JPWO2013035824A1 - 癌幹細胞の分離 - Google Patents
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Abstract
Description
発癌におけるLgr5陰性CSCの存在は、基本的な幹細胞の性質と関連しうる。1つの可能性のある仮説とは、攻撃的な抗癌剤治療などの環境変化の下で細胞集団の別個のサブセットに交替するための内因的な手段を、CSCが利用できるということである。このことは、CSCが、内因的な機序によって新たな環境に適応するための自己防御能を有することを意味しうる(図36)。
〔1〕 細胞マーカーであるLgr5が陽性であり、無血清培養で付着性であることを特徴とする、単離された癌幹細胞。
〔2〕 間葉性細胞である、〔1〕に記載の癌幹細胞。
〔3〕 細胞マーカーであるLgr5が陰性であり、無血清培養で浮遊性であることを特徴とする、単離された癌幹細胞。
〔4〕 上皮細胞である、〔3〕に記載の癌幹細胞。
〔5〕 消化器癌由来である、〔1〕〜〔4〕のいずれかに記載の癌幹細胞。
〔6〕 消化器癌が大腸癌である、〔5〕に記載の癌幹細胞。
〔7〕 細胞マーカーであるCD133、CD44、EpCAM、CD166、CD24、CD26、CD29、EREGのいずれか一つ以上が陽性である、〔1〕〜〔6〕のいずれかに記載の癌幹細胞。
〔8〕 細胞マーカーであるCD133、CD44、EpCAM、CD166、CD24、CD26、CD29およびEREGが陽性である、〔7〕に記載の癌幹細胞。
〔9〕 ALDH活性の細胞マーカーが陽性もしくはLCK、FGFBP1、ROR1および/またはPIGUの細胞マーカーが陽性である、〔1〕、〔2〕、〔5〕〜〔8〕のいずれかに記載の癌幹細胞。
〔10〕 ALDH活性の細胞マーカーが陰性もしくはHLA-DMA、TMEM173、ZMAT3、TNFSF15、AMIGO2、PROM2、GPR87、BLNK、HLA-DMB、GPR172B、GNAI1、FAS、GM2A、FLRT3、STOM、GJB5、ABCA1、SLC6A14、BMPR2、CLDN1、および/またはGPR110の細胞マーカーが陽性である、〔3〕〜〔8〕のいずれかに記載の癌幹細胞。
〔11〕 癌組織の階層構造を再現する特徴を有する癌幹細胞である、〔1〕、〔2〕、〔5〕〜〔9〕のいずれかに記載の癌幹細胞。
〔12〕 癌組織の階層構造を再現する特徴を有する癌幹細胞である、〔3〕〜〔8〕、〔10〕のいずれかに記載の癌幹細胞。
〔13〕 上皮間葉移行能を有する癌幹細胞である、〔1〕、〔2〕、〔5〕〜〔9〕、〔11〕のいずれかに記載の癌幹細胞。
〔14〕 上皮間葉移行能を有する癌幹細胞である、〔3〕〜〔8〕、〔10〕、〔12〕のいずれかに記載の癌幹細胞。
〔15〕 〔1〕、〔2〕、〔5〕〜〔9〕、〔11〕、〔13〕のいずれかに記載の癌幹細胞を含む、実質的に均質な癌幹細胞集団。
〔16〕 〔3〕〜〔8〕、〔10〕、〔12〕、〔14〕のいずれかに記載の癌幹細胞を含む、実質的に均質な癌幹細胞集団。
〔17〕 癌幹細胞または癌幹細胞を含む細胞集団を付着培養する工程を含む、〔1〕、〔2〕、〔5〕〜〔9〕、〔11〕、〔13〕のいずれかに記載の癌幹細胞または〔15〕に記載の実質的に均質な癌幹細胞集団を製造する方法。
〔18〕 癌幹細胞または癌幹細胞を含む細胞集団を浮遊培養する工程または増殖抑制剤存在下において培養する工程を含む、〔3〕〜〔8〕、〔10〕、〔12〕、〔14〕のいずれかに記載の癌幹細胞または〔16〕に記載の実質的に均質な癌幹細胞集団を製造する方法。
〔19〕 以下の(a)〜(c)の工程を含む医薬品のスクリーニング方法;
(a)〔1〕、〔2〕、〔5〕〜〔9〕、〔11〕、〔13〕のいずれかに記載の癌幹細胞を含む実質的に均質な癌幹細胞集団を準備する工程、
(b)前記癌幹細胞集団または前記癌幹細胞集団に含まれる癌幹細胞を被検物質で処理する工程、
(c)前記被検物質で処理された癌幹細胞集団または癌幹細胞の生物学的特性の変化を検出する工程。
〔20〕 医薬品が抗癌剤または転移もしくは再発抑制剤である、〔19〕に記載のスクリーニング方法。
〔21〕 以下の(a)〜(c)の工程を含む医薬品のスクリーニング方法;
(a)〔3〕〜〔8〕、〔10〕、〔12〕、〔14〕のいずれかに記載の癌幹細胞を含む実質的に均質な癌幹細胞集団を準備する工程、
(b)前記癌幹細胞集団または前記癌幹細胞集団に含まれる癌幹細胞を被検物質で処理する工程、
(c)前記被検物質で処理された癌幹細胞集団または癌幹細胞の生物学的特性の変化を検出する工程。
