JPWO2018003195A1 - ゲルの乾燥防止用組成物、ゲル複合体およびそれを含むｄｎａチップならびにそれらの製造方法 - Google Patents

ゲルの乾燥防止用組成物、ゲル複合体およびそれを含むｄｎａチップならびにそれらの製造方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、従来よりも簡便にゲルの乾燥を防ぐことができるゲルの乾燥防止用組成物、ゲル複合体およびそれを含むＤＮＡチップならびにそれらの製造方法を提供するものである。この課題は、多価アルコールと、ゼラチン、コラーゲン、カラギーナン、ペクチンおよび寒天から選択される少なくとも一種とを含む、ゲルの乾燥防止用組成物によって解決することができる。

Description

本発明は、ゲルの乾燥防止用組成物、ゲル複合体およびそれを含むＤＮＡチップならびにそれらの製造方法に関する。本発明はさらに、ＤＮＡチップの乾燥防止方法にも関する。
ゲルは、自重の数百、数千倍の溶媒を保持することができる材料として、従来から高吸水性樹脂、紙おむつや生理用品、ソフトコンタクトレンズ、屋内緑化用含水シート等に利用されている。また、薬物の徐放性も有し、ドラッグデリバリーシステムや創傷被覆材等の医療材料にも応用されている。さらに、衝撃吸収材料、制振・防音材料等への利用もされており、その用途は多岐に渡る。
また、ゲルは遺伝子解析のツールであるＤＮＡチップ（「ＤＮＡマイクロアレイ」と称されることもある）において核酸プローブ（単に「プローブ」ともいう）として搭載するポリヌクレオチドを保持又は被覆する目的でも用いられている。ＤＮＡチップとは、遺伝子の塩基配列と相補の配列をもつＤＮＡ断片を基板上に規則正しく配列固定化し、遺伝子由来の核酸塩基とハイブリダイゼーション反応を基板上で行うことにより、遺伝子の発現解析や多型解析等を行う有用なデバイスである。ＤＮＡチップとしては、フォトリソグラフィー技術を利用して直接ＤＮＡを基板上に合成することにより得られるＤＮＡチップ（特許文献１、特許文献２）、スライドグラス上にＤＮＡをピン等でスポッティングすることにより得られるＤＮＡチップ（非特許文献１）等が知られている。また、電気化学的にＤＮＡを基板に固定化することにより得られるＤＮＡチップ（特許文献３）、中空繊維を複数本集束させた中空繊維束を中空繊維の長手方向と交差する方向で切断して得られる貫通孔型のＤＮＡチップＤＮＡチップ（特許文献４）等も知られている。
しかしながら、ゲルは通常溶媒として水を含んでいることから、大気環境下に置くと次第に水が揮発してしまい、収縮したり白濁したりする恐れがあった。その中でも特に、ゲルを使用するＤＮＡチップでは、乾燥の影響によりゲルが経時的に劣化し、核酸プローブのハイブリダイゼーション反応が阻害される可能性があった。従って、ＤＮＡチップにおいてゲルの乾燥を防止するために、ＤＮＡチップを緩衝液中に浸して個別包装し、保存および運搬するという方法が提案されている（特許文献５）。
米国特許第５４４５９３４号明細書 米国特許第５７７４３０５号明細書 米国特許第５６０５６６２号明細書 ＷＯ０１／０９８７８１パンフレット 特開２００６−１８９３０７号公報
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０，４６７−４７０（１９９５）
上記のような個別包装によって保存および運搬することで、ゲルの乾燥を防止することができるが、使用する際にはその個別包装を開封し、その中に充填されている緩衝液を除去してから用いる必要があるため、手順が煩雑であった。また、ＤＮＡチップの場合も、検査に使用する前に充填されている緩衝液を除去する必要があり、場合によっては緩衝液を除去する際にさらに洗浄を行う必要性が生じることもあるため、手順が煩雑であった。
そこで本発明の目的は、従来よりも簡便にゲルの乾燥を防ぐことができるゲルの乾燥防止用組成物、ゲル複合体およびそれを含むＤＮＡチップならびにそれらの製造方法を提供することにある。また、本発明の目的は、ＤＮＡチップの乾燥防止方法を提供することにもある。
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであり、以下に記載する特徴を有するものである。
［１］
多価アルコールと、
ゼラチン、コラーゲン、カラギーナン、ペクチンおよび寒天から選択される少なくとも一種と
を含む、ゲルの乾燥防止用組成物。
［２］
多価アルコール１００質量部に対して、ゼラチン、コラーゲン、カラギーナン、ペクチンおよび寒天から選択される少なくとも一種を１〜１０質量部含む、［１］に記載のゲルの乾燥防止用組成物。
［３］
多価アルコールがグリセロール、ジグリセロール、ペンタエリトリトール、トリメチロールプロパン、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、１，４−ペンタンジオール、１，５−ペンタンジオール、１，６−ヘキサンジオール、３，４−ヘキサンジオール、ネオペンチルグリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコールおよびジプロピレングリコールから選択される少なくとも一種である、［１］または［２］に記載のゲルの乾燥防止用組成物。
［４］
前記ゲルが、ＤＮＡチップの基板上又は基板中において核酸プローブを保持又は被覆するゲルである、［１］〜［３］のいずれかに記載のゲルの乾燥防止用組成物。
［５］
ゲルと、
［１］〜［４］のいずれかに記載のゲルの乾燥防止用組成物のゲル化物と
を含むゲル複合体。
［６］
