、モノC1−6アルキルアミノ基又はジC1−6アルキルアミノ基を示し、
Vは、それぞれ独立して、酸素原子又は硫黄原子を示し、
Z11が、下記式(II)で表される保護基又はヒドロキシホスフィニル基であるとき、Z12は、下記式(VI)で表される保護基を示し、
Z11が、下記式(VI)で表される保護基であるとき、Z12は、下記式(II)で表される保護基又はヒドロキシホスフィニル基を示し、
式(II)が、
R1は、それぞれ独立して、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基、C2−40アルキニル基又は、
式 −L7−O−R4
(式中、L7は、C1−40アルキレン基、C2−40アルケニレン基又はC2−40アルキニレン基であり、R4は、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基又はC2−40アルキニル基である)で表される基であり、少なくとも1つのR1の炭素数は10以上であり、sは、1から5の整数であり、
L11は、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L12は、単結合、−O−又は−N(R2)−(式中、R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)であり、
L13は、単結合、−C(O)−又はC1−6アルキレン基であり、L12が単結合のとき、L13は、単結合又は−C(O)−である)であり、
式(VI)が、
(式中、*は、ヒドロキシ基との結合位置を示し、
Ar1は、下記式(VII)
(式中、*は、Ar1が結合する炭素原子を示し、
R1は、それぞれ独立して、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基、C2−40アルキニル基、又は、
式 −L7−O−R4
(式中、L7は、C1−40アルキレン基、C2−40アルケニレン基又はC2−40アルキニレン基であり、R4は、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基又はC2−40アルキニル基である)で表される基であり、少なくとも1つのR1の炭素数は10以上であり、sは、1から5の整数である)で表される基であり、
Ar2及びAr3は、それぞれ独立して、前記式(VII)で表される基又は下記式(VIII)
(式中、*は、Ar2及びAr3が結合する炭素原子を示し、
R10は、置換基群Aから選択される置換基であり、
置換基群Aは、ハロゲン原子、C1−6アルキル基、C2−6アルケニル基、C2−6アルキニル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6ハロアルケニル基、C1−6アルコキシ基、C1−6ハロアルコキシ基、モノC1−6アルキルアミノ基、ジC1−6アルキルアミノ基、C1−6アルキルカルボニル基、C1−6ハロアルキルカルボニル基、C1−6ハロアルコキシカルボニル基、C1−6アルコキシカルボニル基、モノC1−6アルキルアミノカルボニル基、ジC1−6アルキルアミノカルボニル基、C1−6アルコキシC1−6アルキル基、C1−6アルキルスルホニル基及びC1−6ハロアルキルスルホニル基により構成される置換基群を意味し、
tは、0から5の整数であり、tが2から5のとき、R10は、同一でも異なっていてもよい)で表される基である)である]で表される化合物、該化合物の互変異性体又はその塩。
5’位及び3’位の一方が、ヒドロキシ基又は反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基であり、擬似固相保護基を有さない、p個重合オリゴヌクレオチドとをカップリングさせる工程を含み、
n及びpは、それぞれ独立して、2以上の整数であり、n+pは、11以上であり、
n個重合オリゴヌクレオチドの3’位及び5’位の一方が、反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基であるとき、p個重合オリゴヌクレオチドの5’位及び3’位の一方が、ヒドロキシ基であり、
n個重合オリゴヌクレオチドの3’位及び5’位の一方が、ヒドロキシ基であるとき、p個重合オリゴヌクレオチドの5’位及び3’位の一方が、反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基である、n+p個重合オリゴヌクレオチドの製造方法。
62. n及びpは、それぞれ独立して、4以上の整数である、59.から61.のいずれか1つに記載の製造方法。
R1は、それぞれ独立して、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基、C2−40アルキニル基又は、
式 −L7−O−R4
(式中、L7は、C1−40アルキレン基、C2−40アルケニレン基又はC2−40アルキニレン基であり、R4は、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基又はC2−40アルキニル基である)で表される基であり、少なくとも1つのR1の炭素数は10以上であり、sは、1から5の整数であり、
L11は、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L12は、単結合、−O−又は−N(R2)−(式中、R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)であり、
L13は、単結合、−C(O)−又はC1−6アルキレン基であり、L12が単結合のとき、L13は、単結合又は−C(O)−である]で表される、擬似固相保護基。
R1は、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基又はC2−40アルキニル基であり、少なくとも1つのR1の炭素数は10以上であり、sは、1から5の整数であり、
L11は、C1−6アルキレン基であり、
L12は、−O−又は−N(R2)−(式中、R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)であり、
L13は、単結合、−C(O)−又はC1−6アルキレン基である]で表される、擬似固相保護基。
下記式(II−1)
式 −L7−O−R4
(式中、L7は、C1−40アルキレン基、C2−40アルケニレン基又はC2−40アルキニレン基であり、R4は、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基又はC2−40アルキニル基である)で表される基であり、少なくとも1つのR1の炭素数は10以上であり、sは、1から5の整数であり、
L11は、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L12は、単結合、−O−又は−N(R2)−(式中、R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)であり、
L13は、単結合、−C(O)−又はC1−6アルキレン基であり、L12が単結合の時、L13は、単結合又は−C(O)−である]で表されるカルボキシ化合物、又は下記式(II−2)
2’位、3’位、5’位及び核酸塩基部の少なくとも1カ所が、下記式(II)
特に記述がない限り、本明細書で用いるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味をもつ。本明細書に記載されたものと同様又は同等の任意の方法及び材料は、本発明の実施又は試験において使用することができるが、好ましい方法及び材料を以下に記載する。
「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。また「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
「C1−6アルキルスルホニルオキシ基」、「C1−6ハロアルキルスルホニルオキシ基」及び「C6−10アリールスルホニルオキシ基」は、それぞれ前記「C1−6アルキル基」、「C1−6ハロアルキル基」及び「C6−10アリール基」が、スルホニルオキシ基に結合した基を意味する。
「ジC6−10アリールメチル基」とは、2つの前記「C6−10アリール基」がメチル基に結合した基を意味する。
また「アミノカルボニル基」は、本明細書において「カルバモイル基」と互換可能に使用され、例えば「モノC1−6アルキルカルバモイル基」及び「ジC1−6アルキルカルバモイル基」は、それぞれ上記「モノC1−6アルキルアミノカルボニル基」及び「ジC1−6アルキルアミノカルボニル基」と同義であり、「N−(C6−10アリール)カルバモイル基」、「N−(5−10員ヘテロアリール)カルバモイル基」、「N−(C6−10アリールスルホニル)カルバモイル基」及び「N−アラルキルカルバモイル基」は、それぞれ上記「C6−10アリールアミノカルボニル基」、「5−10員ヘテロアリールアミノカルボニル基」、「C6−10アリールスルホニルアミノカルボニル基」及び「アラルキルアミノカルボニル基」と同義である。
ここで、前記C1−6アルキル基等は、無置換であるか又はハロゲン原子及びシアノ基からなる群から選択される1つ以上の置換基により、置換されている。
「置換されたヒドロキシ(ジアルキルアミノ)ホスフィノ基」としては、例えば、シアノエトキシ(ジイソプロピルアミノ)ホスフィノ基等が挙げられる。
ここで、前記リボース及び2’−デオキシリボースは、無置換であるか又は、C1−6アルキル基、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、アミノ基、基本保護基で置換されたヒドロキシ基、基本保護基で置換されたアミノ基からなる群から選択される1つ以上の置換基で置換されている。また、前記C1−6アルキル基は、無置換であるか、ハロゲン原子、C1−6アルコキシカルボニル基、モノC1−6アルキルアミノカルボニル基及びジC1−6アルキルアミノカルボニル基等から独立して選択される1つ以上の置換基で置換されている。前記C1−6アルコキシカルボニル基、モノC1−6アルキルアミノカルボニル基及びジC1−6アルキルアミノカルボニル基等は、無置換であるか又は、モノC1−6アルキルアミノ基、ジC1−6アルキルアミノ基、C6−10アリール基、5−10員ヘテロアリール基又は3−11員含窒素非芳香族ヘテロ環基より置換されている。また、リボースの2’位ヒドロキシ基は、無置換であるか又は基本保護基で置換されている。前記基本保護基で置換されたアミノ基の基本保護基としては、後述する核酸塩基における「アミノ基の基本保護基」と同様の基が挙げられる。
2’位と4’位が架橋したリボースとは、ヌクレオシドの2’位と4’位とが架橋基を介して架橋されている限り限定されないが、例えば、2’位と4’位とが、C2−6アルキレン基[該アルキレン基は無置換であるか、又はC1−6アルキル基で置換されている。また、該アルキレン基の1若しくは2つのメチレン基は、置き換えられていないか、又は−O−、−NR11−(R11は水素原子又はC1−6アルキル基を示す)、−S−、−CO−、−CS−、−COO−、−OCONR12−(R12は水素原子又はC1−6アルキル基を示す)、−CONR13−(R13は水素原子又はC1−6アルキル基を示す)及び−CSNR14−(R14は水素原子又はC1−6アルキル基を示す)から選ばれる基で置き換えられている]で架橋されたリボースが挙げられる。具体例としては、下記式の化合物が挙げられる。
前記アミノカルボニル型保護基のC6−10アリールは、好ましくは、フェニル、2−ニトロフェニル、2−トリフルオロメチルフェニル、3−トリフルオロメチルフェニル、4−トリフルオロメチルフェニル、2−クロロフェニル、2−フルオロフェニル、2−メチルフェニル、2−シアノフェニル、2−トリフルオロメトキシフェニル、2−クロロ−6−トリフルオロメチルフェニル、2−クロロ−4−トリフルオロメチルフェニル、2,6−ジクロロフェニル、2,6−ジフルオロフェニル、2,6−ジメチルフェニル、ペンタフルオロフェニル、2−メトキシフェニル、2,3−ジメトキシフェニル、2,4−ジメトキシフェニル、2,5−ジメトキシフェニル、2,6−ジメトキシフェニル、3,4,5−トリメトキシフェニル、2,3,4−トリメトキシフェニル、2,4,5−トリメトキシフェニル、2,4,6−トリメトキシフェニルである。
前記モノC1−6アルキルアミノカルボニル基は、好ましくは、エチルアミノカルボニル基である。
前記アラルキルアミノカルボニル基は、好ましくは、ベンジルアミノカルボニル基等を挙げることができる。
前記核酸塩基における「スルファニル基の基本保護基」としては、「ヒドロキシ基の基本保護基」と同様の保護基に加えて、ジスルフィド結合を形成する保護基を挙げることができる。
本明細書中「伸長反応サイクル」は、擬似固相保護基を有するヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドの3’−ヒドロキシ基又は5’−ヒドロキシ基を、反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基を有するヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドと反応させるか、又は、擬似固相保護基を有するヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドの3’−ヒドロキシ基又は5’−ヒドロキシ基を、反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基へ変換した後に、該3’位又は5’位の反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基を、ヒドロキシ基を有するヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドと反応させ、擬似固相保護基を有するヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドと、反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基又はヒドロキシ基を有するヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドとの結合体を得る反応サイクルを意味する。
伸長反応サイクルは、ある実施態様においては、擬似固相保護基を少なくとも1つ有し、3’位又は5’位に一時保護基で置換されたヒドロキシ基を有するヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドの一時保護基を除去してヒドロキシ基を生成する反応を含む工程と、生成したヒドロキシ基を、反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基へ変換する工程と、生成した反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基を、ヒドロキシ基を有するヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドと反応させ、これらが亜リン酸ジエステル結合又は亜リン酸トリエステル結合等を介して結合したオリゴヌクレオチドを得る工程と、を含む。
本発明に使用される擬似固相保護基とは、該保護基を反応基質が有することにより、反応基質及び反応生成物が低極性溶媒に可溶化し、液相中の反応が可能であると共に、一定以上の極性溶媒の添加により反応生成物又は反応基質が沈殿し、固液分離が可能となる保護基である。擬似固相保護基を有する反応基質を使用することにより、反応性と後処理の簡便性とを両立することができる。
R1は、それぞれ独立して、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基又はC2−40アルキニル基であるか、又は
式 −L7−O−R4
(式中、L7は、C1−40アルキレン基、C2−40アルケニレン基又はC2−40アルキニレン基であり、R4は、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基又はC2−40アルキニル基である)で表される基であり、
少なくとも1つのR1の炭素数は10以上であり、sは、1から5の整数であり、
L1及びL3は、それぞれ独立して、単結合、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L2及びL4は、それぞれ独立して、単結合、−COO−、−CON(R2)−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−OCO−、−N(R2)CO−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−C(O)−又は−O−であり、
L5及びL6は、それぞれ独立して、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基であり、
mは、0又は1である。
R1は、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基又はC2−40アルキニル基であり、少なくとも1つのR1の炭素数は10以上であり、sは、1から5の整数であり、
L1は、単結合、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L2は、単結合、−COO−、−CON(R2)−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−OCO−、−N(R2)CO−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−C(O)−又は−O−であり、
L3は、単結合、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L4は、単結合、−COO−、−CON(R2)−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−OCO−、−N(R2)CO−(式中R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)、−C(O)−又は−O−であり、
L5は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基であり、
L6は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基であり、
mは、0又は1である。
ここで、L2が、−COO−又は−O−であり、L4が、−OCO−又は−O−であるとき、L3は、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であることが好ましい。また、L1が、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、L2が、単結合であるとき、L3は、単結合であることが好ましい。
R1は、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基又はC2−40アルキニル基であるか、又は式 −L7−O−R4(式中、L7は、C1−40アルキレン基、C2−40アルケニレン基又はC2−40アルキニレン基であり、R4は、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基又はC2−40アルキニル基である)で表される基であり、少なくとも1つのR1の炭素数は10以上であり、sは、1から5の整数であり、
L11は、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L12は、単結合、−O−又は−N(R2)−(式中、R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)であり、
L13は、単結合、−C(O)−又はC1−6アルキレン基であり、
L12が、単結合のとき、L13は、単結合、又は−C(O)−である。
式(II)中、*は、前記擬似固相保護基が保護する基との結合位置を示し、
R1は、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基又はC2−40アルキニル基であり、少なくとも1つのR1の炭素数は10以上であり、sは、1から5の整数であり、
L11は、C1−6アルキレン基であり、
L12は、−O−又は−N(R2)−(式中、R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)であり、
L13は、単結合、−C(O)−又はC1−6アルキレン基である。
式中、*は、前記擬似固相保護基が保護する基との結合位置を示し、
Ar1は、下記式(VII)
(式中、*は、Ar1が結合する炭素原子を示し、
R1は、それぞれ独立して、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基、C2−40アルキニル基、又は、
式 −L7−O−R4
(式中、L7は、C1−40アルキレン基、C2−40アルケニレン基又はC2−40アルキニレン基であり、R4は、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基又はC2−40アルキニル基である)で表される基であり、少なくとも1つのR1の炭素数は10以上であり、sは、1から5の整数である)で表される基であり、
Ar2及びAr3は、それぞれ独立して、前記式(VII)で表される基又は下記式(VIII)
(式中、*は、Ar2及びAr3が結合する炭素原子を示し、
R10は、置換基群Aから選択される置換基であり、
置換基群Aは、ハロゲン原子、C1−6アルキル基、C2−6アルケニル基、C2−6アルキニル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6ハロアルケニル基、C1−6アルコキシ基、C1−6ハロアルコキシ基、モノC1−6アルキルアミノ基、ジC1−6アルキルアミノ基、C1−6アルキルカルボニル基、C1−6ハロアルキルカルボニル基、C1−6ハロアルコキシカルボニル基、C1−6アルコキシカルボニル基、モノC1−6アルキルアミノカルボニル基、ジC1−6アルキルアミノカルボニル基、C1−6アルコキシC1−6アルキル基、C1−6アルキルスルホニル基及びC1−6ハロアルキルスルホニル基により構成される置換基群を意味し、
tは、0から5の整数であり、tが2から5のとき、R10は、同一でも異なっていてもよい)で表される基である。
3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシスクシニル基、
(3−{3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンジルオキシカルボニル}プロパノイル基)、
3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンゾイル基、
4−オキソ−4−(2,4,6−トリス(オクタデシルオキシ)フェニル)ブチリル基、
2−(3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンズアミド)エトキシスクシニル基(3−[2−{3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンズアミド}エトキシカルボニル]プロパノイル基)、
2−(N−メチル−3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンズアミド)エトキシスクシニル基(3−[2−{N−メチル−3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンズアミド}エトキシカルボニル]プロパノイル基)、
(N−メチル−3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンズアミド)アセチル基、
((3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンゾイル)オキシ)メチル基、
2−(N−メチル−3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンズアミド)エトキシスクシニルオキシメチル基({(3−[2−{N−メチル−3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンズアミド}エトキシカルボニル]プロパノイル)オキシ}メチル基)、
5−(3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)ベンゾイルオキシ)−4−オキソ−ペンタノイル基、
5−(2,4,6−トリス(オクタデシルオキシ)ベンゾイルオキシ)−4−オキソ−ペンタノイル基、
4−オキソ−6−(3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)フェニル)ヘキサノイル基、
(E)−4−オキソ−6−(3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)フェニル)−5−ヘキセノイル基、
ジフェニル(3,4,5−トリス(オクタデシルオキシ)フェニル)メチル基、
ジフェニル(3,4−ジ(ドコシルオキシ)フェニル)メチル基、
ジフェニル(3,5−ジ(ドコシルオキシ)フェニル)メチル基、
ビス(4−(ドコシルオキシ)フェニル)フェニルメチル基、
及び、(4−((12−(オクタデシルオキシ)ドデシル)オキシ)フェニル)ジフェニルメチル基
などが挙げられる。
擬似固相保護基の具体例としては、特開2010−275254号、国際公開第2012/157723号、国際公開第2014−077292号、オーガニック レターズ(Organic Letters)、2016年、18巻、800−803頁等に開示された基も挙げられる。
本発明に使用される一時保護基とは、ヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドの5’位ヒドロキシ基若しくは3’位ヒドロキシ基を保護する保護基であって、前記「伸長反応サイクル」において脱保護される保護基であり、かつ前記「擬似固相保護基」が有する機能を有さない保護基である。脱保護された5’位ヒドロキシ基若しくは3’位ヒドロキシ基は、伸長反応サイクルにおいて、別のヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドの反応性リン含有基との結合に利用されるか、又は反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基へ変換された後、別のヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドのヒドロキシ基との結合に利用される。一時保護基は、例えば、以下の文献に記載されるような保護基が挙げられる。
Protective Groups in Organic Synthesis, Greene T. W. and Wuts P.G.M., published by Wiley Interscience, 1999及びProtecting Groups, Kocienski P. J., 1994, Georg Thieme Verlag。
