JPWO2016194108A1

JPWO2016194108A1 - 分取クロマトグラフ

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Publication number: JPWO2016194108A1
Application number: JP2017521367A
Authority: JP
Inventors: 恭章中村; 忠行山口; 悠佑長井
Original assignee: Shimadzu Corp
Current assignee: Shimadzu Corp
Priority date: 2015-06-01
Filing date: 2015-06-01
Publication date: 2017-11-02
Anticipated expiration: 2035-06-01
Also published as: WO2016194108A1; US20180136174A1; JP6394803B2; CN107615058A; CN107615058B

Abstract

クロマトグラフのカラム１４において時間的に分離された試料中の目的成分を各分取容器２６に採取する分取クロマトグラフにおいて、筐体内に収容されたフローセル２１２と、該フローセル２１２を通過する成分を検出する検出器２１３とを有する検出部２１と、前記カラム１４と前記フローセル２１２の入口端を接続する第１配管１５と、前記筐体内に収容された、前記フローセル２１２を通過した成分を前記分取容器２６に接続される流路である分取流路又は廃液流路に選択的に流す流路切替部２４と、前記筐体内に収容された、前記フローセル２１２の出口端と前記流路切替部２４を接続する第２配管２７とを備える。

Description

本発明は、液体クロマトグラフのカラムで分離した目的成分をフラクションコレクターにより採取する分取クロマトグラフに関する。

分取クロマトグラフは、液体クロマトグラフ部、その後段に設けられた検出器及びフラクションコレクター、並びにこれらの動作を制御する制御部から構成される。分取クロマトグラフでは、液体クロマトグラフ部のカラムで時間的に分離され溶出した試料中の成分が検出器を通過する際に検出され、フラクションコレクターに導入されて分取容器に採取される（例えば特許文献１、２）。

液体クロマトグラフ部は、例えば送液ポンプ、試料注入部、及びカラム等で構成されており、カラムから溶出した成分は配管を通じて吸光分光光度計等の検出器のフローセルに導入される。検出器では、フローセルの他、重水素ランプ等の光源と回折格子、及び該回折格子を駆動するモータが１つの筐体内に収容されており、フローセルを通過した成分は配管を通じてフラクションコレクターに導入される。フラクションコレクターでは、バイアル瓶等の分取容器が接続された分取流路、廃液容器が接続された廃液流路、及び、検出器を通過してきた成分を分取流路又は廃液流路に選択的に流す流路切替部などが１個の筐体に収容されている。

分取クロマトグラフでは、検出器においてフローセルを通過する目的成分が検出されると、該目的成分がフローセルからフラクションコレクターの流路切替部に到達するまでに要する時間（遅れ時間）を考慮したタイミングで流路切替部が切り替えられ、目的成分が分取容器に採取される。具体的には、目的成分の検出開始時点から遅れ時間が経過した時点で流路切替部が流路を分取流路側に切り替えることにより目的成分の採取が開始され、目的成分の検出終了時点から遅れ時間が経過した時点で流路切替部が流路を廃液流路側に切り替えることにより目的成分の採取が終了する。この遅れ時間は、例えば、検出器のフローセルからフラクションコレクターの流路切替部までの配管の容量を移動相の流量（単位時間当たりの送液量）で除することにより計算される（例えば特許文献３）。

特開２０００−２１４１５１号公報特開２００７−１８３１７３号公報特許第３２６８８２０号明細書

松下至著「液体クロマトグラフィーQ&A100」技報堂, 2000年6月,ISBN 4-7655-0387-9, pp.229

従来の分取クロマトグラフでは、検出器で検出された目的成分が、遅れ時間が経過した時点で流路切替部に到達することを前提に、流路切替部を切り替えて目的成分を採取する。しかし、配管の径や断面積等には、公差の範囲内で製造上の誤差がある。前記遅れ時間は、配管の径（断面積）と長さの積で決まる配管容量に基づいて算出されるため、配管が長いほど配管の径の誤差の影響が大きくなり、遅れ時間が不正確になる。

また、フローセルを通過した目的成分は、移動相の中で拡散しながら配管内を流れて流路切替部に到達する。よって、流路切り替え部に到達した時点で、目的成分のピーク開始点は遅れ、ピーク幅もブロードになっている。その結果、目的成分が十分に到達していないのに分取を開始したり、目的成分のピークがまだ続いているのに分取を終了したりしてしまう、という問題があった。これらは配管容量を流量で割って算出した単純な遅れ時間ではカバーしきれなかった。

本発明が解決しようとする課題は、確実に目的成分を採取することができる分取クロマトグラフを提供することである。

上記課題を解決するために成された本発明は、クロマトグラフのカラムにおいて時間的に分離された試料中の目的成分を各分取容器に採取する分取クロマトグラフであって、
a) 筐体内に収容されたフローセルと、該フローセルを通過する成分を検出する検出器とを有する検出部と、
b) 前記カラムと前記フローセルの入口端を接続する第１配管と、
c) 前記筐体内に収容された、前記フローセルを通過した成分を前記分取容器に接続される流路である分取流路又は廃液流路に選択的に流す流路切替部と、
d) 前記筐体内に収容された、前記フローセルの出口端と前記流路切替部を接続する第２配管と
を備えることを特徴とする。

従来の分取クロマトグラフでは、フラクションコレクター（流路切替部及び分取容器）と検出部はそれぞれ別の筐体に収容されており、フローセルと流路切替部を接続する配管はこれらの筐体をつなぐように配設されていた。そのため、両筐体の配置によってはそれらをつなぐ配管の長さが長くなり、遅れ時間の誤差や配管内での成分の拡散が大きくなっていた。これに対し、本発明に係る分取クロマトグラフでは、検出部（フローセル）と流路切替部が同一の筐体内に収容されているため、標準的に第２配管の長さを従来よりも短くすることができる。これにより、従来の分取クロマトグラフに比べて配管容量の誤差を小さくし、遅れ時間を従来よりも正確にすることができる。また、第２配管を短くすることによって目的成分の拡散が小さく抑えられるため、従来よりも確実に目的成分を採取することができる。

前記検出部には、ＬＥＤを光源とする吸光光度計を好適に用いることができる。従来の分取クロマトグラフ吸光分光光度計では、重水素ランプ等の白色光源が用いられている。そのため、所望の波長の光を取り出すための回折格子及び該回折格子を駆動するモータを有する分光部を用いる必要があり、吸光分光光度計全体をフラクションコレクターの筐体内に収容することが難しい。一方、発光波長の範囲が狭いＬＥＤ光源を用いると分光部（回折格子及びモータ）が不要になる。従って、検出器全体を小型化して前記筐体内に収容することができる。
なお、従来同様に重水素ランプ等の光源及び分光部を有する検出器を使用する場合には、フローセルのみを上記筐体内に収容し、光ファイバーを用いて光源からの照射光やフローセルを通過した測定光を輸送するようにすればよい。

分取クロマトグラフでは、通常、複数の分取容器を収容したラックが前記筐体内に配置される。また、分取流路の出口端が取り付けられた分画ヘッドと、該分画ヘッドを水平及び垂直方向に移動させ、分取流路の出口端を所定の分取容器の上方に位置させるための駆動機構が設けられている。

そこで、本発明に係る分取クロマトグラフでは、
e) 前記分取流路の出口端が取り付けられ、前記フローセル及び前記第２配管並びに前記流路切替部が搭載された分画ヘッドと、
f) 前記分取流路の出口端を前記各分取容器間で移動させる駆動機構と
を備えることが好ましい。

上記態様の分取クロマトグラフでは、分画ヘッドにフローセル及び流路切替部が搭載される。即ち、フローセルと流路切替部が分画ヘッドと共に移動するため、分画ヘッドの移動を考慮する必要がなく、第２配管をさらに短くすることができる。また、フローセルと流路切替部を隣接して配置すれば、遅れ時間なしで目的成分を分取することができる。

本発明に係る分取クロマトグラフを用いることにより、フローセルから流路切替部に至る配管の長さを短くし、遅れ時間の誤差及び目的成分の拡散を抑えて確実に目的成分を採取することができる。

本発明に係る分取クロマトグラフの一実施例の要部構成図。本実施例の分取クロマトグラフの分画ヘッドに関する説明図。本実施例の分取クロマトグラフの吸光光度計の要部構成図。本実施例の分取クロマトグラフと従来の分取クロマトグラフの配管等の比較。

本発明に係る分取クロマトグラフの実施例について、以下、図面を参照して説明する。
本実施例の分取クロマトグラフの要部構成を図１に示す。また、分取クロマトグラフのフラクションコレクター２０の要部構成を図２に示す。本実施例の分取液体クロマトグラフは、大別して、試料に含まれる目的成分を分離する液体クロマトグラフ部１０、液体クロマトグラフ部１０で分離された目的成分を採取するフラクションコレクター２０、及びこれらの動作を制御する制御部３０から構成されている。

液体クロマトグラフ部１０は、移動相容器１１内の移動相が送液ポンプ１２により吸引され所定の流量でカラム１４に送液される。目的成分を含む試料は試料注入部１３から注入されて移動相の流れによりカラム１４に輸送される。試料中の目的成分はカラム１４内部で時間的に分離され溶出する。液体クロマトグラフ部１０の各ユニットは、それぞれの筐体内に収容されそれぞれ配管により接続されている。

フラクションコレクター２０は、発光波長が異なる３つのＬＥＤ２１１a、２１１b、２１１cを光源とする吸光光度計２１、分画ヘッド２２、該分画ヘッド２２の移動機構（レール２３、モータ等）、電磁弁２４を備えている。吸光光度計２１と電磁弁２４は第２配管２７により接続され分画ヘッド２２の上面に載置されており、該分画ヘッド２２とともにレール２３に沿って移動する。また、フラクションコレクター２０には、ラック２５に収容された複数の分取容器２６が載置されている。フラクションコレクター２０の各部は１つの筐体内に収容されている。

液体クロマトグラフ部１０のカラム１４において分離された成分は、第１配管１５を通じて吸光光度計２１のフローセル２１２に導入される。吸光光度計２１の要部構成を図３に示す。吸光光度計２１では、３つのＬＥＤ２１１a、２１１b、２１１cは、分取する３種類の目的成分により吸収される波長帯の光を発する光源であり、後述する分取制御部３２からの制御信号に基づいて時分割で（即ち、３つのＬＥＤから発せられる光が順番に）フローセル２１２に照射される。そして、フローセル２１２を通過した測定光が第１フォトダイオード２１３で検出される。また、各ＬＥＤ２１１a、２１１b、２１１cから発せられる光の一部は第２フォトダイオード２１４で検出される。第１フォトダイオード２１３及び第２フォトダイオード２１４からの検出信号は制御部３０に送られる。制御部３０では、３種類の波長の光の吸光度が計算された後、クロマトグラムが作成され、後述する表示部５０の画面に表示される。

吸光光度計２１において目的成分が検出されると、後述の分取制御部３２により電磁弁２４が切り替えられ、フローセル２１２を通過した該目的成分が分取流路を通じて分取容器に採取される。目的成分が通過した後は、再び分取制御部３２によって電磁弁２４が切り替えられ、フローセル２１２を通過した成分は廃液流路に導かれる。

制御部３０は、記憶部３１及び分取制御部３２を備えている。分取制御部３２は、液体クロマトグラフ部１０及びフラクションコレクター２０の各部の動作を制御する機能ブロックである。また、入力部４０と表示部５０が接続されている。

