WO2019230222A1 - 表面プラズモン励起増強蛍光測定法 - Google Patents
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- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
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- G01N21/15—Preventing contamination of the components of the optical system or obstruction of the light path
Definitions
- the present invention relates to a surface plasmon excitation enhanced fluorescence measurement method, and more particularly to a surface plasmon excitation enhanced fluorescence measurement method with low optical noise, high accuracy and high sensitivity.
- Biochemical reactions such as antigen-antibody reactions are used in biochemical tests.
- a labeling substance containing a fluorescent substance is bound to a substance to be detected such as an antigen to fluorescently label the substance to be detected.
- the fluorescently-labeled target substance is irradiated with excitation light, the fluorescence emitted from the fluorescent substance is detected, and the amount of the target substance is specified from the intensity of the fluorescence.
- a surface plasmon excitation enhanced fluorescence measurement method (Surface Plasmon-Field ⁇ ⁇ ⁇ Enhanced Fluorescence Spectroscopy, SPFS) is known as a method capable of detecting a detection target substance with particularly high sensitivity in FIA.
- a first capturing body for example, a primary antibody
- a reaction field for capturing the substance to be detected.
- an SPFS device having a test chip on the bottom surface of a well (a bottomed concave member that contains a liquid) is known.
- the well is formed by fixing a well member having a through-hole on a metal film formed on a dielectric member having optical transparency, and the reaction field is formed on the bottom surface of the well. It arrange
- the substance to be detected is bound to the first capturing body that forms a reaction field fixed on the metal film.
- a second capture body for example, a secondary antibody
- the fluorescent material is excited by an electric field enhanced by surface plasmon resonance (SPR) and emits fluorescence.
- Patent Document 1 describes a sensor chip in which a layer made of an optical noise absorber is provided in a flow path between a plasmon excitation sensor and a flow path top plate as a technique for reducing noise in SPFS.
- Patent Document 1 can reduce the absolute amount of optical noise by absorbing a certain amount of optical noise immediately after plasmon generation.
- SPFS with high sensitivity and high accuracy
- further noise reduction is required.
- An object of the present invention is to provide a surface plasmon excitation enhanced fluorescence measurement method that is low in noise and capable of highly sensitive and highly accurate analysis.
- the present inventor has obtained the knowledge that dust or the like attached to an optical element such as a prism used in SPFS contributes to noise generated in SPFS, and has completed the present invention.
- the surface plasmon excitation enhanced fluorescence measurement method of the present invention is a surface plasmon that measures fluorescence emitted from the fluorescent material by exciting the fluorescent material by surface plasmon resonance caused by incidence of excitation light on the optical element.
- the optical element is neutralized before the fluorescence measurement.
- Examples of the static elimination method include a method of blowing air to the optical element, a method of using a static eliminator, a method of bringing a metal into contact with the optical element, and a method of bringing an antistatic agent into contact with the prism.
- the optical element is blown after the optical element is neutralized by a method other than blowing.
- methods other than the blowing include a method using a static eliminator, a method of bringing a metal into contact with the optical element, and a method of bringing an antistatic agent into contact with the optical element.
- the optical element include a diffraction grating in which prisms and fine convex portions or concave portions are periodically arranged.
- the surface plasmon excitation enhanced fluorescence measurement is immobilized on a metal film that causes surface plasmon resonance by excitation light incident from the prism, and the metal film.
- the detection chip includes a well body including an accommodating portion having openings in the upper portion and the side portion, and a side wall member having a supplemental region that supplements the substance to be detected.
- the side wall member is configured such that at least a part of the supplementary region is exposed in the accommodating part through an opening in a side part of the accommodating part and closes at least a part of the opening in the side part of the accommodating part.
- the side wall member includes the prism, and the prism has an incident surface on which light is incident, and a reflecting surface on which light incident from the incident surface is reflected,
- the metal film is provided on the reflective surface;
- the supplementary region is disposed on the metal film, and the first capturing body is coupled to the supplemental region.
- the surface plasmon excitation enhanced fluorescence measurement includes a metal film having the diffraction grating that causes surface plasmon resonance by incident excitation light, and the metal film Carried out using a detection chip comprising an immobilized first capture body, A first step of binding a substance to be detected to the first capturing body; A second step of binding a second capturing body labeled with a fluorescent material to a substance to be detected bound to the first capturing body, and excitation light from the prism is incident on the metal film, and surface plasmon resonance
- the method includes a third step of exciting the fluorescent material and measuring fluorescence emitted from the fluorescent material.
- the detection chip includes a well body including an accommodating portion having openings in the upper portion and the side portion, and a side wall member having a supplemental region that supplements the substance to be detected.
- the side wall member is configured so that at least a part of the supplementary region is exposed in the housing part through an opening in a side part of the housing part and closes at least a part of the opening in the side part of the housing part.
- the side wall member Fixed to the well body,
- the side wall member includes a metal film having the diffraction grating,
- the diffraction grating is exposed in the housing portion through an opening in a side portion of the housing portion,
- the capture region is disposed on the diffraction grating, and the first capture body is coupled to the capture region;
- At least a part of the side wall constituting the accommodating portion of the well body has light transmittance.
- the surface plasmon excitation enhanced fluorescence measuring apparatus excites a fluorescent material by surface plasmon resonance generated by entering excitation light into an optical element, and measures fluorescence emitted from the fluorescent material, thereby enhancing surface plasmon excitation enhancement. It is a fluorescence measuring apparatus, and is provided with a static elimination means for neutralizing the optical element.
- the surface plasmon excitation enhanced fluorescence measurement method of the present invention is low in optical noise and can be analyzed with high sensitivity and high accuracy.
- FIG. 1 is a schematic diagram showing a configuration of a biochemical test system according to the first embodiment.
- 2a to 2c are schematic views showing the structure of the inspection chip according to the first embodiment.
- FIG. 2a is a perspective view of the inspection chip.
- FIG. 2b is a perspective view of the well body.
- FIG. 2c is a perspective view of the well body.
- FIG. 3 is a schematic view showing the structure of the side wall member according to the first embodiment.
- FIG. 4 is a schematic view when the inspection chip according to the first embodiment is viewed from the first opening side.
- FIG. 5 is a block diagram of a control calculation unit according to the first embodiment.
- FIG. 6 is a schematic diagram for explaining the circular motion of the inspection chip according to the first embodiment installed on the rotating body of the stirring device.
- FIG. 1 is a schematic diagram showing a configuration of a biochemical test system according to the first embodiment.
- FIG. 2a to 2c are schematic views showing the structure of the inspection chip according to the first
- FIG. 7 is a flowchart for explaining the operation of the biochemical test system according to the first embodiment.
- FIG. 8 is a schematic diagram for explaining the operation of the liquid feeding / conveying unit according to the first embodiment.
- FIG. 9 is a schematic view when the inspection chip according to the first embodiment having the side wall member on the side surface of the well is viewed from the opening side of the well.
- FIG. 10 is a schematic diagram illustrating a configuration of a detection system according to the second embodiment.
- FIG. 11A is a perspective view of a detection chip according to the second embodiment
- FIG. 11B is a perspective view of a well body
- FIG. 11C is a perspective perspective view of the well body.
- FIG. 12 is a schematic diagram showing light incident on the detection chip and light emitted from the detection chip according to the second embodiment.
- 13 is a partially enlarged cross-sectional view in which the vicinity of the reaction field in the cross-sectional view of FIG. 12 is enlarged.
- 14A and 14B are perspective views of the diffraction grating.
- FIG. 15 is a flowchart of the detection method according to the second embodiment, and is a flowchart illustrating an example of an operation procedure of the detection system.
- FIG. 16A and FIG. 16B are schematic views showing light incident on the detection chip and light emitted from the detection chip for explaining a first modification of the detection system according to the second embodiment.
- FIGS. 18A and 18B are graphs of the blank and the fluorescence signal value obtained in the surface plasmon excitation enhanced fluorescence measurement method in which the prism was neutralized, respectively.
- FIGS. 18C and 18D are graphs of the blank and the fluorescence signal value obtained in the surface plasmon excitation enhanced fluorescence measurement method in which the static elimination of the prism was not performed, respectively.
- the surface plasmon excitation enhanced fluorescence measurement method is a surface plasmon excitation in which a fluorescent material is excited by surface plasmon resonance generated by entering excitation light into an optical element, and fluorescence emitted from the fluorescent material is measured.
- the optical element is neutralized before the fluorescence measurement.
- the optical element is a portion that generates surface plasmon resonance upon receiving excitation light.
- a prism is used in the second embodiment.
- the diffraction grating corresponds to the optical element.
- the first embodiment is a biochemical inspection method, in which a plurality of measurement units each performing individual steps constituting one inspection are sequentially arranged on the production line, and the inspection chip proceeds along the production line. Therefore, the individual steps are sequentially performed and the inspection progresses, and a continuous form in which a plurality of inspections can be performed almost simultaneously by introducing a plurality of inspection chips one after another is adopted.
- the present invention is not limited to the continuous form. For example, it is also possible to adopt a discontinuous form in which individual steps constituting one inspection are performed at the same position and the progress of the inspection does not depend on the progress of the inspection chip.
- FIG. 1 is a schematic diagram showing a configuration of a biochemical test system A used in the present embodiment.
- the biochemical inspection system A is a system that performs biochemical inspection using SPFS. Specifically, the biochemical examination system A captures a detection substance by a first capturing body immobilized on a metal film, and the detection target substance captured by the first capturing body is fluorescent with a fluorescent substance. The target substance to be detected is fluorescently labeled by binding the labeled second capturing body.
- the metal film is irradiated with excitation light to generate an enhanced electric field based on surface plasmon resonance in the vicinity of the metal film, and the fluorescence emitted from the fluorescent substance excited by the enhanced electric field is detected to detect the presence and amount of the detected substance. Measure.
- the biochemical test system A is excited by a vibration unit 10, a light projecting unit 20, a liquid feeding / conveying unit 30, and a detection unit 40 on a test chip arranged in the vibration unit 10.
- Light is emitted, and the detection unit 40 is configured to detect fluorescence emitted from the inspection chip.
- the vibration unit 10 is a stirring device (not shown) that stirs the liquid contained in each of the inspection chips 60a, 60c, and 60d by rotational vibration at the positions 10a, 10c, and 10d corresponding to the inspection chips 60a, 60c, and 60d. Prepare each.
- the stirrer is arranged so as not to obstruct the optical path of excitation light, fluorescence, plasmon scattered light, etc., and has an eccentric rotating body.
- the rotating body vibrates while being in contact with the inspection chip, thereby agitating the liquid contained in the inspection chip by applying the rotational vibration in the circumferential direction of the inspection chip.
- the stirring device is not limited to the one having an eccentric rotating body, and any device that can stir the liquid stored in the inspection chip by applying rotational vibration to the inspection chip may be used.
- the stirrer stirs the liquid contained in the test chip, so that the reaction and cleaning of each step in the biochemical test can be performed efficiently.
- the agitation reaction apparatus preferably applies rotational vibration to the inspection chip at the natural frequency of the inspection chip containing the liquid or the vibration frequency before and after the natural frequency. Further, rotational vibration may be applied to the inspection chip while sequentially switching different natural frequencies (n-th natural frequency and m-th natural frequency, n and m are positive integers).
- the position where the stirrer is provided is not limited to the position described above, and the installation position or number is changed as necessary according to the operation content of each step, or the stirrer is provided corresponding to all the inspection chips. It is also possible.
- the light projecting unit 20 includes a light source unit and a first angle adjusting unit (both not shown), and irradiates the inspection chip with excitation light.
- the light source unit includes a light source, a beam shaping optical system, an APC mechanism, and a temperature adjustment mechanism, and irradiates the inspection chip with excitation light.
- 2a to 2c are schematic views having the structure of the inspection chip 60.
- FIG. 2A the test chip 60 includes a well body 61 and a side wall member 62, and is adjacent to the side wall member 62 as shown in FIGS. 2B and 2C.
- a second opening 64 is provided on the side wall of the well body 61.
- FIG. 3 is a partial enlarged cross-sectional view in which the vicinity of the second opening 64 in the cross section in the height direction (vertical direction in FIG.
- the side wall member 62 includes a prism 71, a metal film 75, and a trapping film 76, and the trapping film 76 is exposed at the second opening 64. Thus, a reaction field 77 is formed.
- FIG. 4 is a cross-sectional view of the inspection chip 60, and is a schematic diagram showing light incident on the inspection chip 60 and light emitted from the inspection chip 60.
- the light source unit emits excitation light 91 having a constant wavelength and light amount so that the irradiation spot shape on the reflecting surface 73 of the prism 71 is substantially circular with respect to the prism 71 of the inspection chip 60. Irradiate.
- the size of the irradiation spot is preferably smaller than the reaction field 77.
- the type of the light source is not particularly limited, and is, for example, a laser diode (LD).
- Other examples of light sources include light emitting diodes, mercury lamps, and other laser light sources.
- the light emitted from the light source is not a beam, the light emitted from the light source is converted into a beam by a lens, a mirror, a slit, or the like.
- the light emitted from the light source is not monochromatic light, the light emitted from the light source is converted into monochromatic light by a diffraction grating or the like.
- the light emitted from the light source is not linearly polarized light, the light emitted from the light source is converted into linearly polarized light by a polarizer or the like.
- the beam shaping optical system includes, for example, a collimator, a band pass filter, a linear polarization filter, a half-wave plate, a slit, and a zoom means.
- the beam shaping optical system may be configured to include only a part of these.
- the collimator collimates the excitation light emitted from the light source.
- the bandpass filter turns the excitation light emitted from the light source into narrowband light having only the center wavelength. This is because the excitation light emitted from the light source has a slight wavelength distribution width.
- the linear polarization filter converts the excitation light emitted from the light source into completely linearly polarized light.
- the half-wave plate adjusts the polarization direction of the excitation light so that the P-wave component is incident on the reflection surface 73.
- the slit and zoom means adjust the beam diameter, contour shape, and the like of the excitation light so that the shape of the irradiation spot on the reflection surface 73 is a circle having a predetermined size.
- the APC mechanism controls the light source so that the output of the light source is constant. Specifically, the APC mechanism detects the amount of light branched from the excitation light by a photodiode or the like, and controls the input energy by a regression circuit to control the output of the light source to be constant.
- the temperature adjustment mechanism is, for example, a heater or a Peltier element. Since the wavelength and energy emitted from the light source may vary depending on the temperature, the temperature adjustment mechanism controls the wavelength and energy of the light emitted from the light source to be constant by maintaining the temperature of the light source constant.
- the first angle adjustment unit adjusts the incident angle ⁇ of the excitation light 91 with respect to the reflection surface 73 by relatively rotating the optical axis of the excitation light 91 and the inspection chip 60.
- the first angle adjustment unit scans the incident angle ⁇ by rotating the optical unit about an axis along the height direction of the inspection chip 60 (an axis perpendicular to the paper surface in FIG. 4).
- the detection unit 40 described later specifies the enhancement angle.
- the enhancement angle means that when the excitation light 91 is irradiated onto the reflection surface 73, it passes through the reflection surface 73 and is emitted to the well body 61 side of the inspection chip 60, and plasmon scattered light 94 having the same wavelength as the excitation light 91. This is the angle that is the incident angle when the amount of light reaches the maximum.
- the enhancement angle is set as the incident angle ⁇ of the excitation light 91 at the time of optical blank measurement and fluorescence value measurement described later.
- the incident conditions of the excitation light 91 are determined in the design elements of the inspection chip 60 (for example, the material and shape of the prism 71, the film thickness of the metal film 75, the wavelength of the excitation light 91, etc.) It is generally determined by the refractive index of the liquid to be stored, but may vary depending on the shape error of the prism 71, the composition of the liquid stored in the inspection chip 60 (for example, the type and amount of the fluorescent material), and the like. Therefore, it is preferable to specify an optimal enhancement angle for each examination.
- the detection unit 40 includes a first lens, an optical filter, a second lens, a position switching unit, and a light receiving sensor (all not shown), and the fluorescence 93 and plasmon scattered light emitted from the inspection chip 60. 94 is detected.
- the first lens is a condensing lens, for example, and condenses light emitted from the vicinity of the reaction field 77.
- the second lens is, for example, an imaging lens, and forms an image of light collected by the first lens on the light receiving surface of the light receiving sensor.
- the optical path between the first lens and the second lens is a substantially parallel optical path.
- the optical filter is arranged on the optical path between the first lens and the second lens by the position switching unit.
- the optical filter is, for example, a filter including a multilayer film that reflects a predetermined light component, or a color glass filter that absorbs a predetermined light component, and among the light collected by the first lens, the excitation light 91 and the plasmon Excitation light components such as scattered light 94 are removed, and only fluorescence 93 is guided to the light receiving sensor. Thereby, in the light receiving sensor, the fluorescence 93 can be detected with a high S (signal) / N (noise) ratio.
- the optical filter include an excitation light reflection filter, a short wavelength cut filter, and a band pass filter.
- the optical filter When detecting the plasmon scattered light 93, the optical filter is disposed outside the optical path between the first lens and the second lens. In this case, the enhancement angle that is the incident angle when the amount of the plasmon scattered light 94 is maximized is specified.
- the position switching unit arranges the optical filter on the optical path between the first lens and the second lens or outside the optical path as necessary. Specifically, when detecting fluorescence 93, an optical filter is disposed on the same optical path, and when detecting plasmon scattered light 94, the optical filter is disposed outside the optical path.
- the light receiving sensor detects fluorescence 93 and plasmon scattered light 94.
- the light receiving sensor is, for example, a photomultiplier tube (PMT) or an avalanche photodiode (APD).
- PMT photomultiplier tube
- APD avalanche photodiode
- the light receiving sensor is not limited to these, and may be any sensor that can detect the weak fluorescence 93 and has high sensitivity.
- the detection unit 40 may be configured to detect the reflected light 92 of the excitation light 91 instead of detecting the plasmon scattered light 94.
- the reflected light 92 may be detected by the light receiving sensor or by separately providing a light receiving sensor (for example, a photodiode) for detecting reflected light.
- the detection unit 40 specifies the resonance angle instead of the enhancement angle, It is set as the incident angle ⁇ of the excitation light 91 when measuring the fluorescence value.
- the resonance angle is an angle that is an incident angle when the light quantity of the reflected light 92 of the excitation light 91 reflected by the reflection surface 73 is the minimum when the reflection surface 73 is irradiated with the excitation light 93. Note that the resonance angle exists in the vicinity of the enhancement angle.
- the light projecting unit 20 and the light receiving sensor are arranged at the same height as the inspection unit 60. Thereby, size reduction of a biochemical test
- the light projecting unit 20 and the light receiving sensor are not necessarily arranged at the same height as the inspection unit 60. For example, the positions of the light projecting unit 20 and the light receiving sensor can be freely changed using a mirror or the like.
- the liquid feeding / conveying unit 30 includes a liquid feeding unit and a conveying unit (both not shown).
- the liquid feeding means supplies a liquid such as a reagent to the test chip as needed, and collects the liquid stored in the test chip.
- the conveying means moves the inspection chip as necessary and arranges it at an appropriate position.
- the liquid feeding means includes a reagent chip, a pipette unit, and a first moving mechanism (all not shown).
- the reagent chip is a container that can contain a specimen, a specimen dilution liquid, a measurement buffer, a washing liquid, a labeling liquid for imparting a fluorescent label to a substance to be detected, and the like.
- specimens include body fluids such as blood, serum, plasma, cerebrospinal fluid, urine, nasal fluid, saliva, semen, and tissue extracts.
- substances to be detected include nucleic acids (DNA and RNA), proteins (polypeptides, oligopeptides, etc.), amino acids, carbohydrates, lipids, and modified molecules thereof.
- the sample dilution solution is composed of, for example, BSA (bovine serum albumin), Antifoam SI, NaN3, CMD (carboxymethyl-dextran), HAMA (human anti-mouse antibodies) inhibitor, PBST (phosphate buffered saline with Tween 20).
- the measurement buffer solution is composed of, for example, BSA, Antifoam SI, NaN3, and PBST.
- the labeling solution is composed of, for example, a secondary antibody labeled with a fluorescent substance and PBST.
- a plurality of containers are usually arranged according to the type of liquid, or a plurality of containers are integrated.
- the pipette unit consists of a syringe pump and a nozzle.
- the syringe pump includes a syringe, a plunger capable of reciprocating within the syringe, and a drive mechanism, and quantitatively sucks or discharges liquid by the reciprocating motion of the plunger.
- the drive mechanism is a means for reciprocating the plunger, and includes, for example, a stepping motor.
- the nozzle is once connected to a syringe pump.
- a pipette tip is attached to the other end of the syringe that is not connected to the syringe pump. However, without using a pipette tip, it is also possible to supply a liquid such as a reagent directly into the inspection chip through a nozzle, or to collect the liquid contained in the inspection chip directly through the nozzle.
- the first moving mechanism moves the nozzle and arranges it at a predetermined position.
- the first moving mechanism moves the nozzle freely in two directions, a vertical direction and a horizontal direction.
- the first moving mechanism include a robot arm and a two-axis stage or a turntable that can move up and down.
- the transport means includes an inspection chip holding unit and a second moving mechanism (none of which is shown).
- the inspection chip holding unit is for holding the inspection chip 60 and is configured to be fixed to the second moving mechanism or detachable.
- the second moving mechanism moves the inspection chip holding unit to move the inspection chip 60 held by the inspection chip holding unit to positions 10a to 10e corresponding to the respective measurement units for performing individual steps constituting the inspection. If necessary, place it in an appropriate position.
- Examples of the second moving mechanism include a conveyor and a rotary stage. However, when the continuous form in which a plurality of inspections can be performed almost simultaneously is not employed and the discontinuous form in which individual steps constituting one inspection are performed at the same position is selected, it is not necessary to provide the second moving mechanism.
- the second moving mechanism may be omitted and only the inspection chip holding unit may be provided to hold the inspection chip 60. Further, even when the continuous form is selected, a plurality of inspection chips corresponding to each measurement unit for performing individual steps constituting one inspection, if it is not necessary to move the inspection chip 60 according to the progress of the inspection. 60, when the work in one measurement unit is completed, the test chip 60 is not moved, but a liquid such as a reagent in the test chip 60 is moved into the test chip 60 corresponding to the next measurement unit by liquid feeding means. It is possible to transfer to. Also in this case, the second moving mechanism may be omitted, and only the inspection chip holding portion may be provided to hold each inspection chip 60.