前記ゲルと前記ゲルの乾燥防止用組成物のゲル化物との間の少なくとも一部に相互侵入網目構造が形成されている、［５］に記載のゲル複合体。
［７］
ゲルに、［１］〜［４］のいずれかに記載のゲルの乾燥防止用組成物を塗布するか、又は、［１］〜［４］のいずれかに記載のゲルの乾燥防止用組成物中にゲルを浸漬する工程と、
前記ゲルの乾燥防止用組成物をゲル化する工程と
を含む、ゲル複合体の製造方法。
［８］
以下の工程を含む、ゲル複合体を含むＤＮＡチップの製造方法。
（ｉ）複数本の中空繊維を、中空繊維の各繊維軸が同一方向となるように３次元に配列し、その配列された中空繊維を樹脂で固定することにより、中空繊維束を製造する工程
（ｉｉ）核酸プローブを含むゲル前駆体溶液を前記中空繊維束の各中空繊維の中空部に導入する工程
（ｉｉｉ）前記中空繊維束の各中空繊維の中空部に導入したゲル前駆体溶液を反応させ、核酸プローブを含むゲルを各中空繊維の中空部に保持する工程
（ｉｖ）前記中空繊維束を中空繊維の長手方向に交差する方向で切断して薄片化し、ＤＮＡチップを得る工程
（ｖ）［１］〜［４］のいずれかに記載のゲルの乾燥防止用組成物を、前記ＤＮＡチップ若しくはそのゲルの部分に塗布するか、又は、前記ＤＮＡチップを［１］〜［４］のいずれかに記載のゲルの乾燥防止用組成物中に浸漬する工程、及び
（ｖｉ）前記ゲルの乾燥防止用組成物をゲル化する工程
［９］
ゲルによって保持又は被覆された核酸プローブが搭載されたＤＮＡチップであって、
前記ゲルと［１］〜［４］のいずれかに記載のゲルの乾燥防止用組成物のゲル化物とを含むゲル複合体を含む、ＤＮＡチップ。
［１０］貫通孔型である、［９］に記載のＤＮＡチップ。
［１１］中空繊維を用いた貫通孔型である、［９］または［１０］に記載のＤＮＡチップ。
［１２］
［１］〜［４］のいずれかに記載のゲルの乾燥防止用組成物を、ＤＮＡチップ若しくはそのゲルの部分に塗布するか、又は、前記ＤＮＡチップを［１］〜［４］のいずれかに記載のゲルの乾燥防止用組成物中に浸漬する工程、及び
前記ゲルの乾燥防止用組成物をゲル化する工程
を含む、ＤＮＡチップの乾燥防止方法。
本発明によれば、従来よりも簡便にゲルの乾燥を防ぐことができるゲルの乾燥防止用組成物、ゲル複合体およびそれを含むＤＮＡチップならびにそれらの製造方法を提供することができる。また、本発明によれば、ＤＮＡチップの乾燥防止方法を提供することもできる。
試料５〜８をシリカゲルで覆い、１か月経過した後の状態を示す写真である。 左の３つの図は、３種類の条件で保管したＤＮＡチップに対して、マウス腎臓から増幅したａＲＮＡをハイブリダイゼーションさせた結果を比較した図である。上図は６×ＳＳＣで保管したＤＮＡチップ（試料１１）、左下図はグリセロールゼラチンゲルに１０分間浸漬したＤＮＡチップ（試料９）、右下図はグリセロールゼラチンゲルに２時間浸漬したＤＮＡチップ（試料１０）の結果を示す。また、右側の２つのグラフは、チップによる判定の正確度を示す図であり、右上のグラフは、縦軸は試料１１の結果を、横軸は試料９の結果を示し、右下のグラフは、縦軸は試料１１の結果を、横軸は試料１０の結果を示す。 １日乾燥した後のＫＲＡＳ遺伝子変異検出ＤＮＡチップに対して、ハイブリダイゼーションさせた結果を示した図である。左側の図が６×ＳＳＣ溶液に保管しておいたチップ（試料１４）の結果を示し、右側の図がグリセロールゼラチンゲル溶液組成物に１６時間浸漬させた後、液切りし、遠心機にかけて乾燥させたＤＮＡチップ（試料１３）の結果を示す。 １か月乾燥した後のＫＲＡＳ遺伝子変異検出ＤＮＡチップ（試料１５）に対して、ハイブリダイゼーションさせた結果を示した図である。 ５か月乾燥した後のＫＲＡＳ遺伝子変異検出ＤＮＡチップ（試料１６）に対して、ハイブリダイゼーションさせた結果を示した図である。
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。
［ゲルの乾燥防止用組成物］
本発明によるゲルの乾燥防止用組成物（以下、「本発明による組成物」と称することがある。）は、多価アルコールと、ゼラチン、コラーゲン、カラギーナン、ペクチンおよび寒天から選択される少なくとも一種とを含む組成物である。これらの原料からなる組成物のゲル化物であれば、効果的にゲルの乾燥を防止することができる。
本発明による組成物の組成比としては、特に限定されないが多価アルコール１００質量部に対して、ゼラチン、コラーゲン、カラギーナン、ペクチンおよび寒天から選択される少なくとも一種を１〜１０質量部含むことが好ましく、２〜５質量部含むことがより好ましい。
本発明による組成物に用いる多価アルコールは、１分子当たり２つ以上のヒドロキシル基を有していてもよい。従って、２価アルコールや、３価アルコール、および３価を超える多価アルコールを用いることができる。その中でも、グリセロール、ジグリセロール、ペンタエリトリトール、トリメチロールプロパン、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、１，４−ペンタンジオール、１，５−ペンタンジオール、１，６−ヘキサンジオール、３，４−ヘキサンジオール、ネオペンチルグリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコールおよびジプロピレングリコールが好ましく、グリセロールが特に好ましい。
本発明による組成物には、ゼラチン、コラーゲン、カラギーナン、ペクチンおよび寒天から選択される少なくとも一種が含まれる。好ましくは、ゼラチンおよびコラーゲンから選択される少なくとも一種が含まれる。
