WO2014021099A1

WO2014021099A1 - 液体クロマトグラフ分析装置

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Publication number: WO2014021099A1
Application number: PCT/JP2013/069334
Authority: WO
Inventors: 秀之秋山
Original assignee: 株式会社日立ハイテクノロジーズ
Priority date: 2012-08-03
Filing date: 2013-07-17
Publication date: 2014-02-06
Also published as: JP2014032098A

Abstract

　本発明は、液体クロマトグラフ用検出器のダイナミックレンジを拡大することを目的とする。　単独のフローセルにおいて形成される試料の流路に対して、異なる複数の方向から光を入射させたのち、試料透過後のそれぞれの光を検出するように光導波路を形成させる。　測定データに人為的な操作を加える必要がなく、測定データの信頼性を損なわずに検出器のダイナミックレンジを拡大できる。また、装置に別途の部材を搭載する必要がないため、上記ダイナミックレンジの拡大を安価に実現することができる。

Description

液体クロマトグラフ分析装置

本発明は、液体クロマトグラフ用検出器、及びこれを用いた液体クロマトグラフ分析装置に関する。特に不純物評価など微量成分の含有率を再現性良く測定するのに好適な方法、及び装置に関する。

液体クロマトグラフ分析装置は、移動相を送液する送液部、測定試料を流路に注入する試料注入部、測定試料を各成分に分離する分離部および分離された成分ごとに検出する検出部より構成される。検出部における検出方法としては主に光学的検出方法が採用され、中でも試料の吸光度を測定する方法が最も一般的である。

　本装置における検出部に要求される性能として、十分なダイナミックレンジ（試料成分の測定濃度範囲）の確保がある。例えば試料の主成分に対する不純物の含有率を求めようとした場合、微量成分を定量できる低い定量限界を実現するだけでは不十分であり、同時に主成分も定量できるだけの高濃度側の定量限界も併せて要求される。

　上記のようなダイナミックレンジを拡張する方法として、特許文献１及び２には、光路長の異なる流路をもつ複数のフローセルを検出器に用いる技術について説明されている。

　特許文献３には、単一のフローセルにおいて長短の異なる流路を設けるための、フローセル内の管の材質及び構造に関する技術が説明されている。

　これらは長短２つの光路長の流路を用いて先述のダイナミックレンジの上下限両方を同時に改善するものであり、単流路の場合より２つの光路長の比率だけダイナミックレンジを拡大することが可能である。

米国特許第5214593号米国特許第7847944号米国特許第6342948号

　上述の特許文献１及び２の技術において、複数の流路を用いる場合、液体クロマトグラフのようなフロー計測系を構築するには、これらの流路を直列ないしは並列に接続する必要がある。

　直列接続の場合は同一の試料成分を検出しても上流側の流路と下流側の流路との間に必ず検出時刻のずれが発生するため、各流路より得られた測定結果を統合する際にこの時間ずれを補正する必要がある。また同時に試料成分が各流路を上流より順次通過するにしたがって試料成分の拡散が発生するため、液体クロマトグラフの場合、同一成分にも関わらず検出ピークの形状、特にピーク幅が下流の流路にいくにつれ広がってしまう。よってピーク形状の補正が必要となり、ダイナミックレンジの拡大のために測定データに多くの人為的な操作を要するため、測定結果に対する信頼性を著しく低下させる。

　一方、並列接続の場合は流路の接続を適切に行うことで上述の直列接続の場合のような問題は軽減される。しかしながら、各流路に分配される試料成分の割合を厳密に規定する必要があるため、スプリッタなどの分配装置を流路に追加しなければならず、単流路の場合に比べ測定系が高価になる。さらに、追加部分における試料成分の拡散等、得られる測定結果の質も低下する。