- FIG. 5 is a block diagram of the control calculation unit 50.
- the control calculation unit 50 includes a CPU 51, a light projection control unit 52, a liquid feed drive control unit 53, a liquid feed movement control unit 54, a transport control unit 55, and a detection control unit 56. And an arithmetic unit 57.
- the CPU 51 controls the entire measurement and activates each control unit or calculation unit described later as necessary.
- the light projecting control unit 52 controls the light projecting unit 20 to irradiate a predetermined position with excitation light.
- the liquid feeding drive control unit 53 controls the pipette unit of the liquid feeding unit of the liquid feeding / conveying unit 30 to suck or discharge a predetermined liquid in a predetermined amount.
- the liquid feeding movement control unit 54 controls the first moving mechanism of the liquid feeding means of the liquid feeding conveyance unit 30 and arranges the nozzles at predetermined positions.
- the conveyance control unit 55 controls the conveyance means of the liquid feeding conveyance unit 30 and arranges the inspection chip at an appropriate position as necessary.
- the detection control unit 56 controls the detection unit 4 and detects plasmon scattered light or fluorescence as necessary.
- the calculation unit 57 specifies the enhancement angle based on the amount of plasmon scattered light, performs quantitative measurement such as calculation of the concentration of the substance to be detected based on the amount of fluorescent light, and performs
- FIG. 2 a to 2c are schematic diagrams showing the structure of the inspection chip 60.
- FIG. FIG. 2 a is a perspective view of the inspection chip 60.
- the test chip 60 includes a well body 61 and a side wall member 62.
- the well body 61 has a bottomed structure that can accommodate a liquid.
- FIG. 2 b is a perspective view of the well body 61
- FIG. 2 c is a perspective perspective view of the well body 61.
- the well body 61 has a first opening 63 at one end, a second opening 64 on the side wall adjacent to the side wall member 62, and the side opposite to the first opening 63.
- a bottom surface structure 66 is provided at the side end of the bottom surface.
- the well body 61 is a substantially cylinder in which the outer wall on the side where the side wall member 62 is disposed is horizontally cut according to the width of the side wall member 62 and the bottom surface end is closed by the bottom surface structure 66.
- a space inside the well body 61 connected to the first opening 63 and the second opening 64 serves as a liquid storage portion 65 that stores a liquid such as a reagent.
- the shape of the well body 61 is not limited to a cylinder, and may be a square tube having a square cross section or an asymmetric cross section, for example.
- the shape of the outer wall of the well body 61 on the side where the side wall member 62 is disposed is not limited to a plane as long as the side wall member 62 can be fixed.
- the well body 61 is made of a material transparent to light having the wavelength of the excitation light 91 and light having the wavelength of the fluorescence 93, and is made of, for example, resin or glass. However, a part of the well body 61 may be formed of a material opaque to light having the wavelength of the excitation light 91 and light having the wavelength of the fluorescence 93 as long as measurement in an inspection method described later is not hindered.
- the bottom surface structure 66 is a curved surface in which the tip 66a is biased toward the side wall member 62 side.
- FIG. 4 is a schematic diagram when the inspection chip 60 is viewed from the first opening 63 side. As shown in FIG. 4, the tip 66 a is located not at the symmetry center c of the transverse cross section of the well body 61 but at the tip position x deviated from the symmetry center c toward the side wall member 62.
- the tip position x and the center of gravity (hereinafter simply referred to as “the center of gravity of the inspection chip 60”) G2 of the inspection chip 60 in a state in which a liquid such as a reagent is accommodated are positioned on the same axis in the length direction of the inspection chip 60. To do.
- FIG. 6 is a schematic diagram for explaining the circular motion of the inspection chip 60 installed on the rotating body 99 of the stirring device.
- the upper part of FIG. 6 shows a side view of the inspection chip 60 installed on the rotating body 99 of the agitator when the liquid in the inspection chip 60 is agitated.
- the lower part of FIG. 6 shows a schematic view when the inspection chip 60 is viewed from the first opening 63 side when the liquid in the inspection chip 60 is stirred.
- the tip 66a is an axis in the length direction of the inspection chip 60 where the center of gravity G2 of the inspection chip 60 exists.
- the lower part of FIG. 6 shows a schematic diagram for explaining the circular motion of the inspection chip 60 installed on the rotating body 99 of the stirring device.
- the upper part of FIG. 6 shows a side view of the inspection chip 60 installed on the rotating body 99 of the agitator when the liquid in the inspection chip 60 is agitated.
- the lower part of FIG. 6 shows a schematic view when the inspection chip 60 is viewed from the first opening 63
- the center of gravity G2 and the tip 66a of the inspection chip 60 perform a circular motion in the same motion trajectory, and the inspection chip 60 moves in a circular motion of the rotating body 99. This makes it possible to perform a stable circular motion.
- the inspection chip 60 is expressed by a straight line, and the center of gravity of the inspection chip 60 and the motion trajectory of the tip 66 a are expressed by broken lines.
- test chip 60 can perform a stable circular motion, the test chip 60 will not fall from the stirring device, and the circular motion may cause a reagent or the like contained in the test chip 60.
- the liquid can be efficiently stirred and a reagent or the like can be sufficiently supplied to a reaction field described later.
- the bottom surface structure 66 is not limited to a curved surface, and may be, for example, a pyramid having a tip at the tip position x or a plane having a protrusion at the tip position x.
- the bottom surface structure 66 only needs to be configured to contact the rotating body 99 of the stirring device and to receive a circular motion at the tip position x.
- the bottom surface structure 66 preferably has the same shape as the surface of the rotating body 99 that comes into contact.
- the tip position x and the center of gravity G2 of the test chip 60 are located on the same axis in the length direction of the test chip 60.
- the tip position x is not limited to this, and the well position What is necessary is just to deviate from the center position of the cross section of the main body 61 (symmetrical center c in this embodiment) to the side wall member 62 side.
- the tip position x and the center of gravity G2 of the inspection chip 60 are located on the same axis in the length direction of the inspection chip 60 due to the structure of the inspection chip 60. In some cases.
- the tip position x and the center of gravity G2 of the test chip 60 do not necessarily have to be located on the same axis in the length direction of the test chip 60, and the tip position x is arranged so as to be biased toward the side wall member 62. By doing so, it is possible to stabilize the circular motion of the test chip 60 and to efficiently stir the liquid such as the reagent accommodated in the test chip 60.
- the center of gravity of the test chip 60 is precisely the center of gravity of the test chip 60 in a state where a liquid such as a reagent is accommodated. It can also be the center of gravity of itself.
- the inspection chip 60 uses the well 61 having the bottom structure 66 in which the tip 66a is biased toward the side wall member 62. It is not limited.
- the well body 61 may be configured such that the tip 66a is located at the symmetry center c of the cross section of the well body 61.
- FIG. 3 is a partially enlarged cross-sectional view in which the vicinity of the second opening 64 is enlarged in the cross section in the height direction (vertical direction in FIG. 2) of the test chip 60, and is a schematic diagram showing the structure of the side wall member 62.
- the side wall member 62 includes a prism 71, a metal film 75, and a trapping film 76, and the trapping film 76 is exposed at the second opening 64 to form a reaction field 77.
- the side wall member 62 is bonded to the well body 61 via an adhesive layer (not shown) so that the second opening 64 can be closed without leakage of liquid such as a reagent accommodated in the test chip 60.
- the side wall member 62 may be joined to the well body 61 by laser welding, ultrasonic welding, pressure bonding using a clamp member, or the like without using an adhesive layer.
- the prism 71 is an optical element made of a transparent derivative with respect to the excitation light 91, and has a number of birefringence characteristics.
- Examples of the material of the prism 71 include a resin and glass, and a resin having a refractive index of 1.4 to 1.6 and a small birefringence is preferable.
- FIG. 4 is a schematic diagram when the inspection chip 60 is viewed from the first opening 63 side, and is a schematic diagram showing light incident on the inspection chip 60 and light emitted from the inspection chip 60.
- the prism 71 is a column having a trapezoid as a bottom surface. A surface corresponding to one bottom surface of the trapezoid is a reflection surface 73, and a surface corresponding to one leg is an incident surface 74.
- the excitation light 91 emitted from the light projecting unit 20 is incident on the incident surface 72.
- the prism 71 In the prism 71, the light that has passed through the incident surface 72 and entered the prism 71 is reflected by the reflecting surface 73, and the reflected light 92 reflected by the reflecting surface 73 passes through the emitting surface 74 to the outside of the prism 71. It is comprised so that it may radiate
- the shape of the prism 71 is not limited to a column having a trapezoidal bottom surface, and may be, for example, a triangular column or a semi-cylinder. Moreover, it is preferable that it is a plane.
- the light source of the excitation light 91 is a radar diode (LD)
- the excitation light 91 returns to the LD
- the excitation state of the LD is disturbed, and the wavelength and output of the excitation light 91 change.
- the incident surface 72 is formed so that the excitation light 91 does not return to the light projecting unit 20, and the angle with the reflection surface 73 is set so that the excitation light 91 does not enter the incident surface 72 perpendicularly.
- the angle between the incident surface 72 and the reflecting surface 73 and the angle between the reflecting surface 73 and the emitting surface 74 are both about 80 °.
- the metal film 75 is formed on the reflection surface 73 of the prism 71.
- the material of the metal film 75 is not particularly limited as long as it is a metal that can cause surface plasmon resonance. Examples of the material of the metal film 75 include gold, silver, copper, aluminum, and alloys thereof.
- the method for forming the metal film 75 is not particularly limited. Examples of the method for forming the metal film 75 include sputtering, vapor deposition, and plating.
- the thickness of the metal film 75 is not particularly limited, but is preferably in the range of 30 to 70 nm.
- the capture film 76 is an area on the metal film 75 where the first capture body that specifically binds to the substance to be detected is immobilized.
- the type of the first capturing body is not particularly limited as long as it can specifically bind to the substance to be detected.
- Examples of the first capturing body include an antibody (primary antibody) or a fragment thereof, a nucleic acid, an enzyme, and the like that can specifically bind to the substance to be detected.
- the reaction field 77 is a region of the trapping film 76 exposed to the liquid storage portion 65 of the well body 61 at the second opening 64.
- the first capturing body immobilized on the metal film 75 and forming the capturing film 76 selectively binds the detected substance by specifically binding to the detected substance present in the specimen.
- the surface on which the reaction field 77 is formed that is, in this embodiment, the surface of the region of the metal film 75 corresponding to the reaction field 77 is preferably a flat surface.
- a protective layer may be provided on the reaction field 77 for maintaining the capture capability of the first capture body for a long time.
- the size of the reaction field 77 is not particularly limited.
- the size of the reaction field 77 is defined by the second opening 64. Thereby, the magnitude
- the capture film 76 is smaller than the second opening 64, the size of the capture film 76 becomes the size of the reaction field 77 as it is.
- reaction field 77 is preferably arranged at a position away from the bottom surface of the well body 61 on the bottom structure 66 side.
- liquid such as a reagent
- reaction field 77 can be supplied to the reaction field 77 in the liquid storage part 65, and reaction can be performed efficiently.
- fluorescence 93 it is possible to prevent the detection accuracy from being lowered due to noise caused by the bottom surface of the well body 61 on the bottom surface structure 66 side.
- FIG. 7 is a flowchart for explaining the operation of the biochemical test system A. The operation of the biochemical test system A will be described with reference to FIG.
- step S10 preparation for measurement is performed (step S10). Specifically, under the control of the control calculation unit 50, the liquid feeding / conveying unit 30 moves the target test chip 60 to the position 10a of the biochemical test system A (see FIG. 1), and the test chip 60 corresponds to the position 10a. Attach to the rotating body of the stirring device. Then, the cleaning liquid is supplied to the inspection chip 60 by the liquid feeding / conveying unit 30, and the liquid storage unit 65 is cleaned while stirring the liquid in the inspection chip 60 by the vibration unit 10. At this time, when a protective layer is provided on the reaction field 77 for maintaining the capturing ability of the first capturing body for a long time, the protective layer is also removed. Thereafter, the cleaning liquid in the test chip 60 is collected by the liquid feeding / conveying unit 30, and the measurement buffer is newly supplied into the test chip 60.
- the inspection chip 60 is irradiated with excitation light, and an enhancement measurement for specifying the enhancement angle and an optical blank value measurement for measuring the optical blank are performed (step S20).
- the liquid feeding / conveying unit 30 places the target inspection chip 60 at the position 10b (see FIG. 1) of the biochemical inspection system A, and the light projecting unit 10 is connected to the inspection chip.
- the region of the reflective surface 73 corresponding to 60 reaction fields 77 is irradiated with the excitation light 91 while scanning the incident angle ⁇ .
- the detection unit 40 detects the plasmon scattered light 94 emitted from the metal film 75 irradiated with the excitation light 91 to the inside of the inspection chip 60.
- the control calculation unit 50 acquires data including the relationship between the incident angle ⁇ of the excitation light 91 and the intensity of the plasmon scattered light 94, and the incident when the intensity of the plasmon scattered light 94 becomes maximum based on the data.
- the angle ⁇ is specified as the enhancement angle, and is set to the enhancement angle of the incident angle ⁇ of the excitation light 91.
- the enhancement angle is determined on the order of about 0.1 °.
- the light projecting unit 10 irradiates the region of the reflecting surface 73 corresponding to the reaction field 77 of the inspection chip 60 with the excitation light 91 at the incident angle ⁇ set to the enhancement angle.
- the detection unit 40 detects the amount of light having the same wavelength as the fluorescence 93.
- the control calculation unit 50 records the amount of light measured by the detection unit 40 as an optical blank.
- the measurement buffer in the test chip 60 is collected by the liquid feeding / conveying unit 30, and the measurement sample is newly supplied into the test chip 60.
- a sample collected directly from the examinee may be used, or a sample obtained by diluting a sample collected directly from the examinee with a sample dilution solution may be used.
- a primary reaction for binding a substance to be detected present in the specimen to the first capturing body exposed in the reaction field 77 is performed (step S30). Specifically, under the control of the control calculation unit 50, the liquid feeding / conveying unit 30 moves the target test chip 60 to the position 10c (see FIG. 1) of the biochemical test system A, and the test chip 60 corresponds to the position 10c. Attach to the rotating body of the stirring device. Then, the liquid in the inspection chip 60 is agitated by the vibration unit 10. At this time, the substance to be detected present in the sample specifically binds to the first capturing body exposed in the reaction field 77, so that it is captured by the first capturing body and remains in the reaction field 77. Become.
- the measurement sample in the test chip 60 is collected by the liquid feeding / conveying unit 30, and the cleaning liquid is newly supplied into the test chip 60.
- the vibration unit 10 since the liquid in the test chip 60 is continuously stirred by the vibration unit 10, the detection target substance, impurities, etc. adsorbed nonspecifically in the test chip 60 are removed.
- the cleaning liquid in the inspection chip 60 is collected by the liquid feeding / conveying unit 30, and the labeling liquid is newly supplied into the inspection chip 60.
- a secondary reaction for applying a fluorescent label to the detection target substance captured by the first capturing body is performed (step S40). Specifically, under the control of the control calculation unit 50, the liquid feeding / conveying unit 30 moves the target test chip 60 to the position 10d of the biochemical test system A (see FIG. 1), and the test chip 60 corresponds to the position 10d. Attach to the rotating body of the stirring device. Then, the liquid in the inspection chip 60 is agitated by the vibration unit 10.
- the labeling solution includes a fluorescently labeled second capture body, and the second capture body is a substance to be detected at a site different from the site of the substance to be detected that specifically binds to the first capture body.
- the substance to be detected is indirectly fluorescently labeled by specifically binding to the second capturing body.
- the type of the second capturing body is not particularly limited as long as it can specifically bind to the detected substance at a site different from the site of the detected substance that specifically binds to the first capturing body.
- the second capturing body may be a biomolecule specific to the substance to be detected, or a fragment thereof.
- the second capturing body may be composed of one molecule or a complex formed by combining two or more molecules.
- the labeling liquid in the inspection chip 60 is collected by the liquid feeding / conveying unit 30, and the cleaning liquid is newly supplied into the inspection chip 60. .
- the vibration unit 10 since the liquid in the test chip 60 is continuously stirred by the vibration unit 10, secondly, the trapped body, foreign matters, etc. adsorbed nonspecifically in the test chip 60 are removed.
- step S50 fluorescence value measurement for measuring the fluorescence value from the fluorescence-labeled substance to be detected is performed (step S50). Specifically, under the control of the control calculation unit 50, the liquid feeding / conveying unit 30 places the target inspection chip 60 at the position 10e (see FIG. 1) of the biochemical inspection system A, and the light projecting unit 10 is connected to the inspection chip. The region of the reflective surface 73 corresponding to 60 reaction fields 77 is irradiated with the excitation light 91 at an incident angle ⁇ set to an enhancement angle.
- the detection unit 40 detects the amount of light having the same wavelength as the fluorescence 93.
- the control calculation unit 50 records the amount of light measured by the detection unit 40 as a fluorescence value.
- the reaction field 77 is preferably located below the liquid level of the liquid (measuring buffer solution) in the liquid storage unit 65 and at a position away from the liquid level. Therefore, the measurement buffer solution in this step may be supplied in a larger amount than the liquid used in other steps.
- the inspection chip 60 is disposed under the control of the control calculation unit 50, and the control calculation unit 50 correlates with the amount of the substance to be detected by subtracting the optical blank value acquired in step S20 from the acquired fluorescence value.
- the signal value to be calculated is calculated.
- the control calculation unit 50 may further convert the signal value into the amount or concentration of the substance to be detected based on a calibration curve prepared in advance.
- the biochemical examination system A can measure the presence or amount of the substance to be detected in the specimen.
- the incident angle ⁇ of the excitation light 91 is set to the enhancement angle.
- the incident angle ⁇ of the excitation light 91 may be set to the resonance angle instead of the enhancement angle.
- the light projecting unit 10 irradiates the region of the reflective surface 73 corresponding to the reaction field 77 of the inspection chip 60 with the excitation light 91 while scanning the incident angle ⁇ .
- the detection unit 40 detects the amount of reflected light 92.
- the control calculation unit 50 acquires data including the relationship between the incident angle ⁇ of the excitation light 91 and the light amount of the reflected light 92, and based on the data, the incident angle ⁇ when the light amount of the reflected light 92 is minimized. Is determined as the resonance angle, and the incident angle of the excitation light 91 is set as the resonance angle.
- the fluorescent material used for labeling the second capturing body is excited by surface plasmon resonance generated by entering excitation light from a prism.
- the prism is neutralized before measuring the fluorescence emitted from the fluorescent material.
- the prism 71 is neutralized before the fluorescence value measurement performed in step S50.
- the surface plasmon excitation enhanced fluorescence measurement is performed using a detection chip including a metal film that causes surface plasmon resonance by excitation light incident from the prism, and a first capturing body immobilized on the metal film.
- the process S30 corresponds to the first process
- the process S40 corresponds to the second process
- the process S50 corresponds to the third process. It may be done at any time before. In the case of adopting a continuous configuration in which a plurality of inspections are performed almost simultaneously as in the above-described embodiment, it is preferable to perform static elimination of the prisms one after another before fluorescence measurement for each inspection chip.
- the most effective timing for static elimination is before blank measurement. Further, in order to prepare for low concentration signal measurement, it is effective to perform static elimination immediately before fluorescence measurement.
- the method of removing electricity from the prism There is no particular limitation on the method of removing electricity from the prism. For example, a method of applying air to the prism by blowing air, a method of using a static eliminating device, a method of bringing a metal into contact with the prism, a method of bringing an antistatic agent into contact with the prism, etc. Can be mentioned.
- air may be blown to the prism for a few seconds to several minutes in the vicinity of the light incident surface, the light exit surface, and the optical path from the light incident to the light exit.
- a blowing means such as an axial blower or a centrifugal blower.
- the air volume and the air speed when the air is blown to the prism is usually 0.5 to 5.0 m 3 / min, preferably 0.5 to 3.5 m 3 / min.
- the min and wind speed are usually 0.3 to 15 m / s, preferably 1.0 to 5 m / s.
- limiting in the temperature of the air blown, Low temperature, normal temperature, or high temperature may be sufficient.
- a control unit may be provided in the blowing means, and the wind speed, the temperature of the blown air, and the like may be controlled by the control unit.
- the static eliminator for example, a blow type static eliminator, an AC voltage applied static eliminator, a DC static charge eliminator, a nano static eliminator, a DC air gun type static eliminator (all wedges) And the like.
- Examples of the method of bringing the metal into contact with the prism include a method of bringing the metal into contact with the light incident surface, the light exit surface, and the vicinity of the optical path from the incident to the light emission for several seconds to several minutes.
- Examples of the metal include chemically inactive stainless steel (having no active metal ions), metal oxide, and the like.
- Examples of the method of bringing the antistatic agent into contact with the prism include a method of bringing the antistatic agent into contact with the light incident surface, the light exit surface, and the vicinity of the optical path from the incidence to the emission for several seconds to several minutes. it can.
- Examples of the antistatic agent include surfactants, carbon, plastic additives, and sprays.
- the charge removal of the prism is performed by blowing air to the prism, it is effective because dust and the like can be removed at the same time as the charge removal.
- the prism is discharged by a method other than the method of blowing air to the prism, the prism is discharged by a method other than the method of blowing air to the prism, In addition, it is extremely effective since the charge is removed from the prism and dust can be removed by blowing air.
- the conditions for blowing air to the prism after performing a method other than the method of blowing air to the prism are the same as the conditions for blowing air to the prism described above.
- the second embodiment is a surface plasmon excitation enhanced fluorescence measurement method using a diffraction grating coupled SPFS (GC-SPFS) that generates SPR using a diffraction grating.
- GC-SPFS diffraction grating coupled SPFS
- a detection chip, a detection system, and a detection method for detecting a substance to be detected by GC-SPFS will be described.
- FIG. 10 is a schematic diagram showing a configuration of a detection system 300 according to the second embodiment.
- the detection system 300 operates with the detection chip 400 mounted at a predetermined position.
- the detection system 300 includes an excitation light irradiation unit 310, a fluorescence detection unit 320, a liquid feeding unit 130, a vibration unit 140, and a control unit 350.
- the detection chip 400 is irradiated with excitation light ⁇ so that surface plasmon resonance occurs in the diffraction grating 428 (metal film 425) of the detection chip 400, An enhanced electric field based on surface plasmon resonance is generated in the vicinity of the diffraction grating 428. Then, the presence or amount of the substance to be detected in the specimen is measured by exciting the fluorescent substance existing in the reaction field 426 on the diffraction grating 428 by the enhanced electric field and detecting the fluorescence ⁇ emitted from the fluorescent substance.
