JPWO2013062105A1 - シリカ球状体及びアフィニティ担体 - Google Patents
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Abstract
Description
る。
ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート、ポリオキシエチレンソルビタンステアレート等のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル系、
ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンオクチルフェノールエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェノールエーテル等のポリオキシエチレン高級アルコールエーテル系、
ポリオキシエチレングリコールモノラウレート、ポリオキシエチレングリコールモノステアレート、ポリオキシエチレングリコールモノオレート等のポリオキシエチレン脂肪族エステル系、
ステアリン酸モノグリセライド、オレイン酸モノグリセライド等のグリセリン脂肪酸エステル系等を挙げることができる。
さらに、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル系、ショ糖脂肪酸エステル系、ポリグリセリン脂肪酸エステル系ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油系等を用いてもよい。
(1)分散相及び連続相の調製
分散相として、3号ケイ酸ソーダ(AGCエスアイテック社製)を水で希釈し、SiO2濃度16.9質量%、Na2O濃度6.13質量%(SiO2/Na2Oモル比=2.85)、比重1.222のケイ酸ナトリウム溶液を調製した。
分散相と連続相とを乳化するために用いた乳化装置を図1に示す。
上記(2)で作製した乳化装置を水平に置いて使用し、連続相供給部5より上記(1)で調製した連続相を供給し、分散相供給部7より微小孔部4aを通して上記(1)で調製したケイ酸ナトリウム溶液からなる分散相を供給することで、ケイ酸ナトリウム溶液が連続相中に分散したW/O型エマルションを連続的に製造した。このとき、連続相の供給量は1流路3aあたり642mL/hであり、流路における流れ方向の流速は3m/sであった。実験は常温で行い、このとき、分散相の供給量は微小孔部4aの1個あたり10.4μL/hであった。
平均粒子径:40.6μm
均等係数(D10/90):1.31
平均細孔径:15.6nm
細孔容積:1.16mL/g
比表面積:298m2/g
また、平均細孔径、細孔容積及び比表面積は、オートポアIV9510(島津製作所社製)を用いて水銀圧入法によって測定した。以下同じである。
上記した乳化工程で得られた乳化後シリカ球状体34.5gに、1.5質量%の塩化ナトリウム(NaCl)水溶液をSiO2に対して0.7質量%になるように加え、180℃で一昼夜乾燥させた。それを坩堝に入れ、180℃で6.5時間保持した後、730℃で13時間焼成を行った。過剰のナトリウム分を除去するため、18%の塩酸水溶液で2時間還流処理を行った。ろ過・洗浄後、所定量の0.85Mの水酸化ナトリウム(NaOH)水溶液に25℃で24時間浸漬させた。ろ過後、pH1.5の硫酸水溶液で洗浄し、シリカ球状体の最終品を得た。
平均粒子径:34.4μm
均等係数(D10/90):1.31
平均細孔径:105.0nm
細孔容積:1.64mL/g
比表面積:60m2/g
得られたシリカ球状体10gに80mLのトルエン、4.62mLのジイソプロピルエチルアミン、6.00mLのγ−グリシドキシプロピルトリメトキシシランを加えて、4.5時間還流させた。放冷後、ろ過し、200mLのトルエン、100mLのテトラヒドロフラン(THF)、130mLのメタノールで洗浄し、70℃で乾燥させた。
リンカー固定化量:260μmol/g
得られたリンカー導入シリカ球状体4gに0.2M炭酸水素緩衝液、ならびに充填容積あたり12mg/mL−bedに相当するリコンビナントプロテインA(U.S.5,084,559号公報に記載の方法によって作製したもの)を加え、室温で3時間撹拌した。ろ過・水洗した後、16mLの0.5質量%の塩酸水溶液に室温で一昼夜浸漬させ、残存するエポキシ基を失活させた。ろ過した後、130mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH7.4)、130mLのクエン酸緩衝液(pH2.2)、再度130mLのPBS、60mLの50mM NaOH水溶液、130mLの蒸留水で洗浄した。1%ベンジルアルコールを含む0.1M酢酸緩衝液(pH5.2)中で冷蔵保存した。
リガンド固定化量:11.5mg/mL−bed
静的結合容量(SBC):88mg/mL−bed
上記した製造例1による実施例のアフィニティ担体の作製において、シリカ球状体の最終品として、AGCエスアイテック社製「M.S.GEL.SIL D−50−1000AW」を用いた他は同様にして、アフィニティ担体を作製した。