本発明において、好ましい組成物としては、ゼラチンとグリセロールとを含む組成物、ゼラチンとジグリセロールとを含む組成物、ゼラチンとペンタエリトリトールとを含む組成物、ゼラチンとトリメチロールプロパンとを含む組成物、ゼラチンと１，２−プロパンジオールとを含む組成物、ゼラチンと１，３−プロパンジオールとを含む組成物、ゼラチンと１，２−ブタンジオールとを含む組成物、ゼラチンと１，３−ブタンジオールとを含む組成物、ゼラチンと１，４−ブタンジオールとを含む組成物、ゼラチンと１，４−ペンタンジオールとを含む組成物、ゼラチンと１，５−ペンタンジオールとを含む組成物、ゼラチンと１，６−ヘキサンジオールとを含む組成物、ゼラチンと３，４−ヘキサンジオールとを含む組成物、ゼラチンとネオペンチルグリコールとを含む組成物、ゼラチンとジエチレングリコールとを含む組成物、ゼラチンとトリエチレングリコールとを含む組成物、ゼラチンとジプロピレングリコールとを含む組成物等が挙げられ、より好ましくは、ゼラチンとグリセロールとを含む組成物である。
また、本発明において、好ましい組成物としては、コラーゲンとグリセロールとを含む組成物、コラーゲンとジグリセロールとを含む組成物、コラーゲンとペンタエリトリトールとを含む組成物、コラーゲンとトリメチロールプロパンとを含む組成物、コラーゲンと１，２−プロパンジオールとを含む組成物、コラーゲンと１，３−プロパンジオールとを含む組成物、コラーゲンと１，２−ブタンジオールとを含む組成物、コラーゲンと１，３−ブタンジオールとを含む組成物、コラーゲンと１，４−ブタンジオールとを含む組成物、コラーゲンと１，４−ペンタンジオールとを含む組成物、コラーゲンと１，５−ペンタンジオールとを含む組成物、コラーゲンと１，６−ヘキサンジオールとを含む組成物、コラーゲンと３，４−ヘキサンジオールとを含む組成物、コラーゲンとネオペンチルグリコールとを含む組成物、コラーゲンとジエチレングリコールとを含む組成物、コラーゲンとトリエチレングリコールとを含む組成物、コラーゲンとジプロピレングリコールとを含む組成物等が挙げられ、より好ましくは、コラーゲンとグリセロールとを含む組成物である。
本発明による組成物は、さらに所望により、水を含む。本発明による組成物をＤＮＡチップに用いる場合には、分析に対する不純物の影響を最小限に抑える観点から、使用する水は超純水、純水または蒸留水が好ましく、特に超純水が好ましい。超純水としては、例えばミリＱ水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）を用いることができる。水の含有量は特に限定されないが、ゲルの乾燥防止用組成物の全量に対して、１０〜５０質量％が好ましく、２０〜４０質量％がより好ましい。一方、処理後は水が蒸発し、１質量％以下となっていても構わない。
本発明による組成物は、種々の添加剤を含むことができる。そのような添加剤としては、酸化防止剤、防腐剤および紫外線吸収剤等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。添加剤の量はゲルの乾燥防止用組成物の総量を基準として、３質量％未満であることが好ましく、１質量％未満であることがより好ましい。
本発明による組成物によって乾燥が防止されるゲルとしては、その種類は限定されず、物理ゲルであってもよく化学ゲルであってもよく、食品用途に使用されるゲルであっても、医薬用途に使用されるゲルであっても、その他、工業用、農業用等に使用されるゲルであってもよい。
その中でも、本発明では、乾燥することによってその機能や効果が減弱又は低減するゲルに対して好ましく使用することができる。その中でも、例えば、ＤＮＡチップの基板上又は基板中において核酸プローブを保持又は被覆するゲルがより好ましい。本発明によるゲルの乾燥防止用組成物のゲル化物は、分析に与える影響が非常に小さいか無視できるレベルであるため、これを除去することなく、そのままＤＮＡチップの分析を行うことができる。一方、ハイブリダイゼーションや洗浄工程等におけるＤＮＡチップへの加熱によりゲル化物が溶解し除去された場合も、問題なくＤＮＡチップの分析を行うことができる。
核酸プローブを保持又は被覆するゲルは、ゲル前駆体溶液を核酸プローブと混合した後に重合反応を行うことでゲル化されるものが好ましい。そのようなゲル前駆体溶液としては、例えば、アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルアミノエトキシエタノール、Ｎ−アクリロイルアミノプロパノール、Ｎ−メチロールアクリルアミド、Ｎ−ビニルピロリドン、ヒドロキシエチルメタクリレート、（メタ）アクリル酸、アリルデキストリン等の単量体の一種類以上と、架橋性モノマーとしてメチレンビス（メタ）アクリルアミド、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート等を含むものが挙げられる。また、必要に応じて、ゲル前駆体溶液には、重合開始剤（ラジカル重合開始剤、カチオン重合開始剤およびアニオン重合開始剤等）や溶媒（水や有機溶媒）等が加えられる。
本発明による組成物は、加熱などによって流動性が増し、ゾル化することが好ましい。ゾル化することで、本発明による組成物をゲルやＤＮＡチップに塗布することや、該組成物中にゲルやＤＮＡチップを浸漬することができる。また、ゾル化することで、本発明による組成物が、ゲルの網目構造（第１の網目構造）中に侵入し、その後ゲル化することで第２の網目構造を形成し、ゲルと本発明による組成物との間で２種類の網目構造が相互に絡み合った相互侵入網目構造が形成されることが好ましい。このような相互侵入網目構造を形成することで、ゲルの乾燥をより効果的に防止することができるものと考えられる。