分取制御部３２は、表示部５０に分取条件入力画面を表示し、使用者に、第２配管２７の配管容量と、送液ポンプ１２の送液流量を入力させる。これらが入力されると、該配管容量と送液流量から遅れ時間が計算されて記憶部３１に保存される。遅れ時間は、吸光光度計２１において検出された（目的）成分が電磁弁２４に到達するまでに要する時間である。分取制御部３２は、吸光光度計２１における目的成分の検出開始時点から上記遅れ時間が経過した時点で電磁弁２４の流路を分取流路側に切り替えて目的成分の採取を開始させ、また、目的成分の検出終了時点から遅れ時間が経過した時点で電磁弁２４の流路を廃液流路側に切り替えて目的成分の採取を終了する。

本実施例における吸光光度計２１は、上述のとおり目的成分により吸収される波長の光を発するＬＥＤ２１１a、２１１b、２１１cを光源として用いている。そのため、従来の、水銀ランプ等の白色光源を用いた吸光光度計のように分光部を設ける必要がない。従って、吸光光度計２１が小型であり、分画ヘッド２２の内部に収容することができる。また、本実施例では、分画ヘッド２２の内部電磁弁２４も収容しているため、吸光光度計２１のフローセル２１２と電磁弁２４を結ぶ第２配管２７の配管長が従来よりも短くなる。従って、製造時に生じる配管の径のばらつきに起因する遅れ時間の誤差を小さくして目的成分を確実に採取することができる。さらに、吸光光度計２１のフローセル２１２と電磁弁２４を直結することも可能であり（この場合、本発明に係る第２配管はその境界部となる）、遅れ時間なしで目的成分を採取することができる。なお、図２では、吸光光度計２１及び電磁弁２４を分画ヘッド２２の内部に収容する例を示したが、吸光光度計２１及び電磁弁２４を吸光光度計２１の上面や側面に搭載することもできる。

上記実施例の構成と、従来用いられている構成（比較例）のそれぞれについて、検出器から電磁弁までの配管容量に依存する遅れ時間と、カラムから電磁弁までの配管容量に依存する拡散容量を求めた結果について、以下、説明する。図４は、本実施例と比較例の構成を比較したものである。本実施例と比較例のいずれにおいても、流量を1,000μL/minとした。

図４に示すとおり、本実施例の分取クロマトグラフの第１配管１５（カラム１４〜フローセル２１２）の径はφ0.1mm、長さは1000mmであり、その容量は7.9μLである。また、第２配管２７（フローセル２１２〜電磁弁２４）の径はφ0.1mm、長さは50mmであり、その容量は0.4μLである。一方、従来の分取クロマトグラフでは、第１配管（カラム〜フローセル）の径はφ0.1mm、長さは300mmであり、その容量は2.4μLである。また、第２配管（フローセル〜電磁弁）の径はφ0.3mm、長さは1000mmであり、その容量は70.7μLである。なお、従来の第２配管の径が他と異なる（他よりも太い）のは、検出器のフローセルの耐圧性が低いためである。つまり、検出器のフローセルの出口端に細く長い配管を接続すると背圧が高くなりすぎ液漏れが生じてしまうためである。一方、本実施例の分取クロマトグラフでは第２配管２７が短いため、配管径が小さくてもフローセルに過度な背圧がかかる心配がない。

上述の条件で、第２配管の容量を流量で除して遅れ時間を求めた結果、比較例が4.24secであるのに対し、本実施例は0.024secとなった。つまり、実質的に遅れ時間なしで確実に目的成分を採取できることが分かる。

また、本実施例と比較例のそれぞれについて、カラムから電磁弁までの拡散容量を、非特許文献１に記載されている次式により求めた。

上式(1)において、σvは拡散容量（μL）、dは配管の直径（mm）、Lは配管の長さ（mm）、Fは流量（μL/sec）、Dmは拡散係数（0.002mm²/sec, 一般値)である。

