JPWO2015097863A1 - 診断用情報の分析方法およびそのためのキット - Google Patents

Abstract

本発明は、前立腺癌と前立腺良性疾患とを精度よく判別することのできる新たな診断用情報の分析方法およびその診断情報を得るための診断用キットを提供することを課題とする。本発明に係る診断用情報の分析方法の実施形態の一つは、診断対象に由来する血液検体中の全てのムチン−１（トータルＭＵＣ１）の濃度を測定し、得られた測定値を閾値と比較し、トータルＭＵＣ１の濃度の測定値が閾値よりも大きいことをもって、前記診断対象が罹患している疾患は前立腺癌ではなく前立腺良性疾患であると推定する診断用情報の分析方法であり、本発明に係る診断用キットの実施形態の一つは、トータルＭＵＣ１を定量するための抗ムチン−１抗体を含む診断用キットである。

Description

本発明は、前立腺良性疾患および前立腺癌に関する診断用情報の分析方法に関する。また、本発明は、血液中のムチン−１の濃度に基づく診断用情報の分析方法に関する。

生体の生命機能を担う主役であるタンパク質が、生体内で秩序正しくその機能を発揮するためには、糖鎖修飾をはじめとする翻訳後修飾が極めて重要な役割を担っている。翻訳後修飾に関して、近年、以下のようなことが次々と明らかにされた。生体内の大部分のタンパク質は糖鎖による修飾を受けており、タンパク質に付加した糖鎖がタンパク質の安定性、ホルモンとの結合、毒素との結合、ウイルスの感染、マイコプラズマの感染、細菌の感染、原虫の寄生、受精、発生分化、がん細胞転移、アポトーシスなど、生命現象の様々な場で重要な役割を果たしている。同じアミノ酸配列の、同一名称のタンパク質であっても、修飾されている糖鎖は多種多様であり、タンパク質を産生する細胞の状態によってその糖鎖構造は異なり、生体内での役割が異なるのである。

このような糖鎖の変化と疾病との関係性についても明らかになってきている。例えば、特許文献１には、前立腺疾患に罹患していることを示す前立腺特異抗原(以下ＰＳＡと称する)に関して次の様に記載されている。即ち、前立腺癌の患者に由来する血液試料中には、糖鎖に特定の糖残基、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンβ１−４Ｎアセチルグルコサミン（以下ＬａｃｄｉＮＡｃと称する）残基を有する前立腺特異抗原（以下ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡと称する）および／またはフコースα１−２ガラクトースβ１→４Ｎ−アセチルグルコサミン残基を有する前立腺特異抗原が、前立腺肥大症の患者に由来する血液試料中と比較して、多く含まれていることが記載されている。つまり、前立腺癌の発症によりＰＳＡの糖鎖が変化して前記特定の糖残基を有するＰＳＡが増加し、前立腺癌患者の血液試料中では前記特定の糖残基を有するＰＳＡは高い濃度であることが観察される。これに対して、前立腺肥大症が発症してもそのような糖鎖の変化は起きないため、前立腺肥大症患者では前記特定の糖残基を有するＰＳＡの濃度には、変化が観察されない。このことにより、当該特許文献１には、血液試料中の前記特定の糖残基を有するＰＳＡの濃度を測定することにより、前立腺癌の患者と前立腺肥大症の患者とを判別することができるという、糖鎖分画測定による前立腺癌の鑑別方法が開示されている。その他にも、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）糖鎖分画測定による肝癌の鑑別方法、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）糖鎖分画測定による腺癌の鑑別方法などが提案されている。

また、高分子量糖タンパク質であるムチンの一種であるムチン−１（以下ＭＵＣ１と称する）も腫瘍関連抗原として知られている。ＭＵＣ１は正常腺上皮細胞に広く発現しているが、細胞が悪性になったときに、たとえば乳癌、卵巣癌、肺癌、膵臓癌、膀胱癌において、劇的に発現が増加し、さらに乳癌等においてはグリコシル化のパターンが変化することも知られている。特許文献２および特許文献３にはそれぞれ、そのようなＭＵＣ１の定量に用いることのできるアプタマーリガンドおよび抗ＭＵＣ１抗体が記載されている。また、特許文献４には、前立腺癌および結腸直腸癌のバイオマーカーとしてＭＵＣ１等を用いることができることが記載されている。

糖鎖中に特定の糖残基が含まれている糖タンパク質を特異的に検出するためには、その糖残基を特異的に認識して結合する能力を持つレクチンと呼ばれるタンパク質が広く利用されている。それは、糖鎖をエピトープとする抗体、特に特定の糖残基をエピトープとする抗体が非常に作製しにくく、入手が困難であるためである。レクチンは安価で大量に入手が可能であり、またタンパク質の安定性にも優れており長期間保存も可能である。

例えば、ノダフジレクチン（Wisteria floribunda Agglutinin：以下ＷＦＡと称する）はＮ−アセチルガラクトサミンを主要な結合糖残基とすることが知られている。特許文献１には、このような特徴を持つＷＦＡを担体に結合させてカラムに充填し、アスパラギン結合型糖鎖の側鎖にＬａｃｄｉＮＡｃ残基を有するＰＳＡを分画した後、ＥＬＩＳＡ等により当該画分を定量する方法が記載されている。また、特許文献５には、固相化された抗ＰＳＡ抗体および蛍光標識されたＷＦＡを用いて、糖鎖の側鎖にＬａｃｄｉＮＡｃ残基を有するＰＳＡとサンドイッチ型の複合体を形成させ、ＳＰＦＳ（Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy：表面プラズモン励起増強蛍光分光法）によりこの特定の糖残基を有するＰＳＡを定量する方法が記載されている。

国際公開Ｗ０２０１０／０９０２６４号公報 特表２００９−５３５０５１号公報 国際公開ＷＯ２０１１／１３５８６９号公報 特表２０１３−５２６８５２号公報 特開２０１３−０７６６６６号公報

前立腺癌は、主に６０歳以上の男性に発病し、欧米諸国では男性の癌において肺癌に次ぐ死亡原因となっており、その早期発見が望まれている。前立腺癌の診断方法として、従来広く使用されているものは、血液検体等に含まれる全てのＰＳＡを定量し、トータルＰＳＡ値とし、その値を判断指標とする方法である。さらには、血液検体等に含まれるα１−アンチキモトリプシンと結合しない遊離型ＰＳＡをフリーＰＳＡとして定量し、ＰＳＡ総量に対する遊離型ＰＳＡの量の比率（フリーＰＳＡ／トータルＰＳＡ比）を判断指標とする方法である。

たとえば、（１）トータルＰＳＡ値が１０ｎｇ／ｍＬ以上であることをもって前立腺癌である可能性が高いと判定したり、（２）トータルＰＳＡ値が４〜１０ｎｇ／ｍＬ（グレーゾーン）で、かつフリーＰＳＡ／トータルＰＳＡ比が２５％以下であることをもって前立腺癌である可能性が高いと判定したりする手法が採用されている。前立腺癌である可能性が高いと判定された患者に対しては、確定診断のため、前立腺の生検が行われる。しかしながら、上記の診断方法においては、前立腺癌ではなく、前立腺肥大症等の良性疾患の患者についても前立腺癌である可能性が高いと判定される場合が比較的多い。そのような良性疾患の患者に対しても前立腺の生検がなされ、過度の負担を強いていることから、簡便かつ高精度で前立腺癌と良性疾患とを判別できる診断方法が求められていた。

