JP5463840B2 - 測定方法及び表面プラズモン増強蛍光測定装置 - Google Patents
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アナライトが特異的に反応する1次抗体が固定化された前記反応場に捕捉されたアナライトおよび前記アナライトに結合した2次抗体に、前記振動付与手段により振動を与えるステップと、
前記金属薄膜の一方の面に励起光を照射し、他方の面側の電場を増強させることにより前記2次抗体に付された蛍光物質を励起させるステップと、
前記蛍光物質からの蛍光を測定し、出力信号を周波数解析することにより検体の分析を行うステップと、を有し、
前記振動付与手段により与える振動の周波数は、前記反応場上の前記1次抗体、前記アナライトおよび前記2次抗体の連結体が共振する周波数よりも低く、振動により前記連結体を強制振動させることを特徴とする測定方法。
前記振動付与手段により与える振動により、前記蛍光物質の前記金属薄膜からの距離を周期的に変化させ、前記蛍光物質の前記金属薄膜からの距離の変化により蛍光の強度を変化させることを特徴とする前記1に記載の測定方法。
前記反応場に所定の周波数で振動を与える振動付与手段と、
前記金属薄膜の一方の面に励起光を照射し、他方の面側の電場を増強させ前記反応場に捕捉された2次抗体に付与された蛍光物質を励起させる発光部と、
前記蛍光物質からの蛍光を検出する光検出部と、
前記反応場に捕捉されたアナライトおよび前記アナライトに結合した前記2次抗体に前記振動付与手段により振動を与えた状態で、前記2次抗体に付された蛍光物質からの蛍光を前記光検出部で測定し、出力信号を周波数解析し、得られた信号強度から検体の分析を行う解析手段と、を有し、
前記振動付与手段により与える振動の周波数は、前記反応場上の前記1次抗体、前記アナライトおよび前記2次抗体の連結体が共振する周波数よりも低く、振動により前記連結体を強制振動させることを特徴とする表面プラズモン増強蛍光測定装置。
前記振動付与手段は、前記反応場に交番電界を印加することを特徴とする前記3に記載の表面プラズモン増強蛍光測定装置。
本発明の表面プラズモン増強蛍光測定装置10は、図1に示したように、まず金属薄膜102と、金属薄膜102の一方側面に形成された反応場104と、他方側面に形成された誘電体部材106と、を有するチップ構造体108を備えている。
図3は、反応場104の検体の振動状態を説明する模式図である。同図に示すように、金属薄膜102とITO基板146Aは高圧電源PSにより接続されている。高圧電源PSは交流電圧あるいは極性を交互に入れ替えたパルス状の電圧を出力することが可能であり、反応場104に対して極性を所定の周波数で変化する交番電界を与えることができる。電圧としては例えば数百V、好ましくは数十V以下である。である。高圧電源PS及びITO基板146Aが振動付与手段として機能する。所定の周波数は、反応場104において特異吸着している検体が共振する周波数あるいはこれよりも低い周波数に設定している。当該周波数としては概ね数Hzから数十Hzである。振動を与えることにより特異吸着spは共振あるいは強制振動させられる。
ここで特異吸着spの共振周波数について説明する。特異吸着spの共振周波数を算出するために、まずは図5に示す様な倒立振り子モデルを用いてタンパクの運動方程式について検討する。
慣性モーメント:J=ml2
転倒モーメント:mg・l・sinθ≒mgl・θ
バネの復元力:−k・hθ
復元モーメント:−k・hθ・h=−kh2・θ
上記の元で、運動方程式は以下の数式1で表される。
kt=kh2−mgl≒0.81×10−15(kgm2/t2)
J=M×l2=6.17×10−22×(18×10−9)2=1.99908×10−37(kgm2)
wn=√(kt/J)≒0.636×1011(Hz)
溶媒が水であれば粘度η=0.89(cP)=0.89×10−3(kg/(mt))、
タンパクの大きさを半径r=5nmとすると
体積V=4/3πr3=5.236×10−25(m3)
粘性減衰係数:C=η×V=5.236×10−25×0.89×10−3≒4.66004×10−28(kgm2/t)
減衰比:ζ=C/(2Wn×J)=4.66004×10−28/(2×0.636×1011×1.99908×10−37)≒0.0183