本発明に使用される基本保護基とは、核酸塩基中のアミノ基、カルボニル基、ヒドロキシ基若しくはスルファニル基、又は2’位ヒドロキシ基若しくはアミノ基、3’位ヒドロキシ基若しくは5’位ヒドロキシ基、又はリン酸ジエステル結合、チオリン酸ジエステル結合若しくは亜リン酸ジエステル結合のヒドロキシ基、又はチオリン酸ジエステル結合のスルファニル基を保護する保護基であり、前記「伸長反応サイクル」においては脱保護されず、かつ前記「擬似固相保護基」が有する機能を有さない一般的な保護基である。基本保護基は、例えば、以下の文献に記載される保護基が挙げられる。
Protective Groups in Organic Synthesis, Greene T. W. and Wuts P.G.M., published by Wiley Interscience, 1999及びProtecting Groups, Kocienski P. J., 1994, Georg Thieme Verlag。
「基本保護基で置換された亜リン酸ジエステル結合」は、亜リン酸ジエステル結合がヒドロキシ基を有するとき、当該ヒドロキシ基が基本保護基で置換されていることを意味し、「亜リン酸トリエステル結合」に包含される。
「基本保護基で置換されたチオリン酸ジエステル結合」は、チオリン酸ジエステル結合がヒドロキシ基又はスルファニル基を有するとき、当該ヒドロキシ基又はスルファニル基が基本保護基で置換されていることを意味し、それぞれ「チオリン酸トリエステル結合」、「チオリン酸−O,O,S−トリエステル結合」に包含される。
次に、本発明にかかるオリゴヌクレオチドの製造方法(以下、「本発明の製造方法」ともいう。)について説明する。具体的には、擬似固相保護基で保護されたヌクレオシド又はオリゴヌクレオチド(以下、「n個重合オリゴヌクレオチド」ともいう)から、ヌクレオシド又はオリゴヌクレオチド(以下、「p個重合オリゴヌクレオチド」ともいう)で伸長され、擬似固相保護基で保護されたオリゴヌクレオチド(以下、「n+p個重合オリゴヌクレオチド」ともいう)を製造する方法について説明する。なお、n個重合オリゴヌクレオチドとは、n個のヌクレオシドがリン含有基を介して結合したオリゴヌクレオチドを意味し、n=1の場合、n個重合オリゴヌクレオチドはヌクレオシドと解され、p個重合オリゴヌクレオチドについても同様である。
p個重合オリゴヌクレオチドについても同様である。
方法Aでは、前記擬似固相保護基を有するヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドの5’位又は3’位が反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基であり、前記擬似固相保護基を有するヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドは、3’位又は5’位がヒドロキシ基であるヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドと結合する。
方法Bでは、前記擬似固相保護基を有するヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドの5’位又は3’位がヒドロキシ基であり、前記擬似固相保護基を有するヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドは、3’位又は5’位が反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基であるヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドと結合する。
またオリゴヌクレオチドの製造方法は、前記カップリング工程を含む伸長反応サイクルを少なくとも1つ含む。
方法Bは、好ましくは以下の工程a、工程c及び工程dを伸長反応サイクルに含む。その順番は、工程a、工程c、工程dの順に行うか、工程a、工程d、工程cの順に行う。好ましい順は、工程a、工程c、工程dの順である。
工程aは、伸長末端ではないヒドロキシ基、核酸塩基部及び2’位の中の少なくとも1つに擬似固相保護基を有し、かつ伸長末端のヒドロキシ基が一時保護基で保護されたヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドの一時保護基を除去してヒドロキシ基とすることを含む脱一時保護基工程である。
工程bは、一時保護基が除去されたヒドロキシ基を反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基へ変換することを含む反応性リン化工程である。「反応性リン化」は、「反応性リン含有基化」とも言うことができる。
以下、ホスホロアミダイト法の場合の工程bを、工程b2とする。工程b2では、前記反応性リン含有基は、置換されたヒドロキシ(ジアルキルアミノ)ホスフィノ基であり、反応性リン化工程は、アミダイト化工程という。
工程cは、工程aで一時保護基が除去されたヌクレオシド又はオリゴヌクレオチド、又は工程bで反応性リン化されたヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドに対して、ヒドロキシ基又は反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基を有するヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドを添加して、そのヒドロキシ基を介して亜リン酸ジエステル結合又は亜リン酸トリエステル結合により縮合させることを含むカップリング工程である。
方法Aでは、工程cにおいて、工程bで反応性リン化されたヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドが用いられ、ヒドロキシ基を有するヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドが添加される。
方法Bでは、工程cにおいて、工程aで一時保護基が除去されたヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドが用いられ、反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基を有するヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドが添加される。
以下、ホスホロアミダイト法の場合の工程cを、工程c2とする。工程c2では、前記反応性リン含有基は、置換されたヒドロキシ(ジアルキルアミノ)ホスフィノ基であり、亜リン酸トリエステル結合が形成される。
工程dは、形成された亜リン酸ジエステル結合又は亜リン酸トリエステル結合を、変換することを含む、変換工程である。
以下、ホスホロアミダイト法の場合の工程dを、工程d2とする。工程d2は、前記工程c2で形成された亜リン酸トリエステル結合を、リン酸トリエステル結合又はチオリン酸トリエステル結合等へと変換することを含む、亜リン酸トリエステル結合の変換工程である。
前記リン酸トリエステル結合は、リン酸ジエステル結合の1つのヒドロキシ基の水素原子が基本保護基等の置換基によって置き換えられた結合であり、例えば、C1−40アルキル基、C3−6シクロアルキル基、C6−10アリール基、5−10員ヘテロアリール基、アラルキル基又はヘテロアラルキル基等によって置き換えられた結合が挙げられる。
前記亜リン酸トリエステル結合は、亜リン酸ジエステル結合の1つのヒドロキシ基の水素原子が基本保護基等の置換基によって置き換えられた結合であり、例えば、C1−40アルキル基、C3−6シクロアルキル基、C6−10アリール基、5−10員ヘテロアリール基、アラルキル基又はヘテロアラルキル基等によって置き換えられた結合が挙げられる。
チオリン酸トリエステル結合は、チオリン酸ジエステル結合の1つのヒドロキシ基の水素原子が基本保護基等の置換基によって置き換えられた結合であり、C1−40アルキル基、C3−6シクロアルキル基、C6−10アリール基、5−10員ヘテロアリール基、アラルキル基又はヘテロアラルキル基等によって置き換えられた結合である。
チオリン酸−O,O,S−トリエステル結合は、チオリン酸ジエステル結合の1つのスルファニル基の水素原子が基本保護基等の置換基によって置き換えられた結合であり、C1−40アルキル基、C3−6シクロアルキル基、C6−10アリール基、5−10員ヘテロアリール基、アラルキル基又はヘテロアラルキル基等によって置き換えられた結合である。
ここで、前記リン酸トリエステル結合、前記亜リン酸トリエステル結合、チオリン酸トリエステル結合及びチオリン酸−O,O,S−トリエステル結合における前記C1−40アルキル基は、無置換であるか又は、ハロゲン原子、シアノ基等によって置換されている。前記C3−6シクロアルキル基、前記C6−10アリール基、前記5−10員ヘテロアリール基、前記アラルキル基及び前記ヘテロアラルキル基は、無置換であるか又は、C1−6アルキル基、ハロゲン原子、シアノ基等によって置換されている。
(工程e)
工程eは、工程aから工程dのいずれかで得られた反応混合物と極性溶媒とを混合して、擬似固相保護基を有するヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドを沈殿させて、固液分離により取得する分離工程である。
方法AのH−ホスホネート法の場合、工程a、工程b1、工程c1及び工程d1のいずれかで得られた反応混合物と極性溶媒とを混合する。
方法Aのホスホロアミダイト法の場合、工程a、工程b2、工程c2及び工程d2のいずれかで得られた反応混合物と極性溶媒とを混合する。
方法BのH−ホスホネート法の場合、工程a、工程c1及び工程d1のいずれかで得られた反応混合物と極性溶媒とを混合する。
方法Bのホスホロアミダイト法の場合、工程a、工程c2及び工程d2のいずれかで得られた反応混合物と極性溶媒とを混合する。
なお、工程eは、擬似固相保護基を用いない通常の液相合成法にも、固相合成法にも存在し得ない、擬似固相保護基を用いる液相合成法に特有の工程である。
伸長反応サイクルには、1から4回の工程eが含まれることが好ましい。工程eは、伸長反応サイクル中に、工程aの後、工程bの後及び工程dの後の少なくとも1つに、それぞれ1回含まれることが、副生物発生を厳格に管理・制御でき、高純度のオリゴヌクレオチドに導けるという観点で好ましい。工程eは、伸長反応サイクル中に、工程bの後に1回含まれるか、工程dの後に1回含まれるか、又は工程b及び工程dの後にそれぞれ1回含まれることが、より好ましい。
その他の態様として、工程eは、伸長反応サイクル中に、工程aの後に1回含まれるか、工程bの後に1回含まれるか、又は工程a及び工程bの後にそれぞれ1回含まれることが、より好ましく、工程aの後に1回含まれることがさらに好ましく、工程a及び工程bの後にそれぞれ1回含まれることが、さらにより好ましい。
原料の当量管理と反応を制御することによって副生物の発生量を制御できる状況であれば、工程aから工程dを基本単位として実施し、工程eを含有させることが好ましい。
伸長反応サイクルには、1から3回の工程eが含まれることが好ましい。工程eは、伸長反応サイクル中に、工程aの後、工程cの後及び工程dの後の少なくとも1つに、それぞれ1回含まれることが、副生物発生を厳格に管理・制御でき、高純度のオリゴヌクレオチドに導けるという観点で好ましい。工程eは、伸長反応サイクル中に、工程aの後に1回含まれるか、工程dの後に1回含まれるか、又は工程a及び工程dの後にそれぞれ1回含まれることが、より好ましい。工程eは、伸長反応サイクル中に、工程aの後に1回含まれるか、又は工程a及び工程dの後にそれぞれ1回含まれることが、さらに好ましい。
原料の当量管理と反応を制御することによって副生物の発生量を制御できる状況であれば、工程a、工程c、工程dを基本単位として繰り返した後、工程eを行うことが好ましい。
(工程f)
工程fは、工程aから工程eで得られたオリゴヌクレオチドの基本保護基、一時保護基及び擬似固相保護基を除去する全脱保護工程である。
(工程g)
工程gは、工程aから工程eで得られたオリゴヌクレオチドの基本保護基及び/又は一時保護基を維持しながら、選択的に擬似固相保護基を除去する、脱擬似固相保護基工程である。
2’位、3’位及び核酸塩基部からなる群から選ばれる少なくとも1か所に擬似固相保護基を有し、3’位に基本保護基又は擬似固相保護基で置換されたヒドロキシ基を有し、5’位に一時保護基で置換されたヒドロキシ基を有する第一ヌクレオシド又は第一オリゴヌクレオチドの一時保護基を除去して5’−ヒドロキシ基を生成することを含む第一工程(工程a)と、
生成した5’−ヒドロキシ基を、反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基へ変換することを含む第二工程(工程b)と、
生成した、反応性リン含有基で置換された5’−ヒドロキシ基と、3’位にヒドロキシ基を有し、5’位に一時保護基で置換されたヒドロキシ基を有する第二ヌクレオシド又は第二オリゴヌクレオチドの3’−ヒドロキシ基とから、亜リン酸ジエステル結合又は亜リン酸トリエステル結合を形成して、第一ヌクレオシド又は第一オリゴヌクレオチドと、第二ヌクレオシド又は第二オリゴヌクレオチドとの結合体を得る第三工程(工程c)と、
結合体の亜リン酸ジエステル結合を、リン酸ジエステル結合、チオリン酸ジエステル結合、ボラノリン酸ジエステル結合、アミノリン酸ジエステル結合、リン酸トリエステル結合、又はチオリン酸−O,O,S−トリエステル結合に変換すること、あるいは
結合体の亜リン酸トリエステル結合を、リン酸トリエステル結合、又はチオリン酸トリエステル結合に変換することを含む第四工程(工程d)と、を含むオリゴヌクレオチドの製造方法である。
2’位、5’位及び核酸塩基部からなる群から選ばれる少なくとも1か所に擬似固相保護基を有し、5’位に基本保護基又は擬似固相保護基で置換されたヒドロキシ基を有し、3’位に一時保護基で置換されたヒドロキシ基を有する第三ヌクレオシド又は第三オリゴヌクレオチドの一時保護基を除去して3’−ヒドロキシ基を生成することを含む第七工程(工程a)と、
生成した3’−ヒドロキシ基を、反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基へ変換することを含む第八工程(工程b)と、
生成した、反応性リン含有基で置換された3’−ヒドロキシ基と、5’位にヒドロキシ基を有し、3’位に一時保護基で置換されたヒドロキシ基を有する第四ヌクレオシド又は第四オリゴヌクレオチドの5’−ヒドロキシ基とから、亜リン酸ジエステル結合又は亜リン酸トリエステル結合を形成して、第三ヌクレオシド又は第三オリゴヌクレオチドと、第四ヌクレオシド又は第四オリゴヌクレオチドとの結合体を得る第九工程(工程c)と、
結合体の亜リン酸ジエステル結合を、リン酸ジエステル結合、チオリン酸ジエステル結合、ボラノリン酸ジエステル結合、アミノリン酸ジエステル結合、リン酸トリエステル結合、又はチオリン酸−O,O,S−トリエステル結合に変換すること、あるいは
結合体の亜リン酸トリエステル結合を、リン酸トリエステル結合、又はチオリン酸トリエステル結合に変換することを含む第十工程(工程d)と、を含むオリゴヌクレオチドの製造方法である。
2’位、3’位及び核酸塩基部からなる群から選ばれる少なくとも1か所に擬似固相保護基を有し、3’位に基本保護基又は擬似固相保護基で置換されたヒドロキシ基を有し、5’位に一時保護基で置換されたヒドロキシ基を有する第五ヌクレオシド又は第五オリゴヌクレオチドの一時保護基を除去して5’−ヒドロキシ基を生成することを含む第十三工程(工程a)と、
生成した5’−ヒドロキシ基と、3’位に反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基を有し、5’位に一時保護基で置換されたヒドロキシ基を有する第六ヌクレオシド又は第六オリゴヌクレオチドの反応性リン含有基で置換された3’−ヒドロキシ基とから、亜リン酸ジエステル結合又は亜リン酸トリエステル結合を形成して、第五ヌクレオシド又は第五オリゴヌクレオチドと、第六ヌクレオシド又は第六オリゴヌクレオチドとの結合体を得る第十四工程(工程c)と、
結合体の亜リン酸ジエステル結合を、リン酸ジエステル結合、チオリン酸ジエステル結合、ボラノリン酸ジエステル結合、アミノリン酸ジエステル結合、リン酸トリエステル結合、又はチオリン酸−O,O,S−トリエステル結合に変換すること、あるいは
結合体の亜リン酸トリエステル結合を、リン酸トリエステル結合又はチオリン酸トリエステル結合に変換することを含む第十五工程(工程d)と、を含むオリゴヌクレオチドの製造方法である。
2’位、5’位及び核酸塩基部からなる群から選ばれる少なくとも1か所に擬似固相保護基を有し、5’位に基本保護基又は擬似固相保護基で置換されたヒドロキシ基を有し、3’位に一時保護基で置換されたヒドロキシ基を有する第七ヌクレオシド又は第七オリゴヌクレオチドの一時保護基を除去して3’−ヒドロキシ基を生成することを含む第十八工程(工程a)と、
生成した3’−ヒドロキシ基と、5’位にに反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基を有し、3’位に一時保護基で置換されたヒドロキシ基を有する第八ヌクレオシド又は第八オリゴヌクレオチドの反応性リン含有基で置換された5’−ヒドロキシ基とから、亜リン酸ジエステル結合又は亜リン酸トリエステル結合を形成して、第七ヌクレオシド又は第七オリゴヌクレオチドと、第八ヌクレオシド又は第八オリゴヌクレオチドとの結合体を得る第十九工程(工程c)と、
結合体の亜リン酸ジエステル結合を、リン酸ジエステル結合、チオリン酸ジエステル結合、ボラノリン酸ジエステル結合、アミノリン酸ジエステル結合、リン酸トリエステル結合、又はチオリン酸−O,O,S−トリエステル結合に変換すること、あるいは
結合体の亜リン酸トリエステル結合を、リン酸トリエステル結合、又はチオリン酸トリエステル結合に変換することを含む第二十工程(工程d)と、を含むオリゴヌクレオチドの製造方法である。
まず、方法A(5’)、方法A(3’)、方法B(5’)又は方法B(3’)のそれぞれの場合の工程aをスキーム1又は2に示す。
方法A(5’)及び方法B(5’)における工程aは、低極性溶媒中において、5’位ヒドロキシ基がフッ素試薬、酸又は塩基で除去可能な一時保護基Rで保護されたn個重合オリゴヌクレオチド(ia)(式中、nは、1以上の任意の整数を示し、n=1の場合は、ヌクレオシドを示す。)の一時保護基Rを、フッ素試薬、酸又は塩基の添加により除去する工程(脱一時保護基工程)である(スキーム1)。
ここで、スキーム1中化合物(ia)又は(iia)が、2以上の核酸塩基部を有する場合、それぞれの核酸塩基部は同一であっても異なっていてもよく、(ia)又は(iia)が、2以上の擬似固相保護基を有する場合、それぞれの擬似固相保護基は同一であっても異なっていてもよく、(ia)又は(iia)が、2以上の基本保護基を有する場合、それぞれの基本保護基は同一であっても異なっていてもよく、n個重合オリゴヌクレオチドが、2以上の4’位炭素原子に架橋する有機基を有する場合、それぞれの4’位炭素原子に架橋する有機基は同一であっても異なっていてもよい。
擬似固相保護基は、BaseZ及びZの中の少なくとも1つに含まれることが好ましく、Zの中に含まれることがより好ましい。
Zは、好ましくは、基本保護基又は擬似固相保護基であり、より好ましくは擬似固相保護基である。
式中、*は、擬似固相保護基が保護する基との結合位置を示し、R1は、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基又はC2−40アルキニル基であり、sは、1から5の整数であり、
L1は、C1−6アルキレン基又はC2−6アルケニレン基であり、
L3は、C1−6アルキレン基又はC2−6アルケニレン基であり、
R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基又はC2−6アルケニル基である。
擬似固相保護基のさらに好ましい形態及び他の態様は、XZ又はZに含まれる擬似固相保護基と同様である。
式(III)又は(III−2)において、sは、好ましくは、2から4の整数であり、より好ましくは3である。sが2から5であるとき、それぞれのR1は、同一であっても異なっていてもよい。
式(III)又は(III−2)において、L3は、好ましくはC1−6アルキレン基であり、特に好ましくはメチレン基又はエチレン基である。
式(III)又は(III−2)において、R2は、好ましくは水素原子又はC1−6アルキル基であり、より好ましくは水素原子又はメチル基であり、特に好ましくはメチル基である。
前記式(II)において、sは、好ましくは、2から4の整数であり、特に好ましくは、3である。sが2から5であるとき、それぞれのR1は、同一であっても異なっていてもよい。
前記式(II)において、L12は、好ましくは−O−である。
前記式(II)において、L13は、好ましくは−C(O)−である。
その他の態様として、R1は、好ましくは、−L7−O−R4
で表される基であり、中でもR4は、好ましくは、C10−30アルキル基又はC10−30アルケニル基であり、より好ましくはC10−30アルキル基であり、さらに好ましくはC15−22アルキル基であり、特に好ましくは、オクタデシル基又はドコシル基であり、L7は、好ましくは、C10−20アルキレン基であり、特に好ましくは、ドデカン−1、12−ジイル基である。
前記式(VI)において、sは、好ましくは、1から3の整数である。
前記式(VI)において、tは、好ましくは0である。
前記式(VI)において、Ar3は、好ましくは、フェニル基である。
例えば、Xz又はZにおける擬似固相保護基がレブリニル型擬似固相保護基である場合、一時保護基は、tert−ブチルジメチルシリル基、トリエチルシリル基等のシリル基、又はトリチル基、ジメトキシトリチル基、モノメトキシトリチル基等のトリアリールメチル基が好ましい。
Xz又はZにおける擬似固相保護基がトリチル型擬似固相保護基である場合、一時保護基は、tert−ブチルジメチルシリル基、トリエチルシリル基等のシリル基、又はレブリニル基又は3−ベンゾイルプロピオニル基等が好ましい。
その他の態様として、Xzはより好ましくは、C2−6アルキレン基(該アルキレン基は無置換であるか、又はメチル基で置換されている。ここで、該アルキレン基の1若しくは2つのメチレン基は、置き換えられていないか、又は−O−、−NR11−(R11は水素原子又はメチル基を示す)、−CO−、−CS−、−COO−、−OCONR12−(R12は水素原子又はメチル基を示す)、−CONR13−(R13は水素原子又はメチル基を示す)及び−CSNR14−(R14は水素原子又はメチル基を示す)から選ばれる基で置き換えられている)で表される4’位炭素原子に架橋する有機基である。Xzはより好ましくは、エチレン基(該エチレン基の1若しくは2つのメチレン基は、置き換えられていないか、又は−O−、−CONR13−(R13は水素原子又はメチル基を示す)及び−CSNR14−(R14は水素原子又はメチル基を示す)から選ばれる基で置き換えられている)で表される4’位炭素原子に架橋する有機基である。
中でもtert−ブチルジメチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、tert−ブチルジフェニルシリル基、レブリニル基又は3−ベンゾイルプロピオニル基が好ましく、レブリニル基又は3−ベンゾイルプロピオニル基がより好ましく、レブリニル基が更に好ましい。
一時保護基がレブリニル基又は3−ベンゾイルプロピオニル基等である場合、Xz又はZにおける基本保護基は、tert−ブチルジメチルシリル基、トリエチルシリル基等のシリル基、又はトリチル基、ジメトキシトリチル基、モノメトキシトリチル基等のトリアリールメチル基であることが好ましい。特に方法Bの場合に、レブリニル基又は3−ベンゾイルプロピオニル基等が一時保護基として用いられる。
Yを含めたリン含有基は、例えば以下の構造(又は、以下の構造に塩を付した構造)を有する。
Vが硫黄原子であるとき、該硫黄原子が結合するリン原子に結合するYは、それぞれ独立して、基本保護基で置換されたヒドロキシ基であり、より好ましくは、2−シアノエトキシ基である。
フッ素試薬としては、フッ化水素のピリジン塩、テトラブチルアンモニウムフルオリド、フッ化水素のトリエチルアミン塩、フッ化水素酸、フッ化アンモニウム、フッ化アンモニウムのフッ化水素付加体、フッ化カリウム又はフッ化カリウムのフッ化水素付加体が好ましく、中でも、フッ化水素のピリジン塩又はテトラブチルアンモニウムフルオリドがより好ましく、テトラブチルアンモニウムフルオリドが特に好ましい。
酸としては、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリクロロ酢酸、メタンスルホン酸、p−トルエンスルホン酸、塩酸、酢酸、硝酸アンモニウムセリウム、ホスホン酸又はリン酸が好ましく、中でも、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリクロロ酢酸、メタンスルホン酸、p−トルエンスルホン酸、塩酸、酢酸又は硝酸アンモニウムセリウムがより好ましく、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリクロロ酢酸、メタンスルホン酸、p−トルエンスルホン酸又は酢酸がさらに好ましく、酢酸が特に好ましい。その他の態様として、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸又はホスホン酸が特に好ましい。また、塩化水素(水溶液、1,4−ジオキサン溶液等)も好ましく、塩化水素−1,4−ジオキサン溶液が特に好ましい。
塩基としては、ヒドラジン誘導体(ヒドラジン一水和物、ヒドラジン酢酸塩、硫酸ヒドラジニウム、メチルヒドラジン、イソプロピルヒドラジン塩酸塩、tert−ブチルヒドラジン、アセトヒドラジド、メチルカルバゼート、フェニルヒドラジン、p−トルエンスルホニルヒドラジン、シクロペンチルヒドラジン塩酸塩、シクロヘキシルヒドラジン塩酸塩、ベンジルヒドラジン塩酸塩、2,2,2−トリフルオロエチルヒドラジン(70%水溶液)及び2−シアノエチルヒドラジン等)、ジアミン誘導体(エチレンジアミン等)、ヒドロキシルアミン誘導体(ヒドロキシルアミン塩酸塩等)、アミノアルコール誘導体(エタノールアミン、N−メチルエタノールアミン等)、及び無機塩基(炭酸カリウム等)等が挙げられる。前記ヒドラジン誘導体、ジアミン誘導体、ヒドロキシルアミン誘導体及びアミノアルコール誘導体は、例えば後述の式(V)中、式(V−1)又は式(V−2)で表すことができる。塩基としては、ヒドラジン誘導体が好ましく、ヒドラジン一水和物又はメチルヒドラジンがより好ましい。
これらフッ素試薬、酸及び塩基は、上記低極性溶媒で希釈して使用することができる。 また、フッ素試薬、酸及び塩基以外では、Chirazyme L−2、Chirazyme L−5等の酵素により脱保護することも可能である。
方法Bでは、工程aの後に、工程c又は工程dが実施される。工程c又は工程dの前に、必要に応じて分液処理、溶媒留去によって、工程c又は工程dで用いられる溶媒への置換、工程eを行いn個重合オリゴヌクレオチドの5’位ヒドロキシ基の脱保護体(iia)若しくは3’位ヒドロキシ基の脱保護体(iib)の単離等を行うことができる。
まず、方法A(5’)又は方法A(3’)のそれぞれの場合について、H−ホスホネート法の工程bである工程b1をスキーム3又は4に示す。
方法A(5’)における工程b1は、方法A(5’)における前記工程a若しくは後述の工程d1で得られたn個重合オリゴヌクレオチドの5’位ヒドロキシ基の脱保護体(iia)の5’位ヒドロキシ基をH−ホスホネート化させる工程(下記スキーム3)である。スキーム3中、各記号は、前記定義と同義である。
まず、方法A(5’)又は方法A(3’)のそれぞれの場合について、ホスホロアミダイト法の工程b(工程b2)をスキーム5又は6に示す。
方法A(5’)における工程b2は、方法A(5’)における前記工程a若しくは後述の工程d2で得られたn個重合オリゴヌクレオチドの5’位ヒドロキシ基の脱保護体(iia)の5’位ヒドロキシ基をホスホロアミダイト化合物と反応させて、ホスホロアミダイト化させる工程(下記スキーム5)である。スキーム5中、Prは、ジC1−6アルキルアミノ基であり、その他の記号は、前記定義と同義である。ここで、PrにおけるジC1−6アルキルアミノ基は、その2つのC1−6アルキル基が、それらが結合する窒素原子と一緒になって3−11員含窒素非芳香族ヘテロ環基を形成してもよい。
られる。中でも、ジクロロメタン、クロロホルム、1,2−ジクロロエタン、ベンゼン、トルエン、キシレン、メシチレン、ヘキサン、ペンタン、ヘプタン、ノナン、シクロヘキサン、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、テトラヒドロフラン、tert−ブチルメチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル、又は、これらの組合せが好ましく、ジクロロメタン、クロロホルム、テトラヒドロフランが更に好ましく、ジクロロメタンが特に好ましい。
まず、方法A(5’)、方法A(3’)、方法B(5’)及び方法B(3’)のそれぞれの場合の(工程c1)をスキーム7又は8に示す。
方法A(5’)における工程c1は、前記方法A(5’)における工程b1で得られたn個重合オリゴヌクレオチドの5’位ヒドロキシ基のH−ホスホネート体(iiia)と、5’位ヒドロキシ基が一時保護基Rにより保護され、かつ3’位ヒドロキシ基を持つp個重合オリゴヌクレオチド(iva)(式中、pは、1以上の任意の整数を示し、p=1の場合は、ヌクレオシドを示す。)と、を縮合させる工程である(スキーム7)。
なお、キャッピング反応とは、カップリング反応、酸化反応後に残存したヒドロキシ基を有する化合物のヒドロキシ基を、ヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドを伸長できない置換基に変換する反応である。
キャッピング反応は、後述する工程d1の後に実施してもよい。キャッピング反応は、工程c1又は工程d1の後に実施することが好ましい。
まず、方法A(5’)、方法A(3’)、方法B(5’)及び方法B(3’)のそれぞれの場合の(工程c2)をスキーム11又は12に示す。
方法A(5’)における工程c2は、前記方法A(5’)における工程b2で得られたn個重合オリゴヌクレオチドの5’位ヒドロキシ基のホスホロアミダイト体(viia)と、5’位ヒドロキシ基が一時保護基Rにより保護され、かつ3’位ヒドロキシ基を持つp個重合オリゴヌクレオチド(iva)(式中、pは、1以上の任意の整数を示し、p=1の場合は、ヌクレオシドを示す。)と、を縮合させる工程である(スキーム11)。
また、上記低極性溶媒に、アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル系溶媒;アセトン、2−ブタノン等のケトン系溶媒;N,N−ジメチルホルムアミド、N,N−ジメチルアセトアミド、N−メチルピロリドン等のアミド系溶媒;1,4−ジオキサン、テトラヒドロフラン等の極性エーテル系溶媒;ジメチルスルホキシド等のスルホキシド系溶媒を、5’位又は3’位ヒドロキシ基のホスホロアミダイト体(viia又はviib)、5’位又は3’位ヒドロキシ体(iia又はiib)が溶解し得る限り、適宜の割合で混合して用いてもよい。この場合、極性溶媒としては、アミド系溶媒、ニトリル系溶媒、及びこれらの組合せが好ましく、アセトニトリル、N,N−ジメチルホルムアミド、N−メチルピペリドン、及びこれらの組合せがより好ましく、アセトニトリルが特に好ましい。
極性溶媒は、3’位又は5’位ヒドロキシ基がホスホロアミダイト化され、かつ5’位又は3’位ヒドロキシ基が一時保護基Rにより置換されたp個重合オリゴヌクレオチド(xia又はxib)、又は3’位又は5’位がヒドロキシ基であり、かつ5’位又は3’位ヒドロキシ基が一時保護基Rにより置換されたp個重合オリゴヌクレオチド(iva又はivb)及び縮合剤等の溶液として添加してもよい。
工程d1は、工程c1で得られたn+p個重合オリゴヌクレオチド(va又はvb)若しくは(ixa又はixb)、又は工程aで得られたn個重合オリゴヌクレオチドにリン原子を修飾する試薬を反応させることにより、該n+p個重合オリゴヌクレオチド(va又はvb)若しくは(ixa又はixb)又は、工程aで得られたn個重合オリゴヌクレオチドの亜リン酸ジエステル結合をリン酸ジエステル結合、チオリン酸ジエステル結合、アミノリン酸ジエステル結合、ボラノリン酸ジエステル結合、リン酸トリエステル結合又はチオリン酸−O,O,S−トリエステル結合へと変換する工程である。
工程d1で前記酸化剤を使用する場合、工程d1の反応溶媒は、前記希釈溶媒と同様である。
工程d1で前記硫化剤を使用する場合、工程d1の反応溶媒は、前記希釈溶媒と同様である。
キャッピング反応は、前述する工程c1の後に実施してもよい。
方法Aを用い、工程aの後に工程d1を行う際には、工程d1の後には、前記キャッピング反応を実施しない。
工程d2は、工程c2で得られたn+p個重合オリゴヌクレオチド(xa又はxb)若しくは(xiia又はxiib)、又は工程aで得られたn個重合オリゴヌクレオチドにリン原子を修飾する試薬を反応させることにより、該n+p個重合オリゴヌクレオチド(xa又はxb)若しくは(xiia又はxiib)、又は工程aで得られたn個重合オリゴヌクレオチドの亜リン酸トリエステル結合をリン酸トリエステル結合又はチオリン酸トリエステル結合へと変換する工程である。
工程d2で前記酸化剤を使用する場合、工程d2の反応溶媒は、前記希釈溶媒と同様である。
工程d2で前記硫化剤を使用する場合、工程d2の反応溶媒は、前記希釈溶媒と同様である。
方法Aを用い、工程aの後に工程d2を行う際には、工程d2の後には、前記キャッピング反応を実施しない。
工程eは、工程aから工程dのいずれかで得られた反応溶液と極性溶媒とを混合することによりオリゴヌクレオチドを沈殿させて、固液分離により取得する工程である。
オリゴヌクレオチドの製造方法においては、工程eの後に、基本保護基、一時保護基及び擬似固相保護基の種類と性質に応じて、脱保護を行い、オリゴヌクレオチドを単離することができる。脱保護の方法としては、例えば、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス(PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS)、第3版、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ(JOHN WILLY & SONS)出版(1999年)等に記載されている脱保護方法に従い、オリゴヌクレオチドの保護基を除去する工程を行うことができる。具体的には、擬似固相保護基、ならびに基本保護基であるベンゾイル基、イソブチリル基、フェノキシアセチル基、アセチル基、レブリニル基等、亜リン酸ジエステル結合、リン酸ジエステル結合又はチオリン酸ジエステル結合を保護している基本保護基である2−シアノエチル基等は、アンモニア水、アンモニア水/エタノール溶液、又はアンモニア水とメチルアミン水溶液の混合液で処理することにより、除去することができる。また、5’位又は3’位ヒドロキシ基の一時保護基は、工程aで使用されるフッ素試薬、酸又は塩基、又はそれらを適宜希釈した溶液で処理することにより除去することができる。また、ジャーナルオブザケミカルソサイエティー パーキントランザクション1、2002年、2619頁−2633頁に記載されている脱保護方法に従い、DBU[1,8−ジアザビシクロ[5.4.0]−7−ウンデセン]及びトリメチルシリルクロリドで処理して、リン酸ジエステル結合又はチオリン酸ジエステル結合を保護している2−シアノエチル基等を除去した後に、アンモニア水で擬似固相保護基、ならびに基本保護基であるベンゾイル基、イソブチリル基、フェノキシアセチル基、アセチル基、レブリニル基等を除去する方法を用いることもできる。また、無機塩基(炭酸カリウム等)で基本保護基であるベンゾイル基、イソブチリル基、フェノキシアセチル基、アセチル基、レブリニル基等を除去する方法を用いることもできる。
基本保護基で置換されたリン酸ジエステル結合は、例えば、ジャーナルオブザケミカルソサイエティー パーキントランザクション1、1999、1477頁−1486頁に記載されている方法((E)−2−ニトロベンズアルドキシム、ピリジン−2−アルドキシムなどのオキシム化合物及び、1,1,3,3−テトラメチルグアニジン、DBU等の塩基で処理する方法)で脱保護することにより、リン酸ジエステル結合へ変換することができる。2−シアノエチル基等、β脱離によって脱保護可能な基本保護基で置換されたチオリン酸ジエステル結合は、前記塩基性条件下での脱保護により、チオリン酸ジエステル結合へ変換できる。その他の基本保護基で置換されたチオリン酸ジエステル結合のうち、チオリン酸−O,O,S−トリエステル結合に包含される結合は、例えば、ジャーナルオブザケミカルソサイエティー パーキントランザクション1、1999、1477頁−1486頁に記載されている方法(前記オキシム化合物及び前記塩基で処理する方法等)で脱保護することにより、リン酸ジエステル結合へ変換できる。
保護基を有しないオリゴヌクレオチドは、酵素により容易に分解されやすいため、空気清浄度管理下でオリゴヌクレオチドを単離することが好ましい。
工程aから工程eのいずれかの後に、基本保護基、一時保護基及び擬似固相保護基の種類と性質に応じて、一時保護基及び/又は基本保護基を維持したまま、選択的に擬似固相保護基の脱保護を行うことが可能である。
(式中、*は、前記擬似固相保護基が保護する基との結合位置を示し、
R1は、それぞれ独立して、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基又はC2−40アルキニル基、又は
式 −L7−O−R4
(式中、L7は、C1−40アルキレン基、C2−40アルケニレン基又はC2−40アルキニレン基であり、R4は、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基又はC2−40アルキニル基である)で表される基であり、少なくとも1つのR1の炭素数は10以上であり、sは、1から5の整数であり、
L11は、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L12は、単結合、−O−又は−N(R2)−(式中、R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)であり、
L13は、単結合、−C(O)−又はC1−6アルキレン基であり、L12が単結合のとき、L13は、単結合又は−C(O)−である)で表される擬似固相保護基が挙げられる。
前記レブリニル型擬似固相保護基を有するオリゴヌクレオチドに含まれるリン酸ジエステル結合、亜リン酸トリエステル結合及びチオリン酸ジエステル結合の基本保護基は、好ましくは、2−シアノエチル基である。
前記レブリニル型擬似固相保護基を有するオリゴヌクレオチドの2’位の基本保護基は、好ましくは、tert−ブチルジメチルシリル基、メトキシエチル基又はメチル基であり、より好ましくは、メトキシエチル基又はメチル基であり、特に好ましくはメトキシエチル基である。
前記レブリニル型擬似固相保護基を有するオリゴヌクレオチドの核酸塩基部の基本保護基は、好ましくは、ピバロイル基、フェノキシアセチル基、4−イソプロピルフェノキシアセチル基、アセチル基、ベンゾイル基、イソブチリル基、ジメチルホルムアミジニル基、ジメチルアセトアミジニル基又は9−フルオレニルメチルオキシカルボニル基であり、より好ましくは、ベンゾイル基又はイソブチリル基である。
ここで、前記C6−10アリールアミノカルボニル基、5−10員ヘテロアリールアミノカルボニル基、C6−10アリールスルホニルアミノカルボニル基、及びアラルキルアミノカルボニル基は、無置換であるか、又はハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、C1−6アルキルスルホニル基、C1−6ハロアルキルスルホニル基、C1−6アルコキシ基、C1−6ハロアルコキシ基、C1−6アルキル基、C2−6アルケニル基、C1−6ハロアルキル基及びC2−6ハロアルケニル基からなる群から選択される少なくとも1つの置換基で置換されている。前記モノC1−6アルキルアミノカルボニル基は、無置換であるか、又はハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、C1−6アルキルスルホニル基、C1−6ハロアルキルスルホニル基、C1−6アルコキシ基及びC1−6ハロアルコキシ基からなる群から選択される少なくとも1つの置換基で置換されている。
アデニル基、シトシル基及び5−メチルシトシル基は、前記アミノカルボニル型保護基で置換されていることが好ましく、好ましいアミノカルボニル型保護基は、核酸塩基における「アミノ基の保護基」で前述した通りである。
R3は、それぞれ独立して、水素原子、C1−6アルキル基、シアノ基で置換されたC1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C1−6アルキルカルボニル基、C1−6ハロアルキルカルボニル基、C1−6アルキルスルホニル基、C1−6ハロアルキルスルホニル基、C1−6アルコキシカルボニル基、C1−6ハロアルコキシカルボニル基、C3−6シクロアルキル基、フェニル基、ベンゾイル基、フェニルスルホニル基、フェノキシカルボニル基、又はベンジル基(該フェニル基、ベンゾイル基、フェニルスルホニル基、フェノキシカルボニル基、及びベンジル基は、無置換であるか又は、ハロゲン原子、ニトロ基、C1−6アルキル基、C1−6アルキルカルボニル基、C1−6アルキルスルホニル基、C1−6アルコキシカルボニル基及びC1−6アルコキシ基からなる群から独立して選択される1つ以上の置換基によって置換されている)である。
ここで、ベンゼン環上が、前記置換基で置換されているとき、該置換基は、ベンゼン環が置換されていても、メチレン基が置換されていてもよい。
R3は、好ましくは、それぞれ独立して、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C1−6アルキルカルボニル基、C1−6ハロアルキルカルボニル基、C1−6アルキルスルホニル基、C1−6ハロアルキルスルホニル基、C1−6アルコキシカルボニル基、C1−6ハロアルコキシカルボニル基、フェニル基、ベンゾイル基、フェニルスルホニル基又はフェノキシカルボニル基(該フェニル基、ベンゾイル基、フェニルスルホニル基及びフェノキシカルボニル基は、無置換であるか又は、ハロゲン原子、ニトロ基、C1−6アルキル基、C1−6アルキルカルボニル基、C1−6アルキルスルホニル基、C1−6アルコキシカルボニル基及びC1−6アルコキシ基からなる群から独立して選択される1つ以上の置換基によって置換されている)である。
前記式(V)中、(V−1)で表される化合物のうち、L10がC2−6アルキレン基である化合物は、ジアミン誘導体に包含される。
前記式(V)中、(V−2)で表される化合物のうち、L10が単結合である化合物は、ヒドロキシルアミン誘導体に包含される。
前記式(V)中、(V−2)で表される化合物のうち、L10がC2−6アルキレン基である化合物は、アミノアルコール誘導体に包含される。
ヒドロキシルアミン誘導体としては、ヒドロキシルアミン塩酸塩、N−メチル−ヒドロキシルアミン塩酸塩等が挙げられる。
ジアミン誘導体としては、エチレンジアミン、1,2−ジアミノプロパン、1,3−ジアミノプロパン、2,2−ジメチルプロピレンジアミン、1,4−ジアミノブタン、1,5−ジアミノペンタン、1,6−ジアミノヘキサン等が挙げられる。
アミノアルコール誘導体としては、エタノールアミン、N−メチル−エタノールアミン等が挙げられる。
5’位及び3’位の一方が、ヒドロキシ基又は反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基であり、擬似固相保護基を有さない、p個重合オリゴヌクレオチドとをカップリングさせる工程を含み、
n及びpは、それぞれ独立して、2以上の整数であり、n+pは、11以上であり、
n個重合オリゴヌクレオチドの3’位及び5’位の一方が、反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基であるとき、p個重合オリゴヌクレオチドの5’位及び3’位の一方が、ヒドロキシ基であり、
n個重合オリゴヌクレオチドの3’位及び5’位の一方が、ヒドロキシ基であるとき、p個重合オリゴヌクレオチドの5’位及び3’位の一方が、反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基である、n+p個重合オリゴヌクレオチドの製造方法。
[4] n及びpは、それぞれ独立して、4以上の整数である、[1]から[3]のいずれか1つに記載の製造方法。
[8] 前記極性溶媒が炭素数1から6のアルコール溶媒又は炭素数1から6のニトリル溶媒である、[5]又は[7]に記載の製造方法。
[10] 前記n個重合オリゴヌクレオチドの5’位が、反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基であり、3’位が基本保護基で置換されたヒドロキシ基であり、
前記p個重合オリゴヌクレオチドの3’位が、ヒドロキシ基であり、5’位が、一時保護基で置換されたヒドロキシ基である、[9]に記載の製造方法。
[11] 前記n個重合オリゴヌクレオチドの5’位が、ヒドロキシ基であり、3’位が基本保護基で置換されたヒドロキシ基であり、
前記p個重合オリゴヌクレオチドの3’位が、反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基であり、5’位が、一時保護基で置換されたヒドロキシ基である、[9]に記載の製造方法。
[13] 前記n個重合オリゴヌクレオチドの5’位が、反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基であり、
前記p個重合オリゴヌクレオチドの3’位が、ヒドロキシ基であり、5’位が、一時保護基で置換されたヒドロキシ基である、[12]に記載の製造方法。
[14] 前記n個重合オリゴヌクレオチドの5’位が、ヒドロキシ基であり、
前記p個重合オリゴヌクレオチドの3’位が、反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基であり、5’位が、一時保護基で置換されたヒドロキシ基である、[12]に記載の製造方法。
[17] 前記亜リン酸ジエステル結合を、リン酸ジエステル結合、チオリン酸ジエステル結合、ボラノリン酸ジエステル結合、アミノリン酸ジエステル結合、リン酸トリエステル結合又はチオリン酸−O,O,S−トリエステル結合に変換することを含む亜リン酸ジエステル結合の変換工程を更に含む、[16]に記載の製造方法。
[19] 前記亜リン酸トリエステル結合を、リン酸トリエステル結合又はチオリン酸トリエステル結合に変換することを含む亜リン酸トリエステル結合の変換工程を更に含む、[18]に記載の製造方法。
Baseは、それぞれ独立して、核酸塩基又は基本保護基で置換された核酸塩基を示し、
Xは、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、基本保護基で置換されたヒドロキシ基又は4’位炭素原子に架橋する有機基を示し、
Yは、それぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシ基、置換されたヒドロキシ基、スルファニル基、置換されたスルファニル基、水素化ホウ素基、モノC1−6アルキルアミノ基又はジC1−6アルキルアミノ基を示し、
Vは、それぞれ独立して、酸素原子又は硫黄原子を示し、
Z1は、Z又はRであり、
Z1がZのとき、Z2はRであり、Z1がRのとき、Z2はZであり、
Zは、前記式(II)で表される保護基を示し、
Rは、水素原子、一時保護基、ヒドロキシホスフィニル基、又は置換されたヒドロキシ(ジアルキルアミノ)ホスフィノ基を示す。
ここで、Vが硫黄原子のとき、該硫黄原子が結合するリン原子に結合するYは、基本保護基で置換されたヒドロキシ基を示す。
式(I)中、Z1がRであり、Z2はZである化合物は、方法A(3’)又は方法B(3’)における工程cに用いられる前記p個重合オリゴヌクレオチド又はその製造に使用できる。
式(I)中、Z1及びZ2以外の記号の好適例は、工程aから工程dの好適例と同様である。
特に工程gでは、式(I)中、Zが前記式(II)で表される保護基であり、Rが一時保護基である化合物の当該式(II)で表される保護基を除去し、式(I)中、Zが水素原子であり、Rが一時保護基である化合物を得ることができる。
3’位又は5’位に、前記レブリニル型擬似固相保護基を有するオリゴヌクレオチドは、以下の工程h及び工程iにより、5’位又は3’位に、前記トリチル型擬似固相保護基を有するオリゴヌクレオチドへ変換することができる。
(工程h)
工程hは、5’位又は3’位がヒドロキシ基であり、3’位又は5’位がレブリニル型擬似固相保護基であるオリゴヌクレオチドの当該5’位又は3’位ヒドロキシ基を、式(VI)で表されるトリチル型擬似固相保護基で保護する工程である。
(工程i)
工程iは、5’位又は3’位がトリチル型擬似固相保護基で置換されたヒドロキシ基であり、3’位又は5’位がレブリニル型擬似固相保護基で置換されたヒドロキシ基であるオリゴヌクレオチドのレブリニル型擬似固相保護基を、除去する工程である。
同様に、スキーム15中(via)で表され、Zがレブリニル型擬似固相保護基である5’位ヒドロキシ体は、スキーム16中(vib)で表され、Zがトリチル型擬似固相保護基である3’位ヒドロキシ体に変換できる。スキーム16中(vib)で表され、Zがレブリニル型擬似固相保護基である3’位ヒドロキシ体は、スキーム15中(via)で表され、Zがトリチル型擬似固相保護基である5’位ヒドロキシ体に変換できる。
また、スキーム17中(xiiia)で表され、Zがレブリニル型擬似固相保護基である5’位ヒドロキシ体は、スキーム18中(xiiib)で表され、Zがトリチル型擬似固相保護基である3’位ヒドロキシ体に変換できる。スキーム18中(xiiib)で表され、Zがレブリニル型擬似固相保護基である3’位ヒドロキシ体は、スキーム17中(xiiia)で表され、Zがトリチル型擬似固相保護基である5’位ヒドロキシ体に変換できる。
レブリニル型擬似固相保護基は、好ましくは、工程aにおける前記式(II)で表される擬似固相保護基と同様である。
トリチル型擬似固相保護基は、好ましくは、工程aにおける前記式(VI)で表される擬似固相保護基と同様である。
式中、Qは、脱離基を示し、
Ar1は、下記式(VII)
(式中、*は、Ar1が結合する炭素原子を示し、
R1は、それぞれ独立して、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基、C2−40アルキニル基、又は、
式 −L7−O−R4
(式中、L7は、C1−40アルキレン基、C2−40アルケニレン基又はC2−40アルキニレン基であり、R4は、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基又はC2−40アルキニル基である)で表される基であり、少なくとも1つのR1の炭素数は10以上であり、sは、1から5の整数である)で表される基であり、
Ar2及びAr3は、それぞれ独立して、前記式(VII)で表される基又は下記式(VIII)
(式中、*は、Ar2及びAr3が結合する炭素原子を示し、
R10は、置換基群Aから選択される置換基であり、
置換基群Aは、ハロゲン原子、C1−6アルキル基、C2−6アルケニル基、C2−6アルキニル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6ハロアルケニル基、C1−6アルコキシ基、C1−6ハロアルコキシ基、モノC1−6アルキルアミノ基、ジC1−6アルキルアミノ基、C1−6アルキルカルボニル基、C1−6ハロアルキルカルボニル基、C1−6ハロアルコキシカルボニル基、C1−6アルコキシカルボニル基、モノC1−6アルキルアミノカルボニル基、ジC1−6アルキルアミノカルボニル基、C1−6アルコキシC1−6アルキル基、C1−6アルキルスルホニル基及びC1−6ハロアルキルスルホニル基により構成される置換基群を意味し、
tは、0から5の整数であり、tが2から5のとき、R10は、同一でも異なっていてもよい)で表される基である。
5’位又は3’位がトリチル型擬似固相保護基で置換されたヒドロキシ基であり、3’位又は5’位がレブリニル型擬似固相保護基で置換されたヒドロキシ基であるオリゴヌクレオチドは、トリチル型擬似固相保護基を維持したまま、レブリニル型擬似固相保護基を選択的に除去できる。
反応条件や、試薬等は、工程gと同様である。
工程eと同様の操作による沈殿化及び固液分離工程は、工程iの前及び後の少なくとも一方に実施することが好ましく、工程iの後に実施することがより好ましく、工程iの前及び後の両方に実施することが特に好ましい。工程iの後に、工程eと同様の操作を実施するとき、好ましくは1〜3回、より好ましくは1又は2回、さらに好ましくは1回、工程eと同様の操作が実施される。工程iの前も同様である。
前記亜リン酸ジエステル結合を変換する工程により得られた反応混合物を用いて、工程eと同様に、亜リン酸ジエステル結合が変換されたヌクレオシド又はオリゴヌクレオチド(xvi)を沈殿させて、固液分離により取得する分離工程を実施することができる。前記亜リン酸トリエステル結合を変換する工程により得られた反応混合物を用いて、工程eと同様に、亜リン酸トリエステル結合が変換されたヌクレオシド又はオリゴヌクレオチド(xvii)を沈殿させて、固液分離により取得する分離工程を実施することができる。
5’位又は3’位がトリチル型擬似固相保護基で置換されたヒドロキシ基であり、3’位又は5’位がレブリニル型擬似固相保護基で置換されたヒドロキシ基であるオリゴヌクレオチドは、低極性溶媒中、酸を添加することにより、レブリニル型擬似固相保護基を維持したまま、トリチル型擬似固相保護基を選択的に除去できる。
3’位及び5’位の一方が、ヒドロキシ基又は反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基であり、5’位及び3’位の一方が、前記式(VI)で表される保護基で置換されたヒドロキシ基であるp個重合オリゴヌクレオチドとを反応させ、
n個重合オリゴヌクレオチドとp個重合オリゴヌクレオチドとの結合体を生成するカップリング工程を含み、
n及びpは、それぞれ独立して、1以上の整数であり、
n個重合オリゴヌクレオチドの5’位及び3’位の一方が、反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基であるとき、p個重合オリゴヌクレオチドの3’位及び5’位の一方が、ヒドロキシ基であり、
n個重合オリゴヌクレオチドの5’位及び3’位の一方が、ヒドロキシ基であるとき、p個重合オリゴヌクレオチドの3’位及び5’位の一方が、反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基である、オリゴヌクレオチドの製造方法。
p個重合オリゴヌクレオチドの5’位が前記式(VI)で表される保護基で置換されたヒドロキシ基であり、3’位がヒドロキシ基である、(1)に記載のオリゴヌクレオチドの製造方法。
p個重合オリゴヌクレオチドの5’位が前記式(VI)で表される保護基で置換されたヒドロキシ基であり、3’位が反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基である、(1)に記載のオリゴヌクレオチドの製造方法。
(7) 前記カップリング工程の前に、5’位が前記式(VI)で表される保護基で置換されたヒドロキシ基であり、3’位が前記式(II)で表される保護基で置換されたヒドロキシ基であるヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドの当該式(II)で表される保護基を除去し、3’位にヒドロキシ基を生成する工程を含む、(1)から(6)のいずれか1つに記載のオリゴヌクレオチドの製造方法。
(9) 前記カップリング工程の後に、前記亜リン酸ジエステル結合を、リン酸ジエステル結合、チオリン酸ジエステル結合、ボラノリン酸ジエステル結合、アミノリン酸ジエステル結合、リン酸トリエステル結合又はチオリン酸−O,O,S−トリエステル結合に変換することを含む亜リン酸ジエステル結合の変換工程を更に含む、(8)に記載の製造方法。
(11) 前記カップリング工程の後に、前記亜リン酸トリエステル結合を、リン酸トリエステル結合又はチオリン酸トリエステル結合に変換することを含む亜リン酸トリエステル結合の変換工程を更に含む、(10)に記載の製造方法。
Baseは、それぞれ独立して、核酸塩基又は基本保護基で置換された核酸塩基を示し、
Xは、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、基本保護基で置換されたヒドロキシ基又は4’位炭素原子に架橋する有機基を示し、
Yは、それぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシ基、基本保護基で置換されたヒドロキシ基、スルファニル基、基本保護基で置換されたスルファニル基、水素化ホウ素基、モノC1−6アルキルアミノ基又はジC1−6アルキルアミノ基を示し、
Vは、それぞれ独立して、酸素原子又は硫黄原子を示し、
Z11が、下記式(II)で表される保護基、水素原子、置換されたヒドロキシ(ジアルキルアミノ)ホスフィノ基又はヒドロキシホスフィニル基であるとき、Z12は、下記式(VI)で表される保護基を示し、
Z11が、下記式(VI)で表される保護基であるとき、Z12は、下記式(II)で表される保護基、水素原子、置換されたヒドロキシ(ジアルキルアミノ)ホスフィノ基又はヒドロキシホスフィニル基を示し、
式(II)が、
R1は、それぞれ独立して、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基、C2−40アルキニル基、又は、式 −L7−O−R4
(式中、L7は、C1−40アルキレン基、C2−40アルケニレン基又はC2−40アルキニレン基であり、R4は、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基又はC2−40アルキニル基である)で表される基であり、少なくとも1つのR1の炭素数は10以上であり、sは、1から5の整数であり、
L11は、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L12は、単結合、−O−又は−N(R2)−(式中、R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)であり、
L13は、単結合、−C(O)−又はC1−6アルキレン基であり、L12が単結合のとき、L13は、単結合又は−C(O)−である)であり、
式(VI)が、
(式中、*は、前記基が保護する基との結合位置を示し、
Ar1は、下記式(VII)
(式中、*は、Ar1が結合する炭素原子を示し、
R1は、それぞれ独立して、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基、C2−40アルキニル基、又は、
式 −L7−O−R4
(式中、L7は、C1−40アルキレン基、C2−40アルケニレン基又はC2−40アルキニレン基であり、R4は、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基又はC2−40アルキニル基である)で表される基であり、少なくとも1つのR1の炭素数は10以上であり、sは、1から5の整数である)で表される基であり、
Ar2及びAr3は、それぞれ独立して、前記式(VII)で表される基又は下記式(VIII)
(式中、*は、Ar2及びAr3が結合する炭素原子を示し、
R10は、置換基群Aから選択される置換基であり、
置換基群Aは、ハロゲン原子、C1−6アルキル基、C2−6アルケニル基、C2−6アルキニル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6ハロアルケニル基、C1−6アルコキシ基、C1−6ハロアルコキシ基、モノC1−6アルキルアミノ基、ジC1−6アルキルアミノ基、C1−6アルキルカルボニル基、C1−6ハロアルキルカルボニル基、C1−6ハロアルコキシカルボニル基、C1−6アルコキシカルボニル基、モノC1−6アルキルアミノカルボニル基、ジC1−6アルキルアミノカルボニル基、C1−6アルコキシC1−6アルキル基、C1−6アルキルスルホニル基及びC1−6ハロアルキルスルホニル基により構成される置換基群を意味し、
tは、0から5の整数であり、tが2から5のとき、R10は、同一でも異なっていてもよい)で表される基である)である]化合物、該化合物の互変異性体又はその塩。
ここで、Vが硫黄原子のとき、該硫黄原子が結合するリン原子に結合するYは、基本保護基で置換されたヒドロキシ基を示す。
Z11が、前記式(VI)で表される保護基であり、Z12は、前記式(II)で表される保護基又はヒドロキシホスフィニル基である。
Z11及びZ12の組み合わせは、より好ましくは、Z11が、前記式(II)で表される保護基又は、ヒドロキシホスフィニル基であり、Z12が、前記式(VI)で表される保護基である。
Z11及びZ12の組み合わせは、さらに好ましくは、Z11が、前記式(II)で表される保護基であり、Z12が、前記式(VI)で表される保護基である。
sは2から5の整数であるか、又は
sが1であって、R1が、 式 −L7−O−R4
(式中、L7は、C1−40アルキレン基、C2−40アルケニレン基又はC2−40アルキニレン基であり、R4は、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基又はC2−40アルキニル基である)で表される基であり、R4の炭素数が10以上であることが好ましい。
その他の態様として、前記式(VI)において、sが1であって、R1が、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基又はC2−40アルキニル基であり、R1の炭素数が19以上であることが好ましく、21以上であることがより好ましい。
また、スキーム8中3’位ヒドロキシのH−ホスホネート体(iiib)及びスキーム12中3’位ヒドロキシのホスホロアミダイト体(viib)は、固相合成機により合成された3’位ヒドロキシ体(iib)から工程b1又は工程b2を実施して合成し、用いても良い。スキーム7中5’位ヒドロキシのH−ホスホネート体(iiia)及びスキーム11中5’位ヒドロキシのホスホロアミダイト体(viia)は、固相合成機により合成された5’位ヒドロキシ体(iia)から工程b1又は工程b2を実施して合成し、用いてもよい。
例えば、2’位と4’位が−CSNR14−(R14は水素原子又はC1−6アルキル基を示す)で架橋したリボースに、核酸塩基が結合したヌクレオシドは、対応する−CONR13−(R13は水素原子又はC1−6アルキル基を示す)で架橋した構造を有するヌクレオシド等から、チオカルボニル化試薬(例えばローソン試薬等)を用いて、必要に応じて保護反応及び脱保護反応を行って、合成することができる。
また、L1とL2間の結合、L2とL3間の結合、L3とL4間の結合の内、任意の結合を上記縮合法や官能基変換法等を用いて形成させ、段階的に擬似固相保護基を導入することもできる。また、L2が、−COO−、−CON(R2)−、OCO−又は−N(R2)CO−である場合、L2が含むエステル結合又はアミド結合を、上記縮合法や官能基変換法等を用いて形成させ、段階的に擬似固相保護基を導入することもできる。L4が、−COO−、−CON(R2)−、OCO−又は−N(R2)CO−である場合も同様である。ここで、R2は前記定義に同じである。
また、L1とL2の間の結合、L2とL3の間の結合、L3とL4の間の結合の内、任意の結合を上記縮合法や官能基変換法等を用いて形成させ、段階的に擬似固相保護基を導入することもできる。また、L2が、−COO−、−CON(R2)−、OCO−又は−N(R2)CO−である場合、L2が含むエステル結合又はアミド結合を、上記縮合法や官能基変換法等を用いて形成させ、段階的に擬似固相保護基を導入することもできる。L4が、−COO−、−CON(R2)−、OCO−又は−N(R2)CO−である場合も同様である。ここで、R2は前記定義に同じである。
31P−NMRデータが記載されている場合には、JNM−ECX300;日本電子(JEOL)社製)で測定したシグナルの化学シフトδ(単位:ppm)を表す。
装置A:AB SCIEX TripleTOF 5600
装置B:BRUKER maXis
カラムA:Kinetex PFP(2.6μm、2.1×75mm)
カラムB:XBridgeC18(2.6μm、2.1×75mm)
カラムC:L−column ODS(3.0μm、3.0×150mm)
溶離液種類A:有機層は、テトラヒドロフラン[THF]/アセトニトリル[MeCN]=1/1(体積比)を、水層は、10mM ギ酸アンモニウム水溶液を用いた。
溶離液種類B:有機層は、MeCNを、水層は、水を用いた。
溶離液組成A:有機層と水層の混合比(体積比)を50/50で測定開始後、10分間で90/10に直線的に変えた。その後5分間、当該混合比を90/10に固定した。
溶離液組成B:有機層と水層の混合比(体積比)を50/50で測定開始後、5分間固定し、8分間で95/5に直線的に変えた。その後5分間、当該混合比を95/5に固定した。
溶離液組成C:有機層と水層の混合比(体積比)を2/98で測定開始後、12分間で98/2に直線的に変えた。その後3分間、当該混合比を98/2に固定した。
溶離液組成D:有機層と水層の混合比(体積比)を90/10で測定開始後、8分間固定し、2分間で99/1に直線的に変えた。その後5分間、混合比を99/1に固定した。
溶離液組成E:有機層と水層の混合比(体積比)を90/10で測定開始後5分間固定し、8分間で99/1に直線的に変えた。その後5分間、当該混合比を99/1に固定した。
溶離液組成F:有機層と水層の混合比(体積比)を70/30で測定開始後、10分間で90/10に直線的に変えた。その後5分間、当該混合比を90/10に固定した。
薄層シリカゲルクロマトグラフィーでの精製は、特に記述がない場合は、メルク社製PLCプレートを用いた。薄層シリカゲルカラムクロマトグラフィーで使用された混合溶媒の比は、体積比である。
窒素雰囲気下、化合物1(国際公開第2014−077292号に記載の方法に準じて合成した)(3.75g、4.0mmol)、及び化合物2(New Journal of Chemistry, 2016, 40, 8786-8808に記載の方法に準じて合成した)(1.85g、6.5mmol)のN,N−ジメチルホルムアミド[DMF](77mL)懸濁液に、60℃で炭酸水素ナトリウム(0.68g、8.1mmol)を加え、22時間52分間撹拌した。室温まで冷却し、反応混合物にTHF(40g)を加えて撹拌した後、吸引ろ過を行い、不溶物を除いた。得られたろ液を減圧下濃縮し、反応混合物をメタノール[MeOH](501g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物3(4.1g、収率90%)を淡黄色固体として得た。
1H-NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.87(t,9H),1.08-1.80(m,96H),2.73-2.82(m,4H),4.00-4.05(m,6H),4.88-4.90(m,2H),5.11-5.12(m,2H),7.25-7.37(m,7H).
MS(ESI+):[M+H]+ 1131.9532.(条件1)
窒素雰囲気下、化合物3(3.99g、3.5mmol)のTHF(53g)溶液に、室温で10%パラジウム−炭素(Kタイプ)(0.39g)を加え、水素置換を行い6時間10分間撹拌した。窒素置換を行った後に、セライトろ過を行い、不溶物を除いた。得られたろ液を減圧下濃縮し、反応混合物をMeCN(508g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物4(3.6g、収率97%)を白色固体として得た。
1H-NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.86(t,9H),1.13-1.81(m,96H),2.72-2.77(m,4H),4.00-4.02(m,6H),4.86-4.92(m,2H),7.23-7.34(m,2H).
MS(ESI+):[M+H]+ 1041.9151.(条件1)
窒素雰囲気下、化合物4(1.0g、0.96mmol)、化合物5(東京化成工業社製)(0.87g、1.6mmol)、及びN,N−ジメチルアミノピリジン[DMAP](0.18g、1.5mmol)の塩化メチレン(31g)溶液に、室温で1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩[WSC・HCl](0.29g、1.5mmol)を加え、30時間54分間撹拌した。反応混合物をMeCN(303g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物6(1.4g、収率94%)を白色固体として得た。
1H-NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.88(t,9H),1.26-1.79(m,99H),2.42-2.46(m,2H),2.65-2.69(m,2H),2.79-2.83(m,2H),3.44(d,2H),3.78(s,6H),4.00(q,6H),4.13(d,1H),4.89(s,2H),5.46(d,1H),6.41(q,1H),6.83(d,4H),7.24-7.39(m,11H),7.57(s,1H).
MS(ESI-):[M-H]- 1566.1142.(条件1)
1H-NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.88(t,9H),1.26-1.83(m,96H),1.92(d,3H),2.38-2.47(m,2H),2.68(t,2H),2.83(t,2H),3.89-3.91(m,2H),4.01(q,6H),4.09(d,2H),4.90(s,2H),5.35-5.37(m,1H),6.17-6.21(m,1H),7.29(s,2H),7.46(d,2H),8.33(brs,1H).
MS(ESI-):[M-H]- 1263.9780.(条件1)
1H-NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.88(t,9H),1.25-1.82(m,96H),1.91-1.92(m,3H),2.26-2.44(m,2H),2.66-2.81(m,7H),3.10-3.18(m,1H),3.39-3.50(m,2H),3.77(s,6H),3.97-4.03(m,6H),4.16-4.46(m,6H),4.87(s,2H),5.27-5.33(m,2H),6.21-6.30(m,1H),6.48-6.52(m,1H),6.77-6.81(m,4H),7.23-7.37(m,12H),7.52-7.60(m,3H),8.01(s,1H),8.03(s,1H),8.14(s,1H),8.70(d,1H),9.02(s,1H).
31P-NMR:(300MHz;CDCl3)δ-2.02,-1.94.
MS(ESI+):[M+H]+ 2038.2223.(条件1)
1H-NMR:(300MHz;CDCl3)δ1.81-1.83(m,3H),2.25(t,2H),2.84-2.86(m,3H),3.31-3.42(m,3H),3.73-3.74(m,6H),4.04-4.06(m,1H),4.25-4.44(m,6H),5.40-5.46(m,1H),6.19-6.25(m,1H),6.50-6.55(m,1H),6.74-6.79(m,4H),7.17-7.57(m,13H),8.05-8.08(m,2H),8.42-8.44(m,1H),8.56-8.57(m,1H).
31P-NMR:(300MHz;CDCl3)δ3.81,4.01.
MS(ESI+):[M+H]+ 1015.3334.(条件3)
MS(ESI+):[M+H]+ 1051.9344.(条件1)
1H-NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.88(t,9H),1.21-1.83(m,96H),1.89(s,3H),1.96(s,3H),2.28-2.84(m,11H),3.88(s,2H),3.98-4.04(m,6H),4.20-4.34(m,4H),4.90(s,2H),5.15-5.36(m,2H),6.15(t,1H),6.29(t,1H),7.26-7.42(m,3H),7.44(d,3H).
31P-NMR:(300MHz;CDCl3)δ66.98,67.34.
MS(ESI+):[M+H]+ 1639.0296.(条件1)
窒素雰囲気下、化合物4(0.80g、0.77mmol)、化合物14(Hongene Biotech社製)(0.72g、1.2mmol)、及びDMAP(0.14g、1.2mmol)の塩化メチレン(30g)溶液に、室温でWSC・HCl(0.22g、1.2mmol)を加え、19時間20分間撹拌した。反応混合物を減圧下濃縮後、MeCN(103g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物15(1.2g、収率97%)を白色固体として得た。
1H-NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.88(t,9H),1.24-1.80(m,99H),2.69-2.75(m,4H),3.26(s,3H),3.38-4.01(m,18H),4.24(d,1H),4.42-4.47(m,1H),4.90(s,2H),5.40(q,1H),6.00-6.08(m,1H),6.82-6.85(m,4H),7.23-7.37(m,11H),7.55(d,1H).
MS(ESI+):[M+NH4]+ 1659.1710.(条件1)
窒素雰囲気下、化合物15(1.2g、0.73mmol)、及びインドール(0.26g、2.2mmol)の塩化メチレン溶液(25mL)を10℃に冷却し、TFA(0.28mL、3.7mmol)を加え、3時間32分間撹拌した。ピリジン(0.30mL、3.7mmol)を加えて室温まで昇温し、反応混合物をMeOH(300g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物16(0.97g、収率97%)を白色固体として得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 1340.0201.(条件1)
実施例8の工程1と同様の条件で、化合物14の代わりに化合物17(Hongene Biotech社製)(0.85g、1.2mmol)を用いて反応を実施し、化合物18(1.2g、収率91%)を白色固体として得た。
1H-NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.88(t,9H),1.25-1.82(m,96H),2.79-2.83(m,4H),3.14(s,3H),3.36-3.66(m,6H),3.77(s,6H),3.96-4.04(m,6H),4.37(q,1H),4.91(d,2H),5.06(t,1H),5.54(q,1H),6.16(d,1H),6.79(d,4H),7.22-7.61(m,14H),8.03(d,2H),8.21(s,1H),8.71(s,1H),9.02(brs,1H).
MS(ESI+):[M+H]+ 1755.1882.(条件1)
窒素雰囲気下、化合物18(10mg、5.7μmol)の塩化メチレン溶液(0.2mL)を10℃に冷却し、TFA(4.4μL、58μmol)を加え、1時間撹拌した。反応混合物をLC−MSにより分析し、化合物19が主生成物であることを確認した。
MS(ESI+):[M+H]+ 1453.0515.(条件1)
実施例8の工程1と同様の条件で、化合物14の代わりに化合物20(Hongene Biotech社製)(0.82g、1.2mmol)を用いて反応を実施し、化合物21(1.3g、収率94%)を白色固体として得た。
1H-NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.75(d,3H),0.85-0.95(m,12H),1.20-1.82(m,96H),2.70-2.82(m,4H),3.11-3.77(m,16H),3.96-4.04(m,6H),4.25(d,1H),4.91(d,2H),5.12(q,1H),5.60(q,1H),5.81(d,1H),6.76-6.81(m,4H),7.22-7.52(m,11H),7.82(s,1H).
MS(ESI+):[M+H]+ 1737.1490.(条件1)
実施例9の工程2と同様の条件で、化合物18の代わりに化合物21(1.2g、0.68mmol)を用いて反応を実施し、3時間25分間撹拌した。MeOH(1.0mL)を加えて10分間撹拌し、ピリジン(0.82mL、10mmol)を加えて12分間撹拌した。室温に昇温した後、MeOH(301g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物22(0.95g、収率98%)を白色固体として得た。
1H-NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.88-1.85(m,111H),2.62-2.87(m,4H),3.13(s,3H),3.29-4.04(m,13H),4.32(s,1H),4.70(q,1H),4.94(q,2H),5.55(d,1H),5.81(d,1H),7.29(s,2H),7.78(s,1H),8.45(s,1H),12.11(brs,1H).
MS(ESI+):[M+H]+ 1435.0575.(条件1)
1H-NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.86-1.83(m,117H),2.60-2.89(m,8H),3.16-3.78(m,22H),3.97-4.39(m,12H),4.71(t,1H),4.85-4.92(m,3H),5.55(d,1H),5.89(d,1H),6.80-6.83(m,4H),7.22-7.31(m,9H),7.40-7.42(m,2H),7.78-7.81(m,1H),7.93(s,1H),8.69-8.94(m,1H),9.97-10.53(m,1H),12.23(brs,1H).
31P-NMR:(300MHz;CDCl3)δ67.83,68.37.
MS(ESI+):[M+H]+ 2279.3339.(条件2)
窒素雰囲気下、オクタデシルブロミド(東京化成工業社製)(3.1g、9.3mmol)、及び2,4,6−トリヒドロキシ安息香酸メチル(Alfa Aesar社製)(0.55g、3.0mmol)のDMF(3.0mL)懸濁液に、室温で炭酸カリウム(2.6g、19mmol)を加え、70℃に昇温して19時間48分間撹拌した。室温まで冷却し、水とジエチルエーテルを加えて分液した。得られた水層をジエチルエーテルで2回抽出し、得られた有機層を合わせて、塩化ナトリウム水溶液で洗浄した。得られた水層をジエチルエーテルで抽出し、得られた有機層を合わせて、減圧下濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/クロロホルム=9/1→1/1)により精製し、化合物25(1.4g、収率51%)を白色ロウ状固体として得た。
1H-NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.88(t,9H),1.06-1.80(m,96H),3.84(s,3H),3.90-3.95(m,6H),6.05(s,2H).
MS(ESI+):[M+H]+ 941.8906.(条件1)
窒素雰囲気下、化合物25(0.28g、0.29mmol)のエタノール(2.0g)懸濁液に、室温で水酸化カリウム(0.19g、3.5mmol)を加え、80℃に昇温して24時間20分間撹拌した。室温まで冷却し、反応混合物を減圧下濃縮し、35%塩酸(0.36g)と水(3.3g)の混合液を加えて、析出した固体をろ過した。得られた粗物にMeOH(5.0g)を加えて50℃に昇温し、析出した固体をろ過し、化合物26(0.24g、収率87%)を白色固体として得た。
1H-NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.88(t,9H),1.06-1.79(m,96H),3.89-3.97(m,6H),6.07(s,2H).
MS(ESI-):[M-H]- 925.8669.(条件1)
実施例1−1の工程1と同様の条件で、化合物1の代わりに化合物26(0.19g、0.20mmol)を用いて反応を実施した。室温まで冷却し、反応混合物にTHF(3mL)を加えて撹拌した後、吸引ろ過を行い、不溶物を除いた。得られたろ液を減圧下濃縮し、反応混合物を氷冷したMeOH(10g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物27(0.20g、収率84%)を白色固体として得た。
1H-NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.88(t,9H),1.25-1.80(m,96H),2.67(t,3H),2.92(t,3H),3.93(t,6H),4.76(s,2H),5.11(s,2H),6.06(s,2H),7.30-7.35(m,5H).