〔22〕 医薬品が抗癌剤である、〔21〕に記載のスクリーニング方法。
〔23〕 以下の(a)〜(c)の工程を含む医薬品のスクリーニング方法;
(a)〔1〕、〔2〕、〔5〕〜〔9〕、〔11〕、〔13〕のいずれかに記載の癌幹細胞を含む実質的に均質な癌幹細胞集団を準備する工程、
(b)非ヒト動物に前記細胞集団または前記癌幹細胞集団に含まれる癌幹細胞および被検物質を投与する工程、
(c)前記非ヒト動物における腫瘍の形成を検出する工程。
〔24〕 以下の(a)〜(c)の工程を含む医薬品のスクリーニング方法;
(a)〔3〕〜〔8〕、〔10〕、〔12〕、〔14〕のいずれかに記載の癌幹細胞を含む実質的に均質な癌幹細胞集団を準備する工程、
(b)非ヒト動物に前記細胞集団または前記癌幹細胞集団に含まれる癌幹細胞および被検物質を投与する工程、
(c)前記非ヒト動物における腫瘍の形成を検出する工程。
〔25〕 以下の(a)〜(d)の工程を含む医薬品のスクリーニング方法;
(a)〔1〕、〔2〕、〔5〕〜〔9〕、〔11〕、〔13〕のいずれかに記載の癌幹細胞を含む実質的に均質な癌幹細胞集団を準備する工程、
(b)非ヒト動物に前記細胞集団または前記癌幹細胞集団に含まれる癌幹細胞および増殖抑制剤を投与する工程、
(c)被験物質を投与する工程、
(d)前記非ヒト動物における腫瘍の形成を検出する工程。
〔26〕 前記細胞集団を投与する工程が皮下投与あるいは静脈内投与である、〔23〕〜〔25〕のいずれかに記載のスクリーニング方法。
〔27〕 医薬品が抗癌剤または転移もしくは再発抑制剤である、〔23〕〜〔25〕のいずれかに記載のスクリーニング方法。
〔28〕 以下の(a)〜(c)の工程を含む、〔1〕、〔2〕、〔5〕〜〔9〕、〔11〕、〔13〕のいずれかに記載の癌幹細胞または〔15〕に記載の実質的に均質な癌幹細胞集団を分離または検出する方法;
(a)癌幹細胞を含む細胞集団を準備する工程、
(b)前記細胞集団または前記細胞集団に含まれる細胞とLgr5抗体とを接触させる工程、
(c)前記細胞集団または細胞から、Lgr5が陽性な細胞集団または細胞を分離または検出する工程。
〔29〕 以下の(a)〜(c)の工程を含む、〔1〕、〔2〕、〔5〕〜〔9〕、〔11〕、〔13〕のいずれかに記載の癌幹細胞または〔15〕に記載の実質的に均質な癌幹細胞集団を分離または検出する方法;
(a)癌幹細胞を含む細胞集団を準備する工程、
(b)前記細胞集団または前記細胞集団に含まれる細胞とE-カドヘリン抗体、Snail抗体、LCK抗体、FGFBP1抗体、ROR1抗体、PIGU抗体、および/またはβカテニン抗体とを接触させる工程、
(c)前記細胞集団または細胞から、細胞表面のE-カドヘリンが陰性である、Snailが陽性である、LCKが陽性である、FGFBP1が陽性である、ROR1が陽性である、PIGUが陽性である、および/またはβカテニンが核に局在している細胞集団または細胞を分離または検出する工程。
〔30〕 以下の(a)〜(c)の工程を含む、〔3〕〜〔8〕、〔10〕、〔12〕、〔14〕のいずれかに記載の癌幹細胞または〔16〕に記載の実質的に均質な癌幹細胞集団を分離または検出する方法;
(a)癌幹細胞を含む細胞集団を準備する工程、
(b)前記細胞集団または前記細胞集団に含まれる細胞とLgr5抗体とを接触させる工程、
(c)前記細胞集団または細胞から、Lgr5が陰性な細胞集団または細胞を分離または検出する工程。
〔31〕 以下の(a)〜(c)の工程を含む、〔3〕〜〔8〕、〔10〕、〔12〕、〔14〕のいずれかに記載の癌幹細胞または〔16〕に記載の実質的に均質な癌幹細胞集団を分離または検出する方法;
(a)癌幹細胞を含む細胞集団を準備する工程、
(b)前記細胞集団または前記細胞集団に含まれる細胞とE-カドヘリン抗体、Snail抗体、βカテニン抗体、HLA-DMA抗体、TMEM173抗体、ZMAT3抗体、TNFSF15抗体、AMIGO2抗体、PROM2抗体、GPR87抗体、BLNK抗体、HLA-DMB抗体、GPR172B抗体、GNAI1抗体、FAS抗体、GM2A抗体、FLRT3抗体、STOM抗体、GJB5抗体、ABCA1抗体、SLC6A14抗体、BMPR2抗体、CLDN1抗体、および/またはGPR110抗体とを接触させる工程、
(c)前記細胞集団または細胞から、細胞表面のE-カドヘリンが陽性である、Snailが陰性である、βカテニンが核に局在していない、HLA-DMAが陽性である、TMEM173が陽性である、ZMAT3が陽性である、TNFSF15が陽性である、AMIGO2が陽性である、PROM2が陽性である、GPR87が陽性である、BLNKが陽性である、HLA-DMBが陽性である、GPR172Bが陽性である、GNAI1が陽性である、FASが陽性である、GM2Aが陽性である、FLRT3が陽性である、STOMが陽性である、GJB5が陽性である、ABCA1が陽性である、SLC6A14が陽性である、BMPR2が陽性である、CLDN1が陽性である、および/またはGPR110が陽性である細胞集団または細胞を分離または検出する工程。
〔32〕 Lgr5抗体を含有することを特徴とする、〔28〕〜〔31〕に記載の方法に用いるためのキット又はセット。
〔33〕 以下の(a)および(b)の工程を含む、〔1〕、〔2〕、〔5〕〜〔9〕、〔11〕、〔13〕のいずれかに記載の癌幹細胞または〔15〕に記載の実質的に均質な癌幹細胞集団の存在を検出・同定又は定量する方法;
(a)癌幹細胞を含む細胞集団を準備する工程、
(b)前記細胞集団または前記細胞集団に含まれる細胞とLgr5抗体とを接触させる工程。
〔34〕 Lgr5抗体を含有することを特徴とする、〔33〕に記載の方法に用いるためのキット又はセット。
〔35〕 高い増殖能を有する癌幹細胞と低い増殖能を有する癌幹細胞とを分離または検出する方法。
〔36〕 付着培養により分離することを特徴とする、〔35〕に記載の方法。
〔37〕 増殖抑制剤存在下における培養により分離または検出することを特徴とする、〔35〕に記載の方法。
〔38〕 浮遊培養により分離することを特徴とする、〔35〕に記載の方法。
〔39〕 細胞マーカーであるLgr5を用いて分離することを特徴とする、〔35〕〜〔38〕のいずれかに記載の方法。
〔40〕 さらに、細胞マーカーであるHLA-DMA、TMEM173、ZMAT3、TNFSF15、AMIGO2、PROM2、GPR87、BLNK、HLA-DMB、GPR172B、GNAI1、FAS、GM2A、FLRT3、STOM、GJB5、ABCA1、SLC6A14、BMPR2、CLDN1、および/またはGPR110を用いて分離することを特徴とする、〔39〕に記載の方法。
〔41〕 増殖能が異なる癌幹細胞へと誘導する方法。
〔42〕 高い増殖能を有する癌幹細胞を浮遊培養することにより、低い増殖能を有する癌幹細胞へと誘導する、〔41〕に記載の方法。
〔43〕 高い増殖能を有する癌幹細胞を低接着性プレートで培養することにより、高い増殖能を有する癌幹細胞を低い増殖能を有する癌幹細胞へと誘導する、〔41〕または〔42〕に記載の方法。
〔44〕 増殖抑制剤を用いることにより、高い増殖能を有する癌幹細胞を低い増殖能を有する癌幹細胞へと誘導する、〔41〕に記載の方法。
〔45〕 増殖抑制剤の存在下において培養することを特徴とする、〔44〕に記載の方法。
〔46〕 高い増殖能を有する癌幹細胞を保持する非ヒト動物に増殖抑制剤を投与することを特徴とする、〔44〕に記載の方法。
〔47〕 低い増殖能を有する癌幹細胞を付着培養することにより、高い増殖能を有する癌幹細胞へと誘導する、〔41〕に記載の方法。
〔48〕 低い増殖能を有する癌幹細胞を接着性プレートで培養することにより、高い増殖能を有する癌幹細胞へと誘導する、〔41〕または〔47〕に記載の方法。
〔49〕 低い増殖能を有する癌幹細胞を非ヒト動物に移植することにより、高い増殖能を有する癌幹細胞へと誘導する〔41〕に記載の方法。
〔50〕 〔35〕、〔36〕、〔39〕〜〔41〕、〔47〕〜〔49〕のいずれかに記載の方法により分離および/または誘導された、高い増殖能を有する癌幹細胞。
〔51〕 〔35〕、〔38〕〜〔46〕のいずれかに記載の方法により分離および/または誘導された、低い増殖能を有する癌幹細胞。
〔52〕 〔35〕、〔38〕〜〔46〕のいずれかに記載の方法により分離および/または誘導された癌幹細胞を用いた、抗癌剤のスクリーニング方法。
〔53〕 〔35〕、〔36〕、〔39〕〜〔41〕、〔47〕〜〔49〕のいずれかに記載の方法により分離および/または誘導された癌幹細胞を用いた、化合物の評価方法。
〔54〕 βカテニン抑制剤およびTCF阻害剤とを組み合わせてなる、〔1〕、〔2〕、〔5〕〜〔9〕、〔11〕、〔13〕のいずれかに記載の癌幹細胞の増殖抑制剤。
〔55〕 癌幹細胞の増殖抑制剤が抗癌剤である、〔54〕に記載の癌細胞の増殖抑制剤。
〔56〕 5-FU、オキサリプラチン、またはイリノテカンを有効成分として含有する、〔1〕、〔2〕、〔5〕〜〔9〕、〔11〕、〔13〕のいずれかに記載の癌幹細胞の転移または再発抑制剤。
〔57〕 以下の(a)および(b)の工程を含む、〔1〕〜〔14〕のいずれかに記載の癌幹細胞または〔15〕もしくは〔16〕に記載の実質的に均質な癌幹細胞集団の存在を検出・同定又は定量するための方法。
(a)癌患者から取得したサンプルを準備する工程、
(b)前記サンプルとLgr5抗体、HLA-DMA抗体、TMEM173抗体、ZMAT3抗体、TNFSF15抗体、AMIGO2抗体、PROM2抗体、GPR87抗体、BLNK抗体、HLA-DMB抗体、GPR172B抗体、GNAI1抗体、FAS抗体、GM2A抗体、FLRT3抗体、STOM抗体、GJB5抗体、ABCA1抗体、SLC6A14抗体、BMPR2抗体、CLDN1抗体、および/またはGPR110抗体とを接触させる工程。
〔58〕 検出・同定又は定量するための方法が、癌の診断、癌患者の選別、薬剤の有効性の予見、治療のモニタリング、癌のイメージングである〔57〕に記載の方法。
〔59〕 Lgr5抗体を含有することを特徴とする、〔57〕または〔58〕に記載の方法に用いるためのキット又はセット。
〔60〕 以下の(a)〜(c)のいずれかに記載のヌクレオチド配列からなる遺伝子によりコードされるタンパク質の調節剤を含有する癌幹細胞阻害剤。
(a)配列番号:7〜13のいずれかに記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
(b)配列番号:7〜13のいずれかに記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、配列番号:7〜13のいずれかに記載のヌクレオチド配列からなる遺伝子によりコードされるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
(c)配列番号:7〜13のいずれかに記載のヌクレオチド配列からなる遺伝子によりコードされるタンパク質の少なくとも一つのアミノ酸残基が付加、欠失、又は置換されたタンパク質であって、配列番号:7〜13のいずれかに記載のヌクレオチド配列からなる遺伝子によりコードされるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
〔61〕 前記調節剤が、前記タンパク質に結合する抗体である、〔60〕に記載の癌幹細胞阻害剤。
〔62〕 前記抗体が、キメラ抗体、ヒト型化抗体、ヒト抗体、抗体断片、又は二重特異性抗体である、〔61〕に記載の癌幹細胞阻害剤。
〔63〕 前記調節剤が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー、およびsiRNA、からなる群から選択される、1個またはそれ以上の物質を含む、〔60〕に記載の癌幹細胞阻害剤。
〔64〕 抗癌剤と組み合わせて用いることを特徴とする、〔53〕〜〔56〕〔60〕〜〔63〕のいずれかに記載の癌幹細胞阻害剤。
〔65〕 以下の(a)〜(c)のいずれかに記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド又は該ヌクレオチド配列からなる遺伝子によりコードされるタンパク質、それらの一部、又はそれらの修飾体を含有する癌幹細胞ワクチン。
(a)配列番号:7〜13のいずれかに記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
(b)配列番号:7〜13のいずれかに記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、配列番号:7〜13のいずれかに記載のヌクレオチド配列からなる遺伝子によりコードされるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
(c)配列番号:7〜13のいずれかに記載のヌクレオチド配列からなる遺伝子によりコードされるタンパク質の少なくとも一つのアミノ酸残基が付加、欠失、又は置換されたタンパク質であって、配列番号:7〜13のいずれかに記載のヌクレオチド配列からなる遺伝子によりコードされるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
(a) E-カドヘリン抗体、(b) Snail抗体、(c) GPR110抗体、(d) E-カドヘリン抗体およびSnail抗体、(e) E-カドヘリン抗体およびGPR110抗体、(f) Snail抗体およびGPR110抗体、(g) E-カドヘリン抗体およびSnail抗体およびGPR110抗体。
本発明において「癌」とは、典型的には制御されない細胞増殖により特徴づけられる哺乳動物の生理学的状態を意味し、又はかかる生理学的状態を言う。本発明において、癌の種類は、特に限定されるものではないが、次のものが挙げられる。癌腫(上皮癌)としては、膵臓癌、前立腺癌、乳癌、皮膚癌、消化管の癌、肺癌、肝細胞癌、子宮頸癌、子宮体癌、卵巣癌、卵管癌、膣癌、肝臓癌、胆管癌、膀胱癌、尿管の癌、甲状腺癌、副腎癌、腎臓癌、又はその他の腺組織の癌が挙げられる。肉腫(非上皮癌)としては、脂肪肉腫、平滑筋肉腫、黄紋筋肉腫、滑膜肉腫、血管肉腫、線維肉腫、悪性末梢神経腫瘍、消化管間質系腫瘍、類腱腫、ユーイング肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、白血病、リンパ腫、骨髄腫、その他の実質臓器の腫瘍、例えばメラノーマ又は脳腫瘍が挙げられる(Kumar V, Abbas AK, Fausio N. Robbins and Cotran Pathologic Basis of Disease. 7th Ed. Unit I: General Pathology, 7: Neoplasia, Biology of tumor growth: Benign and malignant neoplasms. 269-342, 2005)。
i)自己複製能を保有する。自己複製能とは、分裂した2つの娘細胞のどちらか1つ又は両方の細胞が、細胞系譜上、親細胞と同等の能力及び分化程度を保持している細胞を産出できる能力をいう。
ii)癌細胞塊を構成する複数種の癌細胞へ分化できる。癌幹細胞から分化した複数種の癌細胞は、正常幹細胞と同様に、細胞系譜上、癌幹細胞を頂点とする階層構造を形成する。癌幹細胞から段階的に多種癌細胞が産出されることにより多様な特徴を有する癌細胞塊が形成される。
本発明において付着性とは、付着培養用の培養容器で培養した場合に培養容器に付着する性質のことをいう。
なお付着培養または浮遊培養を行う前に、癌幹細胞を含む細胞群は増殖させることが好ましい。
本発明の医薬品のスクリーニング方法の一態様として、以下の(a)〜(c)の工程を含む方法を提供する;
(a)Lgr5陽性の付着性癌幹細胞を含む実質的に均質な癌幹細胞集団を準備する工程、
(b)前記癌幹細胞集団または前記癌幹細胞集団に含まれる癌幹細胞を被検物質で処理する工程、
(c)被検物質で処理された癌幹細胞集団または癌幹細胞の生物学的特性の変化を検出する工程。
(a)Lgr5陰性の浮遊性癌幹細胞を含む実質的に均質な癌幹細胞集団を作製する工程、
(b)前記癌幹細胞集団または前記癌幹細胞集団に含まれる癌幹細胞を被検物質で処理する工程
(c)被検物質で処理された癌幹細胞集団または癌幹細胞の生物学的特性の変化を検出する工程。
(a)Lgr5陽性の付着性癌幹細胞を含む実質的に均質な癌幹細胞集団を作製する工程、
(b)非ヒト動物に前記細胞集団または前記癌幹細胞集団に含まれる癌幹細胞および被検物質を投与する工程
(c)前記非ヒト動物における腫瘍の形成を検出する工程。
(a)Lgr5陰性の浮遊性癌幹細胞を含む実質的に均質な癌幹細胞集団を作製する工程、
(b)非ヒト動物に前記細胞集団または前記癌幹細胞集団に含まれる癌幹細胞および被検物質を投与する工程
(c)前記非ヒト動物における腫瘍の形成を検出する工程。
(a)Lgr5陽性の付着性癌幹細胞を含む実質的に均質な癌幹細胞集団を作製する工程、
(b)非ヒト動物に前記細胞集団または前記癌幹細胞集団に含まれる癌幹細胞および増殖抑制剤を投与する工程
(c)被験物質を投与する工程、
(d)前記非ヒト動物における腫瘍の形成を検出する工程。
(a)癌幹細胞を含む細胞集団を準備する工程、
(b)前記細胞集団または前記細胞集団に含まれる細胞とLgr5抗体とを接触させる工程、
(c)前記細胞集団または細胞から、Lgr5が陽性な細胞集団または細胞を分離または検出する工程。
(a)癌幹細胞を含む細胞集団を付着培養し、実質的に均質な癌幹細胞集団を準備する工程、
(b)前記癌幹細胞集団または前記癌幹細胞集団に含まれる癌幹細胞とLgr5抗体とを接触させる工程、
(c)前記癌幹細胞集団または癌幹細胞から、Lgr5が陽性な実質的に均質な癌幹細胞集団または癌幹細胞を分離または検出する工程。
(a)癌幹細胞を含む細胞集団を準備する工程、
(b)前記細胞集団または前記細胞集団に含まれる細胞とE-カドヘリン抗体、Snail抗体、LCK抗体、ROR1抗体、PIGU抗体、および/またはβカテニン抗体とを接触させる工程、
(c)前記細胞集団または細胞から、細胞表面のE-カドヘリンが陰性である、Snailが陽性である、βカテニンが核に局在している細胞集団または細胞を分離または検出する工程。
(a)癌幹細胞を含む細胞集団を付着培養し、実質的に均質な癌幹細胞集団を準備する工程、
(b)前記癌幹細胞集団または前記癌幹細胞集団に含まれる癌幹細胞とE-カドヘリン抗体、Snail抗体、LCK抗体、ROR1抗体、PIGU抗体、および/またはβカテニン抗体とを接触させる工程、
(c)前記癌幹細胞集団または癌幹細胞から、細胞表面のE-カドヘリンが陰性である、Snailが陽性である、LCKが陽性である、ROR1が陽性である、PIGUが陽性である、および/またはβカテニンが核に局在している癌幹細胞集団または癌幹細胞を分離または検出する工程。
(a)癌幹細胞を含む細胞集団を準備する工程、
(b)前記細胞集団または前記細胞集団に含まれる細胞とLgr5抗体とを接触させる工程、
(c)前記細胞集団または細胞から、Lgr5が陰性な細胞集団または細胞を分離または検出する工程。
BD InFluxTM
BD FACSAriaTM III
BD FACSAriaTM II
FACSAriaTM
FACSVantageTM SE(いずれもBD Biosciences社の商品名)
EPICS ALTRA HyPerSort
MoFlo AstriosCytomics FC 500
MoFlo XDP(いずれもBeckman Coulter社の商品名)
LCK抗体:クローンY123(EMD Millipore)、クローンLck-01(Lifespan Biosiences)、
ROR1抗体:クローンRB14753(Aviva Systems Biology)、
PIGU抗体:ウサギpAb(Lifescience Biosiences, LS-C146514 )。
(a)癌幹細胞を含む細胞集団を浮遊培養し、実質的に均質な癌幹細胞集団を準備する工程、
(b)前記癌幹細胞集団または前記癌幹細胞集団に含まれる癌幹細胞とLgr5抗体とを接触させる工程、
(c)前記癌幹細胞集団または癌幹細胞から、Lgr5が陰性な実質的に均質な癌幹細胞集団または癌幹細胞を分離または検出する工程。
(a)癌幹細胞を含む細胞集団を準備する工程、
(b)前記細胞集団または前記細胞集団に含まれる細胞とE-カドヘリン抗体、Snail抗体、βカテニン抗体、HLA-DMA抗体、TMEM173抗体、ZMAT3抗体、TNFSF15抗体、AMIGO2抗体、PROM2抗体、GPR87抗体、BLNK抗体、HLA-DMB抗体、GPR172B抗体、GNAI1抗体、FAS抗体、GM2A抗体、FLRT3抗体、STOM抗体、GJB5抗体、ABCA1抗体、SLC6A14抗体、BMPR2抗体、CLDN1抗体、および/またはGPR110抗体とを接触させる工程、
(c)前記細胞集団または細胞から、細胞表面のE-カドヘリンが陽性である、Snailが陰性である、βカテニンが核に局在していない、HLA-DMAが陽性である、TMEM173が陽性である、ZMAT3が陽性である、TNFSF15が陽性である、AMIGO2が陽性である、PROM2が陽性である、GPR87が陽性である、BLNKが陽性である、HLA-DMBが陽性である、GPR172Bが陽性である、GNAI1が陽性である、FASが陽性である、GM2Aが陽性である、FLRT3が陽性である、STOMが陽性である、GJB5が陽性である、ABCA1が陽性である、SLC6A14が陽性である、BMPR2が陽性である、CLDN1が陽性である、および/またはGPR110が陽性である細胞集団または細胞を分離または検出する工程。
(a)癌幹細胞を含む細胞集団を浮遊培養し、実質的に均質な癌幹細胞集団を準備する工程、
(b)前記癌幹細胞集団または前記癌幹細胞集団に含まれる癌幹細胞とE-カドヘリン抗体、Snail抗体、βカテニン抗体、HLA-DMA抗体、TMEM173抗体、ZMAT3抗体、TNFSF15抗体、AMIGO2抗体、PROM2抗体、GPR87抗体、BLNK抗体、HLA-DMB抗体、GPR172B抗体、GNAI1抗体、FAS抗体、GM2A抗体、FLRT3抗体、STOM抗体、GJB5抗体、ABCA1抗体、SLC6A14抗体、BMPR2抗体、CLDN1抗体、および/またはGPR110抗体とを接触させる工程、
(c)前記癌幹細胞集団または癌幹細胞から、細胞表面のE-カドヘリンが陽性である、Snailが陰性である、βカテニンが核に局在していない、HLA-DMAが陽性である、TMEM173が陽性である、ZMAT3が陽性である、TNFSF15が陽性である、AMIGO2が陽性である、PROM2が陽性である、GPR87が陽性である、BLNKが陽性である、HLA-DMBが陽性である、GPR172Bが陽性である、GNAI1が陽性である、FASが陽性である、GM2Aが陽性である、FLRT3が陽性である、STOMが陽性である、GJB5が陽性である、ABCA1が陽性である、SLC6A14が陽性である、BMPR2が陽性である、CLDN1が陽性である、および/またはGPR110が陽性である癌幹細胞集団または癌幹細胞を分離または検出する工程。
(a)癌幹細胞を含む細胞集団を準備する工程、
(b)前記細胞集団または前記細胞集団に含まれる細胞とLgr5抗体とを接触させる工程、
(c)前記細胞集団または細胞から、Lgr5が陰性な細胞集団または細胞を分離または検出する工程。
BD InFluxTM
BD FACSAriaTM III
BD FACSAriaTM II
FACSAriaTM
FACSVantageTM SE(いずれもBD Biosciences社の商品名)
EPICS ALTRA HyPerSort
MoFlo AstriosCytomics FC 500
MoFlo XDP(いずれもBeckman Coulter社の商品名)
E-カドヘリン抗体:クローン24E10(Cell Signaling Technology)、クローン67A4(Merck)、クローンDECMA-1(Affymetrics)、クローンMB2(Santa cruz)、クローン180224(R&D Systems)、
HLA-DMA抗体:クローンMaP.DM1(BD Biosciences)、クローンTAL18.1(Abcam)、クローンIBL-3/5(Abcam)、クローンER-TR 2(Abcam)、クローンNIMR-4(Abcam)、クローン2G11(Abcam)、クローンER-TR 3(Abcam)、クローン3D6(Abcam)、クローンMRC OX-6(Abcam)、
TMEM173抗体:クローン723505(R&D Systems)、クローン2C9(Abcam)、
TNFSF15抗体:クローンL4G9(Abnova)、
PROM2抗体:クローン244029(R&D Systems)、
GPR87抗体:ウサギpAb(WO2008/031842)
BLNK抗体:クローン5G9(Abnova)、
HLA-DMB抗体:クローンEPR7981(Abcam)、
GPR172B抗体:ウサギpAb(antibodies-online.com、ABIN763170)
FAS抗体:5E2(Santa cruz)、6D50(Santa cruz)、2R2(Santa cruz)、LT95(Santa cruz)、UT-1(Abnova)、DX2(R&D Systems)、4F8D6(Abcam)、B-R17(Abcam)、H11(Abcam)、10F2(Abcam)、MFL7(Abcam)、Alf1.2(Abcam)、DX2(Abcam)、BD29(Abcam)、
STOM抗体:マウスpAb(Abcam, ab67880)
ABCA1抗体:クローンAB.H10(Abcam)、HJ1(Abcam)、
SLC6A14抗体:ウサギpAb(MBL International, BMP052)
BMPR2抗体:クローンMM0060-9A10(Abcam)、
CLDN1抗体:クローン421203(R&D Systems)。
(a)癌幹細胞を含む細胞集団を、増殖抑制剤を含む培地中で培養し、実質的に均質な癌幹細胞集団を準備する工程、
(b)前記癌幹細胞集団または前記癌幹細胞集団に含まれる癌幹細胞とLgr5抗体とを接触させる工程、
(c)前記癌幹細胞集団または癌幹細胞から、Lgr5が陰性な実質的に均質な癌幹細胞集団または癌幹細胞を分離または検出する工程。
(a)癌幹細胞を含む細胞集団を準備する工程、
(b)前記細胞集団または前記細胞集団に含まれる細胞とE-カドヘリン抗体、Snail抗体、βカテニン抗体、HLA-DMA抗体、TMEM173抗体、ZMAT3抗体、TNFSF15抗体、AMIGO2抗体、PROM2抗体、GPR87抗体、BLNK抗体、HLA-DMB抗体、GPR172B抗体、GNAI1抗体、FAS抗体、GM2A抗体、FLRT3抗体、STOM抗体、GJB5抗体、ABCA1抗体、SLC6A14抗体、BMPR2抗体、CLDN1抗体、および/またはGPR110抗体とを接触させる工程、
(c)前記細胞集団または細胞から、細胞表面のE-カドヘリンが陽性である、Snailが陰性である、βカテニンが核に局在していない、HLA-DMAが陽性である、TMEM173が陽性である、ZMAT3が陽性である、TNFSF15が陽性である、AMIGO2が陽性である、PROM2が陽性である、GPR87が陽性である、BLNKが陽性である、HLA-DMBが陽性である、GPR172Bが陽性である、GNAI1が陽性である、FASが陽性である、GM2Aが陽性である、FLRT3が陽性である、STOMが陽性である、GJB5が陽性である、ABCA1が陽性である、SLC6A14が陽性である、BMPR2が陽性である、CLDN1が陽性である、および/またはGPR110が陽性である細胞集団または細胞を分離または検出する工程。
(a)癌幹細胞を含む細胞集団を、増殖抑制剤を含む培地中で培養し、実質的に均質な癌幹細胞集団を準備する工程、
(b)前記癌幹細胞集団または前記癌幹細胞集団に含まれる癌幹細胞とE-カドヘリン抗体、Snail抗体、βカテニン抗体、HLA-DMA抗体、TMEM173抗体、ZMAT3抗体、TNFSF15抗体、AMIGO2抗体、PROM2抗体、GPR87抗体、BLNK抗体、HLA-DMB抗体、GPR172B抗体、GNAI1抗体、FAS抗体、GM2A抗体、FLRT3抗体、STOM抗体、GJB5抗体、ABCA1抗体、SLC6A14抗体、BMPR2抗体、CLDN1抗体、および/またはGPR110抗体とを接触させる工程、
(c)前記癌幹細胞集団または癌幹細胞から、細胞表面のE-カドヘリンが陽性である、Snailが陰性である、βカテニンが核に局在していない、HLA-DMAが陽性である、TMEM173が陽性である、ZMAT3が陽性である、TNFSF15が陽性である、AMIGO2が陽性である、PROM2が陽性である、GPR87が陽性である、BLNKが陽性である、HLA-DMBが陽性である、GPR172Bが陽性である、GNAI1が陽性である、FASが陽性である、GM2Aが陽性である、FLRT3が陽性である、STOMが陽性である、GJB5が陽性である、ABCA1が陽性である、SLC6A14が陽性である、BMPR2が陽性である、CLDN1が陽性である、および/またはGPR110が陽性である癌幹細胞集団または癌幹細胞を分離または検出する工程。
(a)癌患者から取得したサンプルを準備する工程、
(b)該サンプルとLgr5抗体とを接触させる工程。
(a)配列番号:7〜13のいずれかに記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
(b)配列番号:7〜13のいずれかに記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、配列番号:7〜13のいずれかに記載のヌクレオチド配列からなる遺伝子によりコードされるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
(c)配列番号:7〜13のいずれかに記載のヌクレオチド配列からなる遺伝子によりコードされるタンパク質の少なくとも一つのアミノ酸残基が付加、欠失、又は置換されたタンパク質であって、配列番号:7〜13のいずれかに記載のヌクレオチド配列からなる遺伝子によりコードされるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
本発明で使用されるタンパク質は、当業者に公知の任意の方法によって、該タンパク質をコードするDNAを含む遺伝子を含有する発現ベクターを作成し、該発現ベクターにより形質転換させた形質転換体を培養し、該タンパク質を生成、蓄積せしめ、これを採取することによって、容易に調製することが出来る。
(1)タンパク質をコードするDNAを含む遺伝子を含有するDNA断片を切り出し、
(2)該DNA断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結する、
ことにより製造することができる。
Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 69巻, 2110(1972);Gene, 17巻, 107(1982);Molecular & General Genetics, 168巻, 111(1979);Methods in Enzymology, 194巻, 182-187(1991);Proc.Natl.Acad.Sci.USA), 75巻, 1929(1978);及びVirology,52巻,456(1973)。
本発明で使用される抗体は、本発明で使用されるタンパク質と結合する限り特に制限はなく、公知の手段を用いてポリクローナルまたはモノクローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマにより