JP6642592B2 - 送液方法、ならびにこれを行う検出システムおよび検出装置 - Google Patents

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Description

本発明は、微細流路に液体を供給する送液方法、ならびにこれを行う検出システムおよび検出装置に関する。
生化学検査において抗原抗体反応などの生化学反応が利用されている。たとえば、蛍光免疫測定法（以下、「ＦＩＡ」とも称する）では、被検出物質（抗原）に蛍光物質を含む標識物質を反応させる。その後、標識物質で標識された被検出物質に励起光を照射して、蛍光物質が発する蛍光を検出する。そして、検出された蛍光の強度などから、被検出物質の量を特定する。このようなＦＩＡの中でも、特に高感度に被検出物質の検出を行うことが可能な方法として、表面プラズモン励起増強蛍光分光測定方法（Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy、以下「ＳＰＦＳ」とも称する）が知られている。
ＳＰＦＳでは、被検出物質に特異的に結合できる第１の捕捉体（例えば１次抗体）を金属膜上に固定して、被検出物質を捕捉するための反応場を形成する。通常、反応場は、微細な流路内に形成される。そして、この流路に被検出物質を含む液体（検体）を注入することで、第１の捕捉体に被検出物質を結合させる。次いで、蛍光物質で標識された第２の捕捉体（例えば２次抗体）を流路に注入することで、１次抗体に結合している被検出物質に、第２の捕捉体をさらに結合させる。つまり、被検出物質を、間接的に蛍光物質で標識する。この状態で金属膜に励起光を照射すると、蛍光物質が表面プラズモン共鳴（以下、「ＳＰＲ」とも称する）により増強された局在場光により励起され、蛍光を放出する。そして、蛍光物質が放出した蛍光を検出することで、被検出物質を検出できる。
ここで、被検出物質を極少量含む検体を用いる場合、流路内において検体を往復送液することで、被検出物質と第１の捕捉体との接触機会を増やすことができ、第１の捕捉体に十分な量の被検出物質を結合させることができる。流路を洗浄するための洗浄液や、第２の捕捉体についても、同様に往復送液することが好ましい。しかしながら、図１Ａに示されるように、流路４４内に気泡６４が発生してしまうと、第１の捕捉体６０を気泡６４が覆ってしまい、被検出物質６１が気泡６４に覆われた第１の捕捉体６０に結合できなくなることがある。同様に、図１Ｂに示されるように、流路４４内に気泡６４が発生してしまうと、第２の捕捉体６２が気泡６４に覆われた被検出物質６１に結合できなくなることがある。また、蛍光検出時に流路４４内に気泡６４が存在すると、屈折などの影響で蛍光を適切に検出できなくなってしまう。
このような気泡の発生を防ぐために、検体や洗浄液、第２の抗体などの液体を流路内において往復送液するときに、液体の注入および吸引のタイミングを調整することが提案されている（例えば特許文献１参照）。
国際公開第２０１１／０２７８５１号
特許文献１に記載の発明では、図２Ａに示されるように、所定の位置に固定されたピペット（ピペットチップ１３４）を用いて、流路４４内への液体６３の注入および流路４４内からの液体６３の吸引を行っている。このように所定の位置に固定されたピペットチップ１３４を用いて流路４４内の液体６３を除去する場合、図２Ｂに示されるように、流路４４のピペットチップ１３４側の端部近傍に液体６３がわずかに残ってしまう。この状態で、液体６３を吸引したピペットチップ１３４を取り出し、新たな液体６３’を保持するピペットチップ１３４を所定の位置まで挿入すると、図２Ｃに示されるように、残っていた液体６３が流路４４内に押し出される。このままピペットチップ１３４から流路４４内に新たな液体６３’を注入すると、図２Ｄに示されるように、流路４４内において残っていた液体６３と新たに注入された液体６３’との間に気泡６４が発生してしまうこととなる。前述のとおり、流路４４内に気泡６４が存在すると、流路４４内において適切に反応を行うことができなくなるおそれ、また蛍光を適切に検出できなくなるおそれがある（図１２および図１３参照）。
このように、特許文献１に記載の発明は、流路内において液体を往復送液する間の気泡の発生を抑制することができるが、特許文献１に記載の発明には、流路内の液体を交換するときにおける気泡の発生を抑制する観点からは改善の余地がある。
本発明の目的は、流路内に気泡を発生させることなく、流路内の液体の除去および流路内への液体の導入を行うことができる送液方法、ならびにこれを行う検出システムおよび検出装置を提供することである。
本発明の一実施形態に係る送液方法は、流路と、前記流路の一端に接続され、かつ開口部を有する液体注入部とを有する検出用チップの前記液体注入部に前記開口部から挿入されたピペットチップにより、前記開口部と前記ピペットチップとの間に隙間が無い状態で前記液体注入部内の液体を吸引して、前記流路内の液体を除去する第１工程と、前記第１工程の後に、前記開口部と前記ピペットチップとの間に隙間が生じないように、前記ピペットチップを前記ピペットチップの軸方向に沿って２回以上往復移動させるとともに、その間に少なくとも１回は前記ピペットチップにより前記液体注入部内の流体を吸引する第２工程と、前記第２工程の後に、前記開口部と前記ピペットチップとの間に隙間が無い状態で、前記ピペットチップから前記液体注入部内に液体を注入して、前記流路内に液体を導入する第３工程と、を有する。
また、本発明の一実施形態に係る検出システムは、流路と、前記流路の一端に接続され、かつ開口部を有する液体注入部とを有する検出用チップと、その先端にピペットチップを装着された、前記液体注入部内に液体を注入、および前記液体注入部から液体を吸引するためのピペットと、前記ピペットを制御するためのピペット制御部と、を有し、前記流路内に液体を導入する場合、前記ピペット制御部は、前記開口部と前記ピペットチップとの間に隙間が生じないように前記液体注入部に前記ピペットチップが前記開口部から挿入されている状態で、前記ピペットに前記液体注入部内に液体を注入させ、前記流路内から液体を除去する場合、前記ピペット制御部は、前記開口部と前記ピペットチップとの間に隙間が生じないように前記液体注入部に前記ピペットチップが前記開口部から挿入されている状態で、前記ピペットに前記液体注入部内の液体を吸引させ、次いで、前記開口部と前記ピペットチップとの間に隙間が生じないように、前記ピペットに前記ピペットチップを前記ピペットチップの軸方向に沿って２回以上往復移動させるとともに、その間に少なくとも１回は前記液体注入部内の流体を吸引させる。
また、本発明の一実施形態に係る検出装置は、流路と、前記流路の一端に接続され、かつ開口部を有する液体注入部とを有する検出用チップを保持するためのチップホルダーと、その先端にピペットチップを装着することが可能であり、前記チップホルダーに保持された前記検出用チップの前記液体注入部内に液体を注入、および前記液体注入部から液体を吸引するためのピペットと、前記ピペットを制御するためのピペット制御部と、を有し、前記流路内に液体を導入する場合、前記ピペット制御部は、前記開口部と前記ピペットチップとの間に隙間が生じないように前記液体注入部に前記ピペットチップが前記開口部から挿入されている状態で、前記ピペットに前記液体注入部内に液体を注入させ、前記流路内から液体を除去する場合、前記ピペット制御部は、前記開口部と前記ピペットチップとの間に隙間が生じないように前記液体注入部に前記ピペットチップが前記開口部から挿入されている状態で、前記ピペットに前記液体注入部内の液体を吸引させ、次いで、前記開口部と前記ピペットチップとの間に隙間が生じないように、前記ピペットに前記ピペットチップを前記ピペットチップの軸方向に沿って２回以上往復移動させるとともに、その間に少なくとも１回は前記液体注入部内の流体を吸引させる。
本発明によれば、流路内に気泡を発生させることなく、流路内の液体の除去および流路内への液体の導入を行うことができる。
図１Ａおよび図１Ｂは、気泡の影響を説明するための模式図である。 図２Ａ〜Ｄは、従来の送液方法を説明するための模式図である。 図３は、本発明の一実施形態に係る検出装置（ＳＰＦＳ装置）の構成を示す模式図である。 図４は、検出チップの断面図である。 図５は、本発明の一実施の形態に係る送液方法のフローチャートである。 図６Ａ〜Ｄは、本発明の一実施の形態に係る送液方法を示す模式図である。 図７Ａ〜Ｄは、本実施の形態の変形例に係る送液方法を説明するための模式図である。 図８Ａ〜Ｄは、本実施の形態の変形例に係る送液方法を説明するための模式図である。 図９は、本発明の一実施形態に係る検出方法のフローチャートであり、検出装置の動作手順の一例を示すフローチャートである。 図１０は、ピペットチップ内の圧力の経時的変化を示すグラフである。 図１１は、ピペットチップ内の圧力の経時的変化を示すグラフである。 図１２は、１次反応のときの流路の測定領域における気泡の面積と、シグナル値の低下率との関係を示すグラフである。 図１３は、シグナル測定時における流路の測定領域における気泡の面積と、シグナル値の低下率との関係を示すグラフである。