- the excitation light irradiation unit 310, the fluorescence detection unit 320, the liquid supply unit 130, the vibration unit 140, and the control unit 350 in the second embodiment are respectively the light projecting unit 20, the detection unit 40, and the transmission unit in the first embodiment. It corresponds to the liquid transport unit 30, the vibration unit 10, and the control calculation unit 50.
- the detection system 300 is mainly configured in that the detection chip 400 has a diffraction grating 428 as an optical element, and the excitation light irradiation unit 310 generates SPR by irradiating the diffraction grating 428 with excitation light ⁇ . Different from the embodiment.
- FIG. 11A to 11C are schematic views showing the configuration of the detection chip 400 according to the second embodiment.
- 11A is a perspective view of the detection chip 400
- FIG. 11B is a perspective view of the well body 210
- FIG. 11C is a perspective perspective view of the well body 210.
- FIG. 12 is a schematic diagram showing light incident on the detection chip 400 (excitation light ⁇ ) and light emitted from the detection chip 400 (excitation light reflected light ⁇ ′ and fluorescence ⁇ ).
- FIG. 12 is a cross-sectional view along the height direction of the detection chip 400 and shows a state in which a liquid (for example, a measurement buffer solution) is stored in the storage unit 211.
- FIG. 13 is a partially enlarged sectional view in which the vicinity of the reaction field 426 in the sectional view of FIG. 12 is enlarged.
- the detection chip 400 has a well body 210 and a side wall member 420.
- the well main body 210 is the same as the well main body 61 of the detection chip 60 according to the first embodiment except for the shape.
- the well main body 210 has an accommodating portion (well) 211 therein.
- the accommodating part 211 is a bottomed concave part configured to be able to accommodate a liquid, and is opened to the outside by a first opening 212 provided in the upper part and a second opening 213 provided in the side part.
- the well body 210 is made of a material that is transparent to light (at least the light having the wavelength of the excitation light ⁇ and the light having the wavelength of the fluorescence ⁇ ). However, a part of the well body 210 may be made of a material that is opaque to light as long as it does not interfere with light extraction in the detection method described later. At least a part of the side wall constituting the accommodating portion 211 is light transmissive. In the present embodiment, at least the side wall that faces the reaction field 426 among the four side walls that form the housing portion 211 has light transmittance. Examples of materials that are transparent to light include resin and glass.
- the side wall member 420 includes a substrate 421, a metal film 425, and a reaction field 426.
- the “reaction field” means a region exposed in the accommodating portion 211 through the second opening 213 in the capture region 427 arranged on the metal film 425 (see FIG. 13).
- a diffraction grating 428 as an optical element is formed on at least a part of the surface of the metal film 425 corresponding to the reaction field 426.
- the side wall member 420 has at least a part of the trapping region 427 exposed in the accommodating portion 211 to become a reaction field 426, and the side wall member 420 has the second opening 213. It is fixed to the well body 210 so as to completely block at least a part thereof.
- the substrate 421 is a member for supporting the metal film 425 and closing the second opening 213 of the well body 210.
- the substrate 421 also functions as a side wall that constitutes the housing portion 211.
- the shape and material of the substrate 421 are not particularly limited as long as the above functions can be realized. Examples of the material of the substrate 421 include resin and glass.
- the metal film 425 is disposed on the surface of the substrate 421 on the well body 210 side.
- the diffraction grating 428 as an optical element is formed on the metal film 425.
- the metal film 425 may be formed on the entire surface of the substrate 421 on the well body 210 side, or may be formed on only a part thereof. Further, the diffraction grating 428 may be formed on the entire surface of the metal film 425 on the well body 210 side, or may be formed on only a part thereof.
- the diffraction grating 428 is formed on at least a part of a portion corresponding to the reaction field 426 on the surface of the metal film 425.
- the material of the metal film 425 is not particularly limited as long as it is a metal that causes SPR.
- Examples of the material of the metal film 425 include gold, silver, copper, aluminum, and alloys thereof.
- a method for forming the metal film 425 is not particularly limited. Examples of the method for forming the metal film 425 include sputtering, vapor deposition, and plating.
- the thickness of the metal film 425 is not particularly limited, but is preferably in the range of 30 to 70 nm.
- the diffraction grating 428 generates evanescent light when the metal film 425 is irradiated with light.
- the shape of the diffraction grating 428 is not particularly limited as long as the evanescent light can be generated.
- the diffraction grating 428 may be a one-dimensional diffraction grating as shown in FIG. 14A or a two-dimensional diffraction grating as shown in FIG. 14B.
- a plurality of parallel ridges are formed on the surface of the metal film 425 at a predetermined interval.
- convex portions having a predetermined shape are periodically arranged on the surface of the metal film 425.
- Examples of the arrangement of the convex portions include a square lattice, a triangular (hexagonal) lattice, and the like.
- Examples of the cross-sectional shape of the diffraction grating 428 include a rectangular wave shape, a sine wave shape, a sawtooth shape, and the like.
- the pitch of the diffraction grating is preferably in the range of 100 to 2000 nm from the viewpoint of generating SPR.
- the “pitch of the diffraction grating” refers to the center-to-center distance ⁇ of the projections in the arrangement direction of the projections, as shown in FIGS. 14A and 14B.
- the diffraction grating 428 is arranged so that the arrangement direction of the convex portions is along the depth direction of the accommodating portion 211.
- the formation method of the diffraction grating 428 is not particularly limited.
- the metal film 425 may be provided with an uneven shape.
- the metal film 425 may be formed over the substrate 421 that has been provided with a concavo-convex shape in advance.
- the metal film 425 including the diffraction grating 428 can be formed.
- the reaction field 426 is an area for capturing the substance to be detected, which is exposed in the storage unit 211. As described above, the reaction field 426 means a region exposed in the accommodating portion 211 through the second opening 213 in the trapping region 427 arranged on the metal film 425. In this embodiment, at least a part of the reaction field 426 is located on the diffraction grating 428.
- the reaction field 426 is disposed on the inner side surface of the housing part 211. At this time, the reaction field 426 is preferably arranged at a position away from the deepest part of the housing part 211. With such a configuration, a reaction can be efficiently generated in the reaction field 426 when a sample or the like is introduced into the storage unit 211. In addition, it is possible to suppress noise caused by the bottom of the accommodating portion 211 from being mixed with the detection result when detecting the fluorescence ⁇ .
- the capture region 427 is a region where a first capture body for capturing a substance to be detected is immobilized on the metal film 425.
- the type of the first capturing body is not particularly limited as long as it has a recognition site for specifically binding to the substance to be detected.
- Examples of the first capturing body include an antibody (primary antibody) or a fragment thereof that can specifically bind to the substance to be detected, an enzyme that can specifically bind to the substance to be detected, and the like.
- the detection chip 400 may further include a second storage section that can store a liquid in addition to the storage section 211.
- the detection system 300 includes the excitation light irradiation unit 310, the fluorescence detection unit 320, the liquid feeding unit 130, the vibration unit 140, and the control unit 350 in addition to the detection chip 400 (see FIG. 10).
- the excitation light irradiation unit 310 irradiates the diffraction grating 428 with the excitation light ⁇ via the side wall of the well body 210 and the accommodating portion 211.
- the excitation light irradiation unit 310 uses the diffraction grating 428 so that the incident angle with respect to the diffraction grating 428 (metal film 425) is an angle that causes SPR in the diffraction grating 428. Only the P wave for (metal film 425) is emitted toward the diffraction grating 428.
- the excitation light irradiation unit 310 irradiates the excitation light ⁇ to the diffraction grating 428 so that the plane including the optical axis of the excitation light ⁇ and the optical axis of the reflected light ⁇ ′ is along the arrangement direction of the convex portions of the diffraction grating.
- “Excitation light” is light that directly or indirectly excites a fluorescent substance.
- the excitation light ⁇ is light that causes an enhanced electric field on the diffraction grating 428 to excite the fluorescent material when the diffraction grating 428 is irradiated at an angle at which SPR occurs in the diffraction grating 428.
- the excitation light irradiation unit 310 includes a light source unit 111 and a first angle adjustment unit 112.
- the light source unit 111 emits collimated excitation light ⁇ having a constant wavelength and light amount so that the shape of the irradiation spot in the reaction field 426 (diffraction grating 428) is substantially circular.
- the first angle adjustment unit 112 adjusts the incident angle of the excitation light ⁇ with respect to the reaction field 426 (diffraction grating 428).
- the incident angle of the excitation light ⁇ with respect to the diffraction grating 428 is preferably an angle at which the intensity of the enhanced electric field formed by SPR is the strongest and, as a result, the intensity of the fluorescent ⁇ from the fluorescent substance is the strongest.
- the incident angle of the excitation light ⁇ is appropriately selected according to the pitch ⁇ of the diffraction grating 428, the wavelength of the excitation light ⁇ , the type of metal constituting the metal film 425, and the like.
- the incident angle ⁇ of the excitation light ⁇ is set so as to satisfy the following formula (1).
- k sp is the wave number of plasmon excited at the interface between the two types of media (the interface between the metal film 425 and the liquid in the container 211), and is defined as the following equation (2) Is done.
- ⁇ angular frequency of the excitation light
- ⁇ c speed of light
- the first angle adjustment unit 112 diffracts the optical axis of the excitation light ⁇ . The incident angle is adjusted by rotating the grating 428 relatively.
- the fluorescence detection unit 320 detects the fluorescence ⁇ generated by the irradiation of the excitation light ⁇ to the diffraction grating 428 and transmitted through the housing 211 and the side walls of the well body 210. If necessary, the fluorescence detection unit 320 also detects reflected light ⁇ ′ of the excitation light that is generated by the irradiation of the excitation light ⁇ to the diffraction grating 428 and passes through the side wall of the accommodating portion 211 and the well body 210.
- the fluorescence detection unit 320 includes an optical filter 122, a position switching unit 124, a detection unit 125, and a second angle adjustment unit 326.
- the optical filter 122 guides only the fluorescence component to the detection unit 125 and removes the excitation light component (plasmon scattered light ⁇ ) in order to detect the fluorescence ⁇ with a high S (signal) / N (noise) ratio.
- the optical filter 122 include an excitation light reflection filter, a short wavelength cut filter, and a band pass filter.
- the optical filter 122 is, for example, a filter including a multilayer film that reflects a predetermined light component, or a color glass filter that absorbs a predetermined light component.
- the position switching unit 124 switches the position of the optical filter 122. Specifically, when the detection unit 125 detects the fluorescence ⁇ , the optical filter 122 is disposed on the optical path, and when the detection unit 125 detects the plasmon scattered light ⁇ , the optical filter 122 is disposed outside the optical path.
- the detection unit 125 is a light receiving sensor that detects fluorescence ⁇ and plasmon scattered light ⁇ .
- the detection unit 125 has high sensitivity capable of detecting weak fluorescence ⁇ from a minute amount of a substance to be detected.
- the detection unit 125 is, for example, a photomultiplier tube (PMT) or an avalanche photodiode (APD).
- the fluorescence detection unit 320 may further include a condensing lens in order to expand the detection range of the detection unit 125, but it is preferable not to include the condensing lens from the viewpoint of reducing the background.
- the second angle adjustment unit 326 adjusts the angle of the optical axis of the fluorescence detection unit 320 by relatively rotating the optical axis of the fluorescence detection unit 320 and the diffraction grating 428. For example, the second angle adjustment unit 326 rotates the detection unit 125 around the intersection between the optical axis of the fluorescence detection unit 320 and the metal film 425. When the second angle adjustment unit 326 appropriately adjusts the position of the detection unit 125, the intensity of the fluorescence ⁇ emitted from the reaction field 426 (diffraction grating 428) and transmitted through the side wall of the storage unit 211 and the well body 210 is maximized.
- the fluorescence detection unit 320 can detect the fluorescence ⁇ . Further, when the incident angle of the excitation light ⁇ is adjusted by moving the light source unit 111, the reflected light ⁇ ′ can be detected by moving the detection unit 125 according to the position of the light source unit 111.
- the liquid feeding unit 130 introduces various liquids into the accommodating portion 211 of the detection chip 400.
- the liquid feeding unit 130 removes various liquids from the inside of the housing part 211 of the detection chip 400.
- the liquid feeding unit 130 injects, for example, a specimen, a labeling liquid (hereinafter also referred to as “labeling liquid”) containing a second capturing body labeled with a fluorescent substance, a cleaning liquid, a measurement buffer, and the like. And do suction.
- the liquid feeding unit 130 includes a liquid tip 131, a pipette 132, and a pipette control unit 136.
- the liquid chip 131 is a container for storing a liquid such as a specimen, a labeling liquid, a cleaning liquid, and a measurement buffer.
- a liquid chip 131 a plurality of containers are usually arranged according to the type of liquid, or a chip in which a plurality of containers are integrated is arranged.
- the pipette 132 has a syringe pump 133, a nozzle unit 134 connected to the syringe pump 133, and a pipette tip 135 attached to the tip of the nozzle unit 134.
- the pipette control unit 136 includes a driving device for the syringe pump 133 and a moving device for the nozzle unit 134.
- the drive device of the syringe pump 133 is a device for reciprocating the plunger of the syringe pump 133 and includes, for example, a stepping motor.
- the moving device of the nozzle unit 134 moves the nozzle unit 134 freely in two directions, a vertical direction and a horizontal direction.
- the moving device of the nozzle unit 134 is constituted by, for example, a robot arm, a two-axis stage, or a turntable that can move up and down.
- the pipette controller 136 drives the syringe pump 133 to suck various liquids from the liquid tip 131 into the pipette tip 135. Then, the pipette control unit 136 moves the nozzle unit 134 to insert the pipette tip 135 into the housing portion 211 of the detection chip 200 from the first opening 212 and drives the syringe pump 133 to move the pipette tip 135 inside. The liquid is injected into the container 211. In addition, after the introduction of the liquid, the pipette control unit 136 drives the syringe pump 133 to suck the liquid in the storage unit 211 into the pipette tip 135.
- the first capturing body reacts with the substance to be detected in the reaction field 426 (primary reaction), or the first substance labeled with the substance to be detected and the fluorescent substance is reacted.
- the second capturing body is reacted (secondary reaction).
- the vibration unit 140 vibrates the detection chip 400 in order to agitate the liquid in the storage unit 211. In this way, by vibrating the detection chip 200 and stirring the liquid in the storage unit 211, the primary reaction, the secondary reaction, the cleaning, and the like in the reaction field 426 can be performed efficiently.
- the vibration unit 140 is, for example, a piezoelectric element or an eccentric rotating body.
- the excitation unit 140 is disposed at a position that does not interfere with the optical paths of the excitation light ⁇ , fluorescence ⁇ , and plasmon scattered light ⁇ .
- the direction of vibration applied to the detection chip 400 by the excitation unit 140 is not particularly limited.
- the vibration direction include a horizontal direction, a vertical direction (height direction), and a circumferential direction.
- the reciprocating vibration in the horizontal direction can be applied to the detection chip 400 by driving the piezo element in a state where the piezo element as the vibration unit 140 is in contact with the side surface of the detection chip 400.
- the piezo element while the piezo element is in contact with the bottom surface of the detection chip 400 as the vibration unit 140, it is possible to apply vertical reciprocal vibration to the detection chip 400.
- the detection chip 400 is vibrated at the natural frequency of the detection chip 400 in a state where the liquid is stored in the storage unit 211, or the vibration frequency before and after that. Is preferred.
- the detection chip 400 may be vibrated while sequentially switching different natural frequencies (n-th natural frequency and m-th natural frequency, where n and m are positive integers).
- the control unit 350 controls the light source unit 111, the first angle adjustment unit 112, the position switching unit 124, the detection unit 125, the second angle adjustment unit 326, the pipette control unit 136, and the excitation unit 140.
- the control unit 350 includes, for example, a known computer or microcomputer including an arithmetic device, a control device, a storage device, an input device, and an output device.
- liquid is introduced and removed by the liquid feeding unit 130 and vibration is applied by the vibration unit 140 to the detection chip 400 disposed at a position where the excitation light ⁇ can be irradiated.
- the position of the liquid feeding unit 130 and the vibration unit 140 is not limited to this.
- introduction and removal of the liquid by the liquid feeding unit 130 and application of vibration by the vibration unit 140 are performed, and the detection chip 400 is at the second position.
- the excitation light ⁇ irradiation by the excitation light irradiation unit 310 and the fluorescence ⁇ detection by the fluorescence detection unit 320 may be performed.
- the detection system 300 further includes a transport unit for moving the detection chip 400 to the first position and the second position.
- FIG. 15 is a flowchart illustrating an example of an operation procedure of the detection system 300 when performing the detection method of the present embodiment.
- step S110 preparation for detection is performed (step S110). Specifically, the detection chip 400 is installed at a predetermined position of the detection system 300. In addition, when a humectant is present on the reaction field 426 of the detection chip 400, the inside of the container 211 is washed to remove the humectant on the reaction field 426. Thereafter, the control unit 350 controls the pipette control unit 136 to introduce the measurement buffer into the storage unit 211.
- the incident angle of the excitation light ⁇ with respect to the diffraction grating 428 (metal film 425) of the detection chip 400 is set as the resonance angle (step S120).
- the control unit 350 controls the light source unit 111 and the first angle adjustment unit 112 to scan the incident angle of the excitation light ⁇ with respect to the diffraction grating 428 while irradiating the diffraction light 428 with the excitation light ⁇ . .
- the control unit 350 controls the detection unit 125 and the second angle adjustment unit 326 to detect the reflected light ⁇ ′ of the excitation light.
- the control unit 350 controls the position switching unit 124 to move the optical filter 122 out of the optical path.
- the control unit 350 obtains data including the relationship between the incident angle of the excitation light ⁇ and the intensity of the reflected light ⁇ ′. Then, the control unit 350 analyzes the data and determines an incident angle (resonance angle) at which the intensity of the reflected light ⁇ ′ is minimized. Finally, the control unit 350 controls the first angle adjustment unit 112 to set the incident angle of the excitation light ⁇ to the diffraction grating 428 as the resonance angle.
- the control unit 350 controls the light source unit 111 to irradiate the diffraction grating 428 with the excitation light ⁇ .
- the control unit 350 controls the detection unit 125 and the second angle adjustment unit 326 to detect the amount of background light having the same wavelength as the fluorescence ⁇ .
- the control unit 350 controls the position switching unit 124 to move the optical filter 122 on the optical path.
- the control unit 350 controls the second angle adjustment unit 326 so that the angle of the optical axis of the fluorescence detection unit 320 with respect to the perpendicular of the metal film 425 is an appropriate angle (preferably the fluorescence peak angle in step S160).
- the angle of the optical axis of the fluorescence detection unit 320 with respect to the perpendicular of the metal film 425 may be about twice the incident angle of the excitation light ⁇ with respect to the metal film 425.
- the control unit 350 records the measured amount of background light as a blank value.
- the control unit 350 controls the pipette control unit 136 to remove the measurement buffer solution in the storage unit 211 and introduce the sample into the storage unit 211.
- the control unit 350 controls the vibration unit 140 to vibrate the detection chip 400 and stir the sample in the storage unit 211.
- the control unit 350 controls the pipette control unit 136 to remove the sample in the storage unit 211 and introduce a cleaning liquid into the storage unit 211 to clean the storage unit 211.
- the control unit 350 controls the vibration unit 140 to vibrate the detection chip 400 and stir the cleaning liquid in the storage unit 211.
- the types of the specimen and the substance to be detected There are no particular limitations on the types of the specimen and the substance to be detected.
- the second capturing body labeled with the fluorescent substance is bound to the substance to be detected bound to the first capturing body on the diffraction grating 428 (secondary reaction (step S150)).
- the substance to be detected is indirectly labeled with the fluorescent substance.
- the control unit 350 controls the pipette control unit 136 to remove the cleaning liquid in the storage unit 211 and introduce a labeling liquid containing the second capturing body into the storage unit 211. Further, the control unit 350 controls the vibration unit 140 to vibrate the detection chip 400 and stir the labeling liquid in the storage unit 211.
- control unit 350 controls the pipette control unit 136 to remove the labeling liquid in the storage unit 211 and introduce a cleaning liquid into the storage unit 211 to clean the storage unit 211. Also at this time, the control unit 350 controls the vibration unit 140 to vibrate the detection chip 400 and stir the cleaning liquid in the storage unit 211. Further, the control unit 350 controls the pipette control unit 136 to remove the cleaning liquid in the storage unit 211 and introduce a measurement buffer solution into the storage unit 211. *
- the control unit 350 controls the light source unit 111 to transmit the excitation light ⁇ to the diffraction grating 428 (reaction field 426) via the side wall of the well body 210 and the measurement buffer in the storage unit 211. Irradiate.
- the control unit 350 controls the detection unit 125 and the second angle adjustment unit 326 so that light having the same wavelength as the fluorescence ⁇ (mostly the buffer solution for measurement in the storage unit 211 and the well body 210 The amount of fluorescence ⁇ ) transmitted through the side wall is detected.
- the control unit 350 controls the position switching unit 124 to move the optical filter 122 on the optical path.
- control unit 350 controls the second angle adjustment unit 326 so that the angle of the optical axis of the fluorescence detection unit 320 with respect to the perpendicular of the metal film 425 is an appropriate angle (preferably the fluorescence peak angle).
- the angle of the optical axis of the fluorescence detection unit 320 with respect to the perpendicular of the metal film 425 may be about twice the incident angle of the excitation light ⁇ with respect to the metal film 425.
- the control unit 350 records the measured light amount as a fluorescence value.
- the fluorescence value mainly includes a fluorescence component (signal value) derived from a fluorescent substance that labels the substance to be detected, and an optical blank value. Therefore, the control unit 350 can calculate a signal value correlated with the amount of the substance to be detected by subtracting the optical blank value obtained in step S130 from the fluorescence value obtained in step S160. Then, it is converted into the amount and concentration of the substance to be detected by a calibration curve prepared in advance.
- the presence or amount of the substance to be detected contained in the specimen can be detected.
- the liquid level and the bubbles are detected in order to detect the fluorescence ⁇ without passing through the liquid level of the liquid in the storage unit 211. It is possible to detect the substance to be detected with high reliability while suppressing the influence on the detection result.