MS(ESI+):[M+H]+ 1131.9482.(条件1)
実施例1−1の工程2と同様の条件で、化合物3の代わりに化合物27(0.17g、0.15mmol)を用いて反応を実施した。窒素置換を行った後に、セライトろ過を行い、不溶物を除いた。得られたろ液を減圧下濃縮し、反応混合物を氷冷したMeCN(20g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物28(0.15g、収率92%)を白色固体として得た。
1H-NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.88(t,9H),1.06-1.79(m,96H),2.67-2.87(m,4H),3.91-3.97(m,6H),4.75-4.77(m,2H),6.07(s,2H).
MS(ESI+):[M+H]+ 1041.9039.(条件1)
1H-NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.88(t,9H),1.10-1.79(m,99H),2.42-2.92(m,6H),3.05-3.49(m,2H),3.79(s,6H),3.92-3.96(m,6H),4.14(s,1H),4.76(s,2H),5.46(d,1H),6.07(s,2H),6.42(t,1H),6.83(d,4H),7.23-7.60(m,10H).
MS(ESI+):[M+NH4]+ 1585.1657.(条件1)
MS(ESI+):[M+H]+ 1051.9392.(条件1)
1H-NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.86-0.90(m、9H)、1.09-1.84(m、96H)、2.65(s、4H)、3.05(s、3H)、3.76(brs、2H)、3.96(t、6H)、4.38(brs、2H)、6.58(s、2H).
MS(ESI):[M-H]- 1082.9343.(条件1)
窒素雰囲気下、5’−O−(tert−ブチルジメチルシリル)−2’−デオキシシチジン(ジャーナルオブオーガニックケミストリー、2011年、76巻、105頁−126頁に記載の方法に準じて合成した)(2.5g、7.3mmol)と化合物31(5.3g、4.9mmol)の塩化メチレン(155mL)及びDMF(25mL)の混合溶液に、40℃で1−ヒドロキシベンゾトリアゾール[HOBt](無水)(0.74g、5.5mmol)を加え、続いてWSC・HCl(1.9g、9.9mmol)を加えて、1時間40分撹拌した。反応混合物を減圧下濃縮した後にMeOH(503g)に加えて固体を析出させた後にろ過し、化合物32(6.8g、収率98%)を黄色固体として得た。
1H-NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.09-0.10(m、6H)、0.84-0.90(m、18H)、1.20-1.81(m、96H)、2.12-2.21(m、1H)、2.28-2.36(m、1H)、2.61-2.77(m、5H)、3.05(s、3H)、3.76(brs、2H)、3.81-3.97(m、8H)、4.07(q、1H)、4.37(brs、2H)、4.40-4.45(m、1H)、6.29(t、1H)、6.57(s、2H)、7.31(d、1H)、8.31(d、1H)、8.88(brs、1H).
MS(ESI-):[M-H]- 1406.1107.(条件1)
窒素雰囲気下、化合物32(6.7g、4.8mmol)、DMAP(0.062g、0.50mmol)、及びレブリン酸(0.86g、7.4mmol)のTHF(69g)溶液に、室温でWSC・HCl(1.4g、7.5mmol)を加え、50分間撹拌した。その後、DMAP(0.26g、2.1mmol)を加えて、室温で3日間撹拌した。反応混合物をろ過後に、得られたろ液を減圧下濃縮し、THF(38g)を加えて溶液とした後、MeCN(505g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物33(6.7g、収率93%)を淡黄色固体として得た。
1H-NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.09(s、6H)、0.86-0.90(m、18H)、1.26-1.81(m、96H)、2.01-2.13(m、2H)、2.20(s、3H)、2.52-2.80(m、8H)、3.06(s、3H)、3.77(brs、2H)、3.86-3.98(m、8H)、4.20(s、1H)、4.38(brs、2H)、5.26(d、1H)、6.32-6.37(m、1H)、6.57(s、2H)、7.33(d、1H)、8.27(d、1H)、9.17(brs、1H).
MS(ESI-):[M-H]- 1504.1412.(条件1)
窒素雰囲気下、化合物33(6.5g、4.3mmol)、及び酢酸(2.9mL、50mmol)のTHF(71g)溶液に、30℃で1.0M テトラ−n−ブチルアンモニウムフルオリド[TBAF]/THF溶液(28mL、28mmol)を加え、4時間53分撹拌した。その後、反応混合物をMeOH(531g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物34(6.0g、定量的)を白色固体として得た。
1H-NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.88(t、9H)、1.20-1.80(m、96H)、2.20(s、3H)、2.38-2.80(m、10H)、3.05(s、3H)、3.78(brs、2H)、3.88-3.98(m、8H)、4.18(d、1H)、4.39(brs、2H)、5.36(quint、1H)、6.20(dd、1H)、6.59(s、2H)、7.21-7.31(m、1H)、8.19(d、1H).
MS(ESI-):[M-H]- 1390.0541.(条件1)
窒素雰囲気下、亜リン酸(1.20g、14.6mmol)のピリジン(40mL)溶液に、40℃で2,2−ジメチルブチリルクロリド(1.28mL、9.3mmol)を加え、30分間撹拌した。この溶液に化合物34(2.0g、1.4mmol)を加えて40℃で1時間23分撹拌した。その後、反応混合物をMeCNに加えて析出した固体をろ過し、化合物35(2.2g)を白色固体として得た。
1H-NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.88(t、9H)、1.26-1.83(m、96H)、2.19(s、3H)、2.38-2.88(m、10H)、3.06(s、3H)、3.75(brs、2H)、3.92-4.35(m、11H)、5.37(d、1H)、6.17(t、1H)、6.58(s、2H)、6.88(d、1H)、7.26-7.28(m、1H)、8.51(d、1H).
31P-NMR:(300MHz;CDCl3)δ5.73.
MS(ESI-):[M-H]- 1454.0237.(条件1)
窒素雰囲気下、化合物35(1.2g)のピリジン(20mL)溶液に5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)チミジン(東京化成工業社製)(0.44g、0.80mmol)、及び炭酸ビスペンタフルオロフェニル(0.67g、1.7mmol)を加え、23分間撹拌した。その後N−[(2−シアノエチル)チオ]フタルイミド(テトラへドロン、1997年、53巻、14411−14416頁に記載の方法に準じて合成した)(0.19g、0.83mmol)を加え、1時間32分間撹拌した。その後、亜リン酸トリエチル(90μL、0.52mmol)、水(0.28mL、16mmol)を加えて25℃で50分間撹拌し、反応混合物を減圧下濃縮した。トルエン(25g)を加えて減圧下濃縮する操作を3回繰り返した後に、塩化メチレン(20mL)を加え、ピロール(0.11mL、1.6mmol)、ジクロロ酢酸(0.43mL、5.3mmol)を10℃で加え、2時間27分間撹拌した。ピリジン(3.0mL)を加えて室温まで昇温し、反応混合物をMeCN(200g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物36(0.72g)を薄い肌色固体として得た。
1H-NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.88(t、9H)、1.25-1.89(m、99H)、2.20(s、3H)、2.21-2.89(m、13H)、3.06-3.20(m、5H)、3.21-3.98(m、11H)、4.19-4.4.44(m、6H)、5.32-5.34(m、2H)、6.10-6.23(m、2H)、6.58(s、2H)、7.41(t、1H)、7.51(d、1H)、7.95-8.08(m、1H)、8.70-9.60(m、2H).
31P-NMR:(300MHz;CDCl3)δ27.55、27.94.
MS(ESI+):[M+H]+ 1765.1162.(条件1)
窒素雰囲気下、得られた化合物36(0.72g)の塩化メチレン(15mL)とピリジン(2.3mL)の混合溶液に室温でホスホン酸(0.56g、6.8mmol)を加え、2,2−ジメチルブチリルクロリド(0.56mL、4.1mmol)を4分割して10分間おきに加えて31分間撹拌し、2,2−ジメチルブチリルクロリド(0.42mL、3.1mmol)を加えてさらに23分間撹拌した。その後、反応混合物をMeCN(203g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物37(0.72g)を白色固体として得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 1829.0819.(条件1)
窒素雰囲気下、化合物37(0.72g)のピリジン(19mL)溶液にN4−ベンゾイル−5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−2’−デオキシシチジン(東京化成工業社製)(0.49g、0.77mmol)、炭酸ビスペンタフルオロフェニル(0.60g、1.5mmol)を加え、22分間撹拌した(カップリング反応)。その後、硫化剤としてN−[(2−シアノエチル)チオ]フタルイミド(0.18g、0.76mmol)を加え、1時間10分間撹拌した(硫化反応)。その後、反応混合物を2分割し、一方を減圧下濃縮した。トルエン(10g)を加えて減圧下濃縮の操作を3回繰り返した後に、塩化メチレン(10mL)を加え、ピロール(51μL、0.74mmol)、ジクロロ酢酸(0.20mL、2.4mmol)を10℃で加え、2時間10分撹拌した。ピリジン(1.2mL)を加えて室温まで昇温し、反応混合物をさらに2分割し、一方をMeCN(50g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物38(0.18g)を薄い肌色固体として得た。
窒素雰囲気下、得られた化合物38(0.18g)の塩化メチレン(3.0mL)とピリジン(0.50mL)の混合溶液に室温でホスホン酸(0.12g、1.5mmol)を加え、2,2−ジメチルブチリルクロリド(0.13mL、0.96mmol)を4分割して10分間おきに加えて57分間撹拌し、2,2−ジメチルブチリルクロリド(33μL、0.24mmol)を加えてさらに40分間撹拌した。その後、反応混合物をMeCN(51g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物39(0.15g)を白色固体として得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 2291.1664.(条件1)
工程2と同様の条件で、化合物37の代わりに化合物39を、N4−ベンゾイル−5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−2’−デオキシシチジンの代わりにN2−イソブチリル−5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−2’−デオキシグアノシン(東京化成工業社製)(86mg)を用いて、反応を実施し、化合物40(0.12g)を白色固体として得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 2759.2472.(条件1)
工程2と同様の条件で、化合物37の代わりに化合物40を、N4−ベンゾイル−5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−2’−デオキシシチジンの代わりにN6−ベンゾイル−5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−2’−デオキシアデノシン(東京化成工業社製)(0.73g)を用いて、カップリング反応及び硫化反応を実施した。硫化反応後の反応混合物をMeOHに加えて析出した固体をろ過し、化合物41(2.3g、90%)を薄い肌色固体として得た。
MS(ESI+):[M+2H]2+ 1742.2655.(条件1)
MS(ESI+):[M+2H]2+ 1693.2456.(条件1)
窒素雰囲気下、化合物41(0.51g、0.15mmol)の塩化メチレン溶液(10mL)を10℃に冷却し、ピロール(30μL、0.43mmol)を加えて14分間撹拌した。その後、ジクロロ酢酸(82μL、1.0mmol)を加え、4時間3分撹拌した。ピリジン(1.5mL)を加えて室温まで昇温し、反応混合物をMeCN(86g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物43(0.46g)を得た。
MS(ESI+):[M+2H]2+ 1591.1922.(条件1)
窒素雰囲気下、化合物43(0.45g、0.14mmol)の塩化メチレン(5.0mL)とピリジン(1.0mL)の混合溶液に40℃でホスホン酸(0.20g、2.4mmol)を加え、2,2−ジメチルブチリルクロリド(0.19mL、1.4mmol)を4分割して10分間おきに加えて1時間53分撹拌し、2,2−ジメチルブチリルクロリド(0.42mL、0.71mmol)を加えてさらに1時間8分撹拌した。その後、反応混合物をMeCN(84g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物44(0.42g)を白色固体として得た。
MS(ESI+):[M+2H]2+ 1623.1824.(条件1)
MS(ESI+):[M+3H]3+ 2232.9346.(条件1)
窒素雰囲気下、化合物45(0.39g、58μmol)、及びインドール(21mg、0.18mmol)の塩化メチレン溶液(8.0mL)を10℃に冷却し、ジクロロ酢酸(33μL、0.40mmol)を加え、2時間撹拌した。更にジクロロ酢酸(14μL、0.17mmol)を加え、2時間32分撹拌した。ピリジン(0.60mL)を加えて室温まで昇温し、反応混合物をMeOH(100g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物46(0.35g)を得た。
MS(ESI+):[M+3H]3+ 2132.2235.(条件1)
窒素雰囲気下、化合物46(0.17g、27μmol)の塩化メチレン(1.0mL)とピリジン(0.20mL)の混合溶液に40℃でホスホン酸(38mg、0.46mmol)を加え、2,2−ジメチルブチリルクロリド(36μL、0.27mmol)を4分割して10分間おきに加えて1時間5分撹拌し、2,2−ジメチルブチリルクロリド(73μL、0.53mmol)を加えてさらに49分間撹拌した。その後、反応混合物をMeCN(51g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物47(0.17g)を白色固体として得た。
MS(ESI+):[M+3H]3+ 2153.5570.(条件1)
3’−O−レブリニルチミジン(バイオオーガニック アンド メディシナル ケミストリー、2013年、21巻、8013頁−8018頁に記載の方法に準じて合成した)(0.75g、2.2mmol)を用いて、特表2003−525305に記載の方法に準じて合成した化合物48を含有する塩化メチレン(26g)溶液にインドール(0.78g、6.6mmol)を加えて10℃に冷却し、ジクロロ酢酸(0.90mL、11mmol)を加え、1時間17分撹拌した。更にジクロロ酢酸(0.90mL、11mmol)を加え、40分間撹拌した。反応混合物を5%炭酸水素ナトリウム水溶液に加えて分液した。得られた水層に塩化メチレンを加えて分液を行う再抽出操作を11回実施し、得られた有機層を合わせて溶媒を減圧下留去し、粗物を得た。粗物をシリカゲルクロマトグラフィー(クロロホルム−メタノール)で精製し、化合物49(0.65g)を得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 714.1865.(条件3)
窒素雰囲気下、化合物49(0.65g、0.91mmol)とN4−ベンゾイル−5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−3’−O−ヒドロキシホスフィニル−2’−デオキシシチジントリエチルアミン塩(ケムジーンズ社製)(1.0g、1.3mmol)のピリジン(8mL)溶液に、室温で炭酸ビスペンタフルオロフェニル(1.3g、3.2mmol)を加え、15分間撹拌した。その後、硫化剤としてN−[(2−シアノエチル)チオ]フタルイミド(0.43g、1.9mmol)を加え、1時間57分撹拌した。塩化メチレンと5%炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて分液し、得られた水層を塩化メチレンで2回洗浄した。得られた有機層を合わせて溶媒を減圧下留去し、化合物50を含有する反応混合物(13g)を得た。このうち12gを更に減圧下濃縮し、トルエンを加えて減圧下濃縮の操作を3回繰り返した後に、塩化メチレン(16g)、インドール(0.30g、2.6mmol)を加えて10℃に冷却し、ジクロロ酢酸(0.69mL、8.4mmol)を加え、1時間40分撹拌した。反応混合物を5%炭酸水素ナトリウム水溶液に加えて分液した。得られた水層に塩化メチレンを加えて分液を行う再抽出操作を2回実施し、得られた有機層を合わせて溶媒を減圧下留去し、粗物を得た。粗物をシリカゲルクロマトグラフィー(クロロホルム−メタノール)で精製し、化合物51(0.30g)を得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 1176.2650.(条件3)
窒素雰囲気下、化合物51(0.24g、0.20mmol)とN2−イソブチリル−5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−3’−O−ヒドロキシホスフィニル−2’−デオキシグアノシントリエチルアミン塩(ケムジーンズ社製)(0.23g、0.29mmol)のピリジン(6mL)溶液に、室温で炭酸ビスペンタフルオロフェニル(0.43g、1.1mmol)を加え、27分間撹拌した。その後、硫化剤としてN−[(2−シアノエチル)チオ]フタルイミド(0.10g、0.43mmol)を加え、1時間34分撹拌した。塩化メチレンと5%炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて分液し、得られた水層を塩化メチレンで2回洗浄した。得られた有機層を合わせて溶媒を減圧下留去し、化合物52を含有する反応混合物を得た。トルエンを加えて減圧下濃縮の操作を3回繰り返した後に、塩化メチレン(8.0g)及びインドール(77mg、0.66mmol)を加えて10℃に冷却し、ジクロロ酢酸(0.17mL、2.0mmol)を加え、2時間8分撹拌した。反応混合物を5%炭酸水素ナトリウム水溶液に加えて分液した。得られた水層に塩化メチレンを加えて分液を行う再抽出操作を2回実施し、得られた有機層を合わせて溶媒を減圧下留去し、粗物を得た。粗物をシリカゲルクロマトグラフィー(クロロホルム−メタノール)で精製し、化合物53(0.12g)を得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 1644.3648.(条件3)
窒素雰囲気下、化合物53(0.12g、74μmol)とN6−ベンゾイル−5’−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−3’−O−ヒドロキシホスフィニル−2’−デオキシアデノシントリエチルアミン塩(ケムジーンズ社製)(90mg、0.11mmol)のピリジン(5mL)溶液に、室温で炭酸ビスペンタフルオロフェニル(0.28g、0.71mmol)を加え、1時間2分撹拌した。その後、硫化剤としてN−[(2−シアノエチル)チオ]フタルイミド(37mg、0.16mmol)を加え、2時間8分撹拌した。塩化メチレン、アセトニトリルと5%炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて分液し、得られた水層を塩化メチレンとアセトニトリルの混合溶媒で2回洗浄した。得られた有機層を合わせて溶媒を減圧下留去し、化合物54を含有する反応混合物を得た。この反応混合物に塩化メチレン(3.1g)を加えて0℃に冷却し、酢酸(0.15mL)を加えた後に、ヒドラジン1水和物(36μL、0.74mmol)を加え、1時間26分撹拌した。反応混合物にアセチルアセトン(0.30mL)を加えて室温まで昇温し、5%炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて分液した得られた水層に塩化メチレンを加えて分液を行う再抽出操作を2回実施し、得られた有機層を合わせて溶媒を減圧下留去し、粗物を得た。粗物をシリカゲルクロマトグラフィー(クロロホルム−メタノール)で精製し、化合物55(55mg)を得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 2334.5224.(条件3)
窒素雰囲気下、化合物47(43mg)と化合物55(19mg、8.3μmol)のピリジン(1.4mL)溶液に、室温で炭酸ビスペンタフルオロフェニル(59mg、0.15mmol)を加え、58分間撹拌した。その後、硫化剤としてN−[(2−シアノエチル)チオ]フタルイミド(10mg、44μmol)を加え、40分間撹拌した。その後、反応混合物を減圧下濃縮した。トルエン(2g)を加えて減圧下濃縮の操作を3回繰り返した後に、塩化メチレン(1.2mL)を加え、インドール(2.5mg、21μmol)、ジクロロ酢酸(6.2μL、76μmol)を10℃で加え、1時間51分間撹拌した。その後、ジクロロ酢酸(6.2μL、76μmol)を追加し、2時間41分間撹拌した。さらに、ジクロロ酢酸(6.2μL、76μmol)を追加し、1時間38分間撹拌した。ピリジン(0.20mL)を加えて室温まで昇温し、反応混合物をMeCN(38g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物56(51mg)を薄い肌色固体として得た。
MS(ESI+):[M+4H]4+ 2140.0080.(条件1)
窒素雰囲気下、化合物56(50mg、5.8μmol)の塩化メチレン(2.0mL)とピリジン(0.12mL)の混合溶液に40℃でホスホン酸(19mg、0.23mmol)を加え、2,2−ジメチルブチリルクロリド(25μL、0.18mmol)を5分割して加えて1時間12分間撹拌した。その後、反応混合物をMeCN(39g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物57(44mg)を薄い肌色固体として得た。
MS(ESI+):[M+4H]4+ 2155.9794.(条件1)
MS(ESI+):[M+5H]5+ 2205.1210.(条件1)
実施例9の工程2と同様の条件で、化合物18の代わりに化合物24(1.3g、0.59mmol)を用いて反応を実施し、化合物59(1.1g、収率96%)を得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 1977.2053.(条件2)
実施例11と同様の条件で、化合物22の代わりに化合物59(1.1g、0.56mmol)を、化合物23の代わりに化合物60(Hongene Biotech社製)(1.5g、1.7mmol)を用いて反応を実施し、化合物61(1.4g、収率92%)を得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 2726.4152.(条件2)
実施例9の工程2と同様の条件で、化合物18の代わりに化合物61(1.4g、0.50mmol)を用いて反応を実施し、化合物62(1.1g、収率91%)を得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 2424.3080.(条件2)
実施例24の工程2と同様の条件で、化合物59の代わりに化合物62(1.0g、0.42mmol)を、化合物60の代わりに化合物63(Hongene Biotech社製)(1.2g、1.3mmol)を用いて反応を実施し、化合物64(1.2g、収率85%)を得た。
MS(ESI+):[M+2H]2+ 1639.7885.(条件4)
窒素雰囲気下、化合物64(0.20g、61μmol)、インドール(36mg、0.31mmol)の塩化メチレン(2mL)溶液を10℃に冷却し、トリフルオロ酢酸(48μL,0.61mmol)を加えて50分間撹拌した。ピリジン(0.50mL)を加えて室温に昇温し、反応混合物をMeCN(150g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物65(0.14g、収率79%)を得た。
MS(ESI+):[M+2H]2+ 1487.7157.(条件5)
1H-NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.88(t,6H),1.19-1.80(m,80H),2.68(s,1H),3.90-3.95(m,4H),6.79-6.82(m,4H),7.11-7.15(m,4H),7.23-7.30(m,5H).
MS(ESI-):[M-H]- 907.7946.(条件4)
窒素雰囲気下、化合物67(0.50g、0.55mmol)と化合物68(Berry社製)(0.22g、0.60mmol)の塩化メチレン(5mL)とピリジン(5mL)の混合溶液に、室温で塩化チオニル(0.12mL、1.6mmol)を加え、1時間撹拌した。その後、化合物68(0.84mg、2.4mmol)、塩化チオニル(0.30mL、4.1mmol)を追加し、26時間撹拌した。その後、反応混合物をMeCN(300g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物69の3’−OTBS保護体の湿結晶(2.4g)を得た。
窒素雰囲気下、化合物69の3’−OTBS体の湿結晶(2.4g)のTHF(35mL)溶液に、室温で1.0M TBAF/THF溶液(1.0mL、1.0mmol)を加えて21時間撹拌した。反応混合物を減圧下濃縮し、MeCN(253g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物69の粗結晶(0.34g)を得た。薄層シリカゲルクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル/トリエチルアミン=49/49/2)にて精製した。得られた固体を塩化メチレンに溶解させた後、MeCN(5mL)に加えて析出した固体をろ過し、化合物69(50mg、収率8%)を得た。
1H-NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.89(t,6H),1.27-1.81(m,83H),2.33-2.40(m,2H),3.37-3.53(m,2H),3.91-3.96(m,4H),4.04-4.05(m,1H),4.52-4.67(m,1H),6.40(t,1H),6.83(d,4H),7.24-7.58(m,9H),7.90(s,1H).