これに対して、特許文献１および特許文献５には前述したように、Ｎ−アセチルガラクトサミン残基と親和性のあるレクチン、例えばＷＦＡなどと、ＰＳＡを含む可能性のある試料とを接触させ、前記レクチンと親和性のあるＰＳＡ、つまり糖鎖中にＮ−アセチルガラクトサミン残基を有するＰＳＡの量を定量し、その特定のＰＳＡの絶対量、すなわち血液試料中の濃度をもって、あるいはトータルＰＳＡまたはフリーＰＳＡの量に対する特定のＰＳＡの量の比率をもって、前立腺癌と前立腺肥大症とを判別する方法が記載されている。この方法は、トータルＰＳＡまたはフリーＰＳＡの量だけに基づいた場合には、前立腺癌と判定される可能性のある前立腺肥大症患者が、前立腺癌ではなく前立腺肥大症であると正しく診断されることにつながる。

このように、前立腺癌と前立腺良性疾患との判別精度が改善された診断方法は提案されてはいるが、さらにその判別精度を一層向上させることができる、新たな診断用情報を得ることが出来る分析方法が引き続き求められている。

本発明は、前立腺癌と前立腺良性疾患とを精度よく判別することのできる、新たな診断用情報を得ることが出来る分析方法を提供することを課題の一つとする。

本発明者らは、前立腺良性疾患患者に由来する血液試料中には、ＭＵＣ１が前立腺癌患者または健常人に由来する血液試料中に比べて多く含まれることを見出した。このことにより、血液試料中の抗ＭＵＣ１抗体、好ましくはその一種である抗ＫＬ−６モノクローナル抗体との反応性を有する全てのＭＵＣ１を定量し、その情報を利用して、前立腺良性疾患と前立腺癌とを精度よく判別して診断することが可能であることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は前立腺良性疾患患者が前立腺癌患者として誤って診断され、必要としない医療行為を受けることを避けることを可能とする。

本発明は一つの側面において、下記［１］〜［６］に係る診断用情報の分析方法を提供する。
［１］ 診断対象に由来する血液検体中の全てのムチン−１（トータルＭＵＣ１）の濃度を測定し、得られた測定値を閾値と比較し、トータルＭＵＣ１の濃度の測定値が閾値よりも大きいことをもって、診断対象が罹患している疾患は前立腺癌ではなく前立腺良性疾患であると推定する診断用情報の分析方法。
［２］ 診断対象に由来する血液検体中の全てのムチン−１（トータルＭＵＣ１）の濃度を測定し、得られた測定値を閾値と比較し、トータルＭＵＣ１の濃度が閾値よりも大きいことをもって、診断対象が罹患している疾患は前立腺癌ではなく前立腺良性疾患であると推定する診断用情報の分析方法と、診断対象が前立腺疾患に罹患していることを示す前立腺特異抗原に関する診断用情報とを組み合わせて、診断対象が前立腺良性疾患と前立腺癌のどちらに罹患しているかを推定する診断用情報の分析方法。
［３］ 診断対象に由来する血液検体中の全てのムチン−１（トータルＭＵＣ１）の濃度を測定し、得られた測定値を閾値と比較し、トータルＭＵＣ１の濃度の測定値が閾値よりも大きいことをもって、診断対象が罹患している疾患は前立腺癌ではなく前立腺良性疾患であると推定する診断用情報の分析方法と、診断対象に由来する血液検体中の、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンβ１−４Ｎアセチルグルコサミン残基を認識して結合するレクチンとの反応性を有する前立腺特異抗原（ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡ）の濃度を測定し、得られた測定値を閾値と比較し、ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの濃度の測定値が閾値よりも大きいことをもって、診断対象が罹患している疾患は前立腺良性疾患ではなく前立腺癌であると推定する診断用情報の分析方法とを組み合わせて、診断対象が前立腺良性疾患と前立腺癌のどちらに罹患しているかを推定する診断用情報の取得方法。
［４］ ［３］の診断用情報の分析方法において、診断対象が前立腺癌に罹患していると推定される場合に、さらに、トータルＭＵＣ１の濃度の測定値が［３］に記載の閾値より大きなもう一つの閾値よりも大きく、かつＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの濃度の測定値が［３］に記載の閾値より大きなもう一つの閾値よりも大きいことをもって、診断対象が罹患している前立腺癌が、転移性の高い前立腺癌、前立腺良性疾患を伴う前立腺癌またはホルモン抵抗性の前立腺癌であると推定する診断用情報の分析方法。
［５］ 前記前立腺良性疾患が前立腺肥大症である、［１］〜［４］のいずれか一項に記載の診断用情報の分析方法。
［６］ 前記トータルＭＵＣ１が、抗ＫＬ−６モノクローナル抗体との反応性を有するものである、［１］〜［５］のいずれか一項に記載の診断用情報の分析方法。

本発明はもう一つの側面において、下記［７］〜［１０］に係る診断用キットを提供する。
［７］ ［１］に記載の診断用情報の分析方法を実施するためのキットであって、トータルＭＵＣ１を定量するための抗ムチン−１抗体を含む診断用キット。
［８］ ［２］に記載の診断用情報の分析方法を実施するためのキットであって、トータルＭＵＣ１を定量するための抗ムチン−１抗体と、抗前立腺特異抗原を定量するための抗前立腺特異抗原抗体とを含む診断用キット。
［９］ ［３］または［４］に記載の診断用情報の分析方法を実施するためのキットであって、トータルＭＵＣ１を定量するための抗ムチン−１抗体と、抗前立腺特異抗原を定量するための抗前立腺特異抗原抗体およびＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンβ１−４Ｎアセチルグルコサミン残基を認識して結合するレクチンを含む診断用キット。
［１０］ 前記抗ムチン−１抗体が抗ＫＬ−６モノクローナル抗体である、［７］〜［９］のいずれか一項に記載の診断用キット。
［１１］ さらに、診断用情報の分析方法を実施するために必要な情報を記載した使用説明書を含む、［７］〜［１０］のいずれか一項に記載の診断用キット。

本発明の分析方法によって得られる診断用情報は、単独で用いても前立腺良性疾患を高精度で判定することを可能とするが、前立腺良性疾患患者を前立腺癌患者と誤って推定してしまう従来の前立腺癌に関する診断用情報とを組み合わせることによって、従来診断法の誤診断の可能性を著しく低減することを可能とする。

図１は、実施例の定量工程（１）：トータルＭＵＣ１（ＫＬ６）の定量の結果を示す散布図である。ＰＣは前立腺癌患者のサンプル、ＢＰＨは前立腺肥大症患者のサンプルを表す。 図２は、実施例の定量工程（１）：トータルＭＵＣ１（ＫＬ６）の定量の結果（横軸）および定量工程（２）：トータルＰＳＡの定量の結果（縦軸）を複合的に示す散布図である。ＰＣは前立腺癌患者のサンプル、ＢＰＨは前立腺肥大症患者のサンプルを表す。 図３は、実施例の定量工程（１）：トータルＭＵＣ１（ＫＬ６）の定量の結果（横軸）および定量工程（３）：ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの定量の結果（縦軸）を複合的に示す散布図である。ＰＣは前立腺癌患者のサンプル、ＢＰＨは前立腺肥大症患者のサンプルを表し、点線の丸印で囲まれたサンプルは、前立腺癌が他の部位に転移している患者に由来するものである。

本明細書において、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンβ１−４ＮアセチルグルコサミンはＬａｃｄｉＮＡｃ、ムチン−１はＭＵＣ１、ノダフジレクチンはＷＦＡと略記する。

また、本発明において用いる、ＷＦＡに代表されるＬａｃｄｉＮＡｃ残基を認識するレクチンとの反応性を有するＰＳＡをＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡと称し、ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡとそれ以外のＰＳＡを包含するＰＳＡ全体をトータルＰＳＡと称する。

−分析方法−
本発明の診断用情報の分析方法の第１実施形態は、診断対象に由来する血液検体中の全てのＭＵＣ１、すなわちトータルＭＵＣ１の濃度を測定し、得られた測定値を閾値と比較し、トータルＭＵＣ１の濃度の測定値が閾値よりも大きいことをもって、診断対象が罹患している疾患は前立腺癌ではなく前立腺良性疾患であると推定する診断用情報の分析方法である。

上述した本発明による分析方法の第１実施形態によって取得された血液検体中のトータルＭＵＣ１の濃度に基づく診断用情報は、前立腺良性疾患と前立腺癌とを明確に識別することが出来ない先行技術の前立腺癌に関する診断用情報と組み合わせて、前記診断対象が前立腺良性疾患と前立腺癌のどちらに罹患しているかをより明確に判別するために利用することができる。

先行技術はいずれも、前立腺良性疾患を前立腺癌と誤って推定する可能性があり、先行技術の前立腺癌に関する診断用情報は特に限定されるものではなく、公知のいずれかの診断用情報の分析方法によって取得することができる。たとえば、従来一般的であった、血液検体中の全てのＰＳＡの濃度に基づく診断用情報や、国際公開ＷＯ２０１０／０９０２６４号公報（特許文献１）および特開２０１３−７６６６６号公報（特許文献５）に記載されている、血液検体中の特定の糖残基を有するＰＳＡの濃度に基づく診断用情報を利用することができる。

したがって、本発明の診断用情報の分析方法の第２実施形態は、たとえば、第１実施形態で得られた診断用情報の分析方法と、診断対象に由来する血液検体中の全てのＰＳＡの濃度、すなわちトータルＰＳＡの濃度を測定し、得られた測定値を閾値と比較し、トータルＰＳＡの濃度の測定値が閾値よりも大きいことをもって、診断対象が罹患している疾患は前立腺良性疾患ではなく前立腺癌であると推定する診断用情報の分析方法とを組み合わせて、診断対象が前立腺良性疾患と前立腺癌のどちらに罹患しているかを推定する診断用情報の分析方法とすることができる。

上記第２実施形態では、第１実施形態で得られた診断用情報の分析方法と組み合わせて用いる診断用情報の分析方法としてトータルＰＳＡを用いる方法を例示したが、ＰＳＡ総量に対する遊離型ＰＳＡの量の比率（フリーＰＳＡ／トータルＰＳＡ比）を用いる診断用情報の分析方法およびその他の既知の診断用情報の分析方法を用いることが出来ることは上述の通りである。

本発明の診断用情報の分析方法の第３実施形態は、第１実施形態で得られた診断用情報の分析方法と、診断対象に由来する血液検体中の、ＬａｃｄｉＮＡｃ残基を認識して結合するレクチンとの反応性を有するＰＳＡ、すなわちＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの濃度を測定し、得られた測定値を閾値と比較し、ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの濃度の測定値が閾値よりも大きいことをもって、診断対象が罹患している疾患は前立腺良性疾患ではなく前立腺癌であると推定する診断用情報の分析方法とを組み合わせて、診断対象が前立腺良性疾患と前立腺癌のどちらに罹患しているかを推定する診断用情報の分析方法である。

さらに、本発明の診断用情報の分析方法の第４実施形態は、第３実施形態の診断用情報の分析方法において、診断対象が前立腺癌に罹患していると推定される場合に、さらに、トータルＭＵＣ１の濃度の測定値が第３実施形態に記載の閾値（トータルＭＵＣ１に関する第１の閾値）より大きなもう一つの閾値（トータルＭＵＣ１に関する第２の閾値）よりも大きく、かつＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの濃度の測定値が第３実施形態に記載の閾値（ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡに関する第１の閾値）より大きなもう一つの閾値（ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡに関する第２の閾値）よりも大きいことをもって、診断対象が罹患している前立腺癌が、転移性の高い前立腺癌、前立腺良性疾患を伴う前立腺癌またはホルモン抵抗性の前立腺癌であると推定する診断用情報の分析方法である。

ここで、本発明における「トータルＭＵＣ１」は、「抗ＫＬ−６モノクローナル抗体」との反応性を有するものが好ましい。つまり、トータルＭＵＣ１の濃度を測定する際には、通常は固相化用または標識用の抗体として抗ＭＵＣ１抗体を用いるが、その抗ＭＵＣ１抗体として抗ＫＬ−６モノクローナル抗体を用いることが好ましい。

ＭＵＣ１にはいくつかのバリアントがあるが、抗ＭＵＣ１抗体の中には、全ての、または多数のバリアントに共通する部位をエピトープとして認識して結合するモノクローナル抗体も含まれているし、例えば、シアル化糖鎖抗原ＫＬ−６（アミノ酸配列ＰＤＴＲＰＡＰ及びそのスレオニン（Ｔ）に結合しているシアル化糖鎖であるＮｅｕ５Ａｃα２，３Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃα糖鎖からなる抗原）をエピトープとして認識する抗ＫＬ−６モノクローナル抗体や、抗ＣＡ１５−３モノクローナル抗体のように、一部のバリアントに結合するモノクローナル抗体も含まれる。本発明では、様々な抗ＭＵＣ１抗体を用いて診断用情報を分析できる可能性があるが、一つの実施形態として、抗ＫＬ−６モノクローナル抗体を用いると、信頼性の高い分析を行うことができる。以下の明細書の記載においても、好ましい実施形態として、抗ＭＵＣ１抗体は抗ＫＬ−６モノクローナル抗体に読み替えることができる。

具体的には、前述した第１〜第４実施形態において、ＳＰＦＳ、ＥＬＩＳＡ等のサンドイッチ型アッセイの形態で「トータルＭＵＣ１」の濃度を測定する際に、「抗ＭＵＣ１抗体」として「抗ＫＬ−６モノクローナル抗体」を用いた場合、それによって濃度を測定される「トータルＭＵＣ１」は、抗ＫＬ−６モノクローナル抗体との反応性を有する全てのＭＵＣ１（トータルＭＵＣ１（ＫＬ６）と称する）、ということになる。

以下、第１〜第４の各実施形態に関係する事項について順次説明する。

・血液検体
本発明の分析方法では、特定の糖タンパク質の濃度を測定するための試料として、診断対象に由来する血液検体を用いる。

診断対象は、典型的にはヒトであるが、ヒトの疾患のモデル動物（マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ネコ、イヌ、ブタ、サルなど）のようなヒト以外の哺乳動物であってもよい。

好ましいヒトの診断対象者の例として、他の診断方法により前立腺癌に罹患していることを強く示唆されるが、罹患疾患が前立腺良性疾患である可能性も排除できないため、診断精度を高め、前立腺癌に罹患しているか否かを明確にする必要のある患者が挙げられる。

前立腺良性疾患は、典型的には前立腺肥大症（良性前立腺過形成：ＢＰＨ）であるが、前立腺炎など、前立腺に関係するその他の良性疾患も包含される。

血液検体は、全血であってもよいし、全血から調製された血清または血漿であってもよい。また、血液検体は、血液の採取時に添加される抗凝固剤や、採取後に必要に応じて添加される希釈液、試薬等を含んでいてもよい。血液検体は、公知の手法に従って採取、調製すればよい。

・レクチン
本発明の分析方法の第３実施形態および第４実施形態では、ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡを定量するためにＬａｃｄｉＮＡｃ残基を認識して結合するレクチンを用いる。そのようなレクチンの代表例としてはＷＦＡが挙げられるが、本発明で用いることのできるレクチンはこれに限定されるものではない。すなわち、ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの糖鎖中に含まれるＬａｃｄｉＮＡｃ残基を認識して結合する能力を有し、血液検体中のＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの濃度を測定するために利用することのできるレクチンであれば、ＷＦＡと同様に本発明で用いることができる。

さらに、本発明の分析方法の第３実施形態に用いるレクチンとしては、β−ＧａｌＮＡｃ残基およびフコースα（１，２）ガラクトース残基の両方を認識して結合する、キカラスウリレクチン−ＩＩ（ＴＪＡ−ＩＩ）も挙げられる。

ＷＦＡは、Ｔｎ残基およびＬａｃｄｉＮＡｃ残基以外にも、ガラクトースを認識し、結合するが、その結合力は極めて弱く、ＷＦＡと比べ結合定数が数オーダー低いため、本発明を実施する上で障害とはならない。

ＷＦＡ以外のレクチンは、そのレクチンが糖残基のうちＴｎ残基およびＬａｃｄｉＮＡｃ残基のみを認識して結合する能力を有することが好ましいが、Ｔｎ残基およびＬａｃｄｉＮＡｃ残基以外の糖残基を認識して結合する能力が本発明を実施する上で実質的な障害とならない十分に弱い範囲のものであれば本発明に用いることが出来る。

・定量方法
本発明の分析方法を実施する際には、トータルＭＵＣ１、ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡおよびトータルＰＳＡの３項目の測定対象物から、実施形態に応じて必要な、選ばれた項目または全３項目の対象物を測定、定量する必要がある。これらの測定対象物の定量方法は、各実施形態における分析を実施するために十分な精度を有する測定値が得られるものであれば特に限定されるものではなく、公知の定量方法の中から適宜選択することができる。

測定対象物の好適な定量方法として、高感度・高精度で測定対象物を定量することのできるＳＰＦＳ（Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy：表面プラズモン励起増強蛍光分光法）が挙げられる。ＳＰＦＳは、誘電体部材上に形成された金属薄膜に全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる角度で励起光を照射したときに、金属薄膜を透過したエバネッセント波が表面プラズモンとの共鳴により数十倍〜数百倍に増強されることを利用して、金属薄膜近傍に捕捉された測定対象物を標識した蛍光物質を効率的に励起させる方法である。その蛍光物質から発せられる蛍光の強度を測定し、濃度が既知の標準試料を用いて測定したときの蛍光の強度と対比することにより、血液検体中の測定対象物の濃度を決定することができる。このようなＳＰＦＳは、一般的な蛍光標識法などに比べて極めて感度が高いため、検体中の測定対象物の濃度が極めて低い場合であっても、その濃度を測定することが可能である。

なお、トータルＭＵＣ１濃度、ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡ濃度およびトータルＰＳＡ濃度の３項目のうち、実施形態に応じて必要とされる複数の測定項目について、単独項目または最終分析の必要を満たさない複数項目のみを定量することを繰り返して最終分析に必要なデータを得てもよいが、実施形態に応じて必要とされる複数の測定項目を一度にまとめて定量することが、測定工程の効率化や測定結果の信頼性などの面から好適である。

たとえば、一つのＳＰＦＳ用測定部材（以下センサーチップと称する）上に、各測定項目に対応した複数の測定領域を形成することにより、複数の測定項目の定量を並行して行うことができる。このような実施形態は、複数のセンサーチップを用いて各測定対象物を定量する実施形態に比べて、必要な部材、試薬、工程数を削減し、定量に要するコストおよび時間を節約することができるとともに、同一のセンサーチップを用いることで、センサーチップの差異に基づく測定値のばらつきを抑えることができるなどの点で好ましい。

また、本発明では、トータルＭＵＣ１、ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡおよびトータルＰＳＡの血液検体中の濃度に基づいて診断用情報の分析を行うが、ＳＰＦＳ等の定量方法によって、所定の測定プロトコールに従って得られた「測定値」を、ｎｇ／ｍＬ等の所定の単位で表される「濃度」に換算しないまま、分析に用いることも可能である。たとえば、ＳＰＦＳでは通常、蛍光強度の測定値を任意単位（arbitrary unit: a.u.）で表すが、測定対象物の血液検体中の濃度を反映しているその測定値を用いて、閾値を設定し、診断用情報の分析を行ってもよい。

・ＳＰＦＳに基づく実施形態
ＳＰＦＳを実施するための基本的な構成、すなわち、センサーチップ、測定装置およびシステム、測定手順等の実施形態は公知であり、これらを応用して本発明を適切に実施することができる。ＳＰＦＳでは、固相化用プローブ（抗体）−測定対象物−蛍光標識用プローブ（レクチンまたは抗体）の三者からなる複合体を形成させる、サンドイッチ型アッセイの形態で測定対象物を定量することが一般的である。

ここで、トータルＭＵＣ１、ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡおよびトータルＰＳＡのうち、特定の糖残基を有する糖タンパク質であるＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡを定量する場合、代表的には２つの定量方法がある。

第１の定量方法は、特定の糖残基を認識して結合するレクチンを用いた糖タンパク質の分画は行わず、血液検体（糖タンパク質）全体をＳＰＦＳに供し、固相化用プローブ（抗体）に捕捉された糖タンパク質のうち特定の糖残基を有するものを、その特定の糖残基に結合する蛍光標識用プローブ（レクチン）を用いて蛍光標識することによって定量する方法である。固相化用プローブには、特定の糖残基を有さない糖タンパク質も結合するが、それには特定の糖残基を認識する蛍光標識用プローブ（レクチン）は結合しないので、定量の対象とはならない。たとえば、特開２０１３−７６６６６号公報（特許文献５）には、この第１の定量方法と同様の、ＳＰＦＳおよび特定のレクチン（ＷＦＡ等）を利用して特定の糖タンパク質（ＰＳＡ）を定量する方法などが開示されており、これを参考にすることができる。

第２の定量方法は、特定の糖残基を認識して結合するレクチンを用いてあらかじめ特定の糖鎖を有する糖タンパク質を分画して、その画分のみをＳＰＦＳに供し、固相化用プローブ（抗体）に捕捉された特定の糖残基を有する糖タンパク質を、それに結合する蛍光標識用プローブ（抗体）を用いて蛍光標識することによって定量する方法である。どちらの方法であっても、特定の糖残基を認識するレクチンと抗ＰＳＡ抗体との反応性を有する、ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡを定量することができる。たとえば、国際公開ＷＯ２０１０／０９０２６４号公報（特許文献１）には、特定のレクチン（ＷＦＡ等）が結合した担体を充填したカラム（レクチンアフィニティーカラム）を利用して特定の糖タンパク質（ＰＳＡ）を含む画分を精製し、それをＥＬＩＳＡによって定量する方法などが開示されており、これを参考にすることができる。

レクチンアフィニティーカラムを用いた分画法の概要は次の通りである。まず、常法に従って、カラム用の担体と、測定対象物に応じた特定の糖残基を認識して結合するレクチンとを反応させて、レクチンアフィニティーカラムを作製する。次に、常法に従って、前記レクチンアフィニティーカラムに血液検体をアプライし、血液検体中の特定の糖残基を有する測定対象物を前記レクチンに結合させる。レクチンに結合しない物質を含有する画分（非結合画分）を、洗浄用緩衝液をカラムに添加したときの流出液として回収する。その後、レクチンに結合している測定対象物を含有する画分（結合画分）を、溶出用緩衝液をカラムに添加したときの溶出液として回収する。溶出用緩衝液は、前記レクチンに結合している測定対象物を解離させることのできるハプテン糖を溶解したものである。ハプテン糖は、前記レクチンに応じて選択すればよく、たとえば前記レクチンとしてＷＦＡを用いた場合は、そのハプテン糖としてＧａｌＮＡｃを用いることができる。

（１）トータルＭＵＣ１の定量
トータルＭＵＣ１の定量方法としては、センサーチップの表面に固相化された抗ＭＵＣ１抗体（固相化抗ＭＵＣ１抗体）、ＭＵＣ１、および蛍光物質が結合した抗ＭＵＣ１抗体（蛍光標識抗ＭＵＣ１抗体）の三者からなるサンドイッチ型免疫複合体を形成させる方法が挙げられる。

抗ＭＵＣ１抗体は、公知の手法により作製することも可能であり、市販されているものを購入することも可能である。測定の安定性からポリクローナル抗体よりもモノクローナル抗体を用いることが好ましい。市販されている抗ＭＵＣ１モノクローナル抗体としては、例えば、ＶＵ−３Ｄ１、ＶＵ−１２Ｅ１、ＶＵ−１１Ｅ２、ＶＵ−１２Ｅ１、ＶＵ−３Ｃ６、ＶＵ−１３Ｆ１１、ＶＵ−５Ｆ１２、ＶＵ−４Ｃ２、ＶＵ−２Ｇ７、ＶＵ−４Ｈ５、ＶＵ−１１Ｄ１、Ｍ４０２１２０９、Ｍ３Ａ１０６、Ｍ９Ｅ７、Ｍａ５５２、ＶＵ−３Ｃ６、ＳＭ３、ＤＦ３、Ｎｏ．１、Ｎｏ．３、Ｍ２Ｃ５、３Ｈ２７４０、１７５Ｃ５、１２６Ｅ７、Ｃ５９５、１３９Ｈ２、９Ａ１０２、８Ｌ８２０、Ｍ２Ｆ１、Ｍ４Ｈ２、１Ｂ７、Ｍ１０Ｇ４、ＥＰＲ１０２３、ＥＰ１０２４Ｙ、Ｘ３２５、１１５Ｄ８、ＯＣ１２５、Ｘ７５、が挙げられる。これらの抗ＭＵＣ１モノクローナル抗体はいずれも抗ＫＬ−６モノクローナル抗体に該当する。

蛍光標識抗ＭＵＣ１抗体は、抗ＭＵＣ１抗体に、公知の手法を用いて目的とする蛍光物質を結合させて作製することができるが、その際には市販の蛍光物質ラベリングキットなどを用いることもできる。蛍光物質は特に限定されるものではなく、ＳＰＦＳによって適切な蛍光を発することのできる公知の蛍光色素などを用いることができる。

トータルＭＵＣ１の定量における、固相化抗ＭＵＣ１抗体の抗ＭＵＣ１抗体の種類と、蛍光標識抗ＭＵＣ１抗体の抗ＭＵＣ１抗体の種類は、同一であっても異なってもよい。ＭＵＣ１は非常に大きな分子で共通した繰り返し構造が存在するため、同じ種類の抗ＭＵＣ１抗体でも固相化および蛍光標識化ができる。

（２）ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの定量
ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの定量における第１の方法としては、ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡを分画していない血液検体（ＰＳＡ）全体をＳＰＦＳに供し、センサーチップの表面に固相化された抗ＰＳＡ抗体（固相化抗ＰＳＡ抗体）、ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡ、および蛍光体が結合したＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡ用レクチン（蛍光標識ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡ用レクチン）の三者からなるサンドイッチ型免疫複合体を形成させる方法が挙げられる。

抗ＰＳＡ抗体は、公知の一般的な手法により作製することも可能であり、市販されているものを購入することも可能である。測定の安定性からポリクローナル抗体よりもモノクローナル抗体を用いることが好ましい。市販されている抗ＰＳＡモノクローナル抗体としては、例えば、ＰＳ２、ＰＳ３、ＰＳ４、ＰＳ５、ＰＳ６、ＰＳ１５、２Ｈ９、３Ｂ４、５Ａ６、５Ｇ６、８Ｇ４、９Ａ８、９Ｇ２、ＰＳ１、８Ａ６、２Ｈ９、１Ｈ１２、Ｎｏ．７９が挙げられる。また、糖鎖中の特定の糖残基を蛍光標識ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡ用レクチンが認識して結合することを妨げないよう、ＰＳＡの糖鎖ではなくタンパク質の部分をエピトープとする抗体を用いることが好ましい。

蛍光標識ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡ用レクチンは、ＷＦＡに代表されるＬａｃｄｉＮＡｃ残基を認識するレクチンに、公知の一般的な手法を用いて目的とする蛍光物質を結合させることにより作製することができ、その際には市販されている蛍光物質ラベリングキットなどを用いることもできる。蛍光物質は特に限定されるものではなく、ＳＰＦＳによって適切な蛍光を発することのできる公知の蛍光色素などを用いることができる。

しかしながら、本発明の実施形態によっては、前立腺癌に関する診断用情報を取得するために、ＬａｃｄｉＮＡｃ残基を有するＰＳＡだけではなく、ＬａｃｄｉＮＡｃ残基を有するＰＳＡとフコースα（１，２）ガラクトース残基を有するＰＳＡの両方を、定量の対象とすることも可能である（特許文献１および特許文献５参照）。その場合は、蛍光標識ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡ用レクチンを、ＬａｃｄｉＮＡｃ残基とフコースα（１，２）ガラクトース残基の両方を認識するレクチン、たとえばキカラスウリレクチン−ＩＩ（ＴＪＡ−ＩＩ）を用いて作製したりすることも可能である。

ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの定量における第２の方法として、あらかじめＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡ１用レクチンを用いて血液検体からＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡ画分を調製し、そのＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡ画分をＳＰＦＳに供し、固相化抗ＰＳＡ抗体、ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡ、および蛍光物質が結合した抗ＰＳＡ抗体（蛍光標識抗ＰＳＡ抗体）の三者からなるサンドイッチ型免疫複合体を形成させる方法が挙げられる。

ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの第２の定量方法に用いる固相化抗ＰＳＡ抗体は、上述したＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの第１の定量方法に用いる固相化抗ＰＳＡ抗体と同じ種類のものとすることができる。

蛍光標識抗ＰＳＡ抗体は、抗ＰＳＡ抗体に公知の手法を用いて目的とする蛍光物質を結合させて作製することができるが、その際には市販の蛍光物質ラベリングキットなどを用いることもできる。蛍光物質は特に限定されるものではなく、ＳＰＦＳによって適切な蛍光を発することのできる公知の蛍光色素などを用いることができる。

（３）トータルＰＳＡの定量
トータルＰＳＡの定量方法としては、センサーチップの表面に固相化された抗ＰＳＡ抗体（固相化抗ＰＳＡ抗体）、ＰＳＡ、および蛍光体が結合した抗ＰＳＡ抗体（蛍光標識抗ＰＳＡ抗体）の三者からなるサンドイッチ型免疫複合体を形成させる方法が挙げられる。

トータルＰＳＡの定量に用いる固相化抗ＰＳＡ抗体は、ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの定量に用いる固相化抗ＰＳＡ抗体と同じ種類のものとすることができる。また、トータルＰＳＡの定量に用いる蛍光標識抗ＰＳＡ抗体（蛍光物質および／または抗ＰＳＡ抗体）の種類は、ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの定量の第２の方法に用いる蛍光標識抗ＰＳＡ抗体（蛍光物質および／または抗ＭＵＣ１抗体）の種類と同じものとすることができる。

・その他の定量方法に基づく実施形態
ＳＰＦＳ以外の測定対象物の定量方法としては、たとえば、生体関連物質の定量方法として汎用されているＥＬＩＳＡが挙げられる。ＥＬＩＳＡでは、固相化用プローブ（抗体）−測定対象物−酵素標識用プローブ（抗体またはレクチン）の三者からなる複合体を形成させる、サンドイッチ型アッセイの形態で測定対象物を定量することが一般的であり、酵素標識用プローブの酵素と所定の基質との反応により生成する色素量（シグナル強度）に基づいて測定対象物を定量する。

ＥＬＩＳＡを用いてＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡを定量する場合には、上述したＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの第２の定量方法と同様、特定の糖残基を認識して結合するレクチンを利用して、たとえばＷＦＡを担持させたレクチンアフィニティーカラムを利用して、ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡを含む画分を、血液検体中の全てのＰＳＡの中からあらかじめ分離しておく必要がある。

ＥＬＩＳＡおよび分画法を実施するための基本的な手法は公知であり、これらを応用して本発明を適切に実施することができる。たとえば、ＥＬＩＳＡおよび特定のレクチンを担持させたレクチンアフィニティーカラムを利用して特定の糖タンパク質であるＰＳＡを定量する方法などが記載されている、国際公開ＷＯ２０１０／０９０２６４号公報（特許文献１）を参照することができる。