- the detection chip that irradiates the diffraction grating 428 with the excitation light ⁇ so that the plane including the optical axis of the excitation light ⁇ and the optical axis of the reflected light ⁇ ′ is along the depth direction of the housing portion 211.
- the detection chip, the detection system, and the detection method according to the present embodiment are not limited to this.
- the detection system according to the present embodiment has a diffraction grating 428 so that the plane including the optical axis of the excitation light ⁇ and the optical axis of the reflected light ⁇ ′ is along the horizontal direction.
- the diffraction grating 428 is arranged so that the arrangement direction of the convex portions is along the horizontal direction, and the fluorescence ⁇ is also emitted along the horizontal direction. Therefore, the light source unit 111 and the detection unit 125 can be disposed at the same height as the detection chip 400.
- the fluorescent light ⁇ can be detected by transmitting the side wall facing the reaction field 426 among the four side walls constituting the housing part 211 and irradiating the excitation light ⁇ .
- the detection chip, the detection system, and the detection method for irradiating the diffraction grating 428 with the excitation light ⁇ from the accommodating portion 211 side have been described.
- the detection chip, the detection system, and the detection method according to the present embodiment are described. Is not limited to this.
- the detection system according to the present embodiment may irradiate the diffraction grating 428 with excitation light ⁇ from the substrate 421 side.
- the diffraction grating 428 when the diffraction grating 428 is irradiated with the excitation light ⁇ from the substrate 421 side, a part of the excitation light ⁇ passes through the metal film 425 and reaches the diffraction grating 428 to generate SPR. Then, the fluorescent substance is excited by the electric field enhanced by the SPR, and the fluorescence ⁇ having directivity in a predetermined direction is emitted. Therefore, although the light source unit 111 and the detection unit 125 can be arranged at the same height as the detection chip 400, the detection chip 400 is located between the light source unit 111 and the detection unit 125. In the example shown in FIGS.
- the diffraction grating 428 is disposed so that the arrangement direction of the convex portions is along the horizontal direction, and the fluorescence ⁇ is also emitted along the horizontal direction.
- the substrate 421 is preferably made of a dielectric that is transparent to the excitation light ⁇ , and the diffraction grating 428 is formed on both surfaces of the metal film 425. It is preferable to be formed. Examples of the material of the substrate 421 include a resin and glass transparent to the excitation light ⁇ .
- the diffraction grating 428 can be formed on both surfaces of the metal film 425 by forming a diffraction grating on the surface of the resin substrate 421 by nanoimprinting using UV resin and forming the metal film 425 thereon.
- the incident angle of the excitation light ⁇ may be set to the resonance angle in step S20, but the incident angle of the excitation light ⁇ is set to the enhancement angle. May be set.
- the incident angle of the excitation light ⁇ is set to an enhancement angle
- the incident angle of the excitation light ⁇ with respect to the metal film 425 is scanned, and the light amount of the plasmon scattered light ⁇ emitted from the diffraction grating 428 is detected by the detection unit 125. . Then, the incident angle of the excitation light ⁇ when the light quantity of the plasmon scattered light ⁇ becomes maximum is determined as the enhancement angle.
- the fluorescent material used for labeling the second capturing body is excited by surface plasmon resonance generated by entering excitation light into the diffraction grating. Then, before measuring the fluorescence emitted from the fluorescent material, the diffraction grating is neutralized.
- the diffraction grating 428 is neutralized before the fluorescence value measurement performed in step S160.
- the method for neutralizing the diffraction grating is the same as that described in the first embodiment.
- the timing for discharging the diffraction grating is the same as the timing for discharging in the first embodiment.
- Example 1 Surface plasmon excitation enhanced fluorescence measurement was performed using the biochemical test system A described above.
- the target inspection chip 60 was moved to the position 10a of the biochemical inspection system A by the liquid feeding / conveying unit 30, and the inspection chip 60 was mounted on the rotating body of the stirring device corresponding to the position 10a.
- the cleaning liquid was supplied to the test chip 60 by the liquid feeding / conveying unit 30, and the liquid storage unit 65 was cleaned while stirring the liquid in the test chip 60 by the vibration unit 10. Thereafter, the cleaning liquid in the test chip 60 was collected by the liquid feeding / conveying unit 30, and a measurement buffer was newly supplied into the test chip 60.
- the prism 71 was neutralized by blowing air using CYSTAT electrostatic WINSTAT BF-XMB.
- the target inspection chip 60 is placed at the position 10 b of the biochemical inspection system A by the liquid feeding / conveying unit 30, and the light projecting unit 10 sets the region of the reflection surface 73 corresponding to the reaction field 77 of the inspection chip 60.
- the excitation light 91 was irradiated while scanning the incident angle ⁇ .
- the detection unit 40 detects the amount of light having the same wavelength as the fluorescence 93.
- the amount of light measured by the detection unit 40 was recorded as an optical blank by the control calculation unit 50. Further, the reflectance of SPR was obtained.
- the measurement buffer in the test chip 60 was collected by the liquid feeding / conveying unit 30, and the measurement sample was newly supplied into the test chip 60.
- the target inspection chip 60 was moved to the position 10c of the biochemical inspection system A by the liquid feeding / conveying unit 30, and the inspection chip 60 was mounted on the rotating body of the stirring device corresponding to the position 10c.
- the liquid in the inspection chip 60 was stirred by the vibration unit 10.
- the measurement specimen in the test chip 60 is collected by the liquid feeding / conveying unit 30, and the cleaning liquid is newly supplied into the test chip 60. .
- the cleaning liquid in the inspection chip 60 was collected by the liquid feeding / conveying unit 30, and the labeling liquid was newly supplied into the inspection chip 60.
- the target inspection chip 60 was moved to the position 10d of the biochemical inspection system A by the liquid feeding / conveying unit 30, and the inspection chip 60 was attached to the rotating body of the stirring device corresponding to the position 10d.
- the liquid in the inspection chip 60 was stirred by the vibration unit 10.
- the second fluorescently labeled capture body present in the labeling solution was bound to the substance to be detected, and the substance to be detected was indirectly fluorescently labeled.
- the labeling liquid in the inspection chip 60 was collected by the liquid feeding / conveying unit 30 and the cleaning liquid was newly supplied into the inspection chip 60 in order to clean the inside of the inspection chip 60.
- the cleaning liquid in the test chip 60 was collected by the liquid feeding / conveying unit 30, and a measurement buffer was newly supplied into the test chip 60.
- the target inspection chip 60 is placed at the position 10e of the biochemical inspection system A by the liquid feeding / conveying unit 30, and the light projecting unit 10 moves to the region of the reflection surface 73 corresponding to the reaction field 77 of the inspection chip 60.
- the excitation light 91 was irradiated while scanning the incident angle ⁇ .
- the detection unit 40 detects the amount of light having the same wavelength as the fluorescence 93.
- the amount of light measured by the detection unit 40 was recorded as a fluorescence value by the control calculation unit 50. Further, the reflectance of SPR was obtained.
- FIG. 18A shows the relationship between the incident angle ⁇ , the fluorescence signal value, and the SPR reflectance in the blank.
- FIG. 18B shows the relationship between the incident angle ⁇ , the fluorescence signal value, and the SPR reflectance in the measured value of the substance to be detected.
- the black line indicates the fluorescence signal value
- the gray line indicates the SPR reflectance.
- FIG. 18C shows the relationship between the incident angle ⁇ , the fluorescence signal value, and the SPR reflectance in the blank.
- FIG. 18D shows the relationship between the incident angle ⁇ , the fluorescence signal value, and the SPR reflectance in the measured value of the substance to be detected.
- the black line indicates the fluorescence signal value
- the gray line indicates the SPR reflectance.
- Example 1 in which the charge removal of the prism 71 and the air blowing to the prism 71 were performed, as shown in FIG. 18A, one peak appeared in the vicinity of 65 ° in the fluorescence signal value in the blank. No peak appeared near °. For this reason, in Example 1, the influence of the blank on the measured value of the substance to be detected is small even outside the vicinity of 65 ° which is the original enhancement angle.
- Comparative Example 1 As shown in FIG. 18C, it is considered that the peak near 58 ° appears in the fluorescence signal value in the blank because of dust or the like adhering to the prism 71.
- Example 1 As shown in FIG. 18 (A), the peak near 58 ° does not appear in the fluorescence signal value in the blank. This is thought to be due to the removal of dust and the like.
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Abstract
本発明は、光学素子に励起光を入射することにより生じる表面プラズモン共鳴により蛍光物質を励起して、前記蛍光物質から放出される蛍光の測定を行う表面プラズモン励起増強蛍光測定において、前記蛍光の測定を行う前に、前記光学素子の除電を行う表面プラズモン励起増強蛍光測定法である。本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定法は、光学ノイズが低く、高感度かつ高精度な分析が可能である。
Description
本発明は、表面プラズモン励起増強蛍光測定法に関し、詳しくは、光学ノイズが低く、高精度、高感度な表面プラズモン励起増強蛍光測定法に関する。
生化学検査において、抗原抗体反応などの生化学反応が利用されている。たとえば、蛍光免疫測定法(Fluoroimmunoassay, FIA)では、抗原などの被検出物質に蛍光物質を含む標識物質を結合させて被検出物質を蛍光標識する。蛍光標識された被検出物質に励起光を照射し、蛍光物質から発せられる蛍光を検出して、その蛍光の強度から被検出物質の量などを特定する。FIAの中で、被検出物質の検出を特に高感度で行うことが可能な方法として表面プラズモン励起増強蛍光測定法(Surface Plasmon-Field Enhanced Fluorescence Spectroscopy, SPFS)が知られている。
SPFSでは、被検出物質と特異的に結合する第1の捕捉体(たとえば1次抗体)を金属膜上に固定して、被検出物質を捕捉するための反応場を形成する。たとえば、ウェル(液体を収容する有底の凹部材)の底面に検査チップを備えたSPFS装置が知られている。この検査チップでは、ウェルは光透過性を有する誘電体部材の上に形成された金属膜上に、貫通孔を有するウェル部材を固定することで形成されており、反応場は、ウェルの底面を構成する金属膜上に配置されている。被検出物質を含む検体をこのウェルに導入することで、金属膜上に固定された反応場を形成する第1の捕捉体に被検出物質を結合させる。次いで、蛍光標識された第2の捕捉体(たとえば2次抗体)をウェルに導入することで、第1の捕捉体に結合した被検出物質に第2の捕捉体をさらに結合させる。つまり、被検出物質を間接的に蛍光標識する。誘電体部材側から金属膜に励起光を照射すると、蛍光物質が、表面プラズモン共鳴(Surface Plasmon Resonance, SPR)により増強された電場により励起されて蛍光を放出する。
SPFSは高感度、高精度であるので、光学ノイズも高く検出してしまう。SPFSで正確なデータを得るためには、ノイズの低減が必須である。
特許文献1には、SPFSにおいてノイズの低減を図る技術として、プラズモン励起センサーと流路天板との間の流路に光学ノイズ吸収剤からなる層を設けたセンサーチップが記載されている。
特許文献1には、SPFSにおいてノイズの低減を図る技術として、プラズモン励起センサーと流路天板との間の流路に光学ノイズ吸収剤からなる層を設けたセンサーチップが記載されている。
特許文献1に記載された技術により、プラズモン発生直後に一定量の光学ノイズを吸収することにより、光学ノイズの絶対量を低減させることができるが、高感度、高精度であるSPFSにおいては、正確なデータを得るために、さらなるノイズの低減が要求される。
本発明は、ノイズが低く、高感度かつ高精度な分析が可能な表面プラズモン励起増強蛍光測定法を提供することを目的とする。