本発明による組成物の製造方法は特に限定されず、公知の方法で製造することができる。例えば、原料を水に溶解させて混合する一般的な溶液混合法によって製造することができる。また、必要に応じて、製造工程において加熱を行ってもよい。加熱は原料の溶解を促進する程度の温度で行うことができ、例えば、３０〜８０℃、好ましくは４０〜７０℃、より好ましくは４５〜６５℃の範囲の温度で加熱を行うことができる。
上記の通り、本発明による組成物のゲル化物は、あらゆるゲルにおいて乾燥を防止することができるが、ＤＮＡチップの基板上又は基板中において核酸プローブを保持又は被覆するゲルの乾燥を防止するためにも用いることができる。ここでＤＮＡチップとは、遺伝子の塩基配列と相補の配列をもつＤＮＡ断片（核酸プローブ）を基板上に規則正しく配列固定化し、遺伝子由来の核酸塩基とのハイブリダイゼーション反応を基板上で行うことにより、遺伝子解析または診断等のアッセイに利用することができるデバイスである。ＤＮＡチップは「ＤＮＡマイクロアレイ」とも称され得る。ＤＮＡチップには、フォトリソグラフィー技術を利用して直接ＤＮＡを基板上に合成することにより得られるＤＮＡチップ、スライドグラス上にＤＮＡをピン等でスポッティングすることにより得られるＤＮＡチップ、電気化学的にＤＮＡを基板に固定化することにより得られるＤＮＡチップ、および中空繊維（管状体）を複数本集束させた中空繊維束を中空繊維の長手方向と交差する方向で切断して得られる貫通孔型のＤＮＡチップなどの種々のタイプが存在するが、本発明によるゲルの乾燥防止用組成物はいずれのタイプのＤＮＡチップにも用いることができる。
［ゲル複合体］
本発明によるゲル複合体は、ゲルと、上記の本発明による組成物のゲル化物とを含む。本発明によるゲル複合体の態様は、ゲルと本発明による組成物のゲル化物とを含んでいれば特に限定されない。例えば、ゲルの一部を本発明による組成物のゲル化物が被覆しているような態様も、本発明によるゲル複合体の一態様に包含される。また本発明によるゲル複合体は、ゲルと本発明による組成物のゲル化物との間の少なくとも一部に相互侵入網目構造が形成されていることが好ましい。このような相互侵入網目構造を形成することで、ゲルの乾燥をより効果的に防止することができるものと考えられる。
本発明によるゲル複合体に用いられるゲルとしては、上述したように種々のゲルが挙げられるが、ＤＮＡチップの基板上又は基板中においてプローブを保持又は被覆するゲルが好ましい。具体的には、ゲル前駆体溶液を核酸プローブと混合した後に重合反応を行うことでゲル化されるゲルが好ましく、そのようなゲル前駆体溶液としては、例えば、アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルアミノエトキシエタノール、Ｎ−アクリロイルアミノプロパノール、Ｎ−メチロールアクリルアミド、Ｎ−ビニルピロリドン、ヒドロキシエチルメタクリレート、（メタ）アクリル酸、アリルデキストリン等の単量体の一種類以上と、架橋性モノマーとしてメチレンビス（メタ）アクリルアミド、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート等を含むものが挙げられる。また、必要に応じて、ゲル前駆体溶液には、重合開始剤（ラジカル重合開始剤、カチオン重合開始剤およびアニオン重合開始剤等）や溶媒（水や有機溶媒）等が加えられる。
本発明によるゲル複合体は、ゲルに本発明によるゲルの乾燥防止用組成物を塗布するか、又は、本発明によるゲルの乾燥防止用組成物中にゲルを浸漬する工程と、ゲルの乾燥防止用組成物をゲル化する工程とを含む方法によって製造することができる。本発明によるゲルの乾燥防止用組成物が、ゲルの網目構造（第１の網目構造）中に侵入し、その後ゲル化することで第２の網目構造を形成し、ゲルと本発明によるゲルの乾燥防止用組成物との間で２種類の網目構造が相互に絡み合った相互侵入網目構造が形成されることが好ましい。このような相互侵入網目構造を形成することで、ゲルの乾燥をより効果的に防止することができるものと考えられる。
本発明によるゲル複合体の製造方法は、所望により、ゲルに本発明によるゲルの乾燥防止用組成物を塗布するか、又は、本発明によるゲルの乾燥防止用組成物中にゲルを浸漬する工程の前に、ゲルの乾燥防止用組成物をゾル化する工程を含んでいてもよい。ゾル化は例えば加熱によって行うことができる。
本発明によるゲルの乾燥防止用組成物中にゲルを浸漬する時間は特には限定されず、乾燥を防止する対象のゲルの少なくとも一部に（例えば、当該ゲルの表面が本発明によるゲルの乾燥防止用組成物によって被覆されることによってゲルの乾燥が防止できる程度に）本発明のゲル複合体が形成されていればよい。浸漬する時間としては、乾燥を防止するゲルの種類やサイズ、ゲルの乾燥防止用組成物の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、１分以上、好ましくは１０分以上、より好ましくは１時間以上とすることができる。また、浸漬する時間の上限も限定されず、本発明のゲル複合体は乾燥を防止する対象のゲルの全体に形成されれば十分である。
浸漬する方法としては限定されず、攪拌下のゲルの乾燥防止用組成物にゲルを浸漬してもよいし、浸漬してからゲルの乾燥防止用組成物を攪拌してもよいし、ゲルの乾燥防止用組成物中にゲルを浸漬してからゲルを揺らしてもよい。
本発明によるゲルの乾燥防止用組成物をゲルに塗布する場合、公知の種々の方法を用いることができる。例えば、筆や刷毛を用いて塗布することもできるし、スプレーコート法や、バーコート法、スピンコート法、およびフローコート法等を用いることができる。
［ゲル複合体を含むＤＮＡチップ］