MS(ESI+):[M+H]+ 1133.8825.(条件6)
窒素雰囲気下、ホスホン酸(31mg、0.38mmol)のピリジン(0.40mL)溶液に40℃で2,2−ジメチルブチリルクロリド(31μL、0.23mmol)を加え、30分間撹拌した。その後、化合物65(69mg、23μmol)を加えて1時間撹拌し、2,2−ジメチルブチリルクロリド(62μL、0.46mmol)を加えて3時間撹拌した。反応混合物をMeCN(14mL)に加えて析出した固体をろ過し、化合物70(56mg)を得た(H−ホスホネート化工程)。
MS(ESI+):[M+2H]2+ 1519.7002.(条件4)
MS(ESI+):[M+2H]2+ 2119.6333.(条件6)
窒素雰囲気下、化合物71(1.0mg、0.24μmol)のTHF(0.20mL)溶液に室温で酢酸(50μL)、2,4,6−コリジン(50μL)を加え、ベンジルヒドラジン塩酸塩(0.19μg、1.2μmol)を含む水(2.3μL)溶液を加え、3時間撹拌した。その後、ベンジルヒドラジン塩酸塩(0.38μg、2.4μmol)を含む水(4.7μL)溶液を加え、3時間撹拌した。反応混合物をLC−MSにより分析し、化合物72が主生成物であることを確認した。
MS(ESI+):[M+2H]2+ 1608.1779.(条件5)
MS(ESI+):[M+H]+ 2253.6741.(条件3)
窒素雰囲気下、化合物64(10mg、3.1μmol)のTHF(0.20mL)溶液に室温で酢酸(50μL)、2,4,6−コリジン(50μL)を加え、tert−ブチルヒドラジン塩酸塩(4.4mg、35μmol)を含む水(30μL)溶液を加え、7時間撹拌した。反応混合物をLC−MSにより分析し、化合物73の生成を確認した。
実施例28−1と同様の条件で、tert−ブチルヒドラジン塩酸塩の代わりに、シクロペンチルヒドラジン塩酸塩(4.2mg、30μmol;実施例28−2)、イソプロピルヒドラジン塩酸塩(3.4mg、30μmol;実施例28−3)、ベンジルヒドラジン塩酸塩(2.4mg、15μmol;実施例28−4)、シクロヘキシルヒドラジン塩酸塩(4.6mg、30μmol;実施例28−5)又はエチルヒドラジンシュウ酸塩(4.6mg、30μmol;実施例28−6;水は60μL用いた)を用いて反応を実施した。各反応混合物をLC−MSにより分析し、化合物73が主生成物であることを確認した。
実施例28−1と同様の条件で、tert−ブチルヒドラジン塩酸塩の代わりに2,2,2−トリフルオロエチルヒドラジン(70%水溶液)(5.0μL、30μmol;実施例28−7)又は2−シアノエチルヒドラジン(2.6mg、30μmol;実施例28−8)を用いて、溶解のための水を用いずに反応を実施した。各反応混合物をLC−MSにより分析し、化合物73の生成を確認した。
実施例28−1と同様の条件で、tert−ブチルヒドラジン塩酸塩の代わりにベンジルヒドラジン塩酸塩(2.4mg、15μmol;実施例28−9)、2,4,6−コリジンの代わりに酢酸ナトリウム(1.3mg、15μmol)を用いて反応を実施し、反応混合物をLC−MSにより分析し、化合物73が主生成物であることを確認した。
1H-NMR:(300MHz;CDCl3)δ2.37-2.90(m,3H),3.41-3.46(m,2H),3.77(s,6H),4.14-4.17(m,1H),4.70(s,1H),6.44-6.48(m,1H),6.78-6.82(m,4H),7.19-7.41(m,10H),7.64-7.73(m,2H),8.18(s,1H),8.48(s,1H),8.60(s,1H),11.66(s,1H).
MS(ESI+):[M+H]+ 775.2190.(条件3)
1H-NMR:(300MHz;DMSO-d6)δ3.16-4.14(m,16H),4.48(s,1H),4.68-4.70(m,1H),5.20-5.31(brs,1H),6.15-6.16(m,1H),6.80-6.85(m,4H),7.18-7.26(m,7H),7.35(d,2H),7.60(t,1H),7.82(d,1H),7.95(d,1H),8.56(s,1H),8.63(s,1H),10.65(s,1H),11.64(s,1H).
MS(ESI+):[M+H]+ 849.2548.(条件3)
1H-NMR:(300MHz;DMSO-d6)δ1.71(s,3H),2.19-2.36(m,2H),3.18-4.32(m,15H),5.36-5.37(m,1H),5.76-5.77(m,1H),6.19-6.22(m,1H),6.57-6.61(m,1H),6.57-6.61(m,1H),6.89-6.97(m,5H),7.25-7.41(m,9H),7.85-7.87(m,2H),9.13(s,1H),12.76(s,1H).
MS(ESI+):[M+H]+ 723.3010.(条件3)
1H-NMR:(300MHz;DMSO-d6)δ1.60(s,3H),3.26-3.33(m,5H),3.50-3.54(m,2H),3.70-3.86(m,17H),4.00-4.06(m,2H),4.26-4.28(m,1H),5.10-5.13(m,1H),5.87-5.88(m,1H),6.57-6.61(m,1H),6.90-6.97(m,5H),7.25-7.42(m,9H),7.80-7.86(m,2H),9.12(s,1H),12.71(s,1H).
1H-NMR:(300MHz;CDCl3)δ1.26-1.63(m,3H),3.38-4.27(m,18H),5.93-6.03(m,1H),6.83-7.62(m,19H),8.14(s,1H),12.06-12.85(m,1H).
MS(ESI+):[M+H]+ 737.3108.(条件3)
1H-NMR:(300MHz;DMSO-d6)δ1.52(s,3H),3.15-4.27(m,18H),5.17(d,1H),5.83(d,1H),6.88-8.40(m,17H).
MS(ESI+):[M+H]+ 738.3097.(条件3)
窒素雰囲気下、化合物84(Organic Letters, 2014年, 16巻, 4059頁−4061頁に記載の方法に準じて合成した)(0.10g、0.20mmol)のピリジン(2.0mL)溶液に室温でp−トルエンスルホニルイソシアナート(0.19mL、1.2mmol)を加えて18時間30分間撹拌した。酢酸エチル、水を加えて分液した。得られた有機層を減圧下濃縮し、粗物を得た。粗物をシリカゲルクロマトグラフィー(クロロホルム/MeOH=18/1)にて精製し、化合物85(99mg、収率71%)を白色固体として得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 691.2713.(条件3)
参考合成例8−1と同様の条件で、p−トルエンスルホニルイソシアナートの代わりに2−ニトロフェニルイソシアナート(0.24g、1.5mmol)を用いて反応を実施し、化合物86(97mg、収率73%)を黄色固体として得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 658.2784.(条件3)
参考合成例8−1と同様の条件で、p−トルエンスルホニルイソシアナートの代わりに2−(トリフルオロメチル)フェニルイソシアナート(0.18μL、1.2mmol)を用いて反応を実施し、化合物87(0.17g、定量的)を白色固体として得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 681.2802.(条件3)
参考合成例8−1と同様の条件で、p−トルエンスルホニルイソシアナートの代わりに3−(トリフルオロメチル)フェニルイソシアナート(0.11μL、0.81mmol)を用いて反応を実施し、化合物88を得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 681.2796.(条件3)
参考合成例8−1と同様の条件で、p−トルエンスルホニルイソシアナートの代わりに4−(トリフルオロメチル)フェニルイソシアナート(0.12μL、0.81mmol)を用いて反応を実施し、化合物89(58.7mg、収率43%)を白色固体として得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 681.2846.(条件3)
参考合成例8−1と同様の条件で、p−トルエンスルホニルイソシアナートの代わりに2−シアノフェニルイソシアナート(0.12mg、0.81mmol)を用いて反応を実施し、化合物90(25mg、収率18%)を白色固体として得た。
1H-NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.86-1.11(m,28H),2.67-2.82(m,2H),3.90-3.95(m,1H),4.06-4.08(m,2H),4.92-5.00(m,1H),6.34-6.37(m,1H),7.16(t,1H),7.58-7.65(m,2H),8.36(s,1H),8.55(d,1H),8.71(s,2H),13.14(s,1H).
参考合成例8−1と同様の条件で、p−トルエンスルホニルイソシアナートの代わりに2−(トリフルオロメトキシ)フェニルイソシアナート(0.12μL、0.81mmol)を用いて反応を実施し、化合物91(53mg、収率38%)を淡黄色固体として得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 697.2735.(条件3)
参考合成例8−1と同様の条件で、p−トルエンスルホニルイソシアナートの代わりに2−クロロ−4−(トリフルオロメチル)フェニルイソシアナート(89mg、0.40mmol)を用いて反応を実施し、化合物92(30mg、収率42%)を白色固体として得た。
1H-NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.88-1.25(m,28H),2.67-2.76(m,2H),3.90-3.93(m,1H),4.05-4.07(m,2H),4.92-4.95(m,1H),6.32-6.36(m,1H),7.53(dd,1H),7.63(d,1H),8.29(s,1H),8.34(d,1H),8.43(s,1H),8.54(s,1H),12.42(s,1H).
MS(ESI+):[M+H]+ 715.2489.(条件3)
参考合成例8−1と同様の条件で、p−トルエンスルホニルイソシアナートの代わりに4−イソシアナトピリジン(0.22g、1.8mmol)を用いて反応を実施し、化合物93を白色泡状固体として得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 614.2952.(条件3)
参考合成例8−1と同様の条件で、p−トルエンスルホニルイソシアナートの代わりにペンタフルオロフェニルイソシアナート(0.11μL、0.81mmol)を用いて反応を実施し、化合物94(69mg、収率48%)を白色固体として得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 703.2538.(条件3)
窒素雰囲気下、ニコチン酸(30mg、0.24mmol)、及びジフェニルホスホリルアジド(47μL、0.22mmol)のMeCN(0.80mL)溶液に室温でトリエチルアミン(61μL、0.44mmol)を加えて20時間撹拌した。反応混合物を8分割し化合物84(5.5mg、11μmol)を加えて、60℃で2日間撹拌した。その後室温まで冷却した後、析出した固体をろ取して、化合物95(2.8mg、収率41%)を白色固体として得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 614.2864.(条件3)
窒素雰囲気下、化合物96(Organic Letters, 2014年, 16巻, 4059頁−4061頁に記載の方法に準じて、2’−デオキシアデノシンの代わりに2’−デオキシ−5−メチルシチジン(東京化成工業社製)(3.0g、12mmol)を用いて合成し、化合物96(2.3g、収率39%)を得た)(0.10g、0.21mmol)のピリジン(2.0mL)溶液に室温で2−(トリフルオリメチル)フェニルイソシアナート(0.13mL、0.83mmol)を加えて2時間30分間撹拌した。酢酸エチル、水を加えて分液した。得られた有機層を減圧下濃縮し、粗物を得た。粗物をシリカゲルクロマトグラフィー(クロロホルムのみ)にて精製し、化合物97(65mg、収率46%)を白色固体として得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 671.2830.(条件3)
参考合成例9−1と同様の条件で、2−(トリフルオロメチル)フェニルイソシアナートの代わりに2−ニトロフェニルイソシアナート(0.13mg、0.81mmol)を用いて反応を実施し、化合物98(0.10g、収率76%)を白色固体として得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 648.2807.(条件3)
参考合成例9−1と同様の条件で、2−(トリフルオロメチル)フェニルイソシアナートの代わりにフェニルイソシアナート(90μL、0.83mmol)を用いて反応を実施し、化合物99を得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 603.3000.(条件3)
参考合成例9−1と同様の条件で、2−(トリフルオロメチル)フェニルイソシアナートの代わりに2−クロロフェニルイソシアナート(0.10mL、0.83mmol)を用いて反応を実施し、化合物100(77mg、収率59%)を得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 637.2566.(条件3)
参考合成例9−1と同様の条件で、2−(トリフルオロメチル)フェニルイソシアナートの代わりに2−フルオロフェニルイソシアナート(93μL、0.83mmol)を用いて反応を実施し、化合物101(25mg、収率20%)を得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 621.2862.(条件3)
参考合成例9−1と同様の条件で、2−(トリフルオロメチル)フェニルイソシアナートの代わりにベンジルイソシアナート(0.10mL、0.83mmol)を用いて反応を実施し、化合物102(0.14g、定量的)を得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 617.3167.(条件3)
参考合成例9−1と同様の条件で、2−(トリフルオロメチル)フェニルイソシアナートの代わりにエチルイソシアナート(65μL、0.83mmol)を用いて反応を実施し、化合物103(82mg、収率71%)を得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 555.3019.(条件3)
参考合成例8−11と同様の条件で、ニコチン酸の代わりにピコリン酸(60mg、0.49mmol)を用いて反応を行った。反応混合物を2分割して、化合物84の代わりに化合物96(30mg、62μmol)を用いて反応を実施し、化合物104(3.5mg、収率9%)を得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 604.2959.(条件3)
参考合成例9−8と同様の条件で、ピコリン酸の代わりにニコチン酸(30mg、0.24mmol)を用いて反応を行った。反応混合物を2分割して化合物96(10mg、21μmol)を用いて反応を実施し、化合物105(1.5mg、収率12%)を得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 604.2967.(条件3)
窒素雰囲気下、1,1’−カルボニルジイミダゾール[CDI](0.10g、0.62mmol)の塩化メチレン(2.0mL)溶液に室温で4−アミノピリジン(59mg、0.63mmol)のDMF(1.0mL)溶液を加えて3時間35分間撹拌した。化合物96(74mg、0.15mmol)を加えて1晩撹拌した後、酢酸エチル、水を加えて分液した。得られた有機層を減圧下濃縮し、粗物を得た。粗物をシリカゲルクロマトグラフィー(クロロホルム/MeOH=30/1)にて精製し、化合物106(64mg、収率68%)を白色固体として得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 604.2951.(条件3)
参考合成例7と同様の条件で、化合物80の代わりに化合物78(6.9g、13mmol)を用いて反応を実施し、粗物をシリカゲルクロマトグラフィー(酢酸エチル/メタノール/トリエチルアミン=85.5/9.5/5)にて精製し、化合物107(4.2g、収率49%)を白色泡状固体として得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 664.2762.(条件3)
窒素雰囲気下、化合物78(36mg、66μmol)のDMF(0.70mL)溶液に室温で2−メトキシフェニルイソシアナート(8.5μL、66μmol)を加えて16時間20分間撹拌した。反応混合物を減圧下濃縮し、粗物を得た。粗物を薄層シリカゲルクロマトグラフィー(酢酸エチル/トリエチルアミン=95/5)にて精製し、化合物108(32mg、収率70%)を得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 693.2883.(条件3)
参考合成例10−2と同様の条件で、2−メトキシフェニルイソシアナートの代わりに2−(トリフルオロメトキシ)フェニルイソシアナート(10μL、66μmol)を用いて反応を行い、化合物109(36mg、収率72%)を得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 747.2594.(条件3)
参考合成例10−2と同様の条件で、2−メトキシフェニルイソシアナートの代わりに2,6−ジクロロフェニルイソシアナート(13μL、66μmol)を用いて反応を行った。反応混合物をLC−MSにより分析し、化合物110が主生成物であることを確認した。
MS(ESI+):[M+H]+ 731.1975.(条件3)
参考合成例10−2と同様の条件で、2−メトキシフェニルイソシアナートの代わりに2−クロロフェニルイソシアナート(8.0μL、66μmol)を用いて反応を行い、化合物111(15mg、収率33%)を得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 697.2391.(条件3)
参考合成例10−2と同様の条件で、2−メトキシフェニルイソシアナートの代わりに2−フルオロフェニルイソシアナート(7.5μL、66μmol)を用いて反応を行い、化合物112(13mg、収率29%)を得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 681.2701.(条件3)
参考合成例10−2と同様の条件で、2−メトキシフェニルイソシアナートの代わりに2−メチルフェニルイソシアナート(8.2μL、66μmol)を用いて反応を行い、化合物113(28mg、収率63%)を得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 677.2956.(条件3)
参考合成例10−2と同様の条件で、2−メトキシフェニルイソシアナートの代わりに2,6−ジメチルフェニルイソシアナート(9.2μL、66μmol)を用いて反応を行い、化合物114(33mg、収率73%)を得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 691.3101.(条件3)
参考合成例10−2と同様の条件で、2−メトキシフェニルイソシアナートの代わりに2,6−ジフルオロフェニルイソシアナート(10mg、66μmol)を用いて反応を行い、化合物115(29mg、収率62%)を得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 699.2597.(条件3)
参考合成例10−2と同様の条件で、2−メトキシフェニルイソシアナートの代わりにフェニルイソシアナート(2.0mL、18mmol)を用いて反応を行い、化合物116(5.5g、収率45%)を白色泡状固体として得た。
1H-NMR:(300MHz;DMSO-d6)δ1.59-2.78(m,3H),2.23-2.49(m,2H),3.23-3.34(m,2H),3.73(s,6H),3.95-4.32(m,2H),5.36-5.37(m,1H),6.17-6.22(m,1H),6.89-6.92(m,4H),7.09-7.85(m,15H),9.20-9.75(m,1H),12.52-12.69(m,1H).
MS(ESI+):[M+H]+ 663.2767.(条件3)
参考合成例10−2と同様の条件で、2−メトキシフェニルイソシアナートの代わりに2,4−ジメトキシフェニルイソシアナート(12mg、74μmol)を用いて反応を行い、化合物117(37mg、収率77%)を得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 723.2998.(条件3)
参考合成例10−2と同様の条件で、2−メトキシフェニルイソシアナートの代わりに3,4−ジメトキシフェニルイソシアナート(11μL、74μmol)を用いて反応を行い、化合物118(31mg、収率59%)を得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 723.3019.(条件3)
参考合成例10−2と同様の条件で、2−メトキシフェニルイソシアナートの代わりに3,5−ジメトキシフェニルイソシアナート(13mg、74μmol)を用いて反応を行い、化合物119(12mg、収率23%)を得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 723.3010.(条件3)
窒素雰囲気下、化合物78(50mg、92μmol)のピリジン(1.0mL)溶液に、室温でTMSCl(47μL、0.37mmol)を加えて30分間撹拌した。その後、CDI(22mg、0.14mmol)を加えて1時間撹拌し、2,6−ジメトキシアニリン(21mg、0.14mmol)を加え、16時間15分撹拌した。28%アンモニア水(0.25mL)を加え、21時間撹拌した。反応混合物を減圧下濃縮し、塩化メチレン(0.75g)、及び水(0.40g)を加えて分液した。得られた有機層を水(0.40mL)で洗浄した後に溶媒を減圧下留去し、粗物を得た。粗物を薄層シリカゲルクロマトグラフィー(クロロホルム/MeOH/トリエチルアミン=90/5/5)にて精製し、化合物120(46mg、収率61%)を得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 723.3003.(条件3)
参考合成例10−14と同様の条件で、2,6−ジメトキシアニリンの代わりに3,4,5−トリメトキシアニリン(25mg、0.14mmol)を用いて反応を実施し、化合物121(22mg、収率32%)を得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 753.3112.(条件3)
参考合成例10−14と同様の条件で、2,6−ジメトキシアニリンの代わりに2,4,5−トリメトキシアニリン(25mg、0.14mmol)を用いて反応を実施し、化合物122(31mg、収率44%)を得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 753.3075.(条件3)
参考合成例10−14と同様の条件で、2,6−ジメトキシアニリンの代わりに2,3,4−トリメトキシアニリン(25mg、0.14mmol)を用いて反応を実施し、化合物123(19mg、収率27%)を得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 753.306.(条件3)
実施例1−2の工程1と同様の条件で、化合物5の代わりに化合物75(1.1g、1.4mmol)を用いて反応を実施し、化合物124(1.6g、収率94%)を得た。
1H-NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.88(t,9H),1.20-1.82(m,96H),2.68-3.10(m,6H),3.42-3.44(m,2H),3.78(s,6H),3.96-4.04(m,6H),4.31-4.32(m,1H),4.91(s,2H),5.50-5.60(m,1H),6.40-6.51(m,1H),6.78-6.81(m,4H),7.21-7.39(m,10H),7.64-7.73(m,2H),8.11(s,1H),8.21(s,1H),8.47(s,1H),11.57(s,1H).
MS(ESI-):[M-H]- 1796.1126.(条件7)
窒素雰囲気下、化合物124(1.5g、0.86mmol)、及びインドール(0.30g、2.6mmol)の塩化メチレン(30mL)溶液を10℃に冷却し、トリフルオロ酢酸(0.20mL,2.6mmol)を加えて1時間撹拌した。ピリジン(4.6mL)を加えて室温に昇温し、反応混合物をMeCN(339g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物125(1.2g、収率97%)を得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 1495.9817.(条件7)
MS(ESI+):[M+H]+ 1559.9517.(条件6)
MS(ESI+):[M+H]+ 2266.1980.(条件7)
窒素雰囲気下、化合物127(1.2g、0.53mmol)、及びインドール(1.2g、11mmol)の塩化メチレン(24mL)溶液に10℃で、4.0M塩化水素−ジオキサン溶液(0.26mL,1.1mmol)を加えて2時間35分撹拌して、化合物128を得た(脱一時保護基工程)。ピリジン(3.6mL)を加えて室温に昇温し、ホスホン酸(0.65g、7.9mmol)を加え、2,2−ジメチルブチリルクロリド(0.11mL、0.79mmol)を5分割して10分間隔で加えて1時間40分撹拌し、2,2−ジメチルブチリルクロリド(0.11mL、0.79mmol)を加えて40分間撹拌し、さらに2,2−ジメチルブチリルクロリド(0.11mL、0.79mmol)を加えて55分間撹拌した。反応混合物をMeCN(254g)に加えて析出した固体をろ過し、H−ホスホネート体(1.3g)を得た。
窒素雰囲気下、前記H−ホスホネート体(1.3g)のピリジン(24mL)溶液に化合物126(0.50g、0.79mmol)、炭酸ビスペンタフルオロフェニル(0.62g、1.6mmol)を加え、2時間撹拌した。その後、N−[(2−シアノエチル)チオ]フタルイミド(0.18g、0.79mmol)を加え、1時間50分撹拌した。その後、無水イソ酪酸(0.88mL,5.3mmol)、N−メチルイミダゾール(0.42mL、5.3mmol)を加えて1時間40分撹拌し、反応混合物をMeOH(241g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物129(1.2g、収率87%)を得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 2734.3031.(条件6)
実施例29の工程3と同様の条件で、化合物127の代わりに化合物129(1.1g、0.40mmol)、化合物126の代わりに化合物75(0.46g、0.60mmol)を用いて反応を実施し、化合物130(1.1g、収率87%)を白色固体として得た。
MS(ESI+):[M+2H]2+ 1669.1845.(条件6)
実施例29の工程3と同様の条件で、化合物127の代わりに化合物130(0.96g、0.29mmol)、化合物126の代わりに化合物116(0.29g、0.43mmol)を用いて反応を実施し、化合物131(0.93g、収率86%)を白色固体として得た。
MS(ESI+):[M+2H]2+ 1914.7332.(条件6)
実施例29の工程3の脱一時保護基工程と同様の条件で、化合物127の代わりに化合物130(0.10g、30μmol)を用いて反応を実施し、反応混合物をMeOH(20g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物132(75mg、収率83%)を得た。
MS(ESI+):[M+2H]2+ 1518.1199.(条件6)
窒素雰囲気下、化合物67(0.25g、0.28mmol)の塩化メチレン(5mL)溶液に、室温で塩化チオニル(10μL、0.14mmol)を加えて30分間撹拌し、クロロ化体の溶液を調製した。
窒素雰囲気下、上記クロロ化体の溶液のうち3分の1に、ピリジン(0.60mL)を加えた。この溶液に室温で化合物132(58mg、19μmol)を加えて、17時間撹拌した。5%炭酸水素ナトリウム水溶液で分液し、得られた有機層をMeCN(25g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物133(0.14g)を得た。
MS(ESI-):[M-2H]2- 1961.5124.(条件7)
窒素雰囲気下、化合物133(0.13g)のTHF(1.5mL)溶液に室温で酢酸(0.25mL)を加え、メチルヒドラジン(10μL、0.20mmol)を加え、6時間30分撹拌した。その後、反応混合物をMeOH(27g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物134(0.11g)を白色固体として得た。
MS(ESI-):[M-2H]2- 1450.0510.(条件6)
窒素雰囲気下、化合物134のTHF溶液を室温で20時間撹拌した。反応混合物をLC−MSにより分析し、化合物135が主生成物であることを確認した。その後、HPLC分析を行い、化合物135の面積百分率は90%であった。
MS(ESI+):[M+2H]2+ 1006.6731.(条件3)
HPLC分析条件は、以下の通りである。
カラム:L−column ODS(3.0μm、3.0×150mm)
カラム温度:50℃
溶離液組成:有機層としてMeCNを、水層として水を用いた。
有機層と水層の混合比(体積比)を10/90で5分間固定した後、10分間で95/5に直線的に変えた。その後5分間、有機層と水層の混合比を95/5に固定した。
流速:0.80mL/min
検出波長:260nm
窒素雰囲気下、ドコシルブロミド(東京化成工業社製)(6.6g、17mmol)、及び化合物136(東京化成工業社製)(1.4g、8.1mmol)のDMF(20mL)懸濁液を80℃に昇温して、炭酸カリウム(4.4g、32mmol)を加えて50時間20分撹拌した。室温まで冷却し、反応混合物にTHFを加えて撹拌した後、吸引ろ過し、不溶物を除いた。得られたろ液を減圧下濃縮した後、MeOH(702g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物137(6.3g、収率99%)を淡黄色固体として得た。
1H-NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.88(t,6H),1.05-1.88(m,80H),3.88(s,3H),4.00-4.06(m,4H),6.85(d,1H),7.53(d,1H),7.63(dd,1H).