本発明者は、SPFSに使用するプリズムなどの光学素子に付着した埃等が、SPFSにおいて発生するノイズの一因となっているという知見を得て、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定法は、光学素子に励起光を入射することにより生じる表面プラズモン共鳴により蛍光物質を励起して、前記蛍光物質から放出される蛍光の測定を行う表面プラズモン励起増強蛍光測定において、前記蛍光の測定を行う前に、前記光学素子の除電を行う。
前記除電の方法としては、光学素子に送風を行う方法、静電気除去装置を用いる方法、前記光学素子に金属を接触させる方法、および前記プリズムに帯電防止剤を接触させる方法を挙げることができる。
前記表面プラズモン励起増強蛍光測定法においては、前記光学素子の除電を送風以外の方法で行った後、前記光学素子に送風を行うことも好ましい。
前記送風以外の方法としては、静電気除去装置を用いる方法、前記光学素子に金属を接触させる方法、または前記光学素子に帯電防止剤を接触させる方法を挙げることができる。
前記送風以外の方法としては、静電気除去装置を用いる方法、前記光学素子に金属を接触させる方法、または前記光学素子に帯電防止剤を接触させる方法を挙げることができる。
この態様の表面プラズモン励起増強蛍光測定法において、除電をブランク測定の前に行うことが好ましく、さらに蛍光測定の直前にも行うことが好ましい。
前記光学素子としては、プリズムおよび微細な凸部または凹部が周期的に配列されている回折格子を挙げることができる。
前記光学素子としては、プリズムおよび微細な凸部または凹部が周期的に配列されている回折格子を挙げることができる。
本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定法の一態様は、前記表面プラズモン励起増強蛍光測定が、前記プリズムから入射される励起光により表面プラズモン共鳴を生じさせる金属膜と、該金属膜に固定化された第1の捕捉体とを含む検出チップを用いて行われ、前記第1の捕捉体に被検出物質を結合させる第一工程、前記第1の捕捉体に結合した被検出物質に、蛍光物質で標識された第2の捕捉体を結合させる第二工程、および前記金属膜に前記プリズムから励起光を入射し、表面プラズモン共鳴により前記蛍光物質を励起して、前記蛍光物質から放出される蛍光を測定する第三工程を含む。
前記態様の表面プラズモン励起増強蛍光測定法において、例えば前記検出チップは、上部および側部に開口を有する収容部を含むウェル本体と、被検出物質を補足する補足領域を有する側壁部材とを有し、
前記側壁部材は、前記収容部の側部の開口を介して前記補足領域の少なくとも一部が前記収容部内に露出し、かつ前記収容部の側部の開口の少なくとも一部を閉塞するように前記ウェル本体に固定され、
前記側壁部材は、前記プリズムを備え、該プリズムは、光が入射する入射面と、該入射面から入射された光が反射する反射面とを有し、
前記反射面上に前記金属膜が設けられ、
前記金属膜上に前記補足領域が配置され、該補足領域に前記第1の捕捉体が結合されている。
前記側壁部材は、前記収容部の側部の開口を介して前記補足領域の少なくとも一部が前記収容部内に露出し、かつ前記収容部の側部の開口の少なくとも一部を閉塞するように前記ウェル本体に固定され、
前記側壁部材は、前記プリズムを備え、該プリズムは、光が入射する入射面と、該入射面から入射された光が反射する反射面とを有し、
前記反射面上に前記金属膜が設けられ、
前記金属膜上に前記補足領域が配置され、該補足領域に前記第1の捕捉体が結合されている。
本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定法の他の態様は、前記表面プラズモン励起増強蛍光測定が、入射される励起光により表面プラズモン共鳴を生じさせる前記回折格子を有する金属膜と、該金属膜に固定化された第1の捕捉体とを含む検出チップを用いて行われ、
前記第1の捕捉体に被検出物質を結合させる第一工程、
前記第1の捕捉体に結合した被検出物質に、蛍光物質で標識された第2の捕捉体を結合させる第二工程、および
前記金属膜に前記プリズムから励起光を入射し、表面プラズモン共鳴により前記蛍光物質を励起して、前記蛍光物質から放出される蛍光を測定する第三工程を含む。
前記第1の捕捉体に被検出物質を結合させる第一工程、
前記第1の捕捉体に結合した被検出物質に、蛍光物質で標識された第2の捕捉体を結合させる第二工程、および
前記金属膜に前記プリズムから励起光を入射し、表面プラズモン共鳴により前記蛍光物質を励起して、前記蛍光物質から放出される蛍光を測定する第三工程を含む。
前記態様の表面プラズモン励起増強蛍光測定法において、例えば前記検出チップは、上部および側部に開口を有する収容部を含むウェル本体と、被検出物質を補足する補足領域を有する側壁部材とを有し、
前記側壁部材は、前記収容部の側部の開口を介して前記補足領域の少なくとも一部が前記収容部内に露出し、かつ前記収容部の側部の開口の少なくとも一部を閉塞するように前記ウェル本体に固定され、
前記側壁部材は、前記回折格子を有する金属膜を備え、
前記回折格子は、前記収容部の側部の開口を介して前記収容部内に露出し、
前記捕捉領域は前記回折格子上に配置され、前記捕捉領域に前記第1の捕捉体が結合されており、
前記ウェル本体の前記収容部を構成する側壁の少なくとも一部は光透過性を有する。
前記側壁部材は、前記収容部の側部の開口を介して前記補足領域の少なくとも一部が前記収容部内に露出し、かつ前記収容部の側部の開口の少なくとも一部を閉塞するように前記ウェル本体に固定され、
前記側壁部材は、前記回折格子を有する金属膜を備え、
前記回折格子は、前記収容部の側部の開口を介して前記収容部内に露出し、
前記捕捉領域は前記回折格子上に配置され、前記捕捉領域に前記第1の捕捉体が結合されており、
前記ウェル本体の前記収容部を構成する側壁の少なくとも一部は光透過性を有する。
本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置は、光学素子に励起光を入射することにより生じる表面プラズモン共鳴により蛍光物質を励起して、前記蛍光物質から放出される蛍光の測定を行う表面プラズモン励起増強蛍光測定装置であって、前記光学素子の除電を行う除電手段を備える。
本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定法は、光学ノイズが低く、高感度かつ高精度な分析が可能である。
本発明に係る表面プラズモン励起増強蛍光測定法は、光学素子に励起光を入射することにより生じる表面プラズモン共鳴により蛍光物質を励起して、前記蛍光物質から放出される蛍光の測定を行う表面プラズモン励起増強蛍光測定において、前記蛍光の測定を行う前に、前記光学素子の除電を行う。
前記光学素子は、表面プラズモン励起増強蛍光測定において、励起光の入射を受けて表面プラズモン共鳴を発生させる部位であり、以下に説明する第一の実施形態においてはプリズムが、第二の実施形態においては回折格子が前記光学素子に該当する。
以下、図面を参照しながら本発明に係る表面プラズモン励起増強蛍光測定法を実施する形態を説明する。
[第一の実施形態]
第一の実施形態は、生化学検査方法であり、1つの検査を構成する個々のステップをそれぞれ行う複数の測定ユニットが生産ラインに順に並んでおり、検査チップが生産ラインに沿って進行することにより、個々のステップが順に行われ検査が進行していくとともに、複数の検査チップを次々と導入することにより、複数の検査をほぼ同時に行える連続形態を採用している。ただし、本発明は連続形態には限定されない。たとえば、1つの検査を構成する個々のステップを同じ位置で行い、検査の進行が検査チップの進行に依存しない非連続形態を採用することもできる。
[第一の実施形態]
第一の実施形態は、生化学検査方法であり、1つの検査を構成する個々のステップをそれぞれ行う複数の測定ユニットが生産ラインに順に並んでおり、検査チップが生産ラインに沿って進行することにより、個々のステップが順に行われ検査が進行していくとともに、複数の検査チップを次々と導入することにより、複数の検査をほぼ同時に行える連続形態を採用している。ただし、本発明は連続形態には限定されない。たとえば、1つの検査を構成する個々のステップを同じ位置で行い、検査の進行が検査チップの進行に依存しない非連続形態を採用することもできる。
(生化学検査システム)
図1は、本実施形態で使用する生化学検査システムAの構成を示す模式図である。生化学検査システムAは、SPFSを利用した生化学検査を行うシステムである。具体的に、生化学検査システムAは、金属膜上に固定化された第1の捕捉体により被検出物質を捕捉し、第1の捕捉体に捕捉された被検出物質に、蛍光物質により蛍光標識された第2の捕捉体を結合させて被検出物質を蛍光標識する。その後、金属膜に励起光を照射して金属膜近傍において表面プラズモン共鳴に基づく増強電場を発生させ、増強電場によって励起された蛍光物質から放出された蛍光を検出して被検出物質の存在や量を測定する。
図1は、本実施形態で使用する生化学検査システムAの構成を示す模式図である。生化学検査システムAは、SPFSを利用した生化学検査を行うシステムである。具体的に、生化学検査システムAは、金属膜上に固定化された第1の捕捉体により被検出物質を捕捉し、第1の捕捉体に捕捉された被検出物質に、蛍光物質により蛍光標識された第2の捕捉体を結合させて被検出物質を蛍光標識する。その後、金属膜に励起光を照射して金属膜近傍において表面プラズモン共鳴に基づく増強電場を発生させ、増強電場によって励起された蛍光物質から放出された蛍光を検出して被検出物質の存在や量を測定する。
図1に示すように、生化学検査システムAは加振部10と、投光部20と、送液搬送部30と、検出部40とにより、加振部10に配置された検査チップに励起光を照射し、検出部40により、検査チップから出射された蛍光を検出するように構成されている。
(加振部)
加振部10は、検査チップ60a、60cおよび60dに対応する位置10a、10cおよび10dに、回転振動により各検査チップ60a、60cおよび60d内に収容された液体を攪拌する、図示しない攪拌装置をそれぞれ備える。攪拌装置は、励起光、蛍光、プラズモン散乱光等の光路を妨げないように配置され、偏芯した回転体を有する。回転体は検査チップと接触した状態で回転振動を行うことで、検査チップの周方向の回転振動を加えて検査チップ内に収容された液体を攪拌する。ただし、攪拌装置は、偏芯した回転体を有するものに限定されず、検査チップに回転振動を加えることにより検査チップ内に収容された液体を攪拌できるものであればよい。
加振部10は、検査チップ60a、60cおよび60dに対応する位置10a、10cおよび10dに、回転振動により各検査チップ60a、60cおよび60d内に収容された液体を攪拌する、図示しない攪拌装置をそれぞれ備える。攪拌装置は、励起光、蛍光、プラズモン散乱光等の光路を妨げないように配置され、偏芯した回転体を有する。回転体は検査チップと接触した状態で回転振動を行うことで、検査チップの周方向の回転振動を加えて検査チップ内に収容された液体を攪拌する。ただし、攪拌装置は、偏芯した回転体を有するものに限定されず、検査チップに回転振動を加えることにより検査チップ内に収容された液体を攪拌できるものであればよい。
攪拌装置が検査チップ内に収容された液体を攪拌することで、生化学検査における各ステップの反応や洗浄などを効率的に行うことができる。検査チップ内の液体を効率よく攪拌する観点から、攪拌反装置は、液体を収容した検査チップの固有振動数、またはその前後の振動周波数で検査チップに回転振動を加えることが好ましい。また、異なる固有振動数(n次の固有振動数およびm次の固有振動数、nおよびmは正の整数)を順次切り替えながら検査チップに回転振動を加えてもよい。なお、攪拌装置を設ける位置は、前述した位置に限定されず、各ステップの操作内容によって、必要に応じて設置位置もしくは数を変更し、またはすべての検査チップに対応して攪拌装置をそれぞれ設けることも可能である。
(投光部)
投光部20は、光源ユニットと第1角度調整部と(いずれも図示しない)からなり、検査チップに対して励起光を照射する。
投光部20は、光源ユニットと第1角度調整部と(いずれも図示しない)からなり、検査チップに対して励起光を照射する。
光源ユニットは、光源と、ビーム整形光学系と、APC機構と、温度調整機構とからなり、検査チップに励起光を照射する。図2a~cは、検査チップ60の構造を有する模式図である。検査チップ60の構造については後述するが、図2aに示すように、検査チップ60は、ウェル本体61と側壁部材62とからなり、図2bおよびcに示されるように、側壁部材62と隣接するウェル本体61の側壁に、第2開口64が設けられている。図3は、検査チップ60の高さ方向(図2における上下方向)の断面における第2開口64近傍を拡大した部分拡大断面図であり、側壁部材62の構造を示す模式図である。側壁部材62の構造の詳細は後述するが、図3に示すように、側壁部材62は、プリズム71と、金属膜75と、捕捉膜76とからなり、第2開口64において捕捉膜76が露出して反応場77を形成する。
図4は、検査チップ60の横断面を示す図であり、検査チップ60に入射する光と検査チップ60から出射する光とを示す模式図である。図4に示すように、光源ユニットは、波長および光量が一定の励起光91を、検査チップ60のプリズム71に対して、プリズム71の反射面73における照射スポットの形状がほぼ円形となるように照射する。照射スポットの大きさは、反応場77より小さいことが好ましい。
光源の種類は、特に限定されず、例えばレーザーダイオード(LD)である。光源の他の例には、発光ダイオード、水銀灯、その他のレーザー光源が含まれる。光源から照射される光がビームでない場合は、光源から照射される光は、レンズや鏡、スリットなどによりビームに変換される。また、光源から照射される光が単色光でない場合は、光源から照射される光は、回折格子などにより単色光に変換される。さらに、光源から照射される光が直線偏光でない場合は、光源から照射される光は、偏光子などにより直線偏光に変換される。
ビーム整形光学系は、たとえば、コリメーターと、バンドパスフィルターと、直線偏光フィルターと、半波長板と、スリットと、ズーム手段とからなる。ただし、ビーム整形光学系は、これらの一部のみを含むように構成されてもよい。コリメーターは、光源から出射された励起光をコリメートする。バンドパスフィルターは、光源から出射された励起光を中心波長のみの狭帯域光にする。光源から出射された励起光は、若干の波長分布幅を有するからである。直線偏光フィルターは、光源から出射された励起光を完全な直線偏光の光にする。半波長板は、反射面73にP波成分が入射するように、励起光の偏光方向を調整する。スリットおよびズーム手段は、反射面73における照射スポットの形状が所定サイズの円形となるように、励起光のビーム径や輪郭形状等を調整する。
APC機構は、光源の出力が一定となるように光源を制御する。具体的には、APC機構は、励起光から分岐させた光の光量をフォトダイオードなどにより検出し、回帰回路で投入エネルギーを制御して光源の出力を一定に制御する。
温度調整機構は、たとえば、ヒーターやペルチェ素子である。光源から出射される波長およびエネルギーは、温度によって変動することがあるので、温度調整機構は、光源の温度を一定に維持することにより光源から出射される光の波長およびエネルギーを一定に制御する。
第1角度調整部は、励起光91の光軸と検査チップ60とを相対的に回転させて、反射面73に対する励起光91の入射角αを調整する。
たとえば、第1角度調整部は、検査チップ60の高さ方向に沿った軸(図4において紙面と垂直な軸)を中心として、光学ユニットを回動させて入射角αを走査する。これにより、前述した走査によって入射角αが変動したとしても、反射各73における励起光91の照射スポットに位置はほとんど変化せずに維持される。
たとえば、第1角度調整部は、検査チップ60の高さ方向に沿った軸(図4において紙面と垂直な軸)を中心として、光学ユニットを回動させて入射角αを走査する。これにより、前述した走査によって入射角αが変動したとしても、反射各73における励起光91の照射スポットに位置はほとんど変化せずに維持される。
このように、第1角度調整部が励起光91の入射角αを走査することにより、後述する検出部40において増強角が特定される。増強角とは、反射面73に対して励起光91を照射した場合に、反射面73を通過して検査チップ60のウェル本体61側に放出され、励起光91と同一波長のプラズモン散乱光94の光量が最大となるときの入射角たる角度である。増強角は、後述する光学ブランク測定および蛍光値測定時の励起光91の入射角αとして設定される。なお、増強角など励起光91の入射条件は、検査チップ60の設計要素(たとえば、プリズム71の材料や形状、金属膜75の膜厚、励起光91の波長など)や、検査チップ60内に収容される液体の屈折率等によっておおむね決定されるが、プリズム71の形状誤差、検査チップ60内に収容される液体の組成(たとえば、蛍光物質の種類や量など)等により変動することもあることから、検査ごとに最適な増強角を特定することが好ましい。
(検出部)
検出部40は、第1レンズと、光学フィルターと、第2レンズと、位置切替手段と、受光センサーと(いずれも図示せず)からなり、検査チップ60から出射された蛍光93およびプラズモン散乱光94を検出する。
検出部40は、第1レンズと、光学フィルターと、第2レンズと、位置切替手段と、受光センサーと(いずれも図示せず)からなり、検査チップ60から出射された蛍光93およびプラズモン散乱光94を検出する。
第1レンズは、たとえば集光レンズであり、反応場77近傍から出射される光を集光する。第2レンズは、たとえば結像レンズであり、第1レンズで集光された光を受光センサーの受光面に結像させる。第1レンズと第2レンズの間の光路は、ほぼ平行な光路となっている。
光学フィルターは、蛍光93を検出する場合、位置切替部により、第1レンズと第2レンズの間の光路上に配置される。光学フィルターは、たとえば、所定の光成分を反射する多層膜を含むフィルター、または所定の光成分を吸収する色ガラスフィルターであり、第1レンズで集光された光のうち、励起光91やプラズモン散乱光94などの励起光成分を除去し、蛍光93のみを受光センサーに導く。これにより、受光センサーにおいて、高いS(シグナル)/N(ノイズ)比で蛍光93を検出することができる。光学フィルターの例には、励起光反射フィルター、短波長カットフィルターおよびバンドパスフィルターが含まれる。
プラズモン散乱光93を検出する場合、光学フィルターは、第1レンズと第2レンズの間の光路外に配置される。この場合、プラズモン散乱光94の光量が最大となるときの入射角たる増強角が特定される。
位置切替部は、必要に応じて、光学フィルターを、第1レンズと第2レンズの間の光路上に、または同光路外に配置する。具体的には、蛍光93を検出する場合には、光学フィルターを同光路上に配置し、プラズモン散乱光94を検出する場合には、光学フィルターを同光路外に配置する。
受光センサーは、蛍光93やプラズモン散乱光94を検出する。受光センサーは、たとえば、光電子増倍管(PMT)やアバランシェフォトダイオード(APD)などである。ただし、受光センサーは、これらに限定されず、微弱な蛍光93を検出することが可能で、高い感度を有するものであればよい。
また、検出部40は、プラズモン散乱光94を検出する代わりに、励起光91の反射光92を検出するように構成されてもよい。たとえば、上記受光センサーにより、または反射光検出用の受光センサー(たとえばフォトダイオード)を別途設けて、反射光92を検出するように構成されてもよい。この場合、投光部20の第1角度調整部が励起光91の入射角αを走査する際、検出部40においては、増強角の代わりに、共鳴角が特定され、後述する光学ブランク測定および蛍光値測定時の励起光91の入射角αとして設定される。共鳴角とは、反射面73に対して励起光93を照射した場合に、反射面73に反射された励起光91の反射光92の光量が最小となるときの入射角たる角度である。なお、共鳴角は、増強角の極近傍に存在する。
また、投光部20と受光センサーは、検査部60と同じ高さに配置されている。これにより、生化学検査システムの小型化を図ることができる。ただし、投光部20と受光センサーは、必ずしも検査部60と同じ高さに配置されている必要はない。たとえば、ミラーなどを用いて投光部20と受光センサーの位置を自由に変更することも可能である。
(送液搬送部)
送液搬送部30は、送液手段と搬送手段と(いずれも図示せず)からなる。送液手段は、必要に応じて、試薬等の液体を検査チップに供給し、また、検査チップ内に収容された液体を回収する。搬送手段は、必要に応じて、検査チップを移動させて適切な位置に配置する。
送液搬送部30は、送液手段と搬送手段と(いずれも図示せず)からなる。送液手段は、必要に応じて、試薬等の液体を検査チップに供給し、また、検査チップ内に収容された液体を回収する。搬送手段は、必要に応じて、検査チップを移動させて適切な位置に配置する。
送液手段は、試薬チップと、ピペットユニットと、第1移動機構と(いずれも図示せず)からなる。
試薬チップは、検体、検体希釈用液、測定用緩衝液、洗浄液、被検出物質に蛍光標識を付与するための標識液等をそれぞれ収容可能な容器である。検体および被検出物質の種類は特に限定されない。検体の例には、血液、血清、血漿、脳脊髄液、尿、鼻孔液、唾液、精液などの体液および組織抽出液が含まれる。被検出物質の例には、核酸(DNAやRNA)、タンパク質(ポリぺプチド、オリゴペプチドなど)、アミノ酸、糖質、脂質およびこれらの修飾分子が含まれる。検体希釈用液は、たとえばBSA(bovine serum albumin),Antifoam SI、NaN3、CMD(carboxymethyl-dextran)、HAMA(human anti-mouse antibodies)阻害剤、PBST(phosphate buffered saline with Tween 20)からなる。測定用緩衝液は、たとえばBSA、Antifoam SI、NaN3、PBSTからなる。標識液は、たとえば蛍光物質により標識された2次抗体とPBSTとからなる。また、試薬チップは通常、複数の容器が液体の種類に応じて配置されるか、または複数の容器が一体化されている。
試薬チップは、検体、検体希釈用液、測定用緩衝液、洗浄液、被検出物質に蛍光標識を付与するための標識液等をそれぞれ収容可能な容器である。検体および被検出物質の種類は特に限定されない。検体の例には、血液、血清、血漿、脳脊髄液、尿、鼻孔液、唾液、精液などの体液および組織抽出液が含まれる。被検出物質の例には、核酸(DNAやRNA)、タンパク質(ポリぺプチド、オリゴペプチドなど)、アミノ酸、糖質、脂質およびこれらの修飾分子が含まれる。検体希釈用液は、たとえばBSA(bovine serum albumin),Antifoam SI、NaN3、CMD(carboxymethyl-dextran)、HAMA(human anti-mouse antibodies)阻害剤、PBST(phosphate buffered saline with Tween 20)からなる。測定用緩衝液は、たとえばBSA、Antifoam SI、NaN3、PBSTからなる。標識液は、たとえば蛍光物質により標識された2次抗体とPBSTとからなる。また、試薬チップは通常、複数の容器が液体の種類に応じて配置されるか、または複数の容器が一体化されている。
ピペットユニットは、シリンジポンプとノズルとからなる。シリンジポンプは、シリンジと、シリンジ内を往復運動可能なプランジャーと、駆動機構とからなり、プランジャーの往復運動により液体を定量的に吸引または吐出する。駆動機構は、プランジャーを往復運動させるための手段であり、たとえばステッピングモーターからなる。ノズルの一旦はシリンジポンプと接続されている。シリンジポンプと接続しないシリンジの他端には、ピペットチップが装着されている。ただし、ピペットチップを使用せずに、試薬等の液体をノズルにより検査チップ内に直接供給し、または検査チップ内に収容された液体をノズルにより直接回収することも可能である。
第1移動機構は、ノズルを移動させて所定の位置に配置する。たとえば、第1移動機構は、ノズルを垂直方向と水平方向との二方向に自在に移動させる。第1移動機構の例には、ロボットアームと、2軸ステージまたは上下動自在なターンテーブルとからなるものが含まれる。
搬送手段は、検査チップ保持部と、第2移動機構(いずれも図示せず)からなる。
検査チップ保持部は、検査チップ60を保持するためのものであり、第2移動機構に固定され、または着脱自在に構成されている。第2移動機構は、検査チップ保持部を移動させることによって、検査チップ保持部に保持された検査チップ60を、検査を構成する個々のステップをそれぞれ行う各測定ユニットに対応する位置10a~10eなど、必要に応じて適切な位置に配置する。第2移動機構の例には、コンベアや回転ステージが含まれる。ただし、複数の検査をほぼ同時に行える連続形態を採用せず、1つの検査を構成する個々のステップを同じ位置で行う非連続形態を選択する場合は、第2移動機構を設ける必要はない。たとえば、第2移動機構を省略し、検査チップ保持部のみを設けて検査チップ60を保持するように構成してもよい。また、連続形態を選択する場合でも、検査の進行に応じて検査チップ60を移動させる必要がなければ、1つの検査を構成する個々のステップをそれぞれ行う各測定ユニットに対応して複数の検査チップ60を設け、1つの測定ユニットにおける作業が完了したら、検査チップ60を移動させるのではなく、検査チップ60内の試薬等の液体を送液手段等により次の測定ユニットに対応する検査チップ60内に移し替えることが可能である。この場合も、第2移動機構を省略し、検査チップ保持部のみを設けて各検査チップ60を保持するように構成してもよい。