以下、本発明の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。なお、以下の説明では、本発明に係る検出装置および検出システムの代表例として、本発明の一実施の形態に係る送液方法を実施可能なＳＰＦＳ装置について説明するが、本発明に係る検出装置および検出システムはこれに限定されない。以下の説明において、検出チップおよびピペットチップが装着されていない状態のＳＰＦＳ装置が本発明の一実施の形態に係る検出装置に該当し、検出チップおよびピペットチップが装着されている状態のＳＰＦＳ装置が本発明の一実施の形態に係る検出システムに該当する。
図３は、本発明の一実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００の構成を示す模式図である。図３に示されるように、ＳＰＦＳ装置１００は、励起光照射ユニット１１０、蛍光検出ユニット１２０、送液ユニット１３０、搬送ユニット１４０、および制御部１５０を有する。ＳＰＦＳ装置１００では、搬送ユニット１４０のチップホルダー１４２に検出チップ１０を装着した状態で、検出チップ１０の金属膜３０に表面プラズモン共鳴が発生するように励起光αを照射し、表面プラズモン共鳴に基づく局在場光を発生させる。そして、当該局在場光により、金属膜３０上に存在する蛍光物質を励起させ、蛍光物質が発する蛍光βを検出することで、検体中の被検出物質の有無や量を測定する。なお、本実施の形態では、検出チップ１０は、検出装置のチップホルダーに取り外し可能に装着されている。
以下では、検出チップ１０およびＳＰＦＳ装置１００（検出システムおよび検出装置）について先に説明し、その後、検出チップ１０に各種液体を送液する方法（送液方法）およびＳＰＦＳ装置１００を用いた被検出物質の検出方法について説明する。
（検出チップ）
図３に示されるように、検出チップ１０は、入射面２１、成膜面２２、および出射面２３を有するプリズム２０と、プリズム２０の成膜面２２に形成された金属膜３０と、プリズム２０の成膜面２２または金属膜３０上に配置された流路蓋４０とを有する。この後説明するように、検出チップ１０は、さらに、液体注入部４５と、流路４４と、流路４４の一端に接続された貯留部４６と、流路４４の他端に接続された貯留部４６も有する。本実施の形態では、流路蓋４０は、両面テープなどの接着層５０を介して金属膜３０（またはプリズム２０）に接着されており、接着層５０は流路４４の側面形状を規定する役割も担っている。流路蓋４０は、接着層５０を用いずに、レーザー溶着、超音波溶着、クランプ部材を用いた圧着などにより、検出チップ１０の金属膜３０（またはプリズム２０）に接合されていてもよい。この場合は、流路４４の側面形状は、流路蓋４０により規定される。
プリズム２０は、励起光αに対して透明な誘電体からなり、図３に示されるように、入射面２１、成膜面２２および出射面２３を有する。入射面２１は、励起光照射ユニット１１０からの励起光αをプリズム２０の内部に入射させるための面である。また、成膜面２２上には、金属膜３０が配置されており、プリズム２０の内部に入射した励起光αは、金属膜３０の裏面、より具体的にはプリズム２０と金属膜３０との界面（成膜面２２）にて反射する。一方、出射面２３は、成膜面２２にて反射した反射光をプリズム２０の外部に出射させるための面である。
プリズム２０の形状は、特に限定されない。本実施の形態では、プリズム２０の形状は、台形を底面とする柱体である。台形の一方の底辺に対応する面が成膜面２２であり、一方の脚に対応する面が入射面２１であり、他方の脚に対応する面が出射面２３である。底面となる台形は、等脚台形であることが好ましい。これにより、入射面２１と出射面２３とが対称になり、励起光αのＳ波成分がプリズム２０内に滞留しにくくなる。
入射面２１は、励起光αが励起光照射ユニット１１０に戻らないように形成される。励起光αの光源がレーザーダイオード（以下「ＬＤ」ともいう）である場合、励起光αがＬＤに戻ると、ＬＤの励起状態が乱れてしまい、励起光αの波長や出力が変動してしまう。そこで、理想的な共鳴角または増強角を中心とする走査範囲において、励起光αが入射面２１に垂直に入射しないように、入射面２１の角度が設定される。ここで「共鳴角」とは、金属膜３０に対する励起光αの入射角を走査した場合に、出射面２３から出射される反射光の光量が最小となるときの、入射角を意味する。また、「増強角」とは、金属膜３０に対する励起光αの入射角を走査した場合に、検出チップ１０の上方に放出される励起光αと同一波長の散乱光（以下「プラズモン散乱光」という）γの光量が最大となるときの、入射角を意味する。本実施形態では、入射面２１と成膜面２２との角度および成膜面２２と出射面２３との角度は、いずれも約８０°である。
なお、検出チップ１０の設計により、共鳴角（およびその極近傍にある増強角）が概ね決まる。設計要素は、プリズム２０の屈折率や、金属膜３０の屈折率、金属膜３０の膜厚、金属膜３０の消衰係数、励起光αの波長などである。金属膜３０上に第１の捕捉体を介して捕捉された被検出物質によって共鳴角および増強角がシフトするが、その量は数度未満である。
プリズム２０は、複屈折特性を少なからず有する。プリズム２０の材料の例には、樹脂およびガラスが含まれる。プリズム２０の材料は、好ましくは、屈折率が１.４〜１.６であり、かつ複屈折が小さい樹脂である。
金属膜３０は、プリズム２０の成膜面２２上に配置されている。これにより、成膜面２２に全反射条件で入射した励起光αの光子と、金属膜３０中の自由電子との間で相互作用（ＳＰＲ）が生じ、金属膜３０の表面上に局在場光（一般に「エバネッセント光」または「近接場光」とも呼ばれる）が生じる。
金属膜３０の材料は、表面プラズモン共鳴を生じさせうる金属であれば特に限定されない。金属膜３０の材料の例には、金、銀、銅、アルミニウムおよびこれらの合金が含まれる。金属膜３０の形成方法は、特に限定されない。金属膜３０の形成方法の例には、スパッタリング、蒸着、めっきが含まれる。金属膜３０の厚みは、特に限定されないが、３０〜７０ｎｍの範囲内であることが好ましい。
図４は、図３とは別の方向から見た検出チップ１０の断面図である。図４に示されるように、流路蓋４０は、枠体４１、液体注入部被覆フィルム４２および貯留部被覆フィルム４３を有する。枠体４１には、２つの貫通孔が形成されている。一方の貫通孔の一方の開口部が金属膜３０（またはプリズム２０）により塞がれ、他方の開口部が液体注入部被覆フィルム４２により塞がれることで、この貫通孔は液体注入部４５として機能する。他方の貫通孔の一方の開口部が金属膜３０（またはプリズム２０）により塞がれ、他方の開口部が貯留部被覆フィルム４３により塞がれることで、この貫通孔は貯留部４６として機能する。貯留部被覆フィルム４３には、通気孔４７が設けられている。
前述のとおり、本実施の形態では、流路蓋４０（枠体４１）は、両面テープなどの接着層５０を介して金属膜３０（またはプリズム２０）に接着されており、接着層５０は流路４４の側面形状を規定する役割も担っている。すなわち、接着層５０には細長い形状の貫通孔が設けられており、この貫通孔の一方の開口部が金属膜３０（またはプリズム２０）により塞がれ、他方の開口部が枠体４１により塞がれることで、一方の端部が液体注入部４５に開口し、他方の端部が貯留部４６に開口する流路４４が形成される。流路蓋４０が接着層５０を用いずに金属膜３０（またはプリズム２０）に接合される場合は、枠体４１の金属膜３０側の面には、流路４４の形状を規定する溝が形成される。この場合は、溝の開口部が金属膜３０（またはプリズム２０）により塞がれることで、一方の端部が液体注入部４５に開口し、他方の端部が貯留部４６に開口する流路４４が形成される。
枠体４１は、光（例えば、蛍光βおよびプラズモン散乱光γ）に対して透明な材料で形成されている。ただし、後述の検出方法における光の取り出しの妨げにならない限り、枠体４１の一部は光に対して不透明な材料で形成されていてもよい。光に対して透明な材料の例には、樹脂が含まれる。
液体注入部被覆フィルム４２は、ピペットチップ１３４を挿入可能であり、かつピペットチップ１３４を挿入した際には、ピペットチップ１３４の外周に隙間なく密着することが可能なフィルムである。たとえば、液体注入部被覆フィルム４２は、弾性フィルムおよび粘着フィルムの２層フィルムである。液体注入部被覆フィルム４２には、ピペットチップ１３４を挿入するための微細な貫通孔を設けられていてもよい。本実施の形態では、液体注入部被覆フィルム４２に外径が１.２ｍｍの貫通孔が設けられている。