・閾値
第１実施形態およびこれを利用する第２，第３および第４実施形態で用いられる、測定した血液検体中のトータルＭＵＣ１の濃度値を、ある疾患であるか否かを判別するための閾値（トータルＭＵＣ１に関する第１の閾値）のは、一般的な手法によって設定することができる。たとえば、前立腺癌と確定診断された複数の患者に由来する血液検体、および前立腺肥大症等の前立腺良性疾患と確定診断された複数の患者に由来する血液検体について、トータルＭＵＣ１の濃度を測定し、後者の測定データが基準とする比率以上で含まれる濃度を求めることにより、この濃度を前立腺良性疾患と推定するための閾値とすることができる。前記測定データの基準とする比率が、前立腺良性疾患の推定に関する信頼性、即ち、推定が正しい確率に相当する。測定データの母集団であるサンプル数を多くするほど、信頼性の高い閾値を設定することが可能となる。ある血液検体のトータルＭＵＣ１の濃度の測定値をそのようにして設定された閾値と比較し、トータルＭＵＣ１の濃度の測定値が閾値よりも大きければ、この血液検体は前立腺良性疾患に罹患している診断対象に由来するものであると、ある確率でもって推定することができる。前記測定データから、前立腺良性疾患に罹患している診断対象由来の血液検体について分析した場合に１００％陽性と判定し、前立腺癌に罹患している診断対象由来の血液検体について分析した場合に１００％陰性と判定できる閾値を設定できれば理想的であるが、現実的にそのようなことは困難である。目的とする分析の精度を考慮して、前立腺良性疾患に罹患している診断対象由来の血液検体について分析した場合に望ましい高い確率で陽性と判定できる閾値、逆に言えば前立腺癌に罹患している診断対象由来の血液検体について分析した場合に擬陽性と判定されてしまう確率をなるべく低くできる閾値を設定すればよい。

第２実施形態で用いられる、血液検体中のトータルＰＳＡの濃度の測定値と比較するための閾値、第３実施形態で用いられる、血液検体中のＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの濃度の測定値と比較するための閾値（ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡに関する第１の閾値）についても、上記と同様の手法によって設定することができる。

さらに、第４実施形態で用いられる、転移性の高い前立腺癌、前立腺良性疾患を伴う前立腺癌またはホルモン抵抗性の前立腺癌を検出するための、血液検体中のＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの濃度、トータルＭＵＣ１の濃度それぞれと比較するための閾値（それぞれ、トータルＭＵＣ１およびＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡに関する第２の閾値）も、上記と同様の手法によって設定することができる。これらの第４実施形態で用いられる閾値は、第３実施形態で用いられる閾値とは異なる値であり、通常、ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡ、トータルＭＵＣ１どちらについても第３実施形態より高くなる。第３実施形態における分析および第４実施形態における分析は、どちらも血液検体中のＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの濃度およびトータルＭＵＣ１の濃度を所定の閾値と比較する点で共通しているため、同時に行うことが可能である。

−キット−
本発明の診断用情報の分析方法を効率的に実施するために、必要な試薬類をまとめてキットを構成することができる。診断用情報の分析方法は、典型的にはＳＰＦＳやＥＬＩＳＡのようなサンドイッチ型アッセイに基づく定量方法を用いて、また必要に応じてレクチンアフィニティーカラムによる分画法を併用して実施する。したがってキットも、典型的にはそれらの方法に適したサンドイッチ型免疫複合体を形成するための試薬類、すなわち、固相化用生体関連物質である抗体および検出用生体関連物質であるレクチンまたは抗体を主要な構成物とし、また必要に応じてレクチンアフィニティーカラムを作製するためのレクチンも構成物とすることができる。

診断用情報の分析方法の第１実施形態を実施するためのキット（キットの第１実施形態）は、少なくとも、トータルＭＵＣ１を定量するための試薬として、抗ＭＵＣ１抗体を含むものとして構成することができる。この抗ＭＵＣ１抗体は、ＳＰＦＳ用のセンサーチップやＥＬＩＳＡ用の基板の表面に結合させる固相化用、および定量方法がＳＰＦＳであれば蛍光物質と結合させて蛍光標識抗ＭＵＣ１抗体を作製するため、定量方法がＥＬＩＳＡであれば所定の基質と反応する酵素と結合させて酵素標識抗ＭＵＣ１抗体を作製する検出用として用いられる。したがって、この場合の抗ＭＵＣ１抗体は固相化用の抗ＭＵＣ１抗体と検出用の抗ＭＵＣ１抗体を含むが、それらは同じ種類であってもよい。

診断用情報の分析方法の第２実施形態を実施するためのキット（キットの第２実施形態）は、少なくとも以下の試薬を含むものとして構成することができる：トータルＭＵＣ１を定量するための試薬として、抗ＭＵＣ１抗体；ＰＳＡを定量するための試薬として、抗ＰＳＡ抗体。

トータルＭＵＣ１を定量するための試薬については、前述したキットの第１実施形態についてと同様である。

ＰＳＡを定量するための試薬としての抗ＰＳＡ抗体は、たとえばトータルＰＳＡを定量する場合は、ＳＰＦＳ用のセンサーチップやＥＬＩＳＡ用の基板の表面に結合させる固相化用、および定量方法がＳＰＦＳであれば蛍光物質と結合させて蛍光標識抗ＰＳＡ抗体を作製するため、定量方法がＥＬＩＳＡであれば所定の基質と反応する酵素と結合させて酵素標識抗ＰＳＡ抗体を作製する検出用として用いられる。したがって、この場合の抗ＰＳＡ抗体は固相化用の抗ＰＳＡ抗体と検出用の抗ＰＳＡ抗体を含む。

診断用情報の分析方法の第３実施形態を実施するためのキット（キットの第４実施形態）は、少なくとも以下の試薬を含むものとして構成することができる：トータルＭＵＣ１を定量するための試薬として、抗ＭＵＣ１抗体；ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡを定量するための試薬として、抗ＰＳＡ抗体およびＬａｃｄｉＮＡｃ残基を認識して結合するレクチン。

トータルＭＵＣ１を定量するための試薬については、前述したキットの第１実施形態についてと同様である。

ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡを前述した第１の方法に従って定量する場合、キットに含まれる抗ＰＳＡ抗体は、ＳＰＦＳ用のセンサーチップやＥＬＩＳＡ用の基板の表面に結合させる固相化用として用いられる。一方、ＬａｃｄｉＮＡｃ残基を認識して結合するレクチンは、定量方法がＳＰＦＳであれば蛍光物質と結合させて蛍光標識ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡ用レクチンを作製するために用いられ、定量方法がＥＬＩＳＡであれば所定の基質と反応する酵素と結合させて酵素標識ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡ用レクチンを作製する検出用として用いられる。

ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡを前述した第２の方法に従って定量する場合、キットに含まれる抗ＰＳＡ抗体は、ＳＰＦＳ用のセンサーチップやＥＬＩＳＡ用の基板の表面に結合させる固相化用、および定量方法がＳＰＦＳであれば蛍光物質と結合させて蛍光標識抗ＰＳＡ抗体を作製するため、定量方法がＥＬＩＳＡであれば所定の基質と反応する酵素と結合させて酵素標識抗ＰＳＡ抗体を作製する検出用として用いられる。したがって、この場合の抗ＰＳＡ抗体は固相化用の抗ＰＳＡ抗体と検出用の抗ＰＳＡ抗体を含む。一方、ＬａｃｄｉＮＡｃ残基を認識して結合するレクチンは、ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡ画分を調製するためのレクチンアフィニティーカラムを作製するために用いられる。

キットの第１〜第４実施形態に含まれる抗ＭＵＣ１抗体としては抗ＫＬ−６モノクローナル抗体が好ましく、特に固相化用の抗ＭＵＣ１抗体と検出用の抗ＭＵＣ１抗体の両方が含まれる実施形態においては、その両方が抗ＫＬ−６モノクローナル抗体であることが好ましい。