検査チップ保持部は、検査チップ60を保持するためのものであり、第2移動機構に固定され、または着脱自在に構成されている。第2移動機構は、検査チップ保持部を移動させることによって、検査チップ保持部に保持された検査チップ60を、検査を構成する個々のステップをそれぞれ行う各測定ユニットに対応する位置10a~10eなど、必要に応じて適切な位置に配置する。第2移動機構の例には、コンベアや回転ステージが含まれる。ただし、複数の検査をほぼ同時に行える連続形態を採用せず、1つの検査を構成する個々のステップを同じ位置で行う非連続形態を選択する場合は、第2移動機構を設ける必要はない。たとえば、第2移動機構を省略し、検査チップ保持部のみを設けて検査チップ60を保持するように構成してもよい。また、連続形態を選択する場合でも、検査の進行に応じて検査チップ60を移動させる必要がなければ、1つの検査を構成する個々のステップをそれぞれ行う各測定ユニットに対応して複数の検査チップ60を設け、1つの測定ユニットにおける作業が完了したら、検査チップ60を移動させるのではなく、検査チップ60内の試薬等の液体を送液手段等により次の測定ユニットに対応する検査チップ60内に移し替えることが可能である。この場合も、第2移動機構を省略し、検査チップ保持部のみを設けて各検査チップ60を保持するように構成してもよい。
(制御演算部)
図5は、制御演算部50のブロック図である。制御演算部50は、図5に示すように、CPU51と、投光制御部52と、送液駆動制御部53と、送液移動制御部54と、搬送制御部55と、検出制御部56と、演算部57とからなる。
図5は、制御演算部50のブロック図である。制御演算部50は、図5に示すように、CPU51と、投光制御部52と、送液駆動制御部53と、送液移動制御部54と、搬送制御部55と、検出制御部56と、演算部57とからなる。
CPU51は、測定全体の制御を行い、必要に応じて後述する各制御部または演算部を作動させる。投光制御部52は、投光部20の制御を行い、励起光を所定の位置に照射する。送液駆動制御部53は、送液搬送部30の送液手段のピペットユニットの制御を行い、所定の液体を所定量で吸引または吐出する。送液移動制御部54は、送液搬送部30の送液手段の第1移動機構の制御を行い、ノズルを所定の位置に配置する。搬送制御部55は、送液搬送部30の搬送手段の制御を行い、必要に応じて検査チップを適切な位置に配置する。検出制御部56は、検出部4の制御を行い、必要に応じてプラズモン散乱光または蛍光の検出を行う。演算部57は、プラズモン散乱光の光量に基づいて増強角を特定し、蛍光の光量に基づいて被検出物質の濃度の算出などの定量的計測を行い、またその他データの補正処理等を行う。
(検査チップ)
図2a~cは、検査チップ60の構造を示す模式図である。図2aは、検査チップ60の斜視図である。図2aに示すように、検査チップ60はウェル本体61と側壁部材62とからなる。ウェル本体61は、液体を収容可能な有底の構造である。
図2a~cは、検査チップ60の構造を示す模式図である。図2aは、検査チップ60の斜視図である。図2aに示すように、検査チップ60はウェル本体61と側壁部材62とからなる。ウェル本体61は、液体を収容可能な有底の構造である。
(ウェル本体)
図2bは、ウェル本体61の斜視図であり、図2cは、ウェル本体61の斜視透視図である。図2bおよび2cに示すように、ウェル本体61は、一方端に第1開口63を有し、側壁部材62と隣接する側壁に第2開口64を有し、第1開口63とは反対する側の側面端に底面構造66を有する。また、ウェル本体61は、側壁部材62が配置された側の外壁が、側壁部材62の幅に合わせて水平に削られ、底面構造66により底面端が閉塞されている略円筒である。第1開口63および第2開口64と接続しているウェル本体61内部の空間は、試薬等の液体を収容する液体収容部65となる。ただし、ウェル本体61の形状は円筒に限定されず、たとえば横断面が正方形の角筒、または横断面が非対称の形状を有するものであってもよい。特に、ウェル本体61が縦に長い形状を呈する場合、被検出物質の検出精度の更なる向上と、安定して且つ効率的な攪拌とを同時に実現する効果が顕著である。また、側壁部材62が配置された側のウェル本体61の外壁の形状も、側壁部材62を固定できればよく、平面に限定されることはない。
図2bは、ウェル本体61の斜視図であり、図2cは、ウェル本体61の斜視透視図である。図2bおよび2cに示すように、ウェル本体61は、一方端に第1開口63を有し、側壁部材62と隣接する側壁に第2開口64を有し、第1開口63とは反対する側の側面端に底面構造66を有する。また、ウェル本体61は、側壁部材62が配置された側の外壁が、側壁部材62の幅に合わせて水平に削られ、底面構造66により底面端が閉塞されている略円筒である。第1開口63および第2開口64と接続しているウェル本体61内部の空間は、試薬等の液体を収容する液体収容部65となる。ただし、ウェル本体61の形状は円筒に限定されず、たとえば横断面が正方形の角筒、または横断面が非対称の形状を有するものであってもよい。特に、ウェル本体61が縦に長い形状を呈する場合、被検出物質の検出精度の更なる向上と、安定して且つ効率的な攪拌とを同時に実現する効果が顕著である。また、側壁部材62が配置された側のウェル本体61の外壁の形状も、側壁部材62を固定できればよく、平面に限定されることはない。
ウェル本体61は、励起光91の波長を有する光および蛍光93の波長を有する光に対して透明な材料で形成されており、たとえば樹脂またはガラスで形成されている。ただし、後述する検査方法における測定を妨げない限り、ウェル本体61の一部を、励起光91の波長を有する光および蛍光93の波長を有する光に対して不透明な材料で形成してもよい。
底面構造66は、先端66aが側壁部材62側に偏っている曲面となっている。図4は、検査チップ60を第1開口63側から見たときの模式図である。図4に示すように、先端66aは、ウェル本体61の横断面の対称中心cではなく、対称中心cから側壁部材62側に偏った先端位置xに位置する。先端位置xと、試薬等の液体を収容した状態での検査チップ60の重心(以下、単に「検査チップ60の重心」という)G2とは、検査チップ60の長さ方向において同じ軸上に位置する。図6は、攪拌装置の回転体99に設置された検査チップ60の円運動を説明するための模式図である。図6の上方は、検査チップ60内の液体を攪拌する際、攪拌装置の回転体99に設置された検査チップ60の側面図を示す。図6の下方は、検査チップ60内の液体を攪拌する際、検査チップ60を第1開口63側から見たときの模式図を示す。図6に示すように、検査チップ60と回転体99とは、円端66aで接触していることから、先端66aを、検査チップ60の重心G2が存在する検査チップ60の長さ方向の軸上に配置することにより、図6の下方に示すように、検査チップ60の重心G2と先端66aとは、同じ運動軌道で円運動を行うこととなり、検査チップ60は、回転体99の円運動に連れて安定した円運動を行うことが可能となる。なお、図6の下方においては、表記の便宜上、検査チップ60を直線で表記しており、検査チップ60の重心および先端66aの運動軌道をそれぞれ破線で表記している。
以上のように、検査チップ60が安定した円運動を行うことが可能となれば、検査チップ60が攪拌装置から転落することがなくなり、円運動により、検査チップ60内に収容された試薬等の液体を効率よく攪拌し、試薬等を後述する反応場に十分に供給することができる。
ただし、底面構造66は、曲面に限定されず、たとえば、先端位置xに先端を有する角錐、または先端位置xに突出部を有する平面であってもよい。すなわち、底面構造66は、先端位置xにおいて攪拌装置の回転体99と接触して円運動を受けるように構成されていればよい。また、回転体99に装着した際の安定性の観点から、底面構造66は、接触する回転体99の面と同じ形状であることが好ましい。
また、実施形態において、先端位置xと、検査チップ60の重心G2とは、検査チップ60の長さ方向において同じ軸上に位置しているが、先端位置xは、これに限定されず、ウェル本体61の横断面の中心位置(本実施形態においては対称中心c)から、側壁部材62側に偏っていればよい。たとえば、側壁部材62の重さ等により、先端位置xと、検査チップ60の重心G2とを、検査チップ60の長さ方向において同じ軸上に配置することが、検査チップ60の構造上不可能な場合もある。その場合、先端位置xと、検査チップ60の重心G2とは、必ずしも検査チップ60の長さ方向において同じ軸上に位置する必要はなく、先端位置xを、側壁部材62側に偏るように配置すれば、検査チップ60の円運動を安定させて検査チップ60内に収容された試薬等の液体を効率よく攪拌する効果が得られる。
また、前述したとおり、検査チップ60の重心とは、正確には試薬等の液体を収容した状態での検査チップ60の重心であるが、製造等の便宜上、検査チップ60の重心を検査チップ60自体の重心とすることも可能である。
また、本実施形態において、検査チップ60としては、前述したとおり、ウェル61が、先端66aが側壁部材62側に偏っている底面構造66を有するものを使用しているが、本発明はこれに限定されない。たとえば、ウェル本体61は、先端66aがウェル本体61の横断面の対称中心cに位置するように構成されてもよい。
(側壁部材)
図3は、検査チップ60の高さ方向(図2における上下方向)の断面における第2開口64近傍を拡大した部分拡大断面図であり、側壁部材62の構造を示す模式図である。図3に示すように、側壁部材62は、プリズム71と、金属膜75と、捕捉膜76とからなり、第2開口64において捕捉膜76が露出して反応場77を形成する。側壁部材62は、検査チップ60内に収容された試薬等の液体が漏洩することなく第2開口64を閉塞できるように、図示されていない接着層を介してウェル本体61に接着されている。ただし、側壁部材62は、接着層を使用せずに、レーザー溶着、超音波溶着、クランプ部材を用いた圧着などによりウェル本体61と接合されていてもよい。
図3は、検査チップ60の高さ方向(図2における上下方向)の断面における第2開口64近傍を拡大した部分拡大断面図であり、側壁部材62の構造を示す模式図である。図3に示すように、側壁部材62は、プリズム71と、金属膜75と、捕捉膜76とからなり、第2開口64において捕捉膜76が露出して反応場77を形成する。側壁部材62は、検査チップ60内に収容された試薬等の液体が漏洩することなく第2開口64を閉塞できるように、図示されていない接着層を介してウェル本体61に接着されている。ただし、側壁部材62は、接着層を使用せずに、レーザー溶着、超音波溶着、クランプ部材を用いた圧着などによりウェル本体61と接合されていてもよい。
プリズム71は、励起光91に対して透明な誘導体からなる光学素子であり、複屈折特性を少なからず有する。プリズム71の材料の例には、樹脂およびガラスが含まれ、好ましくは、屈折率が1.4~1.6であり、且つ複屈折が小さい樹脂である。
図4は、検査チップ60を第1開口63側から見たときの模式図であり、検査チップ60に入射する光と検査チップ60から出射する光とを示す模式図である。図4に示すように、プリズム71は、台形を底面とする柱体であり、台形の一方の底面に対応する面が反射面73で、一方の脚に対応する面が入射面74である。投光部20から出射された励起光91は、入射面72に入射される。プリズム71は、入射面72を通過してプリズム71の内部に入射した光が反射面73で反射し、反射面73で反射された反射光92が出射面74を通過してプリズム71の外部に出射するように構成されている。ただし、プリズム71の形状は、台形を底面とする柱体に限定されず、たとえば、三角柱または半円柱であってもよい。また、平面であることが好ましい。
また、励起光91の光源がレーダーダイオード(LD)である場合、励起光91がLDに戻ると、LDの励起状態が乱されてしまい、励起光91の波長や出力が変動してしまうので、入射面72は、励起光91が投光部20に戻らないように形成されており、励起光91が入射面72に垂直に入射しないように反射面73との角度が設定される。本実施形態において、入射面72と反射面73との角度、および、反射面73と出射面74との角度は、いずれも約80°である。
金属膜75は、プリズム71の反射面73上に形成されている。金属膜75の材料は、表面プラズモン共鳴を生じさせうる金属であれば特に制限されない。金属膜75の材料の例には、金、銀、銅、アルミニウムおよびこれらの合金が含まれる。金属膜75の形成方法は、特に限定されない。金属膜75の形成方法の例には、スパッタリング、蒸着、めっきが含まれる。金属膜75の厚みは、特に限定されないが、30~70nmの範囲内であることが好ましい。
捕捉膜76は、金属膜75上において、被検出物質と特異的に結合する第1の捕捉体が固定化される領域である。第1の捕捉体の種類は、被検出物質との特異的に結合可能なものであれば特に限定されない。第1の捕捉体の例には、被検出物質と特異的に結合可能な抗体(1次抗体)またはその断片、核酸、酵素などが含まれる。
反応場77は、第2開口64においてウェル本体61の液体収容部65に露出している捕捉膜76の領域である。反応場77において、金属膜75上に固定化され、捕捉膜76を形成する第1の捕捉体は、検体中に存在する被検出物質と特異的に結合することにより被検出物質を選択的に捕捉する。検出精度の観点からは、反応場77が形成される面、すなわち、本実施例においては、反応場77には対応する金属膜75の領域の面は、平面であることが好ましい。また、反応場77の上に、第1の捕捉体の捕捉能力を長時間維持するための保護層を設けてもよい。
反応場77の大きさは特に制限されない。捕捉膜76が第2開口64を閉塞できる大きさである場合、反応場77の大きさは第2開口64により規定される。これにより、反応場77の大きさを高精度且つ容易に調整することができる。一方、捕捉膜76が第2開口64よりも小さい場合、捕捉膜76の大きさがそのまま反応場77の大きさとなる。
また、反応場77は、ウェル本体61の底面構造66側の底面から離れた位置の配置されることが好ましい。これにより、液体収容部65内に試薬等の液体を反応場77に供給し反応を効率よく行うことができる。また、蛍光93を検出する際、ウェル本体61の底面構造66側の底面に起因するノイズによって検出精度が低下してしまうことを防止することもできる。
(生化学検査システムの動作)
図7は、生化学検査システムAの動作を説明するためのフローチャートである。図7を用いて生化学検査システムAの動作を説明する。
図7は、生化学検査システムAの動作を説明するためのフローチャートである。図7を用いて生化学検査システムAの動作を説明する。
まず、測定の準備を行う(工程S10)。具体的に、制御演算部50の制御により、送液搬送部30が対象の検査チップ60を生化学検査システムAの位置10a(図1参照)に移動させ、検査チップ60を位置10aに対応する攪拌装置の回転体に装着する。そして、送液搬送部30により洗浄液が検査チップ60に供給され、加振部10により検査チップ60内の液体を攪拌しながら液体収容部65内の洗浄を行う。この際、反応場77上に第1の捕捉体の捕捉能力を長時間維持するための保護層が設けられている場合、保護層も除去される。その後、送液搬送部30により、検査チップ60内の洗浄液が回収され、測定用緩衝液が検査チップ60内に新たに供給される。
次に、励起光を検査チップ60に照射して、増強角を特定するための増強測定および光学ブランクを測定するための光学ブランク値測定を行う(工程S20)。具体的には、制御演算部50の制御により、送液搬送部30が対象の検査チップ60を生化学検査システムAの位置10b(図1参照)に配置し、投光部10が、検査チップ60の反応場77に対応する反射面73の領域に、入射角αを走査しながら励起光91を照射する。それと同時に、検出部40は、励起光91に照射された金属膜75から検査チップ60の内部側に放出されたプラズモン散乱光94を検出する。制御演算部50は、励起光91の入射角αとプラズモン散乱光94の強度との関係を含むデータを取得し、同データに基づいて、プラズモン散乱光94の強度が最大となったときの入射角αを増強角として特定し、励起光91の入射角αの増強角に設定する。また、増強角は、0.1°程度のオーダーで決定される。
その後、制御演算部50の制御により、投光部10は、検査チップ60の反応場77に対応する反射面73の領域に、増強角に設定された入射角αで励起光91を照射する。それと同時に、検出部40は、蛍光93と同じ波長の光の光量を検出する。制御演算部50は、検出部40により測定された光の光量を光学ブランクとして記録する。
その後、送液搬送部30により、検査チップ60内の測定用緩衝液が回収され、測定用検体が検査チップ60内に新たに供給される。なお、測定用検体としては、受検者から直接採取した検体を使用してもよいし、受検者から直接採取した検体を、検体希釈用液で希釈されたものを使用してもよい。
次に、反応場77に露出している第1の捕捉体に、検体中に存在する被検出物質を結合させるための1次反応を行う(工程S30)。具体的には、制御演算部50の制御により、送液搬送部30が対象の検査チップ60を生化学検査システムAの位置10c(図1参照)に移動させ、検査チップ60を位置10cに対応する攪拌装置の回転体に装着する。そして、加振部10により検査チップ60内の液体を攪拌する。この際、検体中に存在する被検出物質は、反応場77に露出している第1の捕捉体と特異的に結合するので、第1の捕捉体に捕捉され、反応場77に留まることとなる。
反応に十分な時間が経過した後、検査チップ60内を洗浄するために、送液搬送部30により、検査チップ60内の測定用検体が回収され、洗浄液が検査チップ60内に新たに供給される。この際、加振部10により、検査チップ60内の液体を攪拌し続けるので、検査チップ60内に非特異的に吸着した被検出物質や夾雑物等が除去される。
その後、送液搬送部30により、検査チップ60内の洗浄液が回収され、標識液が検査チップ60内に新たに供給される。
次に、第1の捕捉体に捕捉された被検出物質に、蛍光標識を付与するための2次反応を行う(工程S40)。具体的には、制御演算部50の制御により、送液搬送部30が対象の検査チップ60を生化学検査システムAの位置10d(図1参照)に移動させ、検査チップ60を位置10dに対応する攪拌装置の回転体に装着する。そして、加振部10により検査チップ60内の液体を攪拌する。標識液には、蛍光標識された第2の捕捉体が存在し、第2の捕捉体は、第1の捕捉体と特異的に結合する被検出物質の部位とは異なる部位にて被検出物質と特異的に結合するので、被検出物質は、第2の捕捉体と特異的に結合することにより間接的に蛍光標識されることとなる。なお、第2の捕捉体の種類は、第1の捕捉体と特異的に結合する被検出物質の部位とは異なる部位にて被検出物質と特異的に結合できるものであれば特に限定されない。たとえば、第2の捕捉体は、被検出物質に特異的な生体分子であってもよいし、その断片等であってもよい。また、第2の捕捉体は、1分子からなるものであってもよく、2以上の分子が結合してなる複合体であってもよい。
次に、第1の捕捉体に捕捉された被検出物質に、蛍光標識を付与するための2次反応を行う(工程S40)。具体的には、制御演算部50の制御により、送液搬送部30が対象の検査チップ60を生化学検査システムAの位置10d(図1参照)に移動させ、検査チップ60を位置10dに対応する攪拌装置の回転体に装着する。そして、加振部10により検査チップ60内の液体を攪拌する。標識液には、蛍光標識された第2の捕捉体が存在し、第2の捕捉体は、第1の捕捉体と特異的に結合する被検出物質の部位とは異なる部位にて被検出物質と特異的に結合するので、被検出物質は、第2の捕捉体と特異的に結合することにより間接的に蛍光標識されることとなる。なお、第2の捕捉体の種類は、第1の捕捉体と特異的に結合する被検出物質の部位とは異なる部位にて被検出物質と特異的に結合できるものであれば特に限定されない。たとえば、第2の捕捉体は、被検出物質に特異的な生体分子であってもよいし、その断片等であってもよい。また、第2の捕捉体は、1分子からなるものであってもよく、2以上の分子が結合してなる複合体であってもよい。
反応に十分な時間が経過した後、検査チップ60内を洗浄するために、送液搬送部30により、検査チップ60内の標識液が回収され、洗浄液が検査チップ60内に新たに供給される。この際、加振部10により検査チップ60内の液体を攪拌し続けるので、検査チップ60内に非特異的に吸着した第2に捕捉体や夾雑物等が除去される。
その後、送液搬送部30により、検査チップ60内の洗浄液が回収され、測定用緩衝液が検査チップ60内に新たに供給される。
次に、蛍光標識された被検出物質からの蛍光値を測定するための蛍光値測定を行う(工程S50)。具体的には、制御演算部50の制御により、送液搬送部30が対象の検査チップ60を生化学検査システムAの位置10e(図1参照)に配置し、投光部10が、検査チップ60の反応場77に対応する反射面73の領域に、増強角に設定された入射角αで励起光91を照射する。それと同時に、検出部40は、蛍光93と同じ波長の光の光量を検出する。制御演算部50は、検出部40により測定された光の光量を蛍光値として記録する。この際、液体収容部65内の液体(測定用緩衝液)の液面と反応場77の位置とが接近していると、液面で反射または屈折した蛍光までも検出部40により検出されてしまうおそれがあるので、検出精度の観点から、反応場77は、液体収容部65内の液体(測定用緩衝液)の液面以下で、且つ液面から離れた位置に位置することが好ましい。そのため、本工程における測定用緩衝液は、他工程において使用される液体よりも量が多く供給されてもよい。
次に、蛍光標識された被検出物質からの蛍光値を測定するための蛍光値測定を行う(工程S50)。具体的には、制御演算部50の制御により、送液搬送部30が対象の検査チップ60を生化学検査システムAの位置10e(図1参照)に配置し、投光部10が、検査チップ60の反応場77に対応する反射面73の領域に、増強角に設定された入射角αで励起光91を照射する。それと同時に、検出部40は、蛍光93と同じ波長の光の光量を検出する。制御演算部50は、検出部40により測定された光の光量を蛍光値として記録する。この際、液体収容部65内の液体(測定用緩衝液)の液面と反応場77の位置とが接近していると、液面で反射または屈折した蛍光までも検出部40により検出されてしまうおそれがあるので、検出精度の観点から、反応場77は、液体収容部65内の液体(測定用緩衝液)の液面以下で、且つ液面から離れた位置に位置することが好ましい。そのため、本工程における測定用緩衝液は、他工程において使用される液体よりも量が多く供給されてもよい。
その後、制御演算部50の制御により検査チップ60が処分されるとともに、制御演算部50は、取得した蛍光値から、工程S20で取得した光学ブランク値を引くことで、被検出物質の量に相関するシグナル値を算出する。また、制御演算部50は、予め作成しておいた検量線に基づいて、同シグナル値を、被検出物質の量や濃度などに更に換算してもよい。
その後、検査が終了する。以上各工程により、生化学検査システムAは、検体中の被検出物質の存在または量を測定することができる。
なお、上記工程S20では、励起光91の入射角αを増強角に設定したが、増強角の代わりに、励起光91の入射角αを共鳴角に設定してもよい。この場合、工程S20において、投光部10は、検査チップ60の反応場77に対応する反射面73の領域に、入射角αを走査しながら励起光91を照射する。それと同時に、検出部40は、反射光92の光量を検出する。制御演算部50は、励起光91の入射角αと反射光92の光量との関係を含むデータを取得し、同データに基づいて、反射光92の光量が最小となったときの入射角αを共鳴角として特定し、励起光91の入射角を共鳴角に設定する。
なお、上記工程S20では、励起光91の入射角αを増強角に設定したが、増強角の代わりに、励起光91の入射角αを共鳴角に設定してもよい。この場合、工程S20において、投光部10は、検査チップ60の反応場77に対応する反射面73の領域に、入射角αを走査しながら励起光91を照射する。それと同時に、検出部40は、反射光92の光量を検出する。制御演算部50は、励起光91の入射角αと反射光92の光量との関係を含むデータを取得し、同データに基づいて、反射光92の光量が最小となったときの入射角αを共鳴角として特定し、励起光91の入射角を共鳴角に設定する。
本発明に係る表面プラズモン励起増強蛍光測定法における第一の実施形態では、プリズムから励起光を入射することにより生じる表面プラズモン共鳴により、第2の捕捉体の標識に用いられた蛍光物質を励起して、この蛍光物質から放出される蛍光の測定を行う前に、前記プリズムの除電を行う。上記の本実施形態においては、工程S50で行われる蛍光値測定の前に、プリズム71の除電を行う。このようにプリズムの除電を行うことにより、プリズムに付着していた埃等が除去され、蛍光の測定においてプリズムに付着した埃等に起因する光学ノイズが低減されることにより、高感度かつ高精度な表面プラズモン励起増強蛍光測定分析が可能になる。プリズムの除電を行うタイミングは、前記蛍光の測定を行う前であれば特に制限はない。
たとえば、表面プラズモン励起増強蛍光測定が、前記プリズムから入射される励起光により表面プラズモン共鳴を生じさせる金属膜と、該金属膜に固定化された第1の捕捉体とを含む検出チップを用いて行われ、前記第1の捕捉体に被検出物質を結合させる第一工程、前記第1リガンドに結合した被検出物質に、蛍光物質で標識された第2の捕捉体を結合させる第二工程、および前記金属膜に前記プリズムから励起光を入射し、表面プラズモン共鳴により前記蛍光物質を励起して、前記蛍光物質から放出される蛍光を測定する第三工程を含む場合、プリズムの除電を行うタイミングは、蛍光を測定する前であればいずれの時点であってもよい。
上記の実施形態においては、工程S30が第一の工程に該当し、工程S40が第二の工程に該当し、工程S50が第三の工程に該当するので、プリズム71の除電は、工程S50の前であればいずれの時点で行ってもよい。上記の実施形態のように、複数の検査をほぼ同時に行う連続形態を採用する場合には、各検査チップに対して、蛍光測定の前に次々プリズムの除電を行うことが好ましい。
除電のタイミングは、ブランク測定の前であることが最も効果的である。また、低濃度のシグナル測定に備えるために、蛍光測定の直前にも除電を行うことが効果的である。
プリズムの除電を行う方法には特に制限はなく、たとえば、送風によりプリズムに風を当てる方法、静電気除去装置を用いる方法、プリズムに金属を接触させる方法、プリズムに帯電防止剤を接触させる方法などを挙げることができる。
プリズムの除電を行う方法には特に制限はなく、たとえば、送風によりプリズムに風を当てる方法、静電気除去装置を用いる方法、プリズムに金属を接触させる方法、プリズムに帯電防止剤を接触させる方法などを挙げることができる。
プリズムへの送風は、例えば、光の入射面、出射面、入射から出射に至るまでの光路の近辺に数秒~数分程度の間、風を当てるようにすればよい。プリズムに送風する方法としては、軸流送風機や遠心送風機など送風機等の送風手段を用いる方法等を挙げることができる。