MS(ESI+):[M+H]+ 785.7363.(条件6)
窒素雰囲気下、化合物137(5.2g、6.7mmol)のTHF(102g)溶液に、室温で1.0M フェニルマグネシウムブロミド/THF溶液(20mL、20mmol)を加え、50℃で3時間撹拌した。室温に冷却し、1 mol/L塩酸(30g)、酢酸エチル(31g)を加えて分液した。得られた有機層を5%炭酸水素ナトリウム水溶液(30mL)、5%塩化ナトリウム水溶液(30mL)で洗浄した後、反応混合物をMeOH(52g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物138(5.9g、収率97%)を白色固体として得た。
1H-NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.90(t,6H),1.08-1.86(m,80H),2.77(s,1H),3.88(t,2H),3.98(t,2H),6.64(dd,1H),6.77(d,1H),6.88(d,1H),7.24-7.34(m,10H).
実施例1−2の工程1と同様の条件で、化合物5の代わりに化合物126(0.92g、1.4mmol)を用いて反応を実施し、化合物139(1.5g、収率96%)を得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 1663.1637.(条件6)
実施例29の工程2と同様の条件で、化合物124の代わりに化合物139(1.5g、0.88mmol)、化合物126の代わりに化合物75(0.84g、1.1mmol)を用いて反応を実施し、化合物140(1.3g、収率80%)を得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 2266.2098.(条件6)
実施例29の工程3と同様の条件で、化合物127の代わりに化合物140(0.97g、0.43mmol)、化合物126の代わりに化合物116(0.43g、0.64mmol)を用いて反応を実施し、化合物141(0.90g、収率76%)を得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 2638.2663.(条件6)
実施例29の工程3と同様の条件で、化合物127の代わりに化合物141(0.82g、0.30mmol)、化合物126の代わりに化合物5(0.25g、0.45mmol)を用いて反応を実施し、化合物142(0.74g、収率81%)を白色固体として得た。
MS(ESI+):[M+2H]2+ 1565.6859.(条件6)
実施例29の工程3と同様の条件で、化合物127の代わりに化合物142(0.69g、0.22mmol)、化合物126の代わりに化合物120(0.22g、0.33mmol)を用いて反応を実施し、化合物143(0.61g、収率77%)を白色固体として得た。
MS(ESI+):[M+2H]2+ 1811.2333.(条件6)
実施例29の工程3と同様の条件で、化合物127の代わりに化合物143(0.41g、0.11mmol)を用いて脱一時保護基工程を実施し、反応混合物をMeCN(80g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物144(0.34g、収率92%)を白色固体として得た。
MS(ESI+):[M+2H]2+ 1660.1891.(条件6)
窒素雰囲気下、化合物138(0.12g、0.14mmol)の塩化メチレン(2.2)溶液に、室温で4.0M 塩化水素/ジオキサン溶液(0.10mL、0.41mmol)を加えて30分間撹拌し、化合物138のクロロ化体の溶液を調製した。
窒素雰囲気下、化合物144(0.20g、61μmol)、ピリジン(48μL、0.60mmmol)及びモレキュラーシーブス4A(0.20g)の塩化メチレン(4.0mL)懸濁液を室温で45分間撹拌し、上記クロロ化体の溶液の6割を加えて15時間撹拌した。インドール(36mg、0.31mmol)を加えて3時間撹拌し、反応混合物をMeCN(44g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物145(0.22g)を淡黄色固体として得た。
MS(ESI+):[M+2H]2+ 2105.5634.(条件6)
実施例30の工程3と同様の条件で、化合物133の代わりに化合物145(0.16g)を用いて反応を実施し、化合物146(63mg)を黄色固体として得た。
MS(ESI+):[M+2H]2+ 1594.1236.(条件6)
実施例26の工程2(H−ホスホネート化工程)と同様の条件で、化合物65の代わりに化合物144(0.12g、30μmol)を用いて反応を実施し、化合物147を得た。実施例26の工程2(カップリング工程及び硫化工程)と同様の条件で、化合物70の代わりに化合物147、化合物69の代わりに化合物146(42mg)を用いて反応を実施し、化合物148(0.11g)を白色固体として得た。
MS(ESI+):[M+3H]3+ 2212.8775.(条件6)
実施例1−2の工程1と同様の条件で、化合物5の代わりに化合物77(1.2g、1.4mmol)を用いて反応を実施し、化合物149(1.6g、収率93%)を薄肌色固体として得た。
1H-NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.88(t,9H),1.26-1.82(m,96H),2.70-2.95(m,4H),3.15(s,3H),3.37-4.02(m,18H),4.35-4.45(m,1H),4.80-5.15(m,3H),5.46-5.55(m,1H),6.10-6.20(m,1H),6.78-6.82(m,4H),7.22-7.78(m,14H),8.20(s,1H),8.35(s,1H),8.47(s,1H),11.59(s,1H).
MS(ESI+):[M+H]+ 1872.1504.(条件6)
実施例29の工程2と同様の条件で、化合物124の代わりに化合物149(1.5g、0.82mmol)、化合物126の代わりに化合物83(0.90g、1.2mmol)を用いて反応を実施し、化合物150(1.6g、収率91%)を白色固体として得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 2438.2903.(条件6)
1H-NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.88(t,9H),1.25-1.76(m,96H),2.75(s,1H),3.80(t,4H),3.94(t,2H),6.24(s,2H),7.25-7.33(m,10H).
実施例31の工程1と同様の条件で、化合物136の代わりに化合物154(0.89g,5.9mmol)、ドコシルブロミドの代わりに化合物153(国際公開第2010−104169号に記載の方法に準じて合成した)(3.2g、5.6mmol)を用いて反応を実施し、反応混合物をMeCN(90mL)に加えて析出した固体をろ過し、化合物155(3.9g、収率81%)を白色固体として得た。
1H-NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.88(t,3H),1.19-1.85(m,60H),3.39(t,4H),3.88(s,3H),4.00(t,2H),6.87-6.92(m,2H),7.95-8.00(m,2H).
MS(ESI+):[M+H]+ 645.5813.(条件6)
実施例31の工程2と同様の条件で、化合物137の代わりに化合物155(1.5g、2.3mmol)を用いて反応を実施し、反応混合物をMeCN(151g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物156(1.6g、収率92%)を白色固体として得た。
1H-NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.89(t,3H),1.27-1.82(m,60H),2.76(s,1H),3.40(t,4H),3.95(t,2H),6.83(dt,2H),7.16(dt,2H),7.24-7.35(m,10H).
MS(ESI+):[M+H]+ 769.6353.(条件6)
窒素雰囲気下、化合物156(0.32mg、0.40mmol)の塩化メチレン(10mL)溶液に、室温で塩化オキサリル(0.10mL、1.2mmol)を加えて、2時間撹拌した。反応混合物をMeCN(30mL)に加えて析出した固体をろ過し、化合物157(0.33g、定量的)を白色固体として得た。
1H-NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.88(t,3H),1.25-2.00(m,60H),3.38(t,4H),3.95(t,2H),6.80(dt,2H),7.11(dt,2H),7.22-7.32(m,10H).
窒素雰囲気下、化合物128(31mg、16μmol)、ピリジン(6.2μL、77μmol)、モレキュラーシーブス4A(アルドリッチ社製)(34mg)の塩化メチレン(1mL)懸濁液に、室温で化合物157(16mg、20μmol)を加えて、17時間撹拌した。反応混合物をMeOHに加えて析出した固体をろ過し、化合物158(34mg、収率83%)を得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 2714.7099.(条件6)
実施例31と同様の条件で、化合物137の代わりに化合物159(国際公開第2012−157723号に記載の方法に準じて合成した)(2.7g、3.4mmol)を用いて反応を実施し、反応混合物をMeCN(278g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物160(3.0g、収率95%)を得た。
1H-NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.88(t,6H),1.25-1.88(m,80H),2.76(s,1H),3.84(t,4H),6.36-6.41(m,3H),7.03-7.60(m,10H).
MS(ESI+):[M+H]+ 909.8009.(条件6)
窒素雰囲気下、化合物160(0.53g、0.58mmol)の塩化メチレン(10mL)溶液に、室温で塩化オキサリル(0.15mL、1.7mmol)を加えて2時間撹拌した。反応混合物をMeCN(30mL)に加えて析出した固体をろ過し、化合物161(0.49g、収率92%)を白色固体として得た。
1H-NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.88(t,6H),1.07-1.74(m,80H),3.83(t,4H),6.36-6.39(m,3H),7.23-7.32(m,10H).
窒素雰囲気下、ジクロロ酢酸(0.18mL、2.2mmol)、レブリン酸(0.45mL、4.4mmol)のTHF(5.1g)溶液に室温でピロリジン(0.17mL、2.1mmol)を加え、66℃に昇温した。その後、化合物162(Chem. Asian. J., 2010年, 5巻, 904頁−909頁に記載の方法に準じて合成した)(1.0g、1.1mmol)のTHF(5.3g)溶液を加えて、2時間19分撹拌した。反応混合物をMeCN(101g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物163(1.0g、収率90%)を黄土色固体として得た。
1H-NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.88(t,9H),1.26-1.95(m,96H),2.70(t,2H),2.99(t,2H),3.98(t,6H),6.62(d,1H),6.74(s,2H),7.47(d,1H).
MS(ESI+):[M+H]+ 1009.9120.(条件7)
実施例1−2の工程1と同様の条件で、化合物4の代わりに化合物163(0.10g、0.10mmol)を用いて反応を実施し、反応混合物をMeCN(12g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物164(0.13g、収率81%)を茶色固体として得た。
1H-NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.88(t,9H),1.26-1.86(m,99H),2.43-2.51(m,2H),2.69-2.72(m,2H),3.00-3.07(m,2H),3.40-3.58(m,2H),3.78(s,6H),3.96-4.00(m,6H),4.16-4.17(m,1H),5.45-5.55(m,1H),6.44-6.45(m,1H),6.62(d,1H),6.74(s,2H),6.82-7.40(m,13H),7.48(d,1H),7.61(d,1H),8.00-8.18(brs,1H).
MS(ESI+):[M+NH4]+ 1553.1530.(条件7)
実施例5と同様の条件で、化合物9の代わりに化合物164(10mg、6.5μmol)を用いて反応を実施した。反応混合物をLC−MSにより分析し、化合物5及び化合物165が主生成物であることを確認した。
MS(ESI+):[M+H]+ 1005.9341.(条件6、化合物165)
実施例1−1の工程2と同様の条件で、化合物3の代わりに化合物163(0.30g、0.30mmol)を、10%パラジウム−炭素(Kタイプ)の代わりに5%パラジウム−アルミナ(92mg)を用いて反応を実施し、化合物166(0.21g、収率70%)を得た。
1H-NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.88(t,9H),1.26-1.82(m,98H),2.51-2.81(m,6H),3.81-3.95(m,6H),6.35(s,2H).
MS(ESI+):[M+H]+ 1011.9281.(条件7)
実施例1−2の工程1と同様の条件で、化合物4の代わりに化合物166(0.10g、0.10mmol)を用いて反応を実施し、反応混合物をMeCN(11g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物167(0.11g、収率70%)を白色固体として得た。
1H-NMR:(300MHz;CDCl3)δ0.88(t,9H),1.26-1.80(m,101H),2.25-2.78(m,8H),3.40-3.52(m,2H),3.79(s,6H),3.90-3.94(m,6H),4.10-4.17(m,1H),5.40-5.50(m,1H),6.35(s,2H),6.43(t,1H),6.82-6.85(m,4H),7.24-7.39(m,9H),7.61(s,1H),7.85-8.15(brs,1H).
MS(ESI+):[M+NH4]+ 1555.1683.(条件6)
実施例5と同様の条件で、化合物9の代わりに化合物167(10mg、6.5μmol)を用いて反応を実施した。反応混合物をLC−MSにより分析し、化合物5及び化合物168が主生成物であることを確認した。
MS(ESI+):[M+H]+ 1007.9448.(条件6、化合物168)
実施例1−2の工程1と同様の条件で、化合物5の代わりに化合物81(2.5g、3.2mmol)を用いて反応を実施し、化合物169(3.6g、収率94%)を得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 1820.2229.(条件6)
実施例29の工程2と同様の条件で、化合物124の代わりに化合物169(3.5g、1.9mmol)、化合物126の代わりに化合物81(2.3g、2.9mmol)を用いて反応を実施し、化合物170(4.1g、収率88%)を得た。
MS(ESI+):[M+H]+ 2445.3879.(条件6)
実施例30の工程3と同様の条件で、化合物133の代わりに化合物148(40mg)を用いて反応を実施し、化合物171(30mg)を得た。
MS(ESI+):[M+3H]3+ 1871.8923.(条件6)
実施例29の工程3(脱一時保護基工程)と同様の条件で、化合物127の代わりに化合物148(55mg)を用いて反応を実施し、反応混合物をMeCN(10g)に加えて析出した固体をろ過し、化合物172(41mg)を白色固体として得た。
MS(ESI+):[M+3H]3+ 1915.9278.(条件6)
実施例26の工程2(H−ホスホネート化工程)と同様の条件で、化合物65の代わりに化合物172(30mg)を用いて反応を実施し、化合物173を得た。
MS(ESI+):[M+3H]3+ 1937.2397.(条件6)
MS(ESI+):[M+5H]5+ 2298.6761.(条件6)
Claims (48)
- 3’位及び5’位の一方が、下記式(II)
(式中、*は、ヒドロキシ基との結合位置を示し、
R1は、それぞれ独立して、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基、C2−40アルキニル基又は、
式 −L7−O−R4
(式中、L7は、C1−40アルキレン基、C2−40アルケニレン基又はC2−40アルキニレン基であり、R4は、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基又はC2−40アルキニル基である)で表される基であり、少なくとも1つのR1の炭素数は10以上であり、sは、1から5の整数であり、
L11は、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L12は、単結合、−O−又は−N(R2)−(式中、R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)であり、
L13は、単結合、−C(O)−又はC1−6アルキレン基であり、L12が単結合のとき、L13は、単結合又は−C(O)−である)で表される保護基で置換されたヒドロキシ基であり、
5’位及び3’位の一方が一時保護基で置換されたヒドロキシ基であるオリゴヌクレオチドを、
溶媒中、ヒドラジン誘導体、ジアミン誘導体、ヒドロキシルアミン誘導体及びアミノアルコール誘導体から選択される少なくとも1つのアミノ化合物を反応させ、
前記式(II)で表される保護基を除去する工程を含む、
3’位及び5’位の一方がヒドロキシ基であり、5’位及び3’位の一方が一時保護基で置換されたヒドロキシ基であるオリゴヌクレオチドの製造方法。 - 3’位が前記式(II)で表される保護基で置換されたヒドロキシ基であり、5’位が一時保護基で置換されたヒドロキシ基であるオリゴヌクレオチドを反応させる、請求項1に記載の製造方法。
- 前記アミノ化合物が、ヒドラジン誘導体である、請求項1又は2に記載の製造方法。
- 前記アミノ化合物が、ヒドラジン一水和物である、請求項1から3のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記アミノ化合物が、C1−6アルキルヒドラジンである、請求項1から3のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記式(II)で表される保護基を除去する工程が、溶媒として、ハロゲン化炭化水素溶媒、環状エーテル溶媒、低級脂肪族酸溶媒及びピリジン系溶媒からなる群から選択される少なくとも1つの溶媒中で実施される、請求項1から5のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記式(II)で表される保護基を除去する工程の前に、3’位及び5’位の一方が、前記式(II)で表される保護基で置換されたヒドロキシ基であり、5’位及び3’位の一方が、一時保護基で置換されたヒドロキシ基であるオリゴヌクレオチドを含む低極性溶媒溶液と、極性溶媒とを混合して沈殿物を生成させ、生成した沈殿物を固液分離により取得する精製工程を更に含む、請求項1から6のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記極性溶媒が炭素数1から6のアルコール溶媒又は炭素数1から6のニトリル溶媒である、請求項7に記載の製造方法。
- 前記一時保護基が、それぞれ独立して、tert-ブチルジメチルシリル基、トリチル基、モノメトキシトリチル基又はジメトキシトリチル基である、請求項1から8のいずれか1項に記載の製造方法。
- 3’位及び5’位の一方が、下記式(II)
(式中、*は、ヒドロキシ基との結合位置を示し、
R1は、それぞれ独立して、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基、C2−40アルキニル基又は、
式 −L7−O−R4
(式中、L7は、C1−40アルキレン基、C2−40アルケニレン基又はC2−40アルキニレン基であり、R4は、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基又はC2−40アルキニル基である)で表される基であり、少なくとも1つのR1の炭素数は10以上であり、sは、1から5の整数であり、
L11は、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L12は、単結合、−O−又は−N(R2)−(式中、R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)であり、
L13は、単結合、−C(O)−又はC1−6アルキレン基であり、L12が単結合のとき、L13は、単結合又は−C(O)−である)で表される保護基で置換されたヒドロキシ基であり、
5’位及び3’位の一方が、反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基、又はヒドロキシ基であるn個重合オリゴヌクレオチドと、
3’位及び5’位の一方が、ヒドロキシ基又は反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基であり、5’位及び3’位の一方が、一時保護基で置換されたヒドロキシ基であるp個重合オリゴヌクレオチドとを反応させ、
n個重合オリゴヌクレオチドとp個重合オリゴヌクレオチドとの結合体を生成するカップリング工程を含み、
n及びpは、それぞれ独立して、1以上の整数であり、
n個重合オリゴヌクレオチドの5’位及び3’位の一方が、反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基であるとき、p個重合オリゴヌクレオチドの3’位及び5’位の一方が、ヒドロキシ基であり、
n個重合オリゴヌクレオチドの5’位及び3’位の一方が、ヒドロキシ基であるとき、p個重合オリゴヌクレオチドの3’位及び5’位の一方が、反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基である、オリゴヌクレオチドの製造方法。 - n個重合オリゴヌクレオチドの5’位及び3’位の一方が反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基であり、p個重合オリゴヌクレオチドの3’位及び5’位の一方がヒドロキシ基である、請求項10に記載のオリゴヌクレオチドの製造方法。
- 前記カップリング工程の前に、3’位及び5’位の一方が、前記式(II)で表される保護基で置換されたヒドロキシ基であり、5’位及び3’位の一方がヒドロキシ基であるヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドの当該5’位又は3’位のヒドロキシ基を、反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基へ変換し、n個重合オリゴヌクレオチドを生成する反応性リン化工程を含む、請求項11に記載のオリゴヌクレオチドの製造方法。
- 前記反応性リン化工程の前に、3’位及び5’位の一方が、前記式(II)で表される保護基で置換されたヒドロキシ基であり、5’位及び3’位の一方が一時保護基で置換されたヒドロキシ基であるヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドの当該一時保護基を除去し、5’位及び3’位の一方にヒドロキシ基を生成する脱一時保護基工程を含む、請求項12に記載のオリゴヌクレオチドの製造方法。
- n個重合オリゴヌクレオチドの5’位が、反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基であり、3’位が、前記式(II)で表される保護基で置換されたヒドロキシ基であり、
p個重合オリゴヌクレオチドの3’位が、ヒドロキシ基である、請求項11から13のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドの製造方法。 - n個重合オリゴヌクレオチドの5’位及び3’位の一方がヒドロキシ基であり、p個重合オリゴヌクレオチドの3’位及び5’位の一方が反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基である、請求項10に記載のオリゴヌクレオチドの製造方法。
- 前記カップリング工程の前に、3’位及び5’位の一方が、前記式(II)で表される保護基で置換されたヒドロキシ基であり、5’位及び3’位の一方が一時保護基で置換されたヒドロキシ基であるヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドの当該一時保護基を除去し、n個重合オリゴヌクレオチドを生成する脱一時保護基工程を含む、請求項15に記載のオリゴヌクレオチドの製造方法。
- n個重合オリゴヌクレオチドの5’位がヒドロキシ基であり、3’位が前記式(II)で表される保護基で置換されたヒドロキシ基であり、
p個重合オリゴヌクレオチドの3’位が反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基である、請求項15又は16に記載のオリゴヌクレオチドの製造方法。 - 前記一時保護基が、tert-ブチルジメチルシリル基、トリチル基、モノメトキシトリチル基又はジメトキシトリチル基である、請求項10から17のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記反応性リン含有基が、ヒドロキシホスフィニル基であり、カップリング工程が亜リン酸ジエステル結合を形成する、請求項10から18のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記カップリング工程の後に、前記亜リン酸ジエステル結合を、リン酸ジエステル結合、チオリン酸ジエステル結合、ボラノリン酸ジエステル結合、アミノリン酸ジエステル結合、リン酸トリエステル結合又はチオリン酸−O,O,S−トリエステル結合に変換することを含む亜リン酸ジエステル結合の変換工程を更に含む、請求項19に記載の製造方法。
- 前記反応性リン含有基が、置換されたヒドロキシ(ジアルキルアミノ)ホスフィノ基であり、カップリング工程が亜リン酸トリエステル結合を形成する、請求項10から18のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記カップリング工程の後に、前記亜リン酸トリエステル結合を、リン酸トリエステル結合又はチオリン酸トリエステル結合に変換することを含む亜リン酸トリエステル結合の変換工程を更に含む、請求項21に記載の製造方法。
- 少なくとも1つの工程の反応後に、反応液と極性溶媒とを混合して沈殿物を生成させ、生成した沈殿物を固液分離により取得する精製工程を更に含む、請求項10から22のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記極性溶媒が炭素数1から6のアルコール溶媒又は炭素数1から6のニトリル溶媒である、請求項23に記載の製造方法。
- 3’位及び5’位の一方が、下記式(II)