具体的な一例として、目的成分が1.0sec（半値全幅）のピークに相当する広がりでカラムを通過した場合を考える。上述した流量F=1,000μL/minから、目的成分のピークの半値全幅を流量で表すと16.67μLとなる。目的成分の広がりは通常、ガウス分布で表され、ガウス分布では半値全幅=2.35σであることから、目的成分の拡散容量はσ=7.09μLとなる。

次に、本実施例及び比較例のそれぞれについて、図４に示す配管径及び配管長と、流量F=1,000μL/min、拡散係数Dm=0.002mm²/secを用いて上式(1)からσを計算する。すると、本実施例の第１配管ではσ=2.61μL、第２配管ではσ=0.58μLになる。また、比較例の第１配管ではσ=1.43μL、第２配管ではσ=23.46μLになる。最後に、自乗平均により３つのσの値（カラムを出た時点のσ、第１配管のσ、及び第２配管のσ）から全体のσを計算すると、本実施例ではσ=7.58μL、比較例ではσ=24.55μLになる。流量Fに基づきこれらの値を秒数に変換すると本実施例ではσ=0.45sec、比較例ではσ=1.47secになる。最後に、これらを半値全幅に変換すると、本実施例では1.07sec、比較例では3.46secになる。つまり、比較例では目的成分が3.46sec（半値全幅）のピークにまで拡散するのに対し、本実施例では1.07sec（半値全幅）のピークに抑えられる。従って、本実施例の分取クロマトグラフでは、移動相中で目的成分を拡散させることなく、目的成分を確実に採取することができる。

上記実施例は一例であって、本発明の趣旨に沿って適宜に変更することができる。例えば、上記実施例では吸光光度計２１において３種類のＬＥＤ２１１a、２１１b、２１１cからの光を時分割でフローセル２１２に照射したが、各波長の光を吸収する目的成分の溶出順が予め分かっている場合には、その順にＬＥＤを切り替えて用いればよい。また、使用するＬＥＤの数も適宜に変更すればよい。また、LED同様に狭スペクトルである水銀ランプをLEDの代わりに用いても良い。

また、上記実施例では検出器として吸光光度計２１を用いたが、他の検出器（蛍光検出器、電気伝導度検出器、示差屈折率検出器等）を用いることもできる。また、複数の検出器を組み合わせて用いることもできる。
さらに、従来同様に、白色光源を用いる吸光分光光度計を用いることもできる。その場合には、フローセルのみをフラクションコレクターの分取ヘッドに配置し、該光源から発せられる白色光から単色光を取り出す分光部（例えば回折格子）はフラクションコレクターの筐体内外の任意の位置に配置する。そして、分光部において取り出した単色光を光ファイバーにより輸送してフローセルに照射すればよい。
その他、上記実施例では吸光光度計２１を分画ヘッド２２上に載置したが、フラクションコレクターの筐体内であれば別の位置に配置してもよい。

１０…液体クロマトグラフ部
１１…移動相容器
１２…送液ポンプ
１３…試料注入部
１４…カラム
１５…第１配管
２０…フラクションコレクター
２１…フローセル
２１…吸光光度計
２１１a〜２１１c…ＬＥＤ
２１２…フローセル
２１３…第１フォトダイオード
２１４…第２フォトダイオード
２２…分画ヘッド
２３…レール
２４…電磁弁
２５…ラック
２６…分取容器
２７…第２配管
３０…制御部
３１…記憶部
３２…分取制御部
４０…入力部
５０…表示部

液体クロマトグラフ部１０では、移動相容器１１内の移動相が送液ポンプ１２により吸引され所定の流量でカラム１４に送液される。目的成分を含む試料は試料注入部１３から注入されて移動相の流れによりカラム１４に輸送される。試料中の目的成分はカラム１４内部で時間的に分離され溶出する。液体クロマトグラフ部１０の各ユニットは、それぞれの筐体内に収容されそれぞれ配管により接続されている。

フラクションコレクター２０は、発光波長が異なる３つのＬＥＤ２１１a、２１１b、２１１cを光源として備えた吸光光度計２１、分画ヘッド２２、該分画ヘッド２２の移動機構（レール２３、モータ等）、及び電磁弁２４を備えている。吸光光度計２１と電磁弁２４は第２配管２７により接続され分画ヘッド２２の内部に収容されており、該分画ヘッド２２とともにレール２３に沿って移動する。また、フラクションコレクター２０には、ラック２５に収容された複数の分取容器２６が載置されている。フラクションコレクター２０の各部は１つの筐体内に収容されている。

本実施例における吸光光度計２１は、上述のとおり目的成分により吸収される波長の光を発するＬＥＤ２１１a、２１１b、２１１cを光源として用いている。そのため、従来の、水銀ランプ等の白色光源を用いた吸光光度計のように分光部を設ける必要がない。従って、吸光光度計２１が小型であり、分画ヘッド２２の内部に収容することができる。また、本実施例では、分画ヘッド２２の内部に電磁弁２４も収容しているため、吸光光度計２１のフローセル２１２と電磁弁２４を結ぶ第２配管２７の配管長が従来よりも短くなる。従って、製造時に生じる配管の径のばらつきに起因する遅れ時間の誤差を小さくして目的成分を確実に採取することができる。さらに、吸光光度計２１のフローセル２１２と電磁弁２４を直結することも可能であり（この場合、本発明に係る第２配管はその境界部となる）、遅れ時間なしで目的成分を採取することができる。なお、図２では、吸光光度計２１及び電磁弁２４を分画ヘッド２２の内部に収容する例を示したが、吸光光度計２１及び電磁弁２４を分画ヘッド２２の上面や側面に搭載することもできる。

また、上記実施例では検出器として吸光光度計２１を用いたが、他の検出器（蛍光検出器、電気伝導度検出器、示差屈折率検出器等）を用いることもできる。また、複数の検出器を組み合わせて用いることもできる。
さらに、従来同様に、白色光源を用いる吸光分光光度計を用いることもできる。その場合には、フローセルのみをフラクションコレクターの分取ヘッドに配置し、該光源から発せられる白色光から単色光を取り出す分光部（例えば回折格子）はフラクションコレクターの筐体内外の任意の位置に配置する。そして、分光部において取り出した単色光を光ファイバーにより輸送してフローセルに照射すればよい。
その他、上記実施例では吸光光度計２１を分画ヘッド２２の内部に収容したが、フラクションコレクターの筐体内であれば別の位置に配置してもよい。

Claims

クロマトグラフのカラムにおいて時間的に分離された試料中の目的成分を各分取容器に採取する分取クロマトグラフであって、
a) 筐体内に収容されたフローセルと、該フローセルを通過する成分を検出する検出器とを有する検出部と、
b) 前記カラムと前記フローセルの入口端を接続する第１配管と、
c) 前記筐体内に収容された、前記フローセルを通過した成分を前記分取容器に接続される流路である分取流路又は廃液流路に選択的に流す流路切替部と、
d) 前記筐体内に収容された、前記フローセルの出口端と前記流路切替部を接続する第２配管と
を備えることを特徴とする分取クロマトグラフ。
前記検出部がＬＥＤ光源を備えた吸光光度計であることを特徴とする請求項１に記載の分取クロマトグラフ。
前記検出部が、前記筐体外に配置された光源から発せられ前記フローセルに照射される照射光を輸送する光ファイバー、を備えることを特徴とする請求項１に記載の分取クロマトグラフ。
e) 前記分取流路の出口端が取り付けられ、前記フローセル及び前記第２配管並びに前記流路切替部が搭載された分画ヘッドと、
f) 前記分取流路の出口端を前記各分取容器間で移動させる駆動機構と
を備えることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の分取クロマトグラフ。