　また特許文献１においては、２つの検出器がそれぞれ信号を発生させ、その信号は別個に処理されたのちに組み合わされるため、コストがより増加する。

　一方特許文献３に開示されるように、光路長が異なる部分を一体として単流路とした技術においては、長短各流路から得られる吸光度を独立して得ることは困難である。そのため、各光路部分からの透過光を合わせた総光量を検出せざるを得ず、試料成分が低濃度の場合は吸収の変化の大きい長光路部分の振る舞いが全体に対して支配的となる。逆に高濃度領域では長光路部分の透過率が実質ゼロとなり短光路部分の振る舞いが表れてくるため、試料の濃度領域によって検出感度（試料濃度に対する信号の勾配）が変化する。したがってこの場合は出力値の線形性を得るためには検量線のような感度特性曲線を用いた補正が必要であり、ここでも測定データに人為的操作を加える必要が生じ、結果として信頼性が低下する。

　上記目的を達成するための一態様として、試料が流れる流路を形成するフローセルと、前記フローセルを流通する試料に光を照射する光源と、前記試料を透過した光を検出する検出部とを備え、当該光源により照射された光が、前記フローセルの長手方向から前記試料に入射するように形成された第１の光導波路と、前記フローセルの側面方向から前記試料に入射するように形成された第２の光導波路を有することを特徴とする液体クロマトグラフ装置、及び液体クロマトグラフ用検出器を提供する。

　また別の態様として、試料が流れる流路を形成するフローセルと、前記フローセルを流通する試料に光を照射する光源と、前記試料を透過した光を検出する検出器とを備え、前記フローセルの長手方向の中心部に位置し、当該光源により照射される光が、前記フローセルの側面方向から前記試料に入射するように形成された第１の光導波路と、前記第１の光導波路とは異なる位置に形成された第２の光導波路と、前記フローセルの長手方向の外面に形成された反射面とを有し、前記反射面は、前記第２の光導波路を通って前記試料に入射した光を多重反射させることを特徴とする液体クロマトグラフ装置、及び液体クロマトグラフ用検出器を提供する。

　本発明によれば、測定データに人為的な操作を加える必要がなく、測定データの信頼性を損なわずに検出器のダイナミックレンジを拡大できる。

　また、装置に別途の部材を搭載する必要がないため、上記ダイナミックレンジの拡大を安価に実現することができる。

液体クロマトグラフ分析装置における分析原理の説明図液体クロマトグラフ用ダイオードアレイ検出器における吸光度測定原理の説明図本発明の1つめの実施例における液体クロマトグラフ用フローセルの構成図本発明の1つめの実施例における液体クロマトグラフ用ダイオードアレイ検出器の構成図本発明の1つめの実施例における液体クロマトグラフ用ダイオードアレイ検出器の構成図本発明における液体クロマトグラフ用ダイオードアレイ検出器から得られるクロマトグラムを示す図本発明の２つめの実施例における液体クロマトグラフ用フローセルの構成図本発明の２つめの実施例における液体クロマトグラフ用ダイオードアレイ検出器の構成図

　以下、図面を参照して、液体クロマトグラフ分析装置における検出器のダイナミックレンジを拡大する方法、及び装置について詳細に説明する。

　図１は液体クロマトグラフ分析装置における分析原理の説明図である。まず、ポンプ１０１により容器中の移動相１０２が分離カラム１０５に送られる。分離カラム１０５はカラム恒温装置１０４により試料の分離に最適な温度に恒温される。オートサンプラ１０３は分離カラム１０５よりもポンプ１０１側に位置している。オートサンプラ１０３には複数の試料がセットされ、一定時間ごとに自動的に分離カラム１０５に導入される。そして、分離カラム１０５においてそれぞれの成分に分離展開され時間差を伴い溶出される。その後、順次にダイオードアレイ検出器１０６に送られ、成分ごとの吸光度を測定し、データ処理部１０７に取込まれ、計算処理されてレポート出力される。