(式中、*は、ヒドロキシ基との結合位置を示し、
R1は、それぞれ独立して、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基、C2−40アルキニル基又は、
式 −L7−O−R4
(式中、L7は、C1−40アルキレン基、C2−40アルケニレン基又はC2−40アルキニレン基であり、R4は、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基又はC2−40アルキニル基である)で表される基であり、少なくとも1つのR1の炭素数は10以上であり、sは、1から5の整数であり、
L11は、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L12は、単結合、−O−又は−N(R2)−(式中、R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)であり、
L13は、単結合、−C(O)−又はC1−6アルキレン基であり、L12が単結合のとき、L13は、単結合又は−C(O)−である)で表される保護基で置換されたヒドロキシ基であり、
5’位及び3’位の一方が、下記式(VI)
(式中、*は、ヒドロキシ基との結合位置を示し、
Ar1は、下記式(VII)
(式中、*は、Ar1が結合する炭素原子を示し、
R1は、それぞれ独立して、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基、C2−40アルキニル基又は、
式 −L7−O−R4
(式中、L7は、C1−40アルキレン基、C2−40アルケニレン基又はC2−40アルキニレン基であり、R4は、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基又はC2−40アルキニル基である)で表される基であり、少なくとも1つのR1の炭素数は10以上であり、sは、1から5の整数である)で表される基であり、
Ar2及びAr3は、それぞれ独立して、前記式(VII)で表される基又は下記式(VIII)
(式中、*は、Ar2及びAr3が結合する炭素原子を示し、
R10は、置換基群Aから選択される置換基であり、
置換基群Aは、ハロゲン原子、C1−6アルキル基、C2−6アルケニル基、C2−6アルキニル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6ハロアルケニル基、C1−6アルコキシ基、C1−6ハロアルコキシ基、モノC1−6アルキルアミノ基、ジC1−6アルキルアミノ基、C1−6アルキルカルボニル基、C1−6ハロアルキルカルボニル基、C1−6ハロアルコキシカルボニル基、C1−6アルコキシカルボニル基、モノC1−6アルキルアミノカルボニル基、ジC1−6アルキルアミノカルボニル基、C1−6アルコキシC1−6アルキル基、C1−6アルキルスルホニル基及びC1−6ハロアルキルスルホニル基により構成される置換基群を意味し、
tは、0から5の整数であり、tが2から5のとき、R10は、同一でも異なっていてもよい)で表される基である)で表される保護基で置換されたヒドロキシ基であるオリゴヌクレオチドを、
溶媒中、ヒドラジン誘導体、ジアミン誘導体、ヒドロキシルアミン誘導体及びアミノアルコール誘導体から選択される少なくとも1つのアミノ化合物を反応させ、
前記式(II)で表される保護基を除去する工程を含む、
3’位及び5’位の一方がヒドロキシ基であり、5’位及び3’位の一方が前記式(VI)で表される保護基で置換されたヒドロキシ基であるオリゴヌクレオチドの製造方法。 - 3’位及び5’位の一方が、下記式(II)
(式中、*は、ヒドロキシ基との結合位置を示し、
R1は、それぞれ独立して、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基、C2−40アルキニル基又は、
式 −L7−O−R4
(式中、L7は、C1−40アルキレン基、C2−40アルケニレン基又はC2−40アルキニレン基であり、R4は、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基又はC2−40アルキニル基である)で表される基であり、少なくとも1つのR1の炭素数は10以上であり、sは、1から5の整数であり、
L11は、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L12は、単結合、−O−又は−N(R2)−(式中、R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)であり、
L13は、単結合、−C(O)−又はC1−6アルキレン基であり、L12が単結合のとき、L13は、単結合又は−C(O)−である)で表される保護基で置換されたヒドロキシ基であり、5’位及び3’位の一方が、反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基、又はヒドロキシ基であるn個重合オリゴヌクレオチドと、
3’位及び5’位の一方が、ヒドロキシ基又は反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基であり、5’位及び3’位の一方が、下記式(VI)
(式中、*は、5’位又は3’位のヒドロキシ基との結合位置を示し、
Ar1は、下記式(VII)
(式中、*は、Ar1が結合する炭素原子を示し、
R1は、それぞれ独立して、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基、C2−40アルキニル基又は、
式 −L7−O−R4
(式中、L7は、C1−40アルキレン基、C2−40アルケニレン基又はC2−40アルキニレン基であり、R4は、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基又はC2−40アルキニル基である)で表される基であり、少なくとも1つのR1の炭素数は10以上であり、sは、1から5の整数である)で表される基であり、
Ar2及びAr3は、それぞれ独立して、前記式(VII)で表される基又は下記式(VIII)
(式中、*は、Ar2及びAr3が結合する炭素原子を示し、
R10は、置換基群Aから選択される置換基であり、
置換基群Aは、ハロゲン原子、C1−6アルキル基、C2−6アルケニル基、C2−6アルキニル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6ハロアルケニル基、C1−6アルコキシ基、C1−6ハロアルコキシ基、モノC1−6アルキルアミノ基、ジC1−6アルキルアミノ基、C1−6アルキルカルボニル基、C1−6ハロアルキルカルボニル基、C1−6ハロアルコキシカルボニル基、C1−6アルコキシカルボニル基、モノC1−6アルキルアミノカルボニル基、ジC1−6アルキルアミノカルボニル基、C1−6アルコキシC1−6アルキル基、C1−6アルキルスルホニル基及びC1−6ハロアルキルスルホニル基により構成される置換基群を意味し、
tは、0から5の整数であり、tが2から5のとき、R10は、同一でも異なっていてもよい)で表される基である)で表される保護基で置換されたヒドロキシ基であるp個重合オリゴヌクレオチドとを反応させ、
n個重合オリゴヌクレオチドとp個重合オリゴヌクレオチドとの結合体を生成するカップリング工程を含み、
n及びpは、それぞれ独立して、1以上の整数であり、
n個重合オリゴヌクレオチドの5’位及び3’位の一方が、反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基であるとき、p個重合オリゴヌクレオチドの3’位及び5’位の一方が、ヒドロキシ基であり、
n個重合オリゴヌクレオチドの5’位及び3’位の一方が、ヒドロキシ基であるとき、p個重合オリゴヌクレオチドの3’位及び5’位の一方が、反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基である、オリゴヌクレオチドの製造方法。 - 下記式(I):
[式中、nは、1以上の任意の整数を示し、
Baseは、それぞれ独立して、核酸塩基又は基本保護基で置換された核酸塩基を示し、
Xは、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、基本保護基で置換されたヒドロキシ基又は4‘位炭素原子に架橋する有機基を示し、
Yは、それぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシ基、基本保護基で置換されたヒドロキシ基、スルファニル基、基本保護基で置換されたスルファニル基、水素化ホウ素基、モノC1−6アルキルアミノ基又はジC1−6アルキルアミノ基を示し、
Vは、それぞれ独立して、酸素原子又は硫黄原子を示し、
Z1が、水素原子、一時保護基、ヒドロキシホスフィニル基、又は置換されたヒドロキシ(ジアルキルアミノ)ホスフィノ基であるとき、Z2は、下記式(II)で表される保護基を示し、
Z1が、下記式(II)で表される保護基であるとき、Z2は、水素原子、一時保護基、ヒドロキシホスフィニル基又は置換されたヒドロキシ(ジアルキルアミノ)ホスフィノ基を示し、
式(II)が
(式中、*は、ヒドロキシ基との結合位置を示し、
R1は、それぞれ独立して、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基、C2−40アルキニル基又は、
式 −L7−O−R4
(式中、L7は、C1−40アルキレン基、C2−40アルケニレン基又はC2−40アルキニレン基であり、R4は、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基又はC2−40アルキニル基である)で表される基であり、少なくとも1つのR1の炭素数は10以上であり、sは、1から5の整数であり、
L11は、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L12は、単結合、−O−又は−N(R2)−(式中、R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)であり、
L13は、単結合、−C(O)−又はC1−6アルキレン基であり、L12が単結合のとき、L13は、単結合又は−C(O)−である)である]で表される化合物、該化合物の互変異性体又はその塩。 - nが、1から100の整数である、請求項27に記載の化合物、該化合物の互変異性体又はその塩。
- Xが、それぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシ基又は基本保護基で置換されたヒドロキシ基である、請求項27又は28に記載の化合物、該化合物の互変異性体又はその塩。
- Yが、それぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシ基、基本保護基で置換されたヒドロキシ基、スルファニル基又は基本保護基で置換されたスルファニル基である、請求項27から29のいずれか1項に記載の化合物、該化合物の互変異性体又はその塩。
- Z1が、前記式(II)で表される保護基であり、Z2が、水素原子、一時保護基、ヒドロキシホスフィニル基又は置換されたヒドロキシ(ジアルキルアミノ)ホスフィノ基である、請求項27から30のいずれか1項に記載の化合物、該化合物の互変異性体又はその塩。
- 下記式(Ia):
[式中、nは、1以上の任意の整数を示し、
Baseは、それぞれ独立して、核酸塩基又は基本保護基で置換された核酸塩基を示し、
Xは、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、基本保護基で置換されたヒドロキシ基又は4‘位炭素原子に架橋する有機基を示し、
Yは、それぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシ基、基本保護基で置換されたヒドロキシ基、スルファニル基、基本保護基で置換されたスルファニル基、水素化ホウ素基、モノC1−6アルキルアミノ基又はジC1−6アルキルアミノ基を示し、
Vは、それぞれ独立して、酸素原子又は硫黄原子を示し、
Z11が、下記式(II)で表される保護基又はヒドロキシホスフィニル基であるとき、Z12は、下記式(VI)で表される保護基を示し、
Z11が、下記式(VI)で表される保護基であるとき、Z12は、下記式(II)で表される保護基又はヒドロキシホスフィニル基を示し、
式(II)が、
(式中、*は、ヒドロキシ基との結合位置を示し、
R1は、それぞれ独立して、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基、C2−40アルキニル基又は、
式 −L7−O−R4
(式中、L7は、C1−40アルキレン基、C2−40アルケニレン基又はC2−40アルキニレン基であり、R4は、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基又はC2−40アルキニル基である)で表される基であり、少なくとも1つのR1の炭素数は10以上であり、sは、1から5の整数であり、
L11は、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L12は、単結合、−O−又は−N(R2)−(式中、R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)であり、
L13は、単結合、−C(O)−又はC1−6アルキレン基であり、L12が単結合のとき、L13は、単結合又は−C(O)−である)であり、
式(VI)が、
(式中、*は、ヒドロキシ基との結合位置を示し、
Ar1は、下記式(VII)
(式中、*は、Ar1が結合する炭素原子を示し、
R1は、それぞれ独立して、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基、C2−40アルキニル基、又は、
式 −L7−O−R4
(式中、L7は、C1−40アルキレン基、C2−40アルケニレン基又はC2−40アルキニレン基であり、R4は、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基又はC2−40アルキニル基である)で表される基であり、少なくとも1つのR1の炭素数は10以上であり、sは、1から5の整数である)で表される基であり、
Ar2及びAr3は、それぞれ独立して、前記式(VII)で表される基又は下記式(VIII)
(式中、*は、Ar2及びAr3が結合する炭素原子を示し、
R10は、置換基群Aから選択される置換基であり、
置換基群Aは、ハロゲン原子、C1−6アルキル基、C2−6アルケニル基、C2−6アルキニル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6ハロアルケニル基、C1−6アルコキシ基、C1−6ハロアルコキシ基、モノC1−6アルキルアミノ基、ジC1−6アルキルアミノ基、C1−6アルキルカルボニル基、C1−6ハロアルキルカルボニル基、C1−6ハロアルコキシカルボニル基、C1−6アルコキシカルボニル基、モノC1−6アルキルアミノカルボニル基、ジC1−6アルキルアミノカルボニル基、C1−6アルコキシC1−6アルキル基、C1−6アルキルスルホニル基及びC1−6ハロアルキルスルホニル基により構成される置換基群を意味し、
tは、0から5の整数であり、tが2から5のとき、R10は、同一でも異なっていてもよい)で表される基である)である]で表される化合物、該化合物の互変異性体又はその塩。 - Z11が、前記式(II)で表される保護基であり、Z12が、前記式(VI)で表される保護基である、請求項32に記載の化合物、該化合物の互変異性体又はその塩。
- 少なくとも1つのBaseが、基本保護基で置換されたアデニル基であり、当該アデニル基のアミノ基の基本保護基が、C6−10アリールアミノカルボニル基、5−10員ヘテロアリールアミノカルボニル基、C6−10アリールスルホニルアミノカルボニル基、モノC1−6アルキルアミノカルボニル基又はアラルキルアミノカルボニル基(ここで、前記C6−10アリールアミノカルボニル基、前記5−10員ヘテロアリールアミノカルボニル基、前記C6−10アリールスルホニルアミノカルボニル基及び前記アラルキルアミノカルボニル基は、無置換であるか、又は、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、C1−6アルキルスルホニル基、C1−6ハロアルキルスルホニル基、C1−6アルコキシ基、C1−6ハロアルコキシ基、C1−6アルキル基、C2−6アルケニル基、C1−6ハロアルキル基及びC2−6ハロアルケニル基からなる群から選択される少なくとも1つの置換基で置換され、前記モノC1−6アルキルアミノカルボニル基は、無置換であるか、又は、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、C1−6アルキルスルホニル基、C1−6ハロアルキルスルホニル基、C1−6アルコキシ基及びC1−6ハロアルコキシ基からなる群から選択される少なくとも1つの置換基で置換されている)である、請求項32又は33に記載の化合物、該化合物の互変異性体又はその塩。
- 少なくとも1つのBaseが、基本保護基で置換されたシトシル基及び5−メチルシトシル基から選択される少なくとも1つであり、当該シトシル基及び5−メチルシトシル基のアミノ基の基本保護基が、C6−10アリールアミノカルボニル基、5−10員ヘテロアリールアミノカルボニル基、C6−10アリールスルホニルアミノカルボニル基、モノC1−6アルキルアミノカルボニル基又はアラルキルアミノカルボニル基(ここで、前記C6−10アリールアミノカルボニル基、前記5−10員ヘテロアリールアミノカルボニル基、前記C6−10アリールスルホニルアミノカルボニル基、及び前記アラルキルアミノカルボニル基は、無置換であるか、又は、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、C1−6アルキルスルホニル基、C1−6ハロアルキルスルホニル基、C1−6アルコキシ基、C1−6ハロアルコキシ基、C1−6アルキル基、C2−6アルケニル基、C1−6ハロアルキル基及びC2−6ハロアルケニル基からなる群から選択される少なくとも1つの置換基で置換され、前記モノC1−6アルキルアミノカルボニル基は、無置換であるか、又は、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、C1−6アルキルスルホニル基、C1−6ハロアルキルスルホニル基、C1−6アルコキシ基及びC1−6ハロアルコキシ基からなる群から選択される少なくとも1つの置換基で置換されている)である、請求項32から34のいずれか1項に記載の化合物、該化合物の互変異性体又はその塩。
- 請求項10から24のいずれか1項に記載の方法で、3’位及び5’位の一方が、前記式(II)で表される保護基で置換されたヒドロキシ基であり、5’位及び3’位の一方が一時保護基で置換されたヒドロキシ基であるオリゴヌクレオチドを生成する工程を含む、請求項1から9のいずれか1項に記載の製造方法。
- 3’位及び5’位の一方が、反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基又はヒドロキシ基であり、2’位、3’位、5’位及び核酸塩基部からなる群から選択される少なくとも1カ所に、擬似固相保護基を有する、n個重合オリゴヌクレオチドと、
5’位及び3’位の一方が、ヒドロキシ基又は反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基であり、擬似固相保護基を有さない、p個重合オリゴヌクレオチドとをカップリングさせる工程を含み、
n及びpは、それぞれ独立して、2以上の整数であり、n+pは、11以上であり、
n個重合オリゴヌクレオチドの3’位及び5’位の一方が、反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基であるとき、p個重合オリゴヌクレオチドの5’位及び3’位の一方が、ヒドロキシ基であり、
n個重合オリゴヌクレオチドの3’位及び5’位の一方が、ヒドロキシ基であるとき、p個重合オリゴヌクレオチドの5’位及び3’位の一方が、反応性リン含有基で置換されたヒドロキシ基である、n+p個重合オリゴヌクレオチドの製造方法。 - 前記p個重合オリゴヌクレオチドの3’位及び5’位の一方が、一時保護基で置換されたヒドロキシ基である、請求項37に記載の製造方法。
- n+pは、15以上である、請求項37又は38に記載の製造方法。
- n及びpは、それぞれ独立して、4以上の整数である、請求項37から39のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記n個重合オリゴヌクレオチドが、核酸塩基部に擬似固相保護基を有する、請求項37から40のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記n個重合オリゴヌクレオチドの3’位が、擬似固相保護基で置換されたヒドロキシ基である、請求項37から40のいずれか1項に記載の製造方法。
- 請求項1から9及び36のいずれか1項に記載の方法で、p個重合オリゴヌクレオチドを生成する工程を含む、請求項37に記載の製造方法。
- 下記式(II)
[式中、*は、擬似固相保護基が保護する基との結合位置を示し、
R1は、それぞれ独立して、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基、C2−40アルキニル基又は、
式 −L7−O−R4
(式中、L7は、C1−40アルキレン基、C2−40アルケニレン基又はC2−40アルキニレン基であり、R4は、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基又はC2−40アルキニル基である)で表される基であり、少なくとも1つのR1の炭素数は10以上であり、sは、1から5の整数であり、
L11は、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L12は、単結合、−O−又は−N(R2)−(式中、R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)であり、
L13は、単結合、−C(O)−又はC1−6アルキレン基であり、L12が単結合のとき、L13は、単結合又は−C(O)−である]で表される、擬似固相保護基。 - 2’位、3’位、5’位及び核酸塩基部からなる群から選ばれる少なくとも1か所にヒドロキシ基を有するか、又は2’位及び核酸塩基部の少なくとも1カ所にヒドロキシ基又はアミノ基を有するヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドを、
下記式(II−1)
[式中、R1は、それぞれ独立して、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基、C2−40アルキニル基又は、
式 −L7−O−R4
(式中、L7は、C1−40アルキレン基、C2−40アルケニレン基又はC2−40アルキニレン基であり、R4は、C1−40アルキル基、C2−40アルケニル基又はC2−40アルキニル基である)で表される基であり、少なくとも1つのR1の炭素数は10以上であり、sは、1から5の整数であり、
L11は、C1−6アルキレン基、C2−6アルケニレン基又はC2−6アルキニレン基であり、
L12は、単結合、−O−又は−N(R2)−(式中、R2は、水素原子、C1−6アルキル基、C1−6ハロアルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6ハロアルケニル基を示す)であり、
L13は、単結合、−C(O)−又はC1−6アルキレン基であり、L12が単結合の時、L13は、単結合又は−C(O)−である]で表されるカルボキシ化合物、又は下記式(II−2)
(式中、Wは、ハロゲン原子であり、s、R1、L11、L12及びL13は、前記式(II−1)における定義と同じである)で表される酸ハロゲン化物と反応させ、
2’位、3’位、5’位及び核酸塩基部の少なくとも1カ所が、下記式(II)
[式中、*は、ヒドロキシ基との結合位置を示し、s、R1、L11、L12及びL13は、前記式(II−1)における定義と同じである]で表される擬似固相保護基で置換されたヒドロキシ基である、ヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドの製造方法。 - 前記n個重合オリゴヌクレオチド及びp個重合オリゴヌクレオチドの少なくとも一方が、少なくとも1つのアデニル基を有し、当該アデニル基のアミノ基の保護基が、C6−10アリールアミノカルボニル基、5−10員ヘテロアリールアミノカルボニル基、C6−10アリールスルホニルアミノカルボニル基、モノC1−6アルキルアミノカルボニル基又はアラルキルアミノカルボニル基(ここで、前記C6−10アリールアミノカルボニル基、前記5−10員ヘテロアリールアミノカルボニル基、前記C6−10アリールスルホニルアミノカルボニル基、及び前記アラルキルアミノカルボニル基は、無置換であるか、又は、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、C1−6アルキルスルホニル基、C1−6ハロアルキルスルホニル基、C1−6アルコキシ基、C1−6ハロアルコキシ基、C1−6アルキル基、C2−6アルケニル基、C1−6ハロアルキル基及びC2−6ハロアルケニル基からなる群から選択される少なくとも1つの置換基で置換され、前記モノC1−6アルキルアミノカルボニル基は、無置換であるか、又は、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、C1−6アルキルスルホニル基、C1−6ハロアルキルスルホニル基、C1−6アルコキシ基及びC1−6ハロアルコキシ基からなる群から選択される少なくとも1つの置換基で置換されている)である、請求項10から26又は請求項37から43のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドの製造方法。
- 前記n個重合オリゴヌクレオチド及びp個重合オリゴヌクレオチドの少なくとも一方が、シトシル基及び5−メチルシトシル基から選択される少なくとも1つを有し、当該シトシル基及び5−メチルシトシル基のアミノ基の保護基が、C6−10アリールアミノカルボニル基、5−10員ヘテロアリールアミノカルボニル基、C6−10アリールスルホニルアミノカルボニル基、モノC1−6アルキルアミノカルボニル基又はアラルキルアミノカルボニル基(ここで、前記C6−10アリールアミノカルボニル基、前記5−10員ヘテロアリールアミノカルボニル基、前記C6−10アリールスルホニルアミノカルボニル基、及び前記アラルキルアミノカルボニル基は、無置換であるか、又は、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、C1−6アルキルスルホニル基、C1−6ハロアルキルスルホニル基、C1−6アルコキシ基、C1−6ハロアルコキシ基、C1−6アルキル基、C2−6アルケニル基、C1−6ハロアルキル基及びC2−6ハロアルケニル基からなる群から選択される少なくとも1つの置換基で置換され、前記モノC1−6アルキルアミノカルボニル基は、無置換であるか、又は、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、C1−6アルキルスルホニル基、C1−6ハロアルキルスルホニル基、C1−6アルコキシ基及びC1−6ハロアルコキシ基からなる群から選択される少なくとも1つの置換基で置換されている)である、請求項10から26又は請求項37から43又は47のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドの製造方法。
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