共振周期T=2π/(Wn×√(1−ζ2))≒9.88×10−11(t)
共振周波数f=1/T≒10(Ghz)となる。
図6は、表面プラズモン増強蛍光測定装置の制御部18が実行する制御フローである。ステップS11では、ポンプ130を作動させることにより、ピペット150内のアナライトが含まれる検体液を、微細流路143を通じて貯留部148に送液する。当該行為により反応場104の固定されている1次抗体にアナライトが補足される。続いて、ピペット150の交換を行う。交換されたピペット150には、蛍光標識が修飾された2次抗体が含まれる2次抗体液が充填されており、2次抗体液を、微細流路143を通じて貯留部148まで送液する。2次抗体はアナライトに特異的に反応するので、反応場104には、1次抗体、アナライト、2次抗体の順で連結した状態(特異吸着sp)で補足されることになる。
以下に、振動付与手段の変形例について説明する。以下においては振動付与手段以外の構成は図1から図7で説明した構成と同一であり、説明は省略する。
14 マイクロチップ
18 制御部
181 周波数解析部
PS 高圧電源
146A ITO基板
146B 可動壁
17 圧電素子
142 石英基板
143 微細流路
148 貯留部
150 ピペット
161 固定具
102 金属薄膜
104 反応場
112 光源
116 受光手段
120 光検出部
b1 励起光
b2 金属薄膜反射光
b3 蛍光
Claims (6)
- 金属薄膜が設けられた反応場に所定の周波数で振動を与える振動付与手段を有する表面プラズモン増強蛍光測定装置を用いた測定方法であって、
アナライトが特異的に反応する1次抗体が固定化された前記反応場に捕捉されたアナライトおよび前記アナライトに結合した2次抗体に、前記振動付与手段により振動を与えるステップと、
前記金属薄膜の一方の面に励起光を照射し、他方の面側の電場を増強させることにより前記2次抗体に付された蛍光物質を励起させるステップと、
前記蛍光物質からの蛍光を測定し、出力信号を周波数解析することにより検体の分析を行うステップと、を有し、
前記振動付与手段により与える振動の周波数は、前記反応場上の前記1次抗体、前記アナライトおよび前記2次抗体の連結体が共振する周波数よりも低く、振動により前記連結体を強制振動させることを特徴とする測定方法。 - 前記増強された電場は、前記金属薄膜からの距離により異なっており、
前記振動付与手段により与える振動により、前記蛍光物質の前記金属薄膜からの距離を周期的に変化させ、前記蛍光物質の前記金属薄膜からの距離の変化により蛍光の強度を変化させることを特徴とする請求項1に記載の測定方法。 - 金属薄膜が設けられ、アナライトが特異的に反応する1次抗体が固定化された反応場と、
前記反応場に所定の周波数で振動を与える振動付与手段と、
前記金属薄膜の一方の面に励起光を照射し、他方の面側の電場を増強させ前記反応場に捕捉された2次抗体に付与された蛍光物質を励起させる発光部と、
前記蛍光物質からの蛍光を検出する光検出部と、
前記反応場に捕捉されたアナライトおよび前記アナライトに結合した前記2次抗体に前記振動付与手段により振動を与えた状態で、前記2次抗体に付された蛍光物質からの蛍光を前記光検出部で測定し、出力信号を周波数解析し、得られた信号強度から検体の分析を行う解析手段と、を有し、
前記振動付与手段により与える振動の周波数は、前記反応場上の前記1次抗体、前記アナライトおよび前記2次抗体の連結体が共振する周波数よりも低く、振動により前記連結体を強制振動させることを特徴とする表面プラズモン増強蛍光測定装置。 - 前記2次抗体、あるいは前記蛍光物質は、電荷を帯びており、
前記振動付与手段は、前記反応場に交番電界を印加することを特徴とする請求項3に記載の表面プラズモン増強蛍光測定装置。 - 前記振動付与手段は、前記反応場を一の壁面とする流路の、前記反応場以外の他の壁面を振動させることを特徴とする請求項3に記載の表面プラズモン増強蛍光測定装置。
- 前記振動付与手段は、前記反応場を一の壁面とする流路に、液体を往復して送液し、往復運動により前記連結体に振動を与えることを特徴とする請求項3に記載の表面プラズモン増強蛍光測定装置。
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