本発明によるＤＮＡチップは、ゲルによって保持又は被覆された核酸プローブが搭載されたＤＮＡチップであって、ゲルと本発明によるゲルの乾燥防止用組成物のゲル化物とを含むゲル複合体を含む。本発明の一態様によれば、中空繊維を複数本集束させた中空繊維束を中空繊維の長手方向と交差する方向で切断して得られる貫通孔型のＤＮＡチップにおいて、中空繊維の中空部分に核酸プローブがゲルによって保持されており、中空部分に保持されたゲルの少なくとも一部と、本発明による組成物のゲル化物によってゲル複合体が形成されている。本発明によるＤＮＡチップは、ゲルと本発明によるゲルの乾燥防止用のゲル化物とを含むゲル複合体を含むため、ＤＮＡチップに搭載された核酸プローブを保持又は被覆するゲルの乾燥を効果的に防止することができる。さらに、本発明による組成物のゲル化物は、分析に与える影響が非常に小さいか無視できる程度であるため、これを除去することなくそのままＤＮＡチップの分析を行うことができる。一方、ハイブリダイゼーションや洗浄工程等におけるＤＮＡチップへの加熱によりゲル化物が溶解し除去された場合も、問題なくＤＮＡチップの分析を行うことができる。
また、本発明の好ましい態様によれば、貫通孔型のＤＮＡチップにおいて、中空繊維の中空部分に保持されたゲルと本発明による組成物のゲル化物との間で、相互侵入網目構造が形成されている。本明細書において、「相互侵入網目構造」とは、第１の網目構造を有する第１のゲルと第２の網目構造を有する第２のゲルを含むゲルにおいて、第１の網目構造と第２の網目構造が重なり合い、相互に絡み合っている構造をいう。また、このような構造を有するゲルを「ダブルネットワークゲル」という。このような相互侵入網目構造を形成することにより、ゲルの乾燥をより効果的に防止することができると考えられる。
本明細書において「ＤＮＡチップの基板上又は基板中においてプローブを保持又は被覆する」とは、ＤＮＡチップの基板上に合成又は固定されたプローブをゲルによって被覆する態様や、ＤＮＡチップの基盤中の中空繊維の中空部分でプローブによってゲルを保持する態様を含むものである。また、「被覆」とは、全体を包み込むように被覆する態様だけでなく、少なくとも一部を被覆する態様も含むものである。
ＤＮＡチップには上記のような種々のタイプが存在するが、本発明にはいずれのタイプのＤＮＡチップも用いることができる。その中でも、貫通孔型のＤＮＡチップが好ましい。貫通孔型のＤＮＡチップとしては、中空繊維を複数本集束させた中空繊維束を中空繊維の長手方向と交差する方向で切断して得られる貫通孔型のＤＮＡチップや、酸化アルミニウムなどの多孔質無機化合物のような多孔質体で形成された貫通孔を有する貫通孔型のＤＮＡチップ等が挙げられる。複数の中空繊維を用いて得られるＤＮＡチップは、複数のスポット（切断された中空繊維。以下、「貫通孔」と称することもある）を有し、それらのスポット内にゲルが保持されており、そのゲルの中で核酸プローブが保持されている。また、多孔質体で形成された貫通孔を有する貫通孔型のＤＮＡチップも同様に、貫通孔内にゲルが保持されており、そのゲルの中で核酸プローブが保持されている。貫通孔内のゲルも通常溶媒として水を含んでいることから、貫通孔型のＤＮＡチップを大気環境下に置くと次第に水が揮発してゲルが経時的に劣化し、核酸プローブのハイブリダイゼーション反応が阻害される恐れや、貫通孔からゲルが脱落する恐れがあった。しかし本発明の貫通孔型のＤＮＡチップによれば、このような経時的な劣化を効果的に防止し、ハイブリダイゼーション反応の阻害やゲルの脱落を防止することができる。
核酸プローブとは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）やリボ核酸（ＲＮＡ）等の検出に用いられる核酸である。また、核酸プローブにはペプチド核酸（ＰＮＡ）等の核酸のアナログも含まれる。これらは合成されたものでも、生物体から調製されたものでも良い。
核酸プローブは、ゲルによって保持されていても良い。核酸プローブの保持に用いられるゲルは、ゲル前駆体溶液を核酸プローブと混合した後に重合反応を行うことでゲル化されるものが好ましい。そのようなゲル前駆体溶液としては、例えば、アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルアミノエトキシエタノール、Ｎ−アクリロイルアミノプロパノール、Ｎ−メチロールアクリルアミド、Ｎ−ビニルピロリドン、ヒドロキシエチルメタクリレート、（メタ）アクリル酸、アリルデキストリン等の単量体の一種類以上と、架橋性モノマーとしてメチレンビス（メタ）アクリルアミド、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート等を含むものが挙げられる。また、必要に応じて、ゲル前駆体溶液には、重合開始剤（ラジカル重合開始剤、カチオン重合開始剤およびアニオン重合開始剤等）や溶媒（水や有機溶媒）等が加えられる。
本発明によるＤＮＡチップの１枚の厚みは、特に限定はされないが、例えば、１μｍ〜１０，０００μｍが好ましく、より好ましくは１００μｍ〜５，０００μｍである。
本発明に用いるＤＮＡチップとしては、一般的に市販されているものを用いてもよい。そのような市販のＤＮＡチップとしては、例えば、三菱レイヨン株式会社製のジェノパール（登録商標）やゲルをコートしたコードリンクチップ（登録商標）等があげられる。
ＤＮＡチップの製造は種々の公知の方法で行うことができる。その一例として、貫通孔型のＤＮＡチップは特許文献５（特開２００６−１８９３０７号公報）に記載された方法等で製造することができる。
［ゲル複合体を含むＤＮＡチップの製造方法］
本発明の一態様によれば、ゲル複合体を含むＤＮＡチップの製造方法（以下、「本発明による製造方法」と称することがある）が提供される。具体的には、下記の工程を含む方法でゲル複合体を含むＤＮＡチップを製造することができる。
（ｉ）複数本の中空繊維を、中空繊維の各繊維軸が同一方向となるように３次元に配列し、その配列された中空繊維を樹脂で固定することにより、中空繊維束を製造する工程、
（ｉｉ）核酸プローブを含むゲル前駆体溶液を中空繊維束の各中空繊維の中空部に導入する工程、
（ｉｉｉ）中空繊維束の各中空繊維の中空部に導入したゲル前駆体溶液を反応させ、核酸プローブを含むゲルを各中空繊維の中空部に保持する工程
（ｉｖ）中空繊維束を中空繊維の長手方向に交差する方向で切断して薄片化し、ＤＮＡチップを得る工程
（ｖ）本発明によるゲルの乾燥防止用組成物を、ＤＮＡチップ若しくはそのゲルの部分に塗布するか、又は、前記ＤＮＡチップを本発明によるゲルの乾燥防止用組成物中に浸漬する工程、及び
（ｖｉ）本発明によるゲルの乾燥防止用組成物をゲル化する工程
ここで、必要に応じて、工程（ｖ）の前に本発明によるゲルの乾燥防止用組成物を加熱してゾル化する工程を加えてもよい。具体的な加熱温度は使用するゲルの乾燥防止用組成物の原料によって適宜選択することができる。例えば、ゲルの乾燥防止用組成物の原料としてゼラチンまたはコラーゲンを用いる場合、４５℃〜７０℃程度まで加熱することで十分にゾル化することができる。その他の原料の場合においても、当業者であれば適宜加熱温度を設定することができる。
工程（ｉｖ）によってＤＮＡチップを得た後は、ゲルの乾燥防止用組成物中にＤＮＡチップを浸漬するか、ゲルの乾燥防止用組成物をＤＮＡチップに塗布する。浸漬する場合、ＤＮＡチップ全体がゲルの乾燥防止用組成物中に完全に浸漬されていなくてもよく、少なくとも核酸プローブ、少なくとも中空部分に保持されたゲルの表面、または少なくとも核酸プローブが配列固定化されている領域がゲルの乾燥防止用組成物中に浸漬されていればよい。
浸漬する時間は特には限定されず、ＤＮＡチップ中のゲルの少なくとも一部に（例えば、当該ゲルの表面が本発明によるゲルの乾燥防止用組成物によって被覆されることによってゲルの乾燥が防止できる程度に）本発明のゲル複合体が形成されていればよい。浸漬する時間としては、乾燥を防止するゲルの種類やサイズ、ゲルの乾燥防止用組成物の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、１分以上、好ましくは１０分以上、より好ましくは１時間以上とすることができる。また、浸漬する時間の上限も限定されず、本発明のゲル複合体は上記ゲルの全体に形成されれば十分である。
浸漬する方法としては限定されず、攪拌下のゲルの乾燥防止用組成物にゲルを浸漬してもよいし、浸漬してからゲルの乾燥防止用組成物を攪拌してもよいし、ゲルの乾燥防止用組成物中にゲルを浸漬してからゲルを揺らしてもよい。
本発明によるゲルの乾燥防止用組成物をＤＮＡチップに塗布する場合、公知の種々の方法を用いることができる。例えば、筆や刷毛を用いて塗布することもできるし、スプレーコート法や、バーコート法、スピンコート法、およびフローコート法等を用いることができる。
工程（ｖ）の浸漬または塗布の後には、液切り工程を行って、余分なゲルの乾燥防止用組成物を除去することが好ましい。液切り工程は種々の公知の方法で行うことができるが、遠心処理によって行うことが好ましく、効率化の観点から、ＤＮＡチップを複数枚立ててプレートごと遠心処理を行うのがより好ましい。
工程（ｖｉ）の本発明によるゲルの乾燥防止用組成物をゲル化する工程は、特に限定されないが、例えば、遠心処理による乾燥やゲルの乾燥防止用組成物の冷却等によって行うことができる。工程（ｖ）において、本発明によるゲルの乾燥防止用組成物がゲルの網目構造（第１の網目構造）中に侵入し、工程（ｖｉ）においてそのゲルの乾燥防止用組成物がゲル化することで第２の網目構造を形成し、ゲルと本発明によるゲルの乾燥防止用組成物との間で２種類の網目構造が相互に絡み合った相互侵入網目構造が形成されることが好ましい。このような相互侵入網目構造を形成することで、ゲルの乾燥をより効果的に防止することができるものと考えられる。
［ＤＮＡチップの乾燥防止方法］
本発明の一態様によれば、ゲルの乾燥防止用組成物を用いたＤＮＡチップの乾燥防止方法が提供される。具体的には、本発明によるゲルの乾燥防止用組成物をＤＮＡチップ若しくはそのゲルの部分に塗布するか、又は、ＤＮＡチップを本発明によるゲルの乾燥防止用組成物中に浸漬する工程、及び本発明によるゲルの乾燥防止用組成物をゲル化する工程を含む方法によって、ＤＮＡチップに搭載された核酸プローブを保持又は被覆するゲルの乾燥を防止することができる。
以下、実施例により本発明をより詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。
１．核酸プローブ拡散浸漬用ゲルの調製
まず、核酸プローブの拡散浸漬に用いるゲルを調製した。下表に調製に用いた原料とその量を示す。
表中、ＤＭＡＡｍはＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（シグマアルドリッチ社製）を示し、ＭＢＡＡｍはＮ，Ｎ−メチレンビスアクリルアミド（シグマアルドリッチ社製）を示し、ＶＡ−０４４は２，２’−ビス（２−イミダゾリン−２−イル）［２，２’−アゾビスプロパン］・２塩酸塩（和光純薬社製）を示し、超純水はミリＱ水を示す。