弾性フィルムの種類は、ピペットチップ１３４挿入時にピペットチップ１３４の外周に密着可能であれば特に限定されない。たとえば、弾性フィルムは、引張弾性定数が０.０５〜２ＧＰａ、引張破断伸度が２００〜２０００％、引裂強度が８０〜３０００ｍＮであるポリウレタンフィルムである。弾性フィルムのその他の例には、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）、直鎖状低密度ポリエチレン（ＬＬＤＰＥ）、中密度ポリエチレン（ＭＤＰＥ）、ナイロン、無延伸ポリプロピレン（ＣＰＰ）、エチレン−ビニルアルコール共重合体（ＥＶＯＨ）、シリコーン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）およびポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）などからなるフィルムが含まれる。弾性フィルムの厚みは、特に制限されないが、例えば１００μｍ程度である。粘着フィルムの種類は、弾性フィルムと枠体４１とを互いに固定可能であれば特に制限されない。
前述のとおり、貯留部被覆フィルム４３は、通気孔４７を有する。貯留部被覆フィルム４３の構成は、特に制限されない。たとえば、貯留部被覆フィルム４３は、前述の液体注入部被覆フィルム４２と同様の２層フィルムであってもよい。
流路４４内に露出している金属膜３０には、第１の捕捉体が固定されている。第１の捕捉体は、検体中の被検出物質と特異的に結合するための認識部位を有する物質である。流路４４内に第１の捕捉体が固定されていると、流路４４内に検体を往復送液したときに、第１の捕捉体に被検出物質が選択的に結合する。つまり、被検出物質が流路４４内に捕捉される。これにより、後述のように被検出物質を検出することが可能となる。第１の捕捉体の種類は、被検出物質に特異的に結合するための認識部位を有していれば特に制限されない。第１の捕捉体の例には、被検出物質に特異的に結合可能な抗体（１次抗体）またはその断片、被検出物質に特異的に結合可能な酵素などが含まれる。流路４４の幅および高さは、特に制限されず、検出チップ１０の用途などに応じて適宜選択される。
液体注入部４５には、図６に示されるように、ピペットチップ１３４が挿入される。このとき、液体注入部４５の開口部（液体注入部被覆フィルム４２に設けられた貫通孔）はピペットチップ１３４の外周に隙間なく接触している。このため、ピペットチップ１３４から液体注入部４５内に液体を注入することで流路４４内に液体を導入することができ、液体注入部４５内の液体をピペットチップ１３４に吸引することで流路４４内の液体を除去することができる。また、液体の注入および吸引を交互に行うことで、流路４４内において液体を往復送液することもできる。液体注入部４５の形状および容積は、ピペットチップ１３４の形状などに合わせて適宜選択される。
液体注入部４５から流路４４内に流路４４の容積を超える量の液体が導入された場合、貯留部４６には流路４４から液体が流入する。また、流路４４内において液体を往復送液するときにも、貯留部４６には液体が流入する。貯留部４６に流入した液体は、貯留部４６内で攪拌される。貯留部４６内で液体が攪拌されると、流路４４を通過する液体（検体や洗浄液など）の成分（例えば被検出物質や洗浄成分など）の濃度が均一になり、流路４４内で各種反応が生じやすくなったり、洗浄効果が高まったりする。なお、貯留部４６の形状および容積は、液体の往復送液時に液体を十分に貯留可能であれば、特に制限されない。
検出チップ１０は、通常、測定のたびに交換される。また、検出チップ１０は、好ましくは各片の長さが数ｍｍ〜数ｃｍの構造物であるが、「チップ」の範疇に含まれないより小型の構造物またはより大型の構造物であってもよい。
（ＳＰＦＳ装置）
次に、ＳＰＦＳ装置１００の検出チップ以外の構成要素について説明する。前述のとおり、ＳＰＦＳ装置１００は、励起光照射ユニット１１０、蛍光検出ユニット１２０、送液ユニット１３０、搬送ユニット１４０および制御部１５０を有する。
励起光照射ユニット１１０は、チップホルダー１４２に保持された検出チップ１０に励起光αを照射する。蛍光βまたはプラズモン散乱光γの測定時には、励起光照射ユニット１１０は、金属膜３０に対する入射角がＳＰＲを生じさせる角度となるように、金属膜３０に対するＰ波のみを入射面２１に向けて出射する。ここで「励起光」とは、蛍光物質を直接または間接的に励起させる光である。たとえば、励起光αは、プリズム２０を介して金属膜３０にＳＰＲが生じる角度で照射されたときに、蛍光物質を励起させる局在場光を金属膜３０の表面上に生じさせる光である。励起光照射ユニット１１０は、光源ユニット１１１、角度調整機構１１２および光源制御部１１３を含む。
光源ユニット１１１は、コリメートされ、かつ波長および光量が一定の励起光αを、金属膜３０裏面における照射スポットの形状が略円形となるように出射する。光源ユニット１１１は、例えば、励起光αの光源、ビーム整形光学系、ＡＰＣ機構および温度調整機構（いずれも不図示）を含む。
光源の種類は、特に限定されず、例えばレーザーダイオード（ＬＤ）である。光源の他の例には、発光ダイオード、水銀灯、その他のレーザー光源が含まれる。光源から出射される光がビームでない場合は、光源から出射される光は、レンズや鏡、スリットなどによりビームに変換される。また、光源から出射される光が単色光でない場合は、光源から出射される光は、回折格子などにより単色光に変換される。さらに、光源から出射される光が直線偏光でない場合は、光源から出射される光は、偏光子などにより直線偏光の光に変換される。
ビーム整形光学系は、例えば、コリメーターやバンドパスフィルター、直線偏光フィルター、半波長板、スリット、ズーム手段などを含む。ビーム整形光学系は、これらのすべてを含んでいてもよいし、一部を含んでいてもよい。コリメーターは、光源から出射された励起光αをコリメートする。バンドパスフィルターは、光源から出射された励起光αを中心波長のみの狭帯域光にする。光源からの励起光αは、若干の波長分布幅を有しているためである。直線偏光フィルターは、光源から出射された励起光αを完全な直線偏光の光にする。半波長板は、金属膜３０にＰ波成分が入射するように励起光αの偏光方向を調整する。スリットおよびズーム手段は、金属膜３０裏面における照射スポットの形状が所定サイズの円形となるように、励起光αのビーム径や輪郭形状などを調整する。
ＡＰＣ機構は、光源の出力が一定となるように光源を制御する。より具体的には、ＡＰＣ機構は、励起光αから分岐させた光の光量を不図示のフォトダイオードなどで検出する。そして、ＡＰＣ機構は、回帰回路で投入エネルギーを制御することで、光源の出力を一定に制御する。
温度調整機構は、例えば、ヒーターやペルチェ素子などである。光源の出射光の波長およびエネルギーは、温度によって変動することがある。このため、温度調整機構で光源の温度を一定に保つことにより、光源の出射光の波長およびエネルギーを一定に制御する。
角度調整機構１１２は、金属膜３０（プリズム２０と金属膜３０との界面（成膜面２２））に対する励起光αの入射角を調整する。角度調整機構１１２は、プリズム２０を介して金属膜３０の所定の位置に向けて所定の入射角で励起光αを照射するために、励起光αの光軸とチップホルダー１４２とを相対的に回転させる。
たとえば、角度調整機構１１２は、光源ユニット１１１を励起光αの光軸と直交する軸（図３の紙面に対して垂直な軸）を中心として回動させる。このとき、入射角を走査しても金属膜３０上での照射スポットの位置がほとんど変化しないように、回転軸の位置を設定する。回転中心の位置を、入射角の走査範囲の両端における２つの励起光αの光軸の交点近傍（成膜面２２上の照射位置と入射面２１との間）に設定することで、照射位置のズレを極小化することができる。
前述のとおり、金属膜３０に対する励起光αの入射角のうち、プラズモン散乱光γの光量が最大となる角度が増強角である。励起光αの入射角を増強角またはその近傍の角度に設定することで、高強度の蛍光βを測定することが可能となる。検出チップ１０のプリズム２０の材料および形状、金属膜３０の膜厚、流路４４内の液体の屈折率などにより、励起光αの基本的な入射条件が決まるが、流路４４内の蛍光物質の種類および量、プリズム２０の形状誤差などにより、最適な入射条件はわずかに変動する。このため、測定ごとに最適な増強角を求めることが好ましい。
光源制御部１１３は、光源ユニット１１１に含まれる各種機器を制御して、光源ユニット１１１からの励起光αの出射を制御する。光源制御部１１３は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
蛍光検出ユニット１２０は、金属膜３０への励起光αの照射によって生じた蛍光βを検出する。また、必要に応じて、蛍光検出ユニット１２０は、金属膜３０への励起光αの照射によって生じたプラズモン散乱光γも検出する。蛍光検出ユニット１２０は、受光ユニット１２１、位置切り替え機構１２２およびセンサー制御部１２３を含む。
受光ユニット１２１は、検出チップ１０の金属膜３０の法線方向に配置される。受光ユニット１２１は、第１レンズ１２４、光学フィルター１２５、第２レンズ１２６および受光センサー１２７を含む。
第１レンズ１２４は、例えば、集光レンズであり、金属膜３０上から出射される光を集光する。第２レンズ１２６は、例えば、結像レンズであり、第１レンズ１２４で集光された光を受光センサー１２７の受光面に結像させる。両レンズの間の光路は、略平行な光路になっている。光学フィルター１２５は、両レンズの間に配置されている。