平均粒子径:45.7μm
均等係数(D10/90):1.93
平均細孔径:99.0nm
細孔容積:1.78mL/g
比表面積:71m2/g
リガンド固定化量:11.6mg/mL−bed
静的結合容量(SBC):74mg/mL−bed
実施例1として、上記した製造例1で作製したアフィニティ担体を内径5mm×長さ200mmのガラス製カラムに充填し、アフィニティクロマトグラフィ用カラムを作製した。
比較例1として、製造例2で作製した比較例のアフィニティ担体を用いた他は上記した実施例1と同様にして、アフィニティクロマトグラフィ用カラムを作製した。
比較例2として、市販のアガロース系担体(MabSelect SuRe、GE Healthcare社製)を用いた他は上記した実施例1と同様にして、アフィニティクロマトグラフィ用カラムを作製した。
比較例3として、市販のCPG(コントロールポアーガラス)系担体(Prosep Ultra Plus、Millipore社製)を用いた他は上記した実施例1と同様にして、アフィニティクロマトグラフィ用カラムを作製した。
実施例1及び比較例1〜3のカラムに水を通液した場合の線流速と圧力損失の関係を測定した。結果を図2に示す。
実施例2として、上記した製造例1のアフィニティ担体を内径5mm×長さ50mmのガラス製カラムに充填し、アフィニティクロマトグラフィ用カラムを作製した。
比較例4として、製造例2で作製したアフィニティ担体を用いた他は上記した実施例2と同様にして、アフィニティクロマトグラフィ用カラムを作製した。
比較例5として、市販のアガロース系担体(MabSelect Xtra、GE Healthcare社製)を用いた他は上記した実施例2と同様にして、アフィニティクロマトグラフィ用カラムを作製した。
比較例6として、市販のアガロース系担体(MabSelect SuRe、GE Healthcare社製)を用いた他は上記した実施例2と同様にして、アフィニティクロマトグラフィ用カラムを作製した。
比較例7として、市販のアガロース系担体(MabSelect SuRe XL、GE Healthcare社製)を用いた他は上記した実施例2と同様にして、アフィニティクロマトグラフィ用カラムを作製した。
比較例8として、市販のCPG(コントロールポアーガラス)系担体(Prosep Ultra Plus、Millipore社製)を用いた他は上記した実施例2と同様にして、アフィニティクロマトグラフィ用カラムを作製した。
次の手順で動的結合容量(DBC)を測定し、結果を図3に示す。実施例2及び比較例5〜8のカラムをクロマトグラフィ装置「AKTA explorer 10S」(GE Healthcare社製)に装填して、各カラムに0.5mg/mLのポリクローナルhuman IgGを含むPBS(pH7.4)を種々の線流速にて通液した。通液した0.5mg/mLのポリクローナルhuman IgGを含むPBS(pH7.4)の吸光度に対し、溶出液の吸光度が10%ブレイクスルーした時点で、添加したポリクローナルhuman IgGの質量を求め、動的結合容量を算出した。
なお、2011年10月28日に出願された日本特許出願2011−237204号の明細書、特許請求の範囲、図面および要約書の全内容をここに引用し、本発明の明細書の開示として、取り入れるものである。
2 アクリル樹脂製板
3 ステンレス鋼版
3a 流路
4 ステンレス鋼版
4a 微小孔部
5 連続相供給部
6 連続相排出部
7 分散相供給部
Claims (7)
- (a)レーザー式光散乱法による測定方法において、平均粒子径が30μm〜40μmであり、
(b)コールターカウンター法による測定方法において、粒子径分布の体積換算の積算量が小さいほうから10%の粒子径(D10)と90%の粒子径(D90)の比(D10/D90)が1.50以下であり、
(c)水銀圧入法による測定方法において、平均細孔径が85nm〜115nmの範囲であり、細孔容積が1.5mL/g以上である、
ことを特徴とするシリカ球状体。 - 前記粒子径分布の体積換算の積算量が小さいほうから10%の粒子径(D10)と90%の粒子径(D90)の比(D10/D90)が1.35以下である、請求項1に記載のシリカ球状体。
- 前記平均粒子径が33μm〜37μmである、請求項1または2に記載のシリカ球状体。
- 比表面積として、55m2/g〜75m2/gを有する請求項1〜3のいずれか1項に記載のシリカ球状体。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載のシリカ球状体を含み、前記シリカ球状体にリガンドが固定されたアフィニティ担体。
- リガンドがプロテインAであり、該プロテインAの固定化量が、10mg/mL−bed以上である請求項5に記載のアフィニティ担体。
- 動的結合容量として、50mg/mL−bed以上を有する請求項5に記載のアフィニティ担体。
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