最初にモノマー溶液と重合開始剤溶液をそれぞれ表１ａおよび表１ｂに示す配合で調製した。次いで、これらの溶液を表１ｃに記載された重量測り取り、グリセロールと混合することで表１ｃの重合液を調製した。さらにこの重合液１２ｇに超純水を４ｇ加えて混合、および脱気して１２ｍＬのガラス瓶に入れて静置し、約３．８質量％のＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドゲルを作製した。
２．ゲルの乾燥防止用組成物の調製
グリセロール（蛍光分析用、関東化学株式会社製）１９．２ｇと、超純水（ミリＱ水）１０ｇと、粉末ゼラチン（コラーゲン含有量４．４５ｇ／５ｇ、販売元：株式会社八社会）０．６０ｇとを室温で混合した。その後、混合物を６０℃の恒温槽に移動して適宜撹拌しつつ１時間程度温め、粉末ゼラチンを完全に溶解させてゲルの乾燥防止用組成物（以下、グリセロールゼラチンゲル溶液組成物ともいう）を得た。得られたグリセロールゼラチンゲル溶液組成物は、そのまま６０℃に維持した。
３．ゲルの乾燥防止用組成物の評価
続いて、上記工程１で調製した約３．８質量％のＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドゲルのチップゲルを、スパチュラを用いてに示すように円形の中央で半分に切断した。切断されたチップゲルを崩れないようにして、新品の２５ｍＬの平底チューブに移した。同様の作業を繰り返し、合計で８つの試料を用意した。
得られた試料のうち、４つには上記工程２で調製したグリセロールゼラチンゲル溶液組成物を６ｍＬ加え、残りの４つには６×ＳＳＣ溶液（塩化ナトリウム９９．９ｍＭおよびクエン酸ナトリウム・２水和物９９．９ｍＭを含む水溶液；ｐＨ＝７．０）を６ｍＬ加え、上記工程１で調製した約３．８質量％のＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドゲルのチップゲルをそれぞれ浸漬させた。６×ＳＳＣ溶液に浸漬させた４つの試料のうち、２つは６０℃で１０分間浸漬させ、残りの２つは６０℃で１６時間浸漬させた。グリセロールゼラチンゲル溶液組成物で浸漬させた試料についても、同様の操作を行った。
３−１．冷蔵庫での保管による評価
グリセロールゼラチンゲル溶液組成物に６０℃で１０分間浸漬させた試料（試料１）および６０℃で１６時間浸漬させた試料（試料２）、ならびに６×ＳＳＣ溶液に６０℃で１０分間浸漬させた試料（試料３）および６０℃で１６時間浸漬させた試料（試料４）の液切りをした。その後、試料を入れた平底チューブに、空気穴を開けたパラフィルムで蓋をして冷蔵庫内で４℃、３か月間静置した。その結果、６×ＳＳＣ溶液に浸漬していたチップゲル（試料３および４）はいずれも半分程度の大きさに収縮していたが、グリセロールゼラチンゲル溶液組成物に浸漬していたもの（試料１および２）はほぼ元のままの大きさであった。
３−２．乾燥剤中での保管による評価
試料５〜８（試料１〜４と同様にして調製し、評価３−１に用いなかった試料）を用いて更なる評価を行った。まず、クッキングシート（旭化成ホームプロダクツ社製）を約５ｃｍ×１０ｃｍの長方形に切ったものを用意し、これを２つ折りにして試料５〜８のチップゲルを挟み、シリカゲルで覆い１か月間静置した。
その結果、６×ＳＳＣ溶液に浸漬していたチップゲル（試料７および８）は白濁して縮んでいたが、グリセロールゼラチンゲル溶液組成物に浸漬させたもの（試料５および６）はいずれも元の形状を保っていた。結果を図１に示す。
特開２００６−１８９３０７号公報に記載された方法と同様にして、約３．８質量％のＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドゲルをスポットとした貫通孔型のＤＮＡチップを作製した。ＤＮＡチップのプローブには三菱レイヨン社製アンチエイジングチップのマウス版のプローブを用いた。
このＤＮＡチップをグリセロールゼラチンゲル溶液組成物に浸漬させるために、ＤＮＡチップを複数枚立てて収納し、プレートごと遠心機にかけて液切りすることが出来る液切り容器を作製した。
＜グリセロールゼラチンゲル溶液組成物で処理したチップの作製＞
実施例１と同様の組成のグリセロールゼラチンゲル溶液組成物を約５０ｍＬ調製し、図８に示すように容器内に注ぎ、ＤＮＡチップの核酸プローブが配列固定化されているゲルが存在する領域を含む部分を６０℃で所定の時間浸漬した。その後容器を傾けてグリセロールゼラチンゲル溶液組成物を捨て、さらに、容器ごと遠心機を用いて余分なゲル溶液組成物を除去し、ＤＮＡチップを乾燥状態にした。その後、シリカゲルとともに袋に密閉し、使用するまで室温で暗所に保管した。
上記の操作を異なる浸漬時間で行い、下記の試料９および１０を得た。また、比較として下記試料１１を用意した。
（９）グリセロールゼラチンゲル溶液組成物に１０分間浸漬させた後、一晩乾燥状態にしておいたＤＮＡチップ（三菱レイヨン社製アンチエイジングチップのマウス版プローブ）（１０）グリセロールゼラチンゲル溶液組成物に１２０分間浸漬させた後、一晩乾燥状態にしておいたＤＮＡチップ（三菱レイヨン社製アンチエイジングチップのマウス版プローブ）
（１１）６×ＳＳＣ溶液に浸漬した状態で保管しておいたＤＮＡチップ（三菱レイヨン社製アンチエイジングチップのマウス版プローブ）
上記３種類のＤＮＡチップに対して、マウス腎臟から増幅したａＲＮＡをハイブリダイゼーションさせて結果を比較した。
ハイブリダイゼーションの条件は、
０．１２Ｍ ＴＮＴバッファーで６５℃、１６時間
とした。
ハイブリダイゼーション後の洗浄条件は、
０．１２Ｍ ＴＮＴバッファー６ｍｌ ６５℃、２０分間浸漬、静置を２回、
０．１２Ｍ ＴＮバッファー６ｍｌ ６５℃、１０分間浸漬、静置を１回
とした。