光学フィルター１２５は、蛍光成分のみを受光センサー１２７に導き、高いＳ（シグナル）／Ｎ（ノイズ）比で蛍光βを検出するために、励起光成分（プラズモン散乱光γ）を除去する。光学フィルター１２５の例には、励起光反射フィルター、短波長カットフィルターおよびバンドパスフィルターが含まれる。光学フィルター１２５は、例えば、所定の光成分を反射する多層膜を含むフィルター、または所定の光成分を吸収する色ガラスフィルターである。
受光センサー１２７は、蛍光βおよびプラズモン散乱光γを検出する。受光センサー１２７は、微小量の被検出物質からの微弱な蛍光βを検出することが可能な、高い感度を有する。受光センサー１２７は、例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ）やアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）などである。
位置切り替え機構１２２は、光学フィルター１２５の位置を、受光ユニット１２１における光路上または光路外に切り替える。具体的には、受光センサー１２７が蛍光βを検出する時には、光学フィルター１２５を受光ユニット１２１の光路上に配置し、受光センサー１２７がプラズモン散乱光γを検出する時には、光学フィルター１２５を受光ユニット１２１の光路外に配置する。
センサー制御部１２３は、受光センサー１２７の出力値の検出や、検出した出力値による受光センサー１２７の感度の管理、適切な出力値を得るための受光センサー１２７の感度の変更、などを制御する。センサー制御部１２３は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
送液ユニット１３０は、チップホルダー１４２に保持された検出チップ１０の液体注入部４５内に各種液体を注入して流路４４内に液体を導入する。また、送液ユニット１３０は、チップホルダー１４２に保持された検出チップ１０の液体注入部４５から各種液体を吸引して流路４４内の液体を除去する。また、送液ユニット１３０は、液体注入部４５内への液体の注入および液体注入部４５内の液体の吸引を交互に繰り返すことで、流路４４内において液体を往復送液する。本実施の形態では、送液ユニット１３０は、例えば検体や、洗浄液、蛍光物質で標識された第２の捕捉体を含む標識液（以下「標識液」ともいう）などの注入および吸引を行う。送液ユニット１３０は、液体チップ１３１、ピペット１３２およびピペット制御部１３３を含む。
液体チップ１３１は、検体や洗浄液、標識液などの液体をそれぞれ収容するための容器である。液体チップ１３１としては、通常、複数の容器が液体の種類に応じて配置されるか、または複数の容器が一体化したチップが配置される。
ピペット１３２は、ピペットチップ１３４およびシリンジポンプ１３５を有する。シリンジポンプ１３５内のプランジャーの往復運動によって、シリンジポンプ１３５（ピペット１３２）の先端に装着されたピペットチップ１３４における液体の吸引および排出が定量的に行われる。ピペットチップ１３４が交換可能であると、ピペットチップ１３４の洗浄が不要となる。このため、不純物の混入などを防止する観点から好ましい。ピペットチップ１３４が交換可能に構成されていない場合は、ピペットチップ１３４内を洗浄する構成をさらに付加することにより、ピペットチップ１３４を交換せずに使用することが可能となる。この場合は、ピペットチップ１３４とシリンジポンプ１３５とが固定または一体化されていてもよい。
本実施の形態では、ピペットチップ１３４を検出チップ１０の液体注入部４５内に挿入したときに、液体注入部４５の開口部（液体注入部被覆フィルム４２に設けられた貫通孔）とピペットチップ１３４の外周とが隙間なく接触する必要がある。そこで、ピペットチップ１３４のうち、検出チップ１０の液体注入部被覆フィルム４２と接触する領域は、外径が一定であることが好ましく、円柱形状であることが好ましい。なお、液体注入部被覆フィルム４２と接触しない領域では、外径が一定である必要はなく、任意の形状とすることができる。また、図６Ｃに示されるように、ピペットチップ１３４を数百μｍ程度上下方向（ピペットチップ１３４の軸方向）に移動させても、液体注入部４５の開口部（液体注入部被覆フィルム４２に設けられた貫通孔）とピペットチップ１３４の外周との間に隙間が生じないということであれば、ピペットチップ１３４の外形形状は、特に限定されず、例えば円錐台形状であってもよい。
ピペット制御部１３３は、シリンジポンプ１３５の駆動装置、およびピペット１３２の移動装置を含む。シリンジポンプ１３５の駆動装置は、シリンジポンプ１３５のプランジャーを往復運動させるための装置であり、例えば、ステッピングモーターを含む。ステッピングモーターを含む駆動装置は、ピペット１３２の送液量や送液速度を管理できるため、検出チップ１０の残液量を管理する観点から好ましい。ピペット１３２の移動装置は、例えば、ピペット１３２を、ピペットチップ１３４の軸方向（例えば垂直方向）と、軸方向を横断する方向（例えば水平方向）との二方向に自在に動かす。ピペット１３２の移動装置は、例えば、ロボットアーム、２軸ステージまたは上下動自在なターンテーブルによって構成される。
ピペット制御部１３３は、シリンジポンプ１３５を駆動して、液体チップ１３１から各種液体をピペットチップ１３４内に吸引させる。そして、ピペット制御部１３３は、ピペット１３２を移動させて、検出チップ１０の液体注入部４５内に開口部（液体注入部被覆フィルム４２に設けられた貫通孔）からピペットチップ１３４を挿入させるとともに、シリンジポンプ１３５を駆動して、ピペットチップ１３４内の液体を液体注入部４５内に注入させる。また、液体の供給後、ピペット制御部１３３は、シリンジポンプ１３５を駆動して、液体注入部４５内の液体をピペットチップ１３４内に吸引させる。ピペット制御部１３３は、シリンジポンプ１３５を駆動して、液体の注入および液体の吸引を交互に繰り返させることで、流路４４内において液体を往復送液させる。このように往復送液することによって、流路４４内を洗浄したり、流路４４内において第１の捕捉体と被検出物質を反応させたり、被検出物質と蛍光物質で標識された第２の捕捉体とを反応させたりする。流路４４内の液体を除去する場合は、この後説明するように、ピペット制御部１３３は、液体注入部４５内の液体をピペットチップ１３４内に吸引させた後、ピペット１３２を移動させて、ピペットチップ１３４をその軸方向に沿って２回以上往復移動させる。このようにすることで、流路４４内における気泡の発生を抑制することができる。
搬送ユニット１４０は、検出チップ１０を測定位置または送液位置に搬送し、固定する。ここで「測定位置」とは、励起光照射ユニット１１０が検出チップ１０に励起光αを照射し、それに伴い発生する蛍光βまたはプラズモン散乱光γを蛍光検出ユニット１２０が検出する位置である。また、「送液位置」とは、送液ユニット１３０が検出チップ１０の液体注入部４５内に液体を注入するか、または検出チップ１０の流路４４内の液体を液体注入部４５から吸引する位置である。搬送ユニット１４０は、搬送ステージ１４１およびチップホルダー１４２を含む。チップホルダー１４２は、搬送ステージ１４１に固定されており、検出チップ１０を着脱可能に保持する。チップホルダー１４２の形状は、検出チップ１０を保持することが可能であり、かつ励起光α、蛍光βおよびプラズモン散乱光γの光路を妨げない形状である。たとえば、チップホルダー１４２には、励起光α、蛍光βおよびプラズモン散乱光γが通過するための開口が設けられている。搬送ステージ１４１は、チップホルダー１４２を一方向およびその逆方向に移動させる。搬送ステージ１４１も、励起光α、蛍光βおよびプラズモン散乱光γの光路を妨げない形状である。搬送ステージ１４１は、例えば、ステッピングモーターなどで駆動される。
制御部１５０は、角度調整機構１１２、光源制御部１１３、位置切り替え機構１２２、センサー制御部１２３、ピペット制御部１３３および搬送ステージ１４１を制御する。制御部１５０は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
（液体の送液方法）
次に、上記検出チップ１０の流路４４に各種液体を送液する方法について説明する。説明の便宜上、流路４４内に液体６３が注入されており、流路４４内において液体６３が往復送液されている状態から説明を開始する。
図５は、本実施の形態に係る送液方法のフローチャートである。また、図６Ａ〜Ｄは、本実施の形態に係る送液方法を説明するための模式図である。図６Ａ〜Ｄのそれぞれにおいて、上の図は、液体注入部４５近傍における検出チップ１０の部分拡大縦断面図であり、下の図は、液体注入部４５の底部近傍における検出チップ１０の部分拡大横断面図である。