プリズムに送風する際の風量および風速は、プリズムの除電が行えれば特に制限はなく、風量では通常0.5~5.0m3/min、好ましくは通常0.5~3.5 m3/min、風速では、通常0.3~15m/s、好ましくは通常1.0~5m/sである。送風される空気の温度には制限はなく、低温でも、常温でも、高温でもよい。
前記送風手段に制御部を設けて、該制御部により、風速、送風される空気の温度等を制御するようにしてもよい。
静電気除去装置を用いる方法としては、たとえば、送風型静電気除去装置、交流電圧印加式静電気除去装置、直流式静電気帯電除電器、nano除電除去装置、直流式エアー・ガン式静電気除去装置(いずれもウエッジ株式会社製)等を用いてプリズムの除電を行う方法が挙げられる。
静電気除去装置を用いる方法としては、たとえば、送風型静電気除去装置、交流電圧印加式静電気除去装置、直流式静電気帯電除電器、nano除電除去装置、直流式エアー・ガン式静電気除去装置(いずれもウエッジ株式会社製)等を用いてプリズムの除電を行う方法が挙げられる。
プリズムに金属を接触させる方法としては、光の入射面、出射面、入射から出射に至るまでの光路の近辺に数秒~数分程度の間、金属を接触させる方法を挙げることができる。前記金属としては、化学的に不活性な(活性な金属イオンを持たない)ステンレス、金属酸化物などがある。
プリズムに帯電防止剤を接触させる方法としては、光の入射面、出射面、入射から出射に至るまでの光路の近辺に数秒~数分程度の間、帯電防止剤を接触させる方法を挙げることができる。前記帯電防止剤としては界面活性剤、カーボン、プラスチック添加剤、スプレーなどがある。
上記のようにプリズムの除電を行うことにより、除電前にプリズムに付着した埃等をプリズムから離脱させることができるが、プリズムの除電を行った後であっても、除電前にプリズムに付着していた埃等がプリズムから離脱せず、そのままプリズムに付着したままになっていることも考えられる。そこで、プリズムの除電を、プリズムに送風をする方法以外の方法で行った場合には、除電後プリズムに付着したままになっている埃等を除去するために、除電後にプリズムに送風することが好ましい。プリズムは除電によりすでに埃等を保持する性質が実質的に失われているので、除電後プリズムに送風を行えば、プリズムに付着している埃等があったとしても、これを容易にプリズムから除去することができる。
プリズムの除電を、プリズムに送風をすることにより行った場合には、除電とともに埃等の除去も同時に行うことができるので効果的である。また、プリズムの除電を、プリズムに送風をする方法以外の方法で行った後にプリズムに送風を行った場合には、プリズムに送風をする方法以外の方法によりプリズムの除電が行われ、さらに送風によってもプリズムの除電が行われ、その上送風により埃等の除去も行うことができることからきわめて効果的である。
プリズムに送風をする方法以外の方法で行った後に行うプリズムへの送風の条件は、上記に示したプリズムへの送風条件と同様である。
プリズムに送風をする方法以外の方法で行った後に行うプリズムへの送風の条件は、上記に示したプリズムへの送風条件と同様である。
[第二の実施形態]
第二の実施形態は、回折格子を利用してSPRを生じさせる回折格子結合型SPFS(GC-SPFS)を用いた表面プラズモン励起増強蛍光測定法である。以下、GC-SPFSにより被検出物質を検出する検出チップ、検出システムおよび検出方法について説明する。
第二の実施形態は、回折格子を利用してSPRを生じさせる回折格子結合型SPFS(GC-SPFS)を用いた表面プラズモン励起増強蛍光測定法である。以下、GC-SPFSにより被検出物質を検出する検出チップ、検出システムおよび検出方法について説明する。
図10は、第二の実施形態に係る検出システム300の構成を示す模式図である。図10に示されるように、検出システム300は、所定の位置に検出チップ400を装着された状態で動作する。検出システム300は、検出チップ400以外に、励起光照射ユニット310、蛍光検出ユニット320、送液ユニット130、加振部140、および制御部350を有する。検出システム300では、所定の位置に検出チップ400を装着した状態で、検出チップ400の回折格子428(金属膜425)で表面プラズモン共鳴が発生するように検出チップ400に励起光αを照射し、回折格子428近傍において表面プラズモン共鳴に基づく増強電場を発生させる。そして、当該増強電場により回折格子428上の反応場426に存在する蛍光物質を励起させ、蛍光物質が発する蛍光βを検出することで、検体中の被検出物質の有無や量を測定する。
第二の実施形態における励起光照射ユニット310、蛍光検出ユニット320、送液ユニット130、加振部140、および制御部350は、それぞれ第一の実施形態における投光部20、検出部40、送液搬送部30、加振部10および制御演算部50に対応する。
検出システム300は、主として、検出チップ400が光学素子として回折格子428を有する点、および励起光照射ユニット310が回折格子428に励起光αを照射することでSPRを生じさせる点で、第一の実施形態と異なる。
(検出チップ)
図11A~Cは、第二の実施形態に係る検出チップ400の構成を示す模式図である。図11Aは、検出チップ400の斜視図であり、図11Bは、ウェル本体210の斜視図であり、図11Cは、ウェル本体210の斜視透視図である。図12は、検出チップ400に入射する光(励起光α)と検出チップ400から出射する光(励起光の反射光α'および蛍光β)を示す模式図である。図12は、検出チップ400の高さ方向に沿う断面図であり、収容部211内に液体(例えば測定用緩衝液)が収容されている状態を示している。図13は、図12の断面図における反応場426近傍を拡大した部分拡大断面図である。
図11A~Cは、第二の実施形態に係る検出チップ400の構成を示す模式図である。図11Aは、検出チップ400の斜視図であり、図11Bは、ウェル本体210の斜視図であり、図11Cは、ウェル本体210の斜視透視図である。図12は、検出チップ400に入射する光(励起光α)と検出チップ400から出射する光(励起光の反射光α'および蛍光β)を示す模式図である。図12は、検出チップ400の高さ方向に沿う断面図であり、収容部211内に液体(例えば測定用緩衝液)が収容されている状態を示している。図13は、図12の断面図における反応場426近傍を拡大した部分拡大断面図である。
図11Aおよび図12に示されるように、検出チップ400は、ウェル本体210および側壁部材420を有する。
ウェル本体210は、第一の実施形態に係る検出チップ60のウェル本体61と形状以外については同様である。ウェル本体210は、その内部に収容部(ウェル)211を有している。収容部211は、液体を収容できるように構成された有底の凹部であり、上部に設けられた第1開口212および側部に設けられた第2開口213により外部に開放されている。
ウェル本体210は、第一の実施形態に係る検出チップ60のウェル本体61と形状以外については同様である。ウェル本体210は、その内部に収容部(ウェル)211を有している。収容部211は、液体を収容できるように構成された有底の凹部であり、上部に設けられた第1開口212および側部に設けられた第2開口213により外部に開放されている。
ウェル本体210は、光(少なくとも励起光αの波長の光および蛍光βの波長の光)に対して透明な材料で形成されている。ただし、後述の検出方法における光の取り出しの妨げにならない限り、ウェル本体210の一部は光に対して不透明な材料で形成されていてもよい。少なくとも、収容部211を構成する側壁の一部は、光透過性を有している。本実施の形態では、少なくとも、収容部211を構成する4つの側壁のうちの反応場426と対向する側壁は、光透過性を有している。光に対して透明な材料の例には、樹脂およびガラスが含まれる。
本実施の形態に係る検出チップ400では、励起光照射ユニット310から出射された光(励起光α)と、反応場426近傍から放出され検出部125により検出される光(励起光の反射光α'および蛍光β)が、いずれも反応場426と対向する側壁を透過する(図10参照)。したがって、これらの光の屈折を抑制したい場合は、図12に示されるように、収容部において反応場426(捕捉領域427)と対向する側壁の内面および外面は、いずれも平面であることが好ましい。
側壁部材420は、基板421、金属膜425および反応場426を有している。「反応場」とは、金属膜425上に配置された捕捉領域427のうち、第2開口213を介して収容部211内に露出している領域を意味する(図13参照)。金属膜425の表面において反応場426に対応する部分の少なくとも一部には、光学素子としての回折格子428が形成されている。図11A、図12および図13に示されるように、側壁部材420は、捕捉領域427の少なくとも一部が収容部211内に露出して反応場426となり、かつ側壁部材420が第2開口213の少なくとも一部を完全に閉塞するようにウェル本体210に固定されている。
基板421は、金属膜425を支持するとともに、ウェル本体210の第2開口213を閉塞するための部材である。基板421は、収容部211を構成する側壁としても機能する。基板421の形状および材料は、上記機能を実現可能であれば特に限定されない。基板421の材料の例には、樹脂およびガラスが含まれる。
金属膜425は、基板421のウェル本体210側の面上に配置されている。前述のとおり、金属膜425には、光学素子としての回折格子428が形成されている。金属膜425は、基板421のウェル本体210側の表面の全体に形成されていてもよいし、一部のみに形成されていてもよい。また、回折格子428は、金属膜425のウェル本体210側の表面の全体に形成されていてもよいし、一部のみに形成されていてもよい。回折格子428は、金属膜425の表面において反応場426に対応する部分の少なくとも一部に形成されている。回折格子428に光を照射すると、金属膜425中に生じる表面プラズモンと、回折格子428により生じるエバネッセント光とが結合してSPRが生じ、金属膜425の表面上に局在する増強電場が生じる。金属膜425の材料は、SPRを生じさせる金属であれば特に限定されない。金属膜425の材料の例には、金、銀、銅、アルミニウムおよびこれらの合金が含まれる。金属膜425の形成方法は、特に限定されない。金属膜425の形成方法の例には、スパッタリング、蒸着、めっきが含まれる。金属膜425の厚みは、特に限定されないが、30~70nmの範囲内であることが好ましい。
回折格子428は、金属膜425に光を照射された時に、エバネッセント光を生じさせる。回折格子428の形状は、エバネッセント光を生じさせることができれば特に限定されない。たとえば、回折格子428は、図14Aに示されるように1次元回折格子であってもよいし、図14Bに示されるように2次元回折格子であってもよい。図14Aに示される1次元回折格子では、金属膜425の表面に、互いに平行な複数の凸条が所定の間隔で形成されている。図14Bに示される2次元回折格子では、金属膜425の表面に、所定形状の凸部が周期的に配置されている。凸部の配列の例には、正方格子、三角(六方)格子などが含まれる。回折格子428の断面形状の例には、矩形波形状、正弦波形状、鋸歯形状などが含まれる。回折格子のピッチは、SPRを発生させる観点から、100~2000nmの範囲が好ましい。ここで「回折格子のピッチ」とは、図14Aおよび14Bに示されるように、凸部の配列方向における凸部の中心間距離Λをいう。なお、本実施の形態では、凸部の配列方向が収容部211の深さ方向に沿うように、回折格子428が配置される。
回折格子428の形成方法は、特に限定されない。たとえば、平板状の基板421の上に金属膜425を形成した後、金属膜425に凹凸形状を付与してもよい。また、予め凹凸形状を付与された基板421の上に、金属膜425を形成してもよい。いずれの方法であっても、回折格子428を含む金属膜425を形成することができる。
反応場426は、収容部211内に露出している、被検出物質を捕捉するための領域である。前述のとおり、反応場426は、金属膜425上に配置された捕捉領域427のうち、第2開口213を介して収容部211内に露出している領域を意味する。本実施の形態では、反応場426の少なくとも一部は、回折格子428の上に位置する。
反応場426は、収容部211の内側面に配置される。このとき、反応場426は、収容部211の最深部から離れた位置に配置されることが好ましい。このような構成とすることで、収容部211内に検体などを導入したときに反応場426において効率よく反応を生じさせることができる。また、蛍光βの検出時に、収容部211の底部に起因するノイズが検出結果に混じることを抑制することもできる。
捕捉領域427は、金属膜425上において被検出物質を捕捉するための第1の捕捉体が固定化されている領域である。第1の捕捉体の種類は、被検出物質に特異的に結合するための認識部位を有していれば特に制限されない。第1の捕捉体の例には、被検出物質に特異的に結合可能な抗体(1次抗体)またはその断片、被検出物質に特異的に結合可能な酵素などが含まれる。
なお、検出チップ400は、収容部211以外にも液体を収容可能な第2収容部をさらに有していてもよい。
なお、検出チップ400は、収容部211以外にも液体を収容可能な第2収容部をさらに有していてもよい。
(検出システム)
次に、検出システム300の検出チップ400以外の構成要素について説明する。前述のとおり、検出システム300は、検出チップ400以外に、励起光照射ユニット310、蛍光検出ユニット320、送液ユニット130、加振部140、および制御部350を有する(図10参照)。
次に、検出システム300の検出チップ400以外の構成要素について説明する。前述のとおり、検出システム300は、検出チップ400以外に、励起光照射ユニット310、蛍光検出ユニット320、送液ユニット130、加振部140、および制御部350を有する(図10参照)。
励起光照射ユニット310は、ウェル本体210の側壁および収容部211を介して回折格子428に励起光αを照射する。励起光の反射光α'または蛍光βの測定時には、励起光照射ユニット310は、回折格子428(金属膜425)に対する入射角が回折格子428でSPRを生じさせる角度となるように、回折格子428(金属膜425)に対するP波のみを回折格子428に向けて出射する。このとき、励起光照射ユニット310は、励起光αの光軸および反射光α'の光軸を含む平面が回折格子の凸部の配列方向に沿うように回折格子428に励起光αを照射する。「励起光」とは、蛍光物質を直接または間接的に励起させる光である。たとえば、励起光αは、回折格子428でSPRが生じる角度で回折格子428に照射されたときに、蛍光物質を励起させる増強電場を回折格子428上に生じさせる光である。励起光照射ユニット310は、光源ユニット111および第1角度調整部112を含む。光源ユニット111は、コリメートされ、かつ波長および光量が一定の励起光αを、反応場426(回折格子428)における照射スポットの形状が略円形となるように出射する。第1角度調整部112は、反応場426(回折格子428)に対する励起光αの入射角を調整する。
回折格子428に対する励起光αの入射角は、SPRにより形成される増強電場の強度が最も強くなり、その結果として蛍光物質からの蛍光βの強度が最も強くなる角度が好ましい。励起光αの入射角は、回折格子428のピッチΛや励起光αの波長、金属膜425を構成する金属の種類などに応じて適切に選択される。たとえば、励起光αの入射角θは、以下の式(1)を満たすように設定される。
k0:励起光αの波数=2π/(λ0/n)
λ0:真空中の励起光αの波長
n:回折格子428上の媒質(収容部211内の液体)の屈折率
θ:励起光αの回折格子428に対する入射角
m:整数
Λ:回折格子428のピッチ
ここで、kspは、2種類の媒質の界面(金属膜425と収容部211内の液体との界面)において励起されるプラズモンの波数であり、以下の式(2)のように定義される。
λ0:真空中の励起光αの波長
n:回折格子428上の媒質(収容部211内の液体)の屈折率
θ:励起光αの回折格子428に対する入射角
m:整数
Λ:回折格子428のピッチ
ここで、kspは、2種類の媒質の界面(金属膜425と収容部211内の液体との界面)において励起されるプラズモンの波数であり、以下の式(2)のように定義される。
ω:励起光αの角周波数
c:光速度
ε1:回折格子428上の媒質(収容部211内の液体)の誘電率=n2
ε2:回折格子428を構成する媒質(金属)の誘電率
励起光αの最適な入射角は、各種条件の変更により変わるため、第1角度調整部112は、励起光αの光軸と回折格子428とを相対的に回転させることで入射角を調整する。
c:光速度
ε1:回折格子428上の媒質(収容部211内の液体)の誘電率=n2
ε2:回折格子428を構成する媒質(金属)の誘電率
励起光αの最適な入射角は、各種条件の変更により変わるため、第1角度調整部112は、励起光αの光軸と回折格子428とを相対的に回転させることで入射角を調整する。
蛍光検出ユニット320は、回折格子428への励起光αの照射によって生じ、収容部211およびウェル本体210の側壁を透過した蛍光βを検出する。また、必要に応じて、蛍光検出ユニット320は、回折格子428への励起光αの照射によって生じ、収容部211およびウェル本体210の側壁を透過した励起光の反射光α'も検出する。蛍光検出ユニット320は、光学フィルター122、位置切替部124、検出部125および第2角度調整部326を含む。
光学フィルター122は、蛍光成分のみを検出部125に導き、高いS(シグナル)/N(ノイズ)比で蛍光βを検出するために、励起光成分(プラズモン散乱光γ)を除去する。光学フィルター122の例には、励起光反射フィルター、短波長カットフィルターおよびバンドパスフィルターが含まれる。光学フィルター122は、例えば、所定の光成分を反射する多層膜を含むフィルター、または所定の光成分を吸収する色ガラスフィルターである。
位置切替部124は、光学フィルター122の位置を切り替える。具体的には、検出部125が蛍光βを検出する時には、光学フィルター122を光路上に配置し、検出部125がプラズモン散乱光γを検出する時には、光学フィルター122を光路外に配置する。
検出部125は、蛍光βおよびプラズモン散乱光γを検出する受光センサーである。検出部125は、微小量の被検出物質からの微弱な蛍光βを検出することが可能な、高い感度を有する。検出部125は、例えば、光電子増倍管(PMT)やアバランシェフォトダイオード(APD)などである。
蛍光検出ユニット320は、検出部125の検出範囲を拡げるために集光レンズをさらに有していてもよいが、バックグラウンドの低減の観点からは集光レンズを含まない方が好ましい。
第2角度調整部326は、蛍光検出ユニット320の光軸と回折格子428とを相対的に回転させることで蛍光検出ユニット320の光軸の角度を調整する。たとえば、第2角度調整部326は、蛍光検出ユニット320の光軸と金属膜425との交点を中心として、検出部125を回転させる。第2角度調整部326が検出部125の位置を適宜調整することで、反応場426(回折格子428)から放出され、収容部211およびウェル本体210の側壁を透過した蛍光βの強度が最大となる角度(蛍光ピーク角)で、蛍光検出ユニット320は蛍光βを検出することができる。また、光源ユニット111を移動させて励起光αの入射角を調整しているときに、光源ユニット111の位置に合わせて検出部125を移動させて反射光α'を検出することができる。
送液ユニット130は、検出チップ400の収容部211内に各種液体を導入する。また、送液ユニット130は、検出チップ400の収容部211内から各種液体を除去する。本実施の形態では、送液ユニット130は、例えば検体や、蛍光物質で標識された第2の捕捉体を含む標識液(以下「標識液」ともいう)、洗浄液、測定用緩衝液などの注入および吸引を行う。送液ユニット130は、液体チップ131、ピペット132およびピペット制御部136を含む。
液体チップ131は、検体や標識液、洗浄液、測定用緩衝液などの液体をそれぞれ収容するための容器である。液体チップ131としては、通常、複数の容器が液体の種類に応じて配置されるか、または複数の容器が一体化したチップが配置される。
ピペット132は、シリンジポンプ133と、シリンジポンプ133に接続されたノズルユニット134と、ノズルユニット134の先端に装着されたピペットチップ135とを有する。シリンジポンプ133内のプランジャーの往復運動によって、ピペットチップ135における液体の吸引および排出が定量的に行われる。
ピペット制御部136は、シリンジポンプ133の駆動装置、およびノズルユニット134の移動装置を含む。シリンジポンプ133の駆動装置は、シリンジポンプ133のプランジャーを往復運動させるための装置であり、例えば、ステッピングモーターを含む。ノズルユニット134の移動装置は、例えば、ノズルユニット134を、垂直方向と水平方向との二方向に自在に動かす。ノズルユニット134の移動装置は、例えば、ロボットアーム、2軸ステージまたは上下動自在なターンテーブルによって構成される。
ピペット制御部136は、シリンジポンプ133を駆動して、液体チップ131から各種液体をピペットチップ135内に吸引させる。そして、ピペット制御部136は、ノズルユニット134を移動させて、検出チップ200の収容部211内に第1開口212からピペットチップ135を挿入させるとともに、シリンジポンプ133を駆動して、ピペットチップ135内の液体を収容部211内に注入させる。また、液体の導入後、ピペット制御部136は、シリンジポンプ133を駆動して、収容部211内の液体をピペットチップ135内に吸引させる。このように収容部211内の液体を順次交換することによって、反応場426において第1の捕捉体と被検出物質を反応させたり(1次反応)、被検出物質と蛍光物質で標識された第2の捕捉体とを反応させたりする(2次反応)。
加振部140は、収容部211内の液体を撹拌するために検出チップ400を振動させる。このように検出チップ200を振動させて収容部211内の液体を撹拌することで、反応場426における1次反応や2次反応、洗浄などを効率的に行うことができる。加振部140は、例えばピエゾ素子や偏芯させた回転体などである。加振部140は、励起光α、蛍光βおよびプラズモン散乱光γの光路を妨げない位置に配置される。
加振部140により検出チップ400に加えられる振動の方向は、特に限定されない。振動方向の例には、水平方向や垂直方向(高さ方向)、周方向などが挙げられる。たとえば、加振部140としてのピエゾ素子を検出チップ400の側面に接触させた状態でピエゾ素子を駆動することで、検出チップ400に水平方向の往復振動を加えることができる。また、加振部140としてピエゾ素子を検出チップ400の底面に接触させた状態でピエゾ素子を駆動することで、検出チップ400に垂直方向の往復振動を加えることができる。また、加振部140としての偏芯させた回転体を検出チップ400の底面に接触させた状態で回転体を回転させることで、検出チップ400に周方向の回転振動を加えることができる。収容部211内の液体を効率よく撹拌する観点からは、収容部211内に液体が収容されている状態の検出チップ400の固有振動数、またはその前後の振動周波数で検出チップ400を振動させることが好ましい。また、異なる固有振動数(n次の固有振動数およびm次の固有振動数、nおよびmは正の整数)を順次切り替えながら検出チップ400を振動させてもよい。
制御部350は、光源ユニット111、第1角度調整部112、位置切替部124、検出部125、第2角度調整部326、ピペット制御部136、加振部140を制御する。制御部350は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
なお、本実施の形態では、励起光αを照射されうる位置に配置された検出チップ400に対して、送液ユニット130による液体の導入および除去、ならびに加振部140による振動の印加を行うことができるように、送液ユニット130および加振部140が配置されているが、送液ユニット130および加振部140の位置はこれに限定されない。たとえば、検出チップ400が第1の位置に配置されている場合に、送液ユニット130による液体の導入および除去、ならびに加振部140による振動の印加が行われ、検出チップ400が第2の位置に配置されている場合に、励起光照射ユニット310による励起光αの照射および蛍光検出ユニット320による蛍光βの検出が行われてもよい。この場合は、検出システム300は、検出チップ400を第1の位置および第2の位置に移動させるための搬送ユニットをさらに有する。
(検出方法)
次に、検出システム300を用いた被検出物質の検出方法について説明する。図15は、本実施の形態の検出方法を行う際の検出システム300の動作手順の一例を示すフローチャートである。
次に、検出システム300を用いた被検出物質の検出方法について説明する。図15は、本実施の形態の検出方法を行う際の検出システム300の動作手順の一例を示すフローチャートである。
まず、検出の準備をする(工程S110)。具体的には、検出システム300の所定の位置に検出チップ400を設置する。また、検出チップ400の反応場426上に保湿剤が存在する場合には、収容部211内を洗浄して反応場426上の保湿剤を除去する。この後、制御部350は、ピペット制御部136を制御して、収容部211内に測定用緩衝液を導入させる。
次いで、検出チップ400の回折格子428(金属膜425)に対する励起光αの入射角を共鳴角に設定する(工程S120)。具体的には、制御部350は、光源ユニット111および第1角度調整部112を制御して、励起光αを回折格子428に照射させながら、回折格子428に対する励起光αの入射角を走査する。これと同時に、制御部350は、検出部125および第2角度調整部326を制御して、励起光の反射光α'を検出させる。このとき、制御部350は、位置切替部124を制御して、光学フィルター122を光路外に移動させる。制御部350は、励起光αの入射角と反射光α'の強度との関係を含むデータを得る。そして、制御部350は、データを解析して、反射光α'の強度が最小となる入射角(共鳴角)を決定する。最後に、制御部350は、第1角度調整部112を制御して、回折格子428に対する励起光αの入射角を共鳴角に設定する。
次いで、光学ブランク値を測定する(工程S130)。具体的には、制御部350は、光源ユニット111を制御して、励起光αを回折格子428に照射させる。これと同時に、制御部350は、検出部125および第2角度調整部326を制御して、蛍光βと同じ波長の背景光の光量を検出させる。このとき、制御部350は、位置切替部124を制御して、光学フィルター122を光路上に移動させる。また、制御部350は、第2角度調整部326を制御して、金属膜425の垂線に対する蛍光検出ユニット320の光軸の角度を適切な角度(好ましくは工程S160における蛍光ピーク角)にする。たとえば、金属膜425の垂線に対する蛍光検出ユニット320の光軸の角度は、金属膜425に対する励起光αの入射角の2倍程度であればよい。制御部350は、測定された背景光の光量をブランク値として記録する。
次いで、検出チップ400の収容部211内に検体を導入し、反応場426の第1の捕捉体に、検体中に含まれる被検出物質を特異的に結合させる(1次反応(工程S140))。具体的には、制御部350は、ピペット制御部136を制御して、収容部211内の測定緩衝液を除去させるとともに、収容部211内に検体を導入させる。また、制御部350は、加振部140を制御して、検出チップ400を振動させて収容部211内の検体を撹拌させる。この後、制御部350が、ピペット制御部136を制御して、収容部211内の検体を除去させるとともに、収容部211内に洗浄液を導入させて、収容部211内を洗浄する。このときも、制御部350は、加振部140を制御して、検出チップ400を振動させて収容部211内の洗浄液を撹拌させる。検体および被検出物質の種類は、特に限定されない。
次いで、回折格子428上の第1の捕捉体に結合した被検出物質に、蛍光物質で標識された第2の捕捉体を結合させる(2次反応(工程S150))。これにより、被検出物質が間接的に蛍光物質で標識される。具体的には、制御部350は、ピペット制御部136を制御して、収容部211内の洗浄液を除去させるとともに、収容部211内に第2の捕捉体を含む標識液を導入させる。また、制御部350は、加振部140を制御して、検出チップ400を振動させて収容部211内の標識液を撹拌させる。この後、制御部350は、ピペット制御部136を制御して、収容部211内の標識液を除去させるとともに、収容部211内に洗浄液を導入させて、収容部211内を洗浄する。このときも、制御部350は、加振部140を制御して、検出チップ400を振動させて収容部211内の洗浄液を撹拌させる。さらに、制御部350は、ピペット制御部136を制御して、収容部211内の洗浄液を除去させるとともに、収容部211内に測定用緩衝液を導入させる。
次いで、被検出物質を標識する蛍光物質からの蛍光値を測定する(工程S160)。具体的には、制御部350は、光源ユニット111を制御して、励起光αを、ウェル本体210の側壁および収容部211内の測定用緩衝液を介して回折格子428(反応場426)に照射させる。これと同時に、制御部350は、検出部125および第2角度調整部326を制御して、蛍光βと同じ波長の光(その大部分は収容部211内の測定用緩衝液およびウェル本体210の側壁を透過してきた蛍光β)の光量を検出させる。このとき、制御部350は、位置切替部124を制御して、光学フィルター122を光路上に移動させる。また、制御部350は、第2角度調整部326を制御して、金属膜425の垂線に対する蛍光検出ユニット320の光軸の角度を適切な角度(好ましくは蛍光ピーク角)にする。たとえば、金属膜425の垂線に対する蛍光検出ユニット320の光軸の角度は、金属膜425に対する励起光αの入射角の2倍程度であればよい。制御部350は、測定された光量を蛍光値として記録する。
最後に、被検出物質の存在または量を算出する(工程S170)。蛍光値は、主として、被検出物質を標識する蛍光物質に由来する蛍光成分(シグナル値)と、光学ブランク値とを含む。したがって、制御部350は、工程S160で得られた蛍光値から工程S130で得られた光学ブランク値を引くことで、被検出物質の量に相関するシグナル値を算出することができる。そして、あらかじめ作成しておいた検量線により、被検出物質の量や濃度などに換算する。
以上の手順により、検体に含まれる被検出物質の存在または量を検出することができる。
以上のように、本実施の形態に係る検出チップ400、検出システム300および検出方法によれば、収容部211内の液体の液面を透過させずに蛍光βを検出するため、液面および気泡による検出結果への影響を抑制して、被検出物質を高い信頼性で検出することができる。
以上のように、本実施の形態に係る検出チップ400、検出システム300および検出方法によれば、収容部211内の液体の液面を透過させずに蛍光βを検出するため、液面および気泡による検出結果への影響を抑制して、被検出物質を高い信頼性で検出することができる。
なお、本実施の形態では、励起光αの光軸および反射光α'の光軸を含む平面が収容部
211の深さ方向に沿うように回折格子428に励起光αを照射する検出チップ、検出システムおよび検出方法について説明したが、本実施の形態に係る検出チップ、検出システムおよび検出方法はこれに限定されない。たとえば、図17Aおよび図17Bに示されるように、本実施の形態に係る検出システムは、励起光αの光軸および反射光α'の光軸を含む平面が水平方向に沿うように回折格子428に励起光αを照射してもよい。この場合、凸部の配列方向が水平方向に沿うように回折格子428が配置され、蛍光βも水平方向に沿って放出される。したがって、光源ユニット111および検出部125は、検出チップ400と同じ高さに配置されうる。また、この場合、収容部211の形状によっては、収容部211を構成する4つの側壁のうちの反応場426が配置されている側の側壁および反応場426と対向する側壁以外の2つの側壁のうちの一方を透過させて励起光αを照射し、他方を透過させて蛍光βを検出することもできる。もちろん、収容部211の形状によっては、収容部211を構成する4つの側壁のうちの反応場426と対向する側壁を透過させて励起光αを照射し、蛍光βを検出することもできる。
211の深さ方向に沿うように回折格子428に励起光αを照射する検出チップ、検出システムおよび検出方法について説明したが、本実施の形態に係る検出チップ、検出システムおよび検出方法はこれに限定されない。たとえば、図17Aおよび図17Bに示されるように、本実施の形態に係る検出システムは、励起光αの光軸および反射光α'の光軸を含む平面が水平方向に沿うように回折格子428に励起光αを照射してもよい。この場合、凸部の配列方向が水平方向に沿うように回折格子428が配置され、蛍光βも水平方向に沿って放出される。したがって、光源ユニット111および検出部125は、検出チップ400と同じ高さに配置されうる。また、この場合、収容部211の形状によっては、収容部211を構成する4つの側壁のうちの反応場426が配置されている側の側壁および反応場426と対向する側壁以外の2つの側壁のうちの一方を透過させて励起光αを照射し、他方を透過させて蛍光βを検出することもできる。もちろん、収容部211の形状によっては、収容部211を構成する4つの側壁のうちの反応場426と対向する側壁を透過させて励起光αを照射し、蛍光βを検出することもできる。
また、本実施の形態では、収容部211側から回折格子428に励起光αを照射する検出チップ、検出システムおよび検出方法について説明したが、本実施の形態に係る検出チップ、検出システムおよび検出方法は、これに限定されない。たとえば、図18Aおよび図18Bに示されるように、本実施の形態に係る検出システムは、基板421側から回折格子428に励起光αを照射してもよい。このように基板421側から回折格子428に励起光αを照射した場合、励起光αの一部は金属膜425を透過して回折格子428に到達し、SPRを生じさせる。そして、SPRにより増強された電場により蛍光物質が励起され、所定の方向に指向性を持った蛍光βが出射される。したがって、光源ユニット111および検出部125は、検出チップ400と同じ高さに配置されうるが、検出チップ400は、光源ユニット111および検出部125の間に位置することとなる。なお、図18Aおよび図18Bに示される例では、凸部の配列方向が水平方向に沿うように回折格子428が配置され、蛍光βも水平方向に沿って放出される。また、このように基板421側から回折格子428に励起光αを照射する場合、基板421は、励起光αに対して透明な誘電体からなることが好ましく、回折格子428は金属膜425の両面に形成されていることが好ましい。基板421の材料の例には、励起光αに対して透明な樹脂およびガラスが含まれる。たとえば、樹脂からなる基板421の表面にUV樹脂を用いたナノインプリントにより回折格子を形成し、その上に金属膜425を形成することで、金属膜425の両面に回折格子428を形成することができる。また、このように基板421側から回折格子428に励起光αを照射する場合、工程S20では励起光αの入射角を共鳴角に設定してもよいが、励起光αの入射角を増強角に設定してもよい。励起光αの入射角を増強角に設定する場合は、金属膜425に対する励起光αの入射角を走査するとともに、回折格子428から放出されたプラズモン散乱光γの光量を検出部125により検出する。そして、プラズモン散乱光γの光量が最大となったときの励起光αの入射角を増強角として決定する。
本発明に係る表面プラズモン励起増強蛍光測定法における第二の実施形態では、回折格子に励起光を入射することにより生じる表面プラズモン共鳴により、第2の捕捉体の標識に用いられた蛍光物質を励起して、この蛍光物質から放出される蛍光の測定を行う前に、前記回折格子の除電を行う。上記の本実施形態においては、工程S160で行われる蛍光値測定の前に、回折格子428の除電を行う。このように回折格子の除電を行うことにより、回折格子に付着していた埃等が除去され、蛍光の測定において回折格子に付着した埃等に起因する光学ノイズが低減されることにより、高感度かつ高精度な表面プラズモン励起増強蛍光測定分析が可能になる。
回折格子の除電の方法は、第一の実施形態において挙げた方法と同様である。回折格子の除電を行うタイミングも、第一の実施形態における除電のタイミングと同様である。
[実施例1]
前述した生化学検査システムAを用いて表面プラズモン励起増強蛍光測定を行った。
送液搬送部30により、対象の検査チップ60を生化学検査システムAの位置10aに移動し、検査チップ60を位置10aに対応する攪拌装置の回転体に装着した。送液搬送部30により洗浄液を検査チップ60に供給し、加振部10により検査チップ60内の液体を攪拌しながら液体収容部65内の洗浄を行った。その後、送液搬送部30により、検査チップ60内の洗浄液を回収し、測定用緩衝液を検査チップ60内に新たに供給した。
前述した生化学検査システムAを用いて表面プラズモン励起増強蛍光測定を行った。
送液搬送部30により、対象の検査チップ60を生化学検査システムAの位置10aに移動し、検査チップ60を位置10aに対応する攪拌装置の回転体に装着した。送液搬送部30により洗浄液を検査チップ60に供給し、加振部10により検査チップ60内の液体を攪拌しながら液体収容部65内の洗浄を行った。その後、送液搬送部30により、検査チップ60内の洗浄液を回収し、測定用緩衝液を検査チップ60内に新たに供給した。
次に、ブランク測定を行う前に、プリズム71の除電を、シシド静電気株式会社WINSTAT BF-XMBを用いて送風することにより行った。
次に、送液搬送部30により、対象の検査チップ60を生化学検査システムAの位置10bに配置し、投光部10によって、検査チップ60の反応場77に対応する反射面73の領域に、入射角αを走査しながら励起光91を照射した。それと同時に、検出部40により、蛍光93と同じ波長の光の光量を検出した。制御演算部50により、検出部40により測定された光の光量を光学ブランクとして記録した。また、SPRの反射率を求めた。
次に、送液搬送部30により、対象の検査チップ60を生化学検査システムAの位置10bに配置し、投光部10によって、検査チップ60の反応場77に対応する反射面73の領域に、入射角αを走査しながら励起光91を照射した。それと同時に、検出部40により、蛍光93と同じ波長の光の光量を検出した。制御演算部50により、検出部40により測定された光の光量を光学ブランクとして記録した。また、SPRの反射率を求めた。
その後、送液搬送部30により、検査チップ60内の測定用緩衝液を回収し、測定用検体を検査チップ60内に新たに供給した。
次に、送液搬送部30により、対象の検査チップ60を生化学検査システムAの位置10cに移動し、検査チップ60を位置10cに対応する攪拌装置の回転体に装着した。加振部10により検査チップ60内の液体を攪拌した。
次に、送液搬送部30により、対象の検査チップ60を生化学検査システムAの位置10cに移動し、検査チップ60を位置10cに対応する攪拌装置の回転体に装着した。加振部10により検査チップ60内の液体を攪拌した。
反応に十分な時間が経過した後、検査チップ60内を洗浄するために、送液搬送部30により、検査チップ60内の測定用検体を回収し、洗浄液を検査チップ60内に新たに供給した。
その後、送液搬送部30により、検査チップ60内の洗浄液を回収し、標識液を検査チップ60内に新たに供給した。
次に、送液搬送部30により、対象の検査チップ60を生化学検査システムAの位置10dに移動し、検査チップ60を位置10dに対応する攪拌装置の回転体に装着した。加振部10により検査チップ60内の液体を攪拌した。標識液に存在する蛍光標識された第2の捕捉体を被検出物質と結合させ、被検出物質を間接的に蛍光標識した。
次に、送液搬送部30により、対象の検査チップ60を生化学検査システムAの位置10dに移動し、検査チップ60を位置10dに対応する攪拌装置の回転体に装着した。加振部10により検査チップ60内の液体を攪拌した。標識液に存在する蛍光標識された第2の捕捉体を被検出物質と結合させ、被検出物質を間接的に蛍光標識した。
反応に十分な時間が経過した後、検査チップ60内を洗浄するために、送液搬送部30により、検査チップ60内の標識液を回収し、洗浄液を検査チップ60内に新たに供給した。
その後、送液搬送部30により、検査チップ60内の洗浄液を回収し、測定用緩衝液を検査チップ60内に新たに供給した。
次に、送液搬送部30により、対象の検査チップ60を生化学検査システムAの位置10eに配置し、投光部10から、検査チップ60の反応場77に対応する反射面73の領域に、入射角αを走査しながら励起光91を照射した。それと同時に、検出部40により、蛍光93と同じ波長の光の光量を検出した。制御演算部50により、検出部40により測定された光の光量を蛍光値として記録した。また、SPRの反射率を求めた。
次に、送液搬送部30により、対象の検査チップ60を生化学検査システムAの位置10eに配置し、投光部10から、検査チップ60の反応場77に対応する反射面73の領域に、入射角αを走査しながら励起光91を照射した。それと同時に、検出部40により、蛍光93と同じ波長の光の光量を検出した。制御演算部50により、検出部40により測定された光の光量を蛍光値として記録した。また、SPRの反射率を求めた。
図18(A)に、ブランクにおける入射角αと蛍光シグナル値およびSPR反射率との関係を示す。図18(B)に、被検出物質の測定値における入射角αと蛍光シグナル値およびSPR反射率との関係を示す。図18(A)および(B)において、黒色の線が蛍光シグナル値を示し、グレーの線がSPR反射率を示す。
[比較例1]
ブランク測定を行う前に、プリズム71の除電およびプリズム71への送風を行わなかったこと以外は実施例と同様の方法により表面プラズモン励起増強蛍光測定を行った。
ブランク測定を行う前に、プリズム71の除電およびプリズム71への送風を行わなかったこと以外は実施例と同様の方法により表面プラズモン励起増強蛍光測定を行った。
図18(C)に、ブランクにおける入射角αと蛍光シグナル値およびSPR反射率との関係を示す。図18(D)に、被検出物質の測定値における入射角αと蛍光シグナル値およびSPR反射率との関係を示す。図18(C)および(D)において、黒色の線が蛍光シグナル値を示し、グレーの線がSPR反射率を示す。
プリズム71の除電およびプリズム71への送風を行わなかった比較例1においては、図18(C)に示すとおり、ブランクにおける蛍光シグナル値に、58°および65°付近に2つのピークが出現した。本来の増強角である65°付近では、図18(D)に示すとおり、被検出物質の測定値は高シグナル値であるので、ブランクの蛍光シグナル値が高くても被検出物質の測定値は大きな影響を受けない。しかし、本来の増強角とは異なる58°付近の角度を増強角として設定してシグナルを測定した場合、被検出物質の測定値は高くないので、ブランクの蛍光シグナル値が高いことは、被検出物質の測定値に大きな影響を及ぼす。
これに対し、プリズム71の除電およびプリズム71への送風を行った実施例1においては、図18(A)に示すとおり、ブランクにおける蛍光シグナル値に65°付近に1つのピークが出現し、58°付近にはピークは出現しなかった。このため、実施例1においては、本来の増強角である65°付近以外においても、被検出物質の測定値に与えるブランクの影響は小さい。
比較例1において、図18(C)に示すように、ブランクにおける蛍光シグナル値に58°付近のピークが現れるのは、プリズム71に付着した埃等が原因であると考えられる。一方、実施例1において、図18(A)に示すように、ブランクにおける蛍光シグナル値に58°付近のピークが現れないのは、プリズム71の除電およびプリズム71への送風により、プリズム71に付着していた埃等が除去されたためであると考えられる。
図18(A)~(D)の結果から、プリズム71の除電およびプリズム71への送風が与えるSPRの反射率への影響は小さいことがわかる。
10 加振部
10a、10b、10c、10d、10e 位置
20 投光部
30 送液搬送部
40 検出部
50 制御演算部
51 CPU
52 投光制御部
53 送液駆動制御部
54 送液移動制御部
55 搬送制御部
56 検出制御部
57 演算部
60、60a、60b、60c、60d、60e、60y 検査チップ
61 ウェル本体
61y ウェル
62、62y 側壁部材
63 第1開口
64 第2開口
65 液体収容部
66 底面構造
66a 先端
71 プリズム
72 入射面
73 反射面
74 出射面
75 金属膜
76 捕捉膜
77 反応場
91 励起光
92 反射光
93 蛍光
94 プラズモン散乱光
99 回転体
A 生化学検査システム
c 対称中心
G2 重心
α 入射角
300 検出システム
310 励起光照射ユニット
111 光源ユニット
112 第1角度調整部
320 蛍光検出ユニット
122 光学フィルター
124 位置切替部
125 検出部
130 送液ユニット
131 液体チップ
132 ピペット
133 シリンジポンプ
134 ノズルユニット
135 ピペットチップ
136 ピペット制御部
140 加振部
350 制御部
400 検出チップ
210 ウェル本体
211 収容部
212 第1開口
213 第2開口
214 保持部
420 側壁部材
425 金属膜
426 反応場
427 捕捉領域
326 第2角度調整部
421 基板
428 回折格子
α 励起光
α' 励起光の反射光
β 蛍光
γ プラズモン散乱光
10a、10b、10c、10d、10e 位置
20 投光部
30 送液搬送部
40 検出部
50 制御演算部
51 CPU
52 投光制御部
53 送液駆動制御部
54 送液移動制御部
55 搬送制御部
56 検出制御部
57 演算部
60、60a、60b、60c、60d、60e、60y 検査チップ
61 ウェル本体
61y ウェル
62、62y 側壁部材
63 第1開口
64 第2開口
65 液体収容部
66 底面構造
66a 先端
71 プリズム
72 入射面
73 反射面
74 出射面
75 金属膜
76 捕捉膜
77 反応場
91 励起光
92 反射光
93 蛍光
94 プラズモン散乱光
99 回転体
A 生化学検査システム
c 対称中心
G2 重心
α 入射角
300 検出システム
310 励起光照射ユニット
111 光源ユニット
112 第1角度調整部
320 蛍光検出ユニット
122 光学フィルター
124 位置切替部
125 検出部
130 送液ユニット
131 液体チップ
132 ピペット
133 シリンジポンプ
134 ノズルユニット
135 ピペットチップ
136 ピペット制御部
140 加振部
350 制御部
400 検出チップ
210 ウェル本体
211 収容部
212 第1開口
213 第2開口
214 保持部
420 側壁部材
425 金属膜
426 反応場
427 捕捉領域
326 第2角度調整部
421 基板
428 回折格子
α 励起光
α' 励起光の反射光
β 蛍光
γ プラズモン散乱光
Claims (16)
- 光学素子に励起光を入射することにより生じる表面プラズモン共鳴により蛍光物質を励起して、前記蛍光物質から放出される蛍光の測定を行う表面プラズモン励起増強蛍光測定において、前記蛍光の測定を行う前に、前記光学素子の除電を行う表面プラズモン励起増強蛍光測定法。
- 前記除電の方法は、前記光学素子に送風を行う方法である請求項1に記載の表面プラズモン励起増強蛍光測定法。
- 前記除電の方法は、静電気除去装置を用いる方法である請求項1に記載の表面プラズモン励起増強蛍光測定法。
- 前記除電の方法は、前記光学素子に金属を接触させる方法である請求項1に記載の表面プラズモン励起増強蛍光測定法。
- 前記除電の方法は、前記光学素子に帯電防止剤を接触させる方法である請求項1に記載の表面プラズモン励起増強蛍光測定法。
- 前記光学素子の除電を送風以外の方法で行った後、前記光学素子に送風を行う請求項1に記載の表面プラズモン励起増強蛍光測定法。
- 前記送風以外の方法は、静電気除去装置を用いる方法、前記光学素子に金属を接触させる方法、または前記光学素子に帯電防止剤を接触させる方法である請求項6に記載の表面プラズモン励起増強蛍光測定法。
- 除電をブランク測定の前に行う請求項1~7のいずれかに記載の表面プラズモン励起増強蛍光測定法。
- 除電を蛍光測定の直前にも行う請求項8に記載の表面プラズモン励起増強蛍光測定法。
- 前記光学素子はプリズムである請求項1~9のいずれかに記載の表面プラズモン励起増強蛍光測定法。
- 前記光学素子は、微細な凸部または凹部が周期的に配列されている回折格子である請求項1~9のいずれかに記載の表面プラズモン励起増強蛍光測定法。
- 前記表面プラズモン励起増強蛍光測定が、前記プリズムから入射される励起光により表面プラズモン共鳴を生じさせる金属膜と、該金属膜に固定化された第1の捕捉体とを含む検出チップを用いて行われ、
前記第1の捕捉体に被検出物質を結合させる第一工程、
前記第1の捕捉体に結合した被検出物質に、蛍光物質で標識された第2の捕捉体を結合させる第二工程、および
前記金属膜に前記プリズムから励起光を入射し、表面プラズモン共鳴により前記蛍光物質を励起して、前記蛍光物質から放出される蛍光を測定する第三工程
を含む請求項10に記載の表面プラズモン励起増強蛍光測定法。 - 前記検出チップは、上部および側部に開口を有する収容部を含むウェル本体と、被検出物質を補足する補足領域を有する側壁部材とを有し、
前記側壁部材は、前記収容部の側部の開口を介して前記補足領域の少なくとも一部が前記収容部内に露出し、かつ前記収容部の側部の開口の少なくとも一部を閉塞するように前記ウェル本体に固定され、
前記側壁部材は、前記プリズムを備え、該プリズムは、光が入射する入射面と、該入射面から入射された光が反射する反射面とを有し、
前記反射面上に前記金属膜が設けられ、
前記金属膜上に前記補足領域が配置され、該補足領域に前記第1の捕捉体が結合されている
請求項12に記載の表面プラズモン励起増強蛍光測定法。 - 前記表面プラズモン励起増強蛍光測定が、入射される励起光により表面プラズモン共鳴を生じさせる前記回折格子を有する金属膜と、該金属膜に固定化された第1の捕捉体とを含む検出チップを用いて行われ、
前記第1の捕捉体に被検出物質を結合させる第一工程、
前記第1の捕捉体に結合した被検出物質に、蛍光物質で標識された第2の捕捉体を結合させる第二工程、および
前記金属膜に前記プリズムから励起光を入射し、表面プラズモン共鳴により前記蛍光物質を励起して、前記蛍光物質から放出される蛍光を測定する第三工程
を含む請求項11に記載の表面プラズモン励起増強蛍光測定法。 - 前記検出チップは、上部および側部に開口を有する収容部を含むウェル本体と、被検出物質を補足する補足領域を有する側壁部材とを有し、
前記側壁部材は、前記収容部の側部の開口を介して前記補足領域の少なくとも一部が前記収容部内に露出し、かつ前記収容部の側部の開口の少なくとも一部を閉塞するように前記ウェル本体に固定され、
前記側壁部材は、前記回折格子を有する金属膜を備え、
前記回折格子は、前記収容部の側部の開口を介して前記収容部内に露出し、
前記捕捉領域は前記回折格子上に配置され、前記捕捉領域に前記第1の捕捉体が結合されており、
前記ウェル本体の前記収容部を構成する側壁の少なくとも一部は光透過性を有する
請求項14に記載の表面プラズモン励起増強蛍光測定法。 - 光学素子に励起光を入射することにより生じる表面プラズモン共鳴により蛍光物質を励起して、前記蛍光物質から放出される蛍光の測定を行う表面プラズモン励起増強蛍光測定装置であって、前記光学素子の除電を行う除電手段を備えた表面プラズモン励起増強蛍光測定装置。
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---|---|---|---|
JP2020521775A JPWO2019230222A1 (ja) | 2018-06-01 | 2019-04-15 | 表面プラズモン励起増強蛍光測定法 |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2018106031 | 2018-06-01 | ||
JP2018-106031 | 2018-06-01 |
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