各実施形態の診断用情報の分析方法を実施するためのキットは、必要に応じて、上記の試薬以外の試薬、器具、使用説明書等を含んでいてもよい。そのような試薬および器具としては、たとえば、所定の抗体をＳＰＦＳ用のセンサーチップやＥＬＩＳＡ用の基板の表面に固相化するための試薬、所定のレクチンまたは抗体に蛍光物質と結合させるための試薬、ＳＰＦＳ用のセンサーチップやＥＬＩＳＡ用の基板の表面の非特異的吸着を抑制するためのブロッキング液、ＳＰＦＳの各工程で血液検体や試薬を送液した後に送液するための洗浄液、レクチンアフィニティーカラムの担体に所定のレクチンを結合させるための試薬、レクチンアフィニティーカラム用の洗浄用もしくは溶出用緩衝液を調製するための試薬、血液検体用の処理液、これらの試薬を反応させるための器具、さらにＳＰＦＳ用のセンサーチップやＥＬＩＳＡ用の基板、レクチンアフィニティーカラムの担体などが挙げられる。また、使用説明書には、本発明の各実施形態の診断用情報の分析方法を実施するために必要な情報、例えば、上記の試薬および器具の使用方法（プロトコール）や、診断用情報の分析に関する閾値などを記載しておくことができる。

［作製・調製工程］
（１）プラズモン励起センサーの作製
厚さ１ｍｍのガラス製の透明平面基板（(株)オハラ「Ｓ−ＬＡＬ １０」、屈折率１．７２）をプラズマ洗浄した後、この基板の片面にクロム薄膜をスパッタリング法によって形成し、このクロム薄膜の表面にさらに金薄膜をスパッタリング法によって形成した。クロム薄膜の厚さは１〜３ｎｍ、金薄膜の厚さは４４〜５２ｎｍであった。このようにして金薄膜が形成された基板を、１０−カルボキシ−１−デカンチオールのエタノール溶液（濃度２５ｍｇ／ｍＬ）に２４時間以上浸漬し、金薄膜の表面にＳＡＭ膜を形成した。この基板をエタノール溶液から取り出し、エタノールおよびイソプロパノールで洗浄した後、エアガンを用いて乾燥させた。

（２）ＳＰＦＳ用流路型測定部材の作製
前記工程で作製したプラズモン励起センサー（金薄膜）の表面に、幅２ｍｍ、長さ１４ｍｍの流路となる穴を有する、厚さ０．５ｍｍのシート状のシリコーンゴムスペーサーを積載した。さらにその上に、両端に貫通孔を有する厚さ２ｍｍのポリメチルメタクリレート板を積載して圧着し、ビスでプラズモン励起センサーに固定して、貫通穴を通じて試料、試薬等を送液することのできる流路を備えた、ＳＰＦＳ用流路型測定部材を作製した。

（３）蛍光標識ＷＦＡの作製
ＷＦＡ（Ｌ-１３５０、Ｖｅｃｔｏｒ社）を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標名）６４７タンパク質ラベリングキット（インビトロゲン社）を用いて蛍光標識化した。手順はそのキットに添付されたプロトコールに従った。未反応のレクチンおよび蛍光色素を除去するため、限外濾過膜（日本ミリポア(株)製）を用いて反応物を精製し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識ＷＦＡ溶液を得た。吸光度を測定してその溶液のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識ＷＦＡの濃度を求めた後、４℃で保存した。

（４）蛍光標識抗ＭＵＣ１抗体の作製
前記工程（３）において、ＷＦＡの代わりに市販の抗ＭＵＣ１モノクローナル抗体（抗ＫＬ−６モノクローナル抗体）を用い、それ以外は同様にして、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識抗ＭＵＣ１抗体を作製した。なお、この抗ＭＵＣ１モノクローナル抗体は、後述する抗ＭＵＣ１抗体固相化領域の形成にも用いた。

（５）蛍光標識抗ＰＳＡ抗体の作製
前記工程（３）において、ＷＦＡの代わりに市販の抗ＰＳＡモノクローナル抗体（ミクリ免疫研究所(株)、クローンＮｏ．７９、２．５ｍｇ／ｍＬ）を用い、それ以外は同様にして、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識抗ＰＳＡ抗体を作製した。

（６）血液検体の調製
前立腺癌の確定診断を受けた患者に由来する血清サンプルおよび前立腺肥大症の確定診断を受けた患者に由来する血清サンプルそれぞれについて、リン酸緩衝溶液にて２〜１０倍に稀釈し、血液検体を調製した。

［定量工程］
前記作製・調製工程（６）で調製した血液検体のそれぞれについて、下記の手順により、トータルＭＵＣ１、ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡおよびトータルＰＳＡそれぞれの濃度を測定した。

（１）トータルＭＵＣ１の定量
（１−１）抗ＭＵＣ１抗体固相化領域の形成
前記作製・調製工程（２）で作製したＳＰＦＳ用流路型測定部材の流路に、超純水を１０分間、その後、リン酸緩衝生理食塩水を２０分間、ペリスタポンプによって、室温（２５℃）、流速５００μＬ／分の条件で循環送液し、プラズモン励起センサーの表面を平衡化した。続いて、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドを５０ｍＭと、エチル(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドを１００ｍＭとを含むリン酸緩衝生理食塩水を５ｍＬ送液し、２０分間循環させた。その後、市販の抗ＭＵＣ１モノクローナル抗体（抗ＫＬ−６モノクローナル抗体）溶液２．５ｍＬを３０分間循環送液することで、ＳＡＭ膜上に当該抗体を固相化し、抗ＭＵＣ１抗体固相化領域を形成した。さらに、１重量％牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水を３０分間循環送液することによって、流路内の非特異吸着防止処理を行った。

（１−２）ＳＰＦＳによる測定
試料送液工程：前記抗ＭＵＣ１抗体固相化領域が形成された流路に、前記作製・調製工程（６）で調製した血液検体を２５分間、循環送液した。

第１洗浄工程：Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を０．０５重量％含むトリス緩衝生理食塩水を１０分間、循環送液した。

ブランク測定工程：前記トリス緩衝生理食塩水で流路を満たした状態で、波長６３５ｎｍのレーザー光を、光学フィルタによりフォトン量を調節し、プリズムを通じて、プラズモン励起センサーの裏面から金属薄膜に照射した。測定領域の上部に設置された、倍率２０倍の対物レンズを付けたＣＣＤイメージセンサー（テキサスインスツルメント(株)）で、蛍光成分以外の波長をカットするフィルタを通過した光の強度を測定した。この測定値は、ＭＵＣ１を標識した蛍光体が発する蛍光を含まないノイズ値であるので、ブランク値とする。

標識工程：前記作製・調製工程（４）で作製したＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識抗ＭＵＣ１抗体を含むリン酸緩衝生理食塩水（１ｎｇ／ｍＬ）５ｍＬを２０分間、循環送液した。

第２洗浄工程：Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を０．０５重量％含むトリス緩衝生理食塩水を２０分間、循環送液した。

シグナル測定工程：前記トリス緩衝生理食塩水で流路を満たした状態で、前記ブランク測定工程のときと同様にして、光の強度を測定した。この測定値は、ＭＵＣ１を標識した蛍光体が発する蛍光を含む、シグナルに相当する。

（２）トータルＰＳＡの定量
（２−１）抗ＰＳＡ抗体固相化領域の形成
トータルＭＵＣ１の定量における前記工程（１−１）において、前記抗ＭＵＣ１モノクローナル抗体の代わりに市販の抗ＰＳＡモノクローナル抗体を用い、それ以外は同様にして、抗ＰＳＡ抗体固相化領域を形成した。

（２−２）ＳＰＦＳによる測定
トータルＭＵＣ１の定量における前記工程（１−２）において、前記作製・調製工程（４）で作製したＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識抗ＭＵＣ１抗体の代わりに、前記作製・調製工程（５）で作製したＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識抗ＰＳＡ抗体を用い、それ以外は同様にして、トータルＰＳＡを定量した。