図６Ａに示されるように、流路４４内において往復送液している状態では、液体注入部被覆フィルム４２とピペットチップ１３４との間に隙間が生じないように、液体注入部４５に開口部（液体注入部被覆フィルム４２に設けられた貫通孔）からピペットチップ１３４が挿入されている。この状態でピペットチップ１３４により液体注入部４５内の液体６３の吸引および液体注入部４５内への液体６３の注入を交互に繰り返すことで、流路４４内において液体６３が往復送液される。このとき、貯留部被覆フィルム４３に通気孔４７が設けられているため、液体注入部４５内に液体６３を注入すると、液体注入部４５、流路４４および貯留部４６内の圧力が過度に高まることなく、液体６３は流路４４内を進行し、貯留部４６内に到達する。また、液体注入部４５内の液体６３を吸引すると、液体注入部４５、流路４４および貯留部４６内の圧力が過度に下がることなく、貯留部４６内の液体６３は流路４４内を進行し、液体注入部４５内に到達する。
次いで、図６Ｂに示されるように、液体注入部４５に挿入されているピペットチップ１３４により液体注入部４５内の液体６３を吸引して、流路４４内の液体６３を除去する（工程Ｓ１１０）。この工程も、液体注入部被覆フィルム４２とピペットチップ１３４との間に隙間が生じない状態で行われる。この工程により、液体注入部４５、流路４４および貯留部４６内の液体６３の大部分が除去されるが、ピペットチップ１３４の位置が固定されているため、液体注入部４５の底や流路４４の液体注入部４５側の端部に液体６３がわずかに残ってしまうことが多い。前述のとおり、このまま新しい液体の注入を行うと流路４４内において気泡６４が発生してしまうこととなる（図２Ｃおよび図２Ｄ参照）。このように流路４４内において気泡６４が発生してしまうと、流路４４内において適切に反応を生じさせることができなくなったり、蛍光を適切に検出できなくなったりするおそれがある（図１２および図１３参照）。そこで、本実施の形態に係る送液方法では、この気泡６４の発生を防ぐために、次工程でピペットチップの往復移動を行う。
次いで、図６Ｃに示されるように、ピペットチップ１３４をピペットチップ１３４の軸方向に沿って２回以上往復移動（上下移動）させる（工程Ｓ１２０）。また、この間に少なくとも１回は、ピペットチップ１３４により液体注入部４５内の流体（残っている液体６３および空気）を吸引する。この工程も、液体注入部被覆フィルム４２とピペットチップ１３４との間に隙間が生じない状態で行われる。ピペットチップ１３４を往復移動させることで、液体注入部４５内の圧力が変動して液体注入部４５または流路４４に残った液体６３の位置が変わる。これにより、ピペットチップ１３４が届かなかった液体６３も吸引できるようになる。また、図６Ｂの下の図に示されるように、流路４４内に残った液体６３により流路４４が塞がれていたとしても、図６Ｃの下の図に示されるように、空気の通り道が形成される。その結果、液体注入部４５および流路４４内に残った液体６３の量が減少するとともに、この後新しい液体の注入を行っても流路４４内において気泡６４が発生することがなくなる。
なお、本明細書において「ピペットチップの往復移動」とは、上方への移動および下方への移動を交互に繰り返すことを意味する。たとえば、往復移動を２回行う場合は、上方への移動、下方への移動、上方への移動および下方への移動をこの順で行うか、または下方への移動、上方への移動、下方への移動および上方への移動をこの順で行う。このように、ピペットチップを最初に移動させる方向は、上方であってもよいし下方であってもよい。また、往復移動前のピペットチップの位置と往復移動後のピペットチップの位置は、同じであってもよいし異なっていてもよい。
往復移動の回数は、２回以上であれば特に限定されないが、往復移動の効果を十分に発揮させる観点からは５回以上であることが好ましい。また、往復移動におけるピペットチップ１３４の上下方向の移動距離（液体注入部４５の底に最も接近している時のピペットチップ１３４の先端の位置と、液体注入部４５の底から最も離れている時のピペットチップ１３４の先端の位置との距離）は、特に限定されないが、往復移動の効果を十分に発揮させる観点からは２００μｍ以上であることが好ましい。
また、ピペットチップ１３４の先端が液体注入部４５の底に接触しないようにピペットチップ１３４を往復移動させてもよいし、ピペットチップ１３４の先端が液体注入部４５の底に接触するようにピペットチップ１３４を往復移動させてもよい。後者の場合は、ピペットチップ１３４の先端と液体注入部４５の底との間で接触と離間とが繰り返されるように、ピペットチップ１３４を往復移動させる。
液体注入部４５内の流体の吸引回数は、１回であってもよいが、複数回であることが好ましく、往復移動の回数と同じ回数であることがより好ましい。また、ピペットチップ１３４の往復移動中における流体の吸引のタイミングは、特に限定されないが、液体注入部４５および流路４４内に残った液体６３を除去する観点からは、ピペットチップ１３４が液体注入部４５の底に最も接近しているときか、またはピペットチップ１３４を液体注入部４５の底に向けて移動させている間であることが好ましい。また、液体注入部４５内の流体の吸引を複数回行う場合、１回あたりの吸引量は、特に限定されないが、液体注入部４５および流路４４内に残った液体６３を除去する観点からは、１０μＬ以上であることが好ましい。
次いで、古い液体６３を吸引したピペットチップ１３４を液体注入部４５から取り出し、ピペットチップ１３４内の古い液体６３を排出させる（工程Ｓ１３０）。そして、ピペットチップ１３４内に新しい液体６３’を採取させた後、新しい液体６３’を保持するピペットチップ１３４を液体注入部４５に開口部（液体注入部被覆フィルム４２に設けられた貫通孔）から挿入する（工程Ｓ１４０）。
次いで、図６Ｄに示されるように、液体注入部４５に挿入されているピペットチップ１３４から液体注入部４５内に液体６３’を注入して、流路４４内に液体６３’を導入する（工程Ｓ１５０）。この工程も、液体注入部被覆フィルム４２とピペットチップ１３４との間に隙間が生じない状態で行われる。前述のとおり、仮に流路４４内に古い液体６３が残っていたとしても、空気の通り道が形成されているため、ピペットチップ１３４の挿入および新しい液体６３’の注入に伴う液体注入部４５内の圧力の増大により古い液体６３が貯留部４６に向かって押し出されることはない。したがって、古い液体６３はその場に留まり、流路４４内を進行する新しい液体６３’と合わさる。このため、古い液体６３と新しい液体６３’との間に気泡６４が形成されることはない（図２Ｄと図６Ｄとを比較参照）。
以上の手順により、流路４４内に気泡を発生させることなく、流路４４内の液体６３の除去および流路４４内への液体６３の導入を行うことができる。
なお、ピペットチップ１３４を往復移動させる工程（工程Ｓ１２０）において、ピペットチップ１３４の先端が液体注入部４５の底に接触しないようにピペットチップ１３４を往復移動させる場合は、その前に行う液体注入部４５内の液体６３を吸引する工程（工程Ｓ１１０）において、液体注入部４５の底の位置を検出しておくことが好ましい。たとえば、図７Ａ〜Ｄに示されるように、液体注入部４５内の液体６３を吸引する工程（工程Ｓ１１０）において、ピペットチップ１３４を液体注入部４５の底に少なくとも１回接触させることで液体注入部４５の底の位置を検出してもよい。また、図８Ａ〜Ｄに示されるように、液体注入部４５内の液体６３を吸引する工程（工程Ｓ１１０）において、ピペットチップ１３４を液体注入部４５の底に向けて移動させながらピペットチップ１３４内の圧力変化を検出することで液体注入部４５の底の位置を検出してもよい。具体的には、液体６３を吸引しながらピペットチップ１３４の先端を液体注入部４５の底に向けて移動させると、ピペットチップ１３４の先端が液体注入部４５の底に接触する直前に負圧量が顕著に増大する。この負圧量の変化により、液体注入部４５の底の位置を検出することができる。
図７Ａ〜Ｄは、本実施の形態の変形例に係る送液方法を説明するための模式図である。この変形例では、図７Ａに示されるように、液体６３の吸引を開始する前に、ピペットチップ１３４の先端を液体注入部４５の底に接触させる。この状態で液体６３の吸引を開始する。その後、図７Ｂに示されるように、ピペットチップ１３４を液体注入部４５の開口部に向けて移動させる。ピペットチップ１３４の先端が液体注入部４５の底に接触している状態では、ピペットチップ１３４の内部の負圧量が大きいが、ピペットチップ１３４の先端が液体注入部４５の底から離れると、ピペットチップ１３４の内部の負圧量が顕著に減少する。したがって、ピペットチップ１３４またはシリンジポンプ１３５内の圧力を測定することで、液体注入部４５の底の位置を検出することができる。このように、本変形例に係る送液方法では、液体注入部４５内の液体６３を吸引する工程（工程Ｓ１１０）において、液体注入部４５の底の位置の検出も同時に行う。図７Ｃに示されるように、ピペットチップ１３４を往復移動させる工程（工程Ｓ１２０）では、ピペットチップ１３４の先端が液体注入部４５の底に接触しないようにピペットチップ１３４を往復移動させる。以後の工程（工程Ｓ１３０〜Ｓ１５０）は、すでに説明した工程と同じである（図７Ｄ参照）。
図８Ａ〜Ｄは、本実施の形態の他の変形例に係る送液方法を説明するための模式図である。この変形例では、図８Ａに示されるように、液体６３を吸引しながら、ピペットチップ１３４の先端を液体注入部４５の底に向けて移動させる。そして、ピペットチップ１３４内の負圧量が顕著に増大したときのピペットチップ１３４の先端の位置を液体注入部４５の底の位置と判断する。この後、図８Ｂに示されるように、ピペットチップ１３４の先端の位置を液体注入部４５の底から離した状態で液体６３の吸引を行う（工程Ｓ１１０）。図８Ｃに示されるように、ピペットチップ１３４を往復移動させる工程（工程Ｓ１２０）では、ピペットチップ１３４の先端が液体注入部４５の底に接触しないようにピペットチップ１３４を往復移動させる。以後の工程（工程Ｓ１３０〜Ｓ１５０）は、すでに説明した工程と同じである（図８Ｄ参照）。
また、ピペットチップ１３４を液体注入部４５に挿入したままピペットチップ１３４内の古い液体６３を新しい液体６３’に交換する場合、または流路４４からピペットチップ１３４内に吸引した古い液体６３を再度流路４４内に導入する場合は、工程Ｓ１３０および工程Ｓ１４０を省略してもよい。
（検出方法）
次に、ＳＰＦＳ装置１００（検出装置、検出システム）を用いた被検出物質の検出方法について説明する。図９は、本実施形態の検出方法を行う際のＳＰＦＳ装置１００の動作手順の一例を示すフローチャートである。
まず、検出の準備をする（工程Ｓ１０）。具体的には、ＳＰＳＦ装置１００のチップホルダー１４２に前述の検出チップ１０を設置する。また、検出チップ１０の流路４４内に保湿剤が存在する場合には、流路４４内を洗浄して保湿剤を除去する。
次いで、検出チップ１０の金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角を増強角に設定する（工程Ｓ２０）。具体的には、制御部１５０が、搬送ステージ１４１を制御して、検出チップ１０を設置位置から検出位置に移動させる。この後、制御部１５０が、光源制御部１１３および角度調整部１１２を制御して、光源ユニット１１１から励起光αを金属膜３０（成膜面２２）の所定の位置に照射しながら、金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角を走査する。このとき、制御部１５０は、位置切替え機構１２２を制御して、光学フィルター１２５を受光ユニット１２１の光路外に移動させる。これとともに、制御部１５０は、センサー制御部１２３を制御して、受光センサー１２７でプラズモン散乱光γを検出する。制御部１５０は、励起光αの入射角とプラズモン散乱光γの強度との関係を含むデータを得る。そして、制御部１５０は、データを解析して、プラズモン散乱光γの強度が最大となる入射角（増強角）を決定する。最後に、制御部１５０は、角度調整部１１２を制御して、金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角を増強角に設定する。
増強角は、プリズム２０の素材および形状、金属膜３０の厚み、流路４４内の液体の屈折率などにより決まるが、流路４４内の液体の種類および量、プリズム２０の形状誤差などの各種要因によりわずかに変動する。このため、検出を行うたびに増強角を決定することが好ましい。増強角は、０.１°程度のオーダーで決定される。
次いで、検出チップ１０の流路４４に前述の送液方法により検体を提供し、検出チップ１０内の金属膜３０上に固定された第１の捕捉体に、検体中に含まれる被検出物質を特異的に結合させる（１次反応（工程Ｓ３０））。なお、被検出物質を結合させた後、流路４４内に前述の送液方法により緩衝液などを提供し、流路４４内を洗浄して、遊離の被検出物質などを除去する。
検体および被検出物質の種類は、特に限定されない。検体の例には、血液や血清、血漿、尿、鼻孔液、唾液、精液などの体液およびその希釈液が含まれる。またこれらの検体に含まれる被検出物質の例には、核酸（ＤＮＡやＲＮＡなど）、タンパク質（ポリペプチドやオリゴペプチドなど）、アミノ酸、糖質、脂質およびこれらの修飾分子が含まれる。
次いで、光学ブランク値を測定する（工程Ｓ４０）。具体的には、制御部１５０が、搬送ステージ１４１を制御して、検出チップ１０を設置位置から検出位置に移動させる。この後、制御部１５０が、光源制御部１１３を制御して、金属膜３０（成膜面２２）に向けて光源ユニット１１１から、増強角で励起光αを出射させる。これと同時に、制御部１５０は、センサー制御部１２３を制御して、受光センサー１２７で光の光量を検出し、これをブランク値として記録する。
次いで、金属膜３０上の第１の捕捉体に結合した被検出物質に、蛍光物質で標識された第２の捕捉体を結合させる（２次反応（工程Ｓ５０））。具体的には、制御部１５０が、搬送ステージ１４１を制御して、検出チップ１０を検出位置から送液位置に移動させる。この後、制御部１５０は、ピペット制御部１３３を制御して、第２の捕捉体を含む標識液を前述の送液方法により流路４４内に提供する。ここで、第２の捕捉体は、被検出物質の、第１の捕捉体が特異的に結合する部位とは異なる部位に、特異的に結合する物質である。また、第２の捕捉体には、蛍光物質が結合している。したがって、標識液を流路４４に提供すると、第１の捕捉体に結合している被検出物質に第２の捕捉体が特異的に結合し、被検出物質が、間接的に蛍光物質で標識される。なお、被検出物質を蛍光物質で標識した後、流路４４内に前述の送液方法により緩衝液などを提供し、流路４４内を洗浄して、遊離の第２の捕捉体などを除去する。
第２の捕捉体は、第１の捕捉体が被検出物質に特異的に結合する部位とは異なる部位に、特異的に結合する物質であればよく、被検出物質に特異的な生体分子であってもよく、その断片などであってもよい。また、第２の捕捉体は、１分子からなるものであってもよく、２以上の分子が結合した複合体であってもよい。
次いで、流路４４の底面（金属膜３０）上に、蛍光物質で標識された被検出物質が第１の捕捉体を介して配置された状態で、プリズム２０を通して励起光αを増強角で金属膜３０（成膜面２２）に照射する。そして、被検出物質を標識する蛍光物質からの蛍光値を測定する（工程Ｓ６０）。具体的には、制御部１５０が、搬送ステージ１４１を制御して、検出チップ１０を送液位置から検出位置に移動させる。この後、制御部１５０は、光源制御部１１３を制御して、金属膜３０（成膜面２２）に向けて光源ユニット１１１から励起光αを出射させる。これと同時に、制御部１５０は、センサー制御部１２３を制御して、受光センサー１２７で蛍光βと同じ波長の光の光量を検出する。
最後に、被検出物質の存在または量を算出する（工程Ｓ７０）。蛍光値は、主として、被検出物質を標識する蛍光物質に由来する蛍光成分（シグナル値）と、光学ブランク値とを含む。したがって、制御部１５０は、工程Ｓ６０で得られた蛍光値から工程Ｓ４０で得られた光学ブランク値を引くことで、被検出物質の量に相関するシグナル値を算出することができる。そして、あらかじめ作成しておいた検量線により、被検出物質の量や濃度などに換算する。
以上の手順により、検体に含まれる被検出物質の存在または量を検出することができる。
（効果）
以上のように、本実施の形態の送液方法によれば、流路内に気泡を発生させることなく、流路内の液体の除去および流路内への液体の注入を行うことができる。したがって、本実施の形態の送液方法を利用する検出装置（検出システム）および検出方法では、気泡によるシグナルの低下による影響を抑制して、被検出物質を高精度に検出することができる。
なお、上記実施の形態では、ＳＰＦＳを利用した検出装置および検出方法について説明したが、検出方法や検出装置は、これらに限定されない。本発明は、ＥＬＩＳＡ法やＲＩｆＳ法、ＳＰＲ法、ＱＣＭなどを利用した検出装置および検出方法にも適用できる。
以下、本発明について実施例を参照して詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されない。
以下の実施例１〜８では、図４に示される構成の検出チップを用いて、流路内からの液体の除去およびピペットチップの往復移動を行った後に、液体注入部および流路内に残った液体の量を測定した。また、その後に流路内に液体を導入して、流路内に気泡が発生したか否かを観察した。同様に、以下の比較例１，２では、同じ検出チップを用いて、流路内からの液体の除去のみを行った後に、液体注入部および流路内に残った液体の量を測定した。また、その後に流路内に液体を導入して、流路内に気泡が発生したか否かを観察した。
（実施例１）
検出チップの液体注入部の底面から２００μｍの位置にピペットチップの先端が位置するようにピペットチップを位置決めした状態で、液体注入部内の液体を５００μＬ／分の速度で２００μＬ吸引して流路内の液体を除去した（図６Ａおよび図６Ｂ参照）。
次いで、ピペットチップを下方に２００μｍ移動させた後、上方に２００μｍ移動させる工程を５回繰り返した（図６Ｃ参照）。プログラム上では、ピペットチップを４００μｍ移動させて液体注入部の底面の下２００μｍの位置まで移動するように設定されているが、実際はピペットチップは２００μｍ下方に移動すると液体注入部の底面にぶつかるため、それ以上下方に移動することはできない。このようにプログラムを設定することで、ピペットチップの先端が液体注入部の底面に確実に接触するように実験を行った。５回の往復移動の間、液体注入部の開口部（液体注入部被覆フィルムに設けられた貫通孔）とピペットとの間に隙間が生じることはなかった。また、ピペットチップを下方に移動させるたびに、液体注入部内の流体を毎回１５μＬ吸引した（移動と吸引が同じタイミング）。
この後、液体注入部および流路内に残った液体の量を測定したところ、残液量は１.５〜３.０μＬであった。また、流路内に液体を導入して、流路内に気泡が発生するか否かを観察したところ、流路内に気泡は１つも発生しなかった（表１参照）。
（実施例２）
５回の往復移動の間、ピペットチップを下方に移動させた後に、液体注入部内の流体を毎回１５μＬ吸引した（移動と吸引が異なるタイミング）点を除いては、実施例１と同様の手順で流路内の液体を除去した。
この後、液体注入部および流路内に残った液体の量を測定したところ、残液量は１.５〜３.２μＬであった。また、流路内に液体を導入して、流路内に気泡が発生するか否かを観察したところ、流路内に気泡は１つも発生しなかった（表１参照）。
（実施例３）
ピペットチップの往復移動の回数が２回である点を除いては、実施例２と同様の手順で流路内の液体を除去した。
この後、液体注入部および流路内に残った液体の量を測定したところ、残液量は１.７〜３.８μＬであった。また、流路内に液体を導入して、流路内に気泡が発生するか否かを観察したところ、流路内に気泡は１つも発生しなかった（表１参照）。
（実施例４）
ピペットチップの往復移動の回数が３回である点を除いては、実施例２と同様の手順で流路内の液体を除去した。
この後、液体注入部および流路内に残った液体の量を測定したところ、残液量は１.７〜３.５μＬであった。また、流路内に液体を導入して、流路内に気泡が発生するか否かを観察したところ、流路内に気泡は１つも発生しなかった（表１参照）。
（実施例５）
ピペットチップの往復移動の回数が４回である点を除いては、実施例２と同様の手順で流路内の液体を除去した。
この後、液体注入部および流路内に残った液体の量を測定したところ、残液量は１.６〜３.２μＬであった。また、流路内に液体を導入して、流路内に気泡が発生するか否かを観察したところ、流路内に気泡は１つも発生しなかった（表１参照）。
（実施例６）
実施例１と同様の手順で、流路内の液体を除去した（図６Ａおよび図６Ｂ参照）。次いで、１回ピペットチップを上方に３００μｍ移動させた。次いで、ピペットチップを下方に４００μｍ移動させた後、上方に４００μｍ移動させる工程を５回繰り返した（図６Ｃ参照）。５回の往復移動の間、ピペットチップは液体注入部内の底面に接触しなかった。また、５回の往復移動の間、液体注入部の開口部（液体注入部被覆フィルムに設けられた貫通孔）とピペットとの間に隙間が生じることはなかった。実施例２と同様に、５回の往復移動の間、ピペットチップを下方に移動させた後に、液体注入部内の流体を毎回１５μＬ吸引した（移動と吸引が異なるタイミング）。
この後、液体注入部および流路内に残った液体の量を測定したところ、残液量は１.７〜３.４μＬであった。また、流路内に液体を導入して、流路内に気泡が発生するか否かを観察したところ、流路内に気泡は１つも発生しなかった（表１参照）。
（実施例７）
検出チップの液体注入部の底面にピペットチップの先端が接触するようにピペットチップを位置決めした状態で、シリンジポンプを４８００μＬ／分の速度で８０μＬ吸引してピペットチップ内部を負圧にした（図７Ａ参照）。プログラム上では、ピペットチップの先端が液体注入部の底面の下１００μｍとなるように設定されているが、実際はピペットチップは液体注入部の底面より下方に移動することはできない。このようにプログラムを設定することで、ピペットチップの先端が液体注入部の底面に確実に接触するように実験を行った。
次いで、ピペットチップ内の負圧が解消するまでピペットチップを上方に移動させて、液体注入部の底面の位置を検出した。その後、ピペットチップの位置はそのままの状態で、液体注入部内の液体を５００μＬ／分の速度で１２０μＬ吸引して流路内の液体を除去した（図７Ｂ参照）。図１０は、ピペットチップ内の圧力の経時的変化を示すグラフである。横軸は時間を示し、縦軸は大気圧に対する差圧を示している。このグラフから、ピペットチップの先端が液体注入部の底面から離れると（４〜５秒の時点）、ピペットチップ内の負圧が解消することがわかる。
次いで、ピペットチップを上方に４００μｍ移動させた後、下方に４００μｍ移動させる工程を５回繰り返した（図７Ｃ参照）。５回の往復移動の間、ピペットチップは液体注入部内の底面に接触しなかった。また、５回の往復移動の間、液体注入部の開口部（液体注入部被覆フィルムに設けられた貫通孔）とピペットとの間に隙間が生じることはなかった。実施例１と同様に、ピペットチップを下方に移動させるたびに、液体注入部内の流体を毎回１５μＬ吸引した（移動と吸引が同じタイミング）。
この後、液体注入部および流路内に残った液体の量を測定したところ、残液量は１.５〜３.０μＬであった。また、流路内に液体を導入して、流路内に気泡が発生するか否かを観察したところ、流路内に気泡は１つも発生しなかった（表１参照）。
（実施例８）
検出チップの液体注入部の底面から約５００μｍの位置にピペットチップの先端が位置するようにピペットチップを位置決めした状態で、液体注入部内の液体を５００μＬ／分の速度で８０μＬ吸引しながらピペットチップを８ｍｍ／秒の速度で５０μｍずつ段階的に下方に移動させた（図８Ａ参照）。そして、ピペットチップ内の負圧が顕著に増大するまでピペットチップを下方に移動させて、液体注入部の底面の位置を検出した。その後、ピペットチップの位置を上方に１００μｍ移動させた後、液体注入部内の液体を５００μＬ／分の速度で１２０μＬ吸引して流路内の液体を除去した（図８Ｂ参照）。図１１は、ピペットチップ内の圧力の経時的変化を示すグラフである。横軸は時間を示し、縦軸は大気圧に対する差圧を示している。このグラフから、ピペットチップの先端が液体注入部の底面に近づくと（１５〜１７秒の時点）、ピペットチップ内の負圧が顕著に増大することがわかる。
次いで、ピペットチップを上方に４００μｍ移動させた後、下方に４００μｍ移動させる工程を５回繰り返した（図８Ｃ参照）。５回の往復移動の間、ピペットチップは液体注入部内の底面に接触しなかった。また、５回の往復移動の間、液体注入部の開口部（液体注入部被覆フィルムに設けられた貫通孔）とピペットとの間に隙間が生じることはなかった。実施例１と同様に、ピペットチップを下方に移動させるたびに、液体注入部内の流体を毎回１５μＬ吸引した（移動と吸引が同じタイミング）。
この後、液体注入部および流路内に残った液体の量を測定したところ、残液量は１.５〜３.０μＬであった。また、流路内に液体を導入して、流路内に気泡が発生するか否かを観察したところ、流路内に気泡は１つも発生しなかった（表１参照）。
（比較例１）
５回の往復移動を行わなかった点を除いては、実施例１と同様の手順で流路内の液体を除去した。
この後、液体注入部および流路内に残った液体の量を測定したところ、残液量は３.５〜６.０μＬであった。また、流路内に液体を導入して、流路内に気泡が発生するか否かを観察したところ、流路内に気泡が発生した（表１参照）。
（比較例２）
ピペットチップの往復移動の回数が１回である点を除いては、実施例１と同様の手順で流路内の液体を除去した。
この後、液体注入部および流路内に残った液体の量を測定したところ、残液量は２.５〜４.８μＬであった。また、流路内に液体を導入して、流路内に気泡が発生するか否かを観察したところ、流路内に気泡が発生した（表１参照）。
Figure 0006642592
これらの実施例および比較例の結果から、液体注入部および流路内の液体を吸引した後に、ピペットチップの往復移動を２回以上行いながら吸引をさらに行うことで、液体注入部および流路内の残液量を低減すること、および流路内における気泡の発生を抑制できることがわかる。また、ピペットチップの往復移動の際に、ピペットチップを下方に移動させながら吸引を行うことで、残液量をより低減できることもわかる（実施例１、実施例７および実施例８）。
図１２および図１３は、比較例１の手順で送液を行ってＳＰＦＳにより被検出物質を検出したときの、シグナル値への気泡の影響を示すグラフである。図１２は、１次反応のときの流路の測定領域（第１の捕捉体が固定化されている領域）における気泡の面積と、シグナル値の変化との関係を示すグラフである。点線は、線形近似曲線を示している。図１３は、シグナル測定時における流路の測定領域における気泡の面積と、シグナル値の変化との関係を示すグラフである。点線は、多項式近似曲線を示している。図１２に示されるグラフから、流路内に気泡が発生すると反応を適切に行うことができず、シグナル値が低下してしまうことがわかる。また、図１３に示されるグラフから、流路内に気泡が発生すると蛍光を適切に検出することができず、シグナル値が低下してしまうことがわかる。
本発明に係る送液方法、検出システムおよび検出装置によれば、流路内に気泡を発生させることなく、流路内に液体を導入することができる。したがって、本発明に係る送液方法、検出システムおよび検出装置は、各種被検出物質を検出するための検出装置や、検出装置に検体などを送液する方法などとして、非常に有用である。
１０ 検出チップ
２０ プリズム
２１ 入射面
２２ 成膜面
２３ 出射面
３０ 金属膜
４０ 流路蓋
４１ 枠体
４２ 液体注入部被覆フィルム
４３ 貯留部被覆フィルム
４４ 流路
４５ 液体注入部
４６ 貯留部
４７ 通気孔
５０ 接着層
６０ 第１の捕捉体
６１ 被検出物質
６２ 第２の捕捉体
６３，６３’ 液体
６４ 気泡
１００ ＳＰＦＳ装置
１１０ 光照射ユニット
１１１ 光源ユニット
１１２ 角度調整機構
１１３ 光源制御部
１２０ 蛍光検出ユニット
１２１ 受光ユニット
１２２ 位置切り替え機構
１２３ センサー制御部
１２４ 第１レンズ
１２５ 光学フィルター
１２６ 第２レンズ
１２７ 受光センサー
１３０ 送液ユニット
１３１ 液体チップ
１３２ ピペット
１３３ ピペット制御部
１３４ ピペットチップ
１３５ シリンジポンプ
１４０ 搬送ユニット
１４１ 搬送ステージ
１４２ チップホルダー
１５０ 制御部
α 励起光
β 蛍光
γ プラズモン散乱光

Claims (18)

  1. 流路と、前記流路の一端に接続され、かつ開口部を有する液体注入部とを有する検出用チップの前記液体注入部に前記開口部から挿入されたピペットチップにより、前記開口部と前記ピペットチップとの間に隙間が無い状態で前記液体注入部内の液体を吸引して、前記流路内の液体を除去する第１工程と、
    前記第１工程の後に、前記開口部と前記ピペットチップとの間に隙間が生じないように、前記ピペットチップを前記ピペットチップの軸方向に沿って２回以上往復移動させるとともに、その間に少なくとも１回は前記ピペットチップにより前記液体注入部内の流体を吸引する第２工程と、
    前記第２工程の後に、前記開口部と前記ピペットチップとの間に隙間が無い状態で、前記ピペットチップから前記液体注入部内に液体を注入して、前記流路内に液体を導入する第３工程と、
    を有する、送液方法。
  2. 前記第２工程において、前記ピペットチップが前記液体注入部の底に最も接近しているときに、前記ピペットチップにより前記液体注入部内の流体を吸引する、請求項１に記載の送液方法。
  3. 前記第２工程において、前記ピペットチップを前記液体注入部の底に向けて移動させている間に、前記ピペットチップにより前記液体注入部内の流体を吸引する、請求項１に記載の送液方法。
  4. 前記第２工程において、前記ピペットチップを前記液体注入部の底に接触するように往復移動させる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の送液方法。
  5. 前記第１工程において、前記ピペットチップを前記液体注入部の底に少なくとも１回接触させることで前記液体注入部の底の位置を検出し、
    前記第２工程において、前記ピペットチップを前記液体注入部の底に接触しないように往復移動させる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の送液方法。
  6. 前記第１工程において、前記ピペットチップを前記軸方向に沿って移動させながら前記ピペットチップ内の圧力変化を検出することで前記液体注入部の底の位置を検出し、
    前記第２工程において、前記ピペットチップを前記液体注入部の底に接触しないように往復移動させる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の送液方法。
  7. 前記第２工程において、前記ピペットチップを５回以上往復移動させる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の送液方法。
  8. 前記第２工程において、前記ピペットチップにより前記液体注入部内の流体を複数回吸引し、
    前記第２工程において、前記ピペットチップによる１回あたりの吸引量は、１０μＬ以上である、
    請求項１〜７のいずれか一項に記載の送液方法。
  9. 前記第２工程において、前記液体注入部の底に最も接近している時の前記ピペットチップの先端の位置と、前記液体注入部の底から最も離れている時の前記ピペットチップの先端の位置との距離は、２００μｍ以上である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の送液方法。
  10. 前記開口部は、前記開口部から前記液体注入部に前記ピペットチップが挿入されている状態においては、前記開口部と前記ピペットチップとの間に隙間が生じないように構成されている、請求項１〜９のいずれか一項に記載の送液方法。
  11. 前記開口部は、前記ピペットチップが挿入されている状態においては、前記ピペットチップの外周に隙間なく密着する密着部材をさらに有し、
    前記流路内に液体を導入する、または前記流路内から液体を除去する場合、前記ピペットチップは、前記密着部材を貫通して前記液体注入部に挿入される、
    請求項１０に記載の送液方法。
  12. 前記密着部材は、弾性フィルムである、請求項１１に記載の送液方法。
  13. 流路と、前記流路の一端に接続され、かつ開口部を有する液体注入部とを有する検出用チップと、
    その先端にピペットチップを装着された、前記液体注入部内に液体を注入、および前記液体注入部から液体を吸引するためのピペットと、
    前記ピペットを制御するためのピペット制御部と、
    を有し、
    前記流路内に液体を導入する場合、前記ピペット制御部は、前記開口部と前記ピペットチップとの間に隙間が生じないように前記液体注入部に前記ピペットチップが前記開口部から挿入されている状態で、前記ピペットに前記液体注入部内に液体を注入させ、
    前記流路内から液体を除去する場合、前記ピペット制御部は、前記開口部と前記ピペットチップとの間に隙間が生じないように前記液体注入部に前記ピペットチップが前記開口部から挿入されている状態で、前記ピペットに前記液体注入部内の液体を吸引させ、次いで、前記開口部と前記ピペットチップとの間に隙間が生じないように、前記ピペットに前記ピペットチップを前記ピペットチップの軸方向に沿って２回以上往復移動させるとともに、その間に少なくとも１回は前記液体注入部内の流体を吸引させ、
    前記開口部は、前記開口部から前記液体注入部に前記ピペットチップが挿入されている状態においては、前記開口部と前記ピペットチップとの間に隙間が生じないように構成されている、
    検出システム。
  14. 前記開口部は、前記ピペットチップが挿入されている状態においては、前記ピペットチップの外周に隙間なく密着する密着部材をさらに有し、
    前記流路内に液体を導入する、または前記流路内から液体を除去する場合、前記ピペットチップは、前記密着部材を貫通して前記液体注入部に挿入される、
    請求項１３に記載の検出システム。
  15. 前記密着部材は、弾性フィルムである、請求項１４に記載の検出システム。
  16. 流路と、前記流路の一端に接続され、かつ開口部を有する液体注入部とを有する検出用チップを保持するためのチップホルダーと、
    その先端にピペットチップを装着することが可能であり、前記チップホルダーに保持された前記検出用チップの前記液体注入部内に液体を注入、および前記液体注入部から液体を吸引するためのピペットと、
    前記ピペットを制御するためのピペット制御部と、
    を有し、
    前記流路内に液体を導入する場合、前記ピペット制御部は、前記開口部と前記ピペットチップとの間に隙間が生じないように前記液体注入部に前記ピペットチップが前記開口部から挿入されている状態で、前記ピペットに前記液体注入部内に液体を注入させ、
    前記流路内から液体を除去する場合、前記ピペット制御部は、前記開口部と前記ピペットチップとの間に隙間が生じないように前記液体注入部に前記ピペットチップが前記開口部から挿入されている状態で、前記ピペットに前記液体注入部内の液体を吸引させ、次いで、前記開口部と前記ピペットチップとの間に隙間が生じないように、前記ピペットに前記ピペットチップを前記ピペットチップの軸方向に沿って２回以上往復移動させるとともに、その間に少なくとも１回は前記液体注入部内の流体を吸引させ、
    前記開口部は、前記開口部から前記液体注入部に前記ピペットチップが挿入されている状態においては、前記開口部と前記ピペットチップとの間に隙間が生じないように構成されている、
    検出装置。
  17. 前記開口部は、前記ピペットチップが挿入されている状態においては、前記ピペットチップの外周に隙間なく密着する密着部材をさらに有し、
    前記流路内に液体を導入する、または前記流路内から液体を除去する場合、前記ピペットチップは、前記密着部材を貫通して前記液体注入部に挿入される、
    請求項１６に記載の検出装置。
  18. 前記密着部材は、弾性フィルムである、請求項１７に記載の検出装置。
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