結果を図２に示す。ここで、試料９と試料１１、試料１０と試料１１を比較した結果、相関係数がそれぞれ０．９９７４と０．９９８４であった。このことから、グリセロールゼラチンゲル溶液組成物で処理し乾燥させたＤＮＡチップと、６×ＳＳＣ溶液に浸漬した状態で保管し、乾燥させていないＤＮＡチップとでほぼ同じ結果が得られたことが分かる。
ＫＲＡＳ遺伝子の一塩基変異を判定するＤＮＡチップ作製した。プローブに用いた配列は下表に示す１４種類の配列である。
実施例３に用いたＤＮＡチップは、事前に相補オリゴＤＮＡを蛍光標識した検体とモデル的に混合したテンプレートからＰＣＲを行った検体とを用いてハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を最適化した。
ハイブリダイゼーションの条件は、
０．１２Ｍ ＴＮＴバッファーで５０℃、３０分
とした。
洗浄条件は、
０．１２Ｍ ＴＮＴバッファー６ｍｌ ５０℃、１０分間浸漬、静置を２回、
０．１２Ｍ ＴＮバッファー６ｍｌ ５０℃、１０分間浸漬、静置を１回
とした。
得られたＤＮＡチップを実施例２と同様に、グリセロールゼラチンゲル溶液組成物に１０分間または１６時間浸漬させた後、液切りし、遠心機にかけて乾燥状態のＤＮＡチップを作製した（試料１２および試料１３）。
乾燥１日後の試料１２および試料１３のＤＮＡチップと、６×ＳＳＣ溶液に保管しておいたＤＮＡチップ（試料１４）に対し、５％の変異型のテンプレートが混入したモデル検体からＰＣＲを行った検体をハイブリダイゼーションしたところ、試料１２および試料１３の乾燥後のＤＮＡチップにおいても、試料１４のＤＮＡチップと同様に正確に判定することが出来た。試料１３、１４の結果を図３に示した。
試料１３をさらに１か月間保管したチップ（試料１５）と６×ＳＳＣ溶液に保管しておいたチップ（試料１４）に対して、変異３（ｍｔ３）、または変異６（ｍｔ６）の５％の変異型のテンプレートが混入したモデル検体からＰＣＲを行った検体をハイブリダイゼーションしたところ、試料１５の乾燥１か月後のチップにおいても正確に判定することが出来た。本結果を図４に示した。
さらに５か月間保管したチップ（試料１６）と６×ＳＳＣ溶液に保管しておいたチップ（試料１４）に対して、変異３（ｍｔ３）、または変異６（ｍｔ６）の５％の変異型のテンプレートが混入したモデル検体からＰＣＲを行った検体をハイブリダイゼーションしたところ、試料１６の乾燥５か月後のチップにおいても正確に判定することが出来た。本結果を図５に示した。
配列番号１〜１４：合成ＤＮＡ
［配列表］

Claims (7)

  1. ゲルによって保持又は被覆された核酸プローブが搭載されたＤＮＡチップであって、
    前記ゲルとゲルの乾燥防止用組成物のゲル化物とを含むゲル複合体を含み、
    前記ゲルの乾燥防止用組成物が、
    多価アルコールと、
    ゼラチン、コラーゲン、カラギーナン、ペクチンおよび寒天から選択される少なくとも一種とを含む、ＤＮＡチップ。
  2. 前記ゲルの乾燥防止用組成物が、多価アルコール１００質量部に対して、ゼラチン、コラーゲン、カラギーナン、ペクチンおよび寒天から選択される少なくとも一種を１〜１０質量部含む、請求項１に記載のＤＮＡチップ。
  3. 前記多価アルコールがグリセロール、ジグリセロール、ペンタエリトリトール、トリメチロールプロパン、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、１，４−ペンタンジオール、１，５−ペンタンジオール、１，６−ヘキサンジオール、３，４−ヘキサンジオール、ネオペンチルグリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコールおよびジプロピレングリコールから選択される少なくとも一種である、請求項１または２に記載のＤＮＡチップ。
  4. 貫通孔型である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＤＮＡチップ。
  5. 中空繊維を用いた貫通孔型である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＤＮＡチップ。
  6. 以下の工程を含む、ゲル複合体を含むＤＮＡチップの製造方法。
    （ｉ）複数本の中空繊維を、中空繊維の各繊維軸が同一方向となるように３次元に配列し、その配列された中空繊維を樹脂で固定することにより、中空繊維束を製造する工程
    （ｉｉ）核酸プローブを含むゲル前駆体溶液を前記中空繊維束の各中空繊維の中空部に導入する工程
    （ｉｉｉ）前記中空繊維束の各中空繊維の中空部に導入したゲル前駆体溶液を反応させ、核酸プローブを含むゲルを各中空繊維の中空部に保持する工程
    （ｉｖ）前記中空繊維束を中空繊維の長手方向に交差する方向で切断して薄片化し、ＤＮＡチップを得る工程
    （ｖ）多価アルコールと、ゼラチン、コラーゲン、カラギーナン、ペクチンおよび寒天から選択される少なくとも一種とを含むゲルの乾燥防止用組成物を、前記ＤＮＡチップ若しくはそのゲルの部分に塗布するか、又は、前記ＤＮＡチップを前記ゲルの乾燥防止用組成物中に浸漬する工程、及び
    （ｖｉ）前記ゲルの乾燥防止用組成物をゲル化する工程
  7. 多価アルコールと、ゼラチン、コラーゲン、カラギーナン、ペクチンおよび寒天から選択される少なくとも一種とを含むゲルの乾燥防止用組成物を、ＤＮＡチップ若しくはそのゲルの部分に塗布するか、又は、前記ＤＮＡチップを前記ゲルの乾燥防止用組成物中に浸漬する工程、及び
    前記ゲルの乾燥防止用組成物をゲル化する工程
    を含む、ＤＮＡチップの乾燥防止方法。
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