　図２は液体クロマトグラフ用ダイオードアレイ検出器の吸光度測定原理の説明図である。
光源２０１から放射された光源光を集光ミラー２０２にて集光してフローセル２０３に導入・透過させる。フローセル透過光を集光レンズ２０４にてスリット２０５に導入し、分散素子２０６にて各波長に分散された光をフォトダイオードアレイ検出器２０７にて検知し、各時点における透過光量スペクトルを得て、これをデータ処理部２０８に格納する。試料成分導入前の透過光量スペクトルを基準として試料がフローセルに導入されたときの透過光量スペクトルを測定し、光量変化から各波長における吸光度を計算し、吸光度スペクトルを得る。

　ここで、フローセルは試料の吸光度を測定するために検出器に備えられる。これは通常円筒形の流路を有し、この流路の一端面より長手方向に光を入射し、他端面より出射された光を光検出器にて測定する構成となっている。

　入射光量と出射光量の比の対数を計算することにより、フローセル流路内に収容された試料成分の吸光度を求めることができる。試料成分の吸光度は成分濃度に比例するため、吸光度のクロマトグラムのピーク面積が当該成分の試料中に含まれる物質量に相当する。

　吸光度検出においてダイナミックレンジの上下限を規定する要因としては、下限は光学系の明るさと光検出器の性能にて決まるベースラインノイズ幅によって規定される検出限界であり、上限は光学系の迷光によって規定される吸光度の直線性が担保される上限である。よって、ベースラインノイズ幅が小さく、低迷光で吸光度直線性の範囲が広い検出器が望ましいが、現状ではベースラインノイズ幅及び迷光を大きく改善することは困難である。

　ただし、フローセルの光路長を変更することによってダイナミックレンジの上限あるいは下限のうちの一方を改善することは可能である。吸光度はBeerの法則により試料濃度とセル光路長の積に比例するため、光路長を延長することにより相対的に濃度を増やすことで、光路長の延長倍率に反比例して検出限界を低くすることができる。
また、逆に光路長を縮小することにより、迷光により規定された吸光度の直線性の上限に到達する試料濃度を増大させることも可能である。
しかしながら、フローセルの光路長を変更することによるこれらの効果は上下限の一方を改善すれば当然他方は同じ倍率で悪化するため、結局ダイナミックレンジを拡大することにはならない。
一方、上述の通り、特許文献１～３のように光路長の異なる複数の流路をもつ多流路フローセルを用いる場合には、測定結果に対する信頼性の低下やコスト増加等の問題が存在する。

　図３は、本発明の１つめの実施例における液体クロマトグラフ用フローセルの構成図である。フローセル流路３０１はガラス板にて直方体状に構成されており、光導波路３０２、３０３によってそれぞれフローセルの長手方向および側面方向から流路に入射光を入射し、光導波路３０４、３０５によってそれぞれの方向のフローセル透過光を分光器に導入する。
この際、図３に示すようにフローセル流路側面方向の透過光を得るための光導波路３０３および３０５をフローセル流路３０１の長手方向の中央部に設置することにより、試料成分の濃度中心が流路の中央に来た時に長手光路および側面光路ともに吸光度が最大となるため、２流路直列系で見られるようなクロマトピークの時間ずれを無くすことができる。

　図４－Ａは、本発明の1つめの実施例における液体クロマトグラフ用ダイオードアレイ検出器の構成図である。光源４０１から放射された光源光を集光ミラー４０２にて光導波路４０３と４０４の入射端面に同時に照射するようにしておき、切替シャッター４０５にて光が通る光路を選択できるようにしておく。切替シャッター４０５は、図示しない制御部によって制御される。

　切替シャッター４０５を図４－Ａに示すように光導波路４０４を遮光する位置にした場合、フローセル流路４０６の長手方向を通過した透過光が集光レンズ４０７に導入される。

　また、切替シャッター４０５を図４－Ｂに示すように光導波路４０３を遮光する位置にした場合、フローセル流路４０６の側面方向を通過した透過光が集光レンズ１４に導入される。予め測定試料中の各成分について保持時間を測定・特定しておけば、試料中の高濃度成分である主成分ピーク出現時には切替シャッター４０５をフローセル流路４０６の側面方向である短光路長側（図４－Ｂ）に、試料中の低濃度成分である不純物ピーク出現時は切替シャッター４０５をフローセル流路４０６の長光路長側（図４－Ａ）に自動的に切り替えるように制御部にてプログラムすることができる。

　図５は、本発明における液体クロマトグラフ用ダイオードアレイ検出器から得られるクロマトグラムを示す図である。図４を用いて上述した切替シャッター４０５の切り替えをプログラムする際に、それぞれの光路から得られた吸光度データをデータ処理部４１３にて光路の切替位置に連動して単位光路長（通常は１０ｍｍ）当たりの吸光度に換算するよう設定する。各区間の時間ごとに得られたクロマトグラムを組み合わせることで、その試料の各成分の含有率を正しく反映した吸光度クロマトグラムを得ることができる。

　実施例１にて説明した構成では、フローセルの実寸法は光路長と等しくなるため、例えば光路長の長短比がより大きい性能が要求される場合には、流路の長手方向に必要なスペースが大きくなり、装置に組み込むことが実際上困難となる場合がある。

　そこで次に、本発明の別の実施形態について説明する。液体クロマトグラフ分析装置の分析原理および液体クロマトグラフ用ダイオードアレイ検出器の吸光度測定原理は図１、及び図２に示した通りである。

　図６は、本発明の２つめの実施例における液体クロマトグラフ用フローセルの構成図である。フローセル流路６０７に相対する１組の反射面６０８を設け、フローセル流路の上端部付近から反射面に対し入射角を持って光を入射する。このとき、１組の反射面間を多重反射してフローセル流路６０７の下端部付近の出射部からフローセル透過光を取り出せるよう入射角を選択することで、フローセル流路の実寸法より大きく延長された光路長のフローセル透過光を得ることができる。
この際にフローセル流路６０７の実寸法に相当した光路長を得るための光路の位置をこの流路の中央部に設置しておけば、実施例1の場合と同様に試料成分の濃度中心が流路の中央に来た時に２つの光路ともに吸光度が最大となるため、２流路直列系で見られるようなクロマトピークの時間ずれを無くすことができる。

　反射面６０８は光量のロスが無い全反射を実現する構成とすることが望ましいが、臨界角の制限等で実現が困難な場合は、鏡面反射を用いる構成とすることもできる。試料が無い状態での透過率を基準とすることにより試料成分の吸光度を求めることが可能だからである。

　図７は、本発明の２つめの実施例における液体クロマトグラフ用ダイオードアレイ検出器の構成図である。

　実施例１の場合と同様に、光源７０１から放射された光源光を集光ミラー７０２にて光導波路７０５と７０６の入射端面に同時に照射するようにしておき、切替シャッター７０３にて光が通る光路を選択できるようにしておけば、同様に長短２つの光路を切り替えることが可能である。

　このような構成をとることにより、長短２つの光路長を得るために必要なフローセルの寸法に自由度を持たせることができ、より省スペース化を図ることができる。

１０１・・・送液ポンプ、１０２・・・移動相、１０３・・・オートサンプラ、１０４・・・カラム恒温装置、１０５・・・分離カラム、１０６・・・ダイオードアレイ検出器、１０７、２０８、４１３、７１４・・・データ処理部、２０１、４０１、７０１・・・光源、２０２、４０２，７０２・・・集光ミラー、２０３・・・フローセル、２０４、７１０・・・集光レンズ、２０５、４１０、７１１、７１３・・・スリット、２０６、４１２、７１２・・・回折格子、２０７、４１１・・・フォトダイオードアレイ検出器、３０１、４０６、６０７、７０７・・・フローセル流路、３０２、３０３、３０４、３０５、４０３、４０４、４０８、４０９、６０１、６０２、６０３、６０４、７０５、７０６、７０８、７０９・・・光導波路、３０６、６０５・・・インレット流路、３０７、６０６・・・アウトレット流路、４０５、７０３・・・切替シャッター、４１４、７０４・・・切替シャッター駆動部、６０８・・・反射面

Claims

　試料が流れる流路を形成するフローセルと、
　前記フローセルを流通する試料に光を照射する光源と、
　前記試料を透過した光を検出する検出部と、を備えた液体クロマトグラフ装置において、
　当該光源により照射された光が、前記フローセルの長手方向から前記試料に入射するように形成された第１の光導波路と、前記フローセルの側面方向から前記試料に入射するように形成された第２の光導波路を有することを特徴とする液体クロマトグラフ装置。
　請求項１に記載された液体クロマトグラフ装置において、
　前記第２の光導波路は、
　当該フローセルの側面方向から照射される光が、
　前記フローセルの長手方向の中心部に照射されるように形成されることを特徴とする液体クロマトグラフ装置。
　請求項１に記載された液体クロマトグラフ装置において、
　前記光源により照射された光を、当該形成された第１の光導波路または第２の光導波路のうちいずれか一方を選択的に通過させる切替手段を有することを特徴とする液体クロマトグラフ装置。
　請求項３に記載された液体クロマトグラフ装置において、
　前記光路切替手段を制御する制御装置を有し、
　前記制御装置は、
　前記試料中の高濃度成分が前記フローセルを流通するときには前記第２の光導波路を通過した光が前記試料に入射するように当該制御を行い、
　前記試料中の低濃度成分が前記フローセルを流通するときには前記第１の光導波路を通過した光が前記試料に入射するように当該制御を行うことを特徴とする液体クロマトグラフ装置。
　試料が流れる流路を形成するフローセルと、
　前記フローセルを流通する試料に光を照射する光源と、
　前記試料を透過した光を検出する検出部と、を備えた液体クロマトグラフ用検出器において、
　当該光源により照射された光が、前記フローセルの長手方向及び前記フローセルの側面方向から前記試料に入射するように形成された光導波路を有することを特徴とする液体クロマトグラフ用検出器。
　試料が流れる流路を形成するフローセルと、
　前記フローセルを流通する試料に光を照射する光源と、
　前記試料を透過した光を検出する検出部と、を備えた液体クロマトグラフ装置において、
　前記フローセルの長手方向の中心部に位置し、当該光源により照射される光が、前記フローセルの側面方向から前記試料に入射するように形成された第１の光導波路と、前記第１の光導波路とは異なる位置に形成された第２の光導波路と、
　前記フローセルの長手方向の外面に形成された反射面と、を有し、
　前記反射面は、前記第２の光導波路を経由して前記試料に入射した光を多重反射させることを特徴とする液体クロマトグラフ装置。
　請求項６に記載された液体クロマトグラフ装置において、
　前記光源により照射された光を、当該形成された光導波路のうちいずれか一方を選択的に通過させる切替手段を有することを特徴とする液体クロマトグラフ装置。
　請求項７に記載された液体クロマトグラフ装置において、
　前記光路切替手段を制御する制御装置を有し、
　前記制御装置は、
　前記試料中の高濃度成分が前記フローセルを流通するときには前記フローセルの側面方向から前記光が前記試料に入射するように前記光路切替手段を制御し、
　前記試料中の低濃度成分が前記フローセルを流通するときには前記フローセルの長手方向から前記光が前記試料に入射するように前記光路切替手段を制御することを特徴とする液体クロマトグラフ装置。
　試料が流れる流路を形成するフローセルと、
　前記フローセルを流通する試料に光を照射する光源と、
　前記試料を透過した光を検出する検出部と、を備えた液体クロマトグラフ用検出器において、
　前記フローセルの長手方向の中心部に位置し、当該光源により照射される光が、前記フローセルの側面方向から前記試料に入射するように形成された第１の光導波路と、前記第１の光導波路とは異なる位置に形成された第２の光導波路と、
　前記フローセルの長手方向の外面に形成された反射面と、を有し、
　前記反射面は、前記第２の光導波路を通って前記試料に入射した光を多重反射させることを特徴とする液体クロマトグラフ用検出器。