（３）ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの定量
（３−１）抗ＰＳＡ抗体固相化領域の形成
トータルＭＵＣ１の定量における前記工程（１−１）において、前記抗ＭＵＣ１モノクローナル抗体の代わりに市販の抗ＰＳＡモノクローナル抗体を用い、それ以外は同様にして、抗ＰＳＡ抗体固相化領域を形成した。

（３−２）ＳＰＦＳによる測定
トータルＭＵＣ１の定量における前記工程（１−２）において、前記作製・調製工程（４）で作製したＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識抗ＭＵＣ１抗体の代わりに、前記作製・調製工程（３）で作製したＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識ＷＦＡを用い、それ以外は同様にして、ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡを定量した。

［分析工程］
図１に、前記定量工程（１）：トータルＭＵＣ１（ＫＬ６）の定量の結果を示す。血液検体中のトータルＭＵＣ１（ＫＬ６）の濃度は、前立腺癌患者よりも前立腺肥大症患者の方が高いことが示されている。したがって、この結果に基づいた場合は、たとえば４．５〜５ｕｎｉｔのある値に相当する濃度を、本発明の分析方法の第１実施形態における閾値として設定することが可能であることが分かる。

図２に、前記定量工程（１）：トータルＭＵＣ１（ＫＬ６）の定量の結果（横軸）および前記定量工程（２）：トータルＰＳＡの定量の結果（縦軸）を複合的に示す。血液検体中のトータルＭＵＣ１（ＫＬ６）の濃度は、前立腺癌患者よりも前立腺肥大症患者の方が高いことが示されている。すなわち、この結果に基づいた場合は、たとえば４．５〜５ｕｎｉｔの範囲を、本発明の分析方法の閾値として設定することが可能であることが分かる。したがって、本発明の分析方法の第２実施形態において、従来診断に用いられてきたトータルＰＳＡに関する閾値がグレーゾーンを含み、前立腺肥大症患者の一定数を前立腺癌であるとする偽陽性の結果を与える場合であっても、トータルＭＵＣ１（ＫＬ６）に関する閾値を併用することで、偽陽性患者を正しく前立腺肥大症であると判定することが可能であることが分かる。

図３に、前記定量工程（１）：トータルＭＵＣ１（ＫＬ６）の定量の結果（横軸）および前記定量工程（３）：ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの定量の結果（縦軸）を複合的に示す。血液検体中のトータルＭＵＣ１（ＫＬ６）の濃度は、前立腺癌患者よりも前立腺肥大症患者の方が高いことが示されている。すなわち、この結果に基づいた場合は、たとえば４．５〜５ｕｎｉｔの範囲を、本発明の分析方法の閾値として設定することが可能であることが分かる。したがって、本発明の分析方法の第３実施形態において、特許文献１に開示されたＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡに関する閾値がグレーゾーンを含み、前立腺肥大症患者の一定数を前立腺癌であるとする偽陽性の結果を与える場合であっても、トータルＭＵＣ１（ＫＬ６）に関する閾値を併用することで、偽陽性患者を正しく前立腺肥大症であると判定することが可能であることが分かる。

なお、図３には、トータルＭＵＣ１（ＫＬ６）の濃度が高く、かつＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの濃度も比較的高いサンプルが１つ見られるが（点線の丸印で囲まれたサンプル）、これは前立腺癌が他の部位に転移している患者に由来するサンプルである。また、他の結果を考慮すれば、前立腺肥大症等の前立腺良性疾患を併発している前立腺癌患者に由来するサンプルの場合も同様になると考えられる。さらに、ホルモン抵抗性の前立腺癌患者に由来するサンプルの場合も同様になると考えられる。したがって、本発明の第４実施形態において、トータルＭＵＣ１（ＫＬ６）およびＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡに関する第２の閾値を設定することで、転移性の高い前立腺癌、前立腺良性疾患を伴う前立腺癌またはホルモン抵抗性の前立腺癌を検出することが可能であることが分かる。

Claims (11)

1. 診断対象に由来する血液検体中の全てのムチン−１（トータルＭＵＣ１）の濃度を測定し、得られた測定値を閾値と比較し、トータルＭＵＣ１の濃度の測定値が閾値よりも大きいことをもって、診断対象が罹患している疾患は前立腺癌ではなく前立腺良性疾患であると推定する診断用情報の分析方法。
2. 診断対象に由来する血液検体中の全てのムチン−１（トータルＭＵＣ１）の濃度を測定し、得られた測定値を閾値と比較し、トータルＭＵＣ１の濃度の測定値が閾値よりも大きいことをもって、診断対象が罹患している疾患は前立腺癌ではなく前立腺良性疾患であると推定する診断用情報の分析方法と、
   診断対象が前立腺疾患に罹患していることを示す前立腺特異抗原に関する診断用情報と
   を組み合わせて、診断対象が前立腺良性疾患と前立腺癌のどちらに罹患しているかを推定する診断用情報の分析方法。
3. 診断対象に由来する血液検体中の全てのムチン−１（トータルＭＵＣ１）の濃度を測定し、得られた測定値を閾値と比較し、トータルＭＵＣ１の濃度の測定値が閾値よりも大きいことをもって、診断対象が罹患している疾患は前立腺癌ではなく前立腺良性疾患であると推定する診断用情報の分析方法と、
   診断対象に由来する血液検体中の、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンβ１−４Ｎアセチルグルコサミン残基を認識して結合するレクチンとの反応性を有する前立腺特異抗原（ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡ）の濃度を測定し、得られた測定値を閾値と比較し、ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの濃度の測定値が閾値よりも大きいことをもって、診断対象が罹患している疾患は前立腺良性疾患ではなく前立腺癌であると推定する診断用情報の分析方法と
   を組み合わせて、診断対象が前立腺良性疾患と前立腺癌のどちらに罹患しているかを推定する診断用情報の分析方法。
4. 請求項３の診断用情報の分析方法において、診断対象が前立腺癌に罹患していると推定される場合に、さらに、
   トータルＭＵＣ１の濃度の測定値が請求項３に記載の閾値より大きなもう一つの閾値よりも大きく、かつＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡの濃度の測定値が請求項３に記載の閾値より大きなもう一つの閾値よりも大きいことをもって、診断対象が罹患している前立腺癌が、転移性の高い前立腺癌、前立腺良性疾患を伴う前立腺癌またはホルモン抵抗性の前立腺癌であると推定する診断用情報の分析方法。
5. 前記前立腺良性疾患が前立腺肥大症である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の診断用情報の分析方法。
6. 前記トータルＭＵＣ１が、抗ＫＬ−６モノクローナル抗体との反応性を有するものである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の診断用情報の分析方法。
7. 請求項１に記載の診断用情報の分析方法を実施するためのキットであって、
   トータルＭＵＣ１を定量するための抗ムチン−１抗体を含む診断用キット。
8. 請求項２に記載の診断用情報の分析方法を実施するためのキットであって、
   トータルＭＵＣ１を定量するための抗ムチン−１抗体と、抗前立腺特異抗原を定量するための抗前立腺特異抗原抗体とを含む診断用キット。
9. 請求項３または４に記載の診断用情報の分析方法を実施するためのキットであって、
   トータルＭＵＣ１を定量するための抗ムチン−１抗体と、ＬａｃｄｉＮＡｃ−ＰＳＡを定量するための抗前立腺特異抗原抗体およびＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンβ１−４Ｎアセチルグルコサミン残基を認識して結合するレクチンを含む診断用キット。
10. 前記抗ムチン−１抗体が抗ＫＬ−６モノクローナル抗体である、請求項７〜９のいずれか一項に記載の診断用キット。
11. さらに、診断用情報の分析方法を実施するために必要な情報を記載した使用説明書を含む、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の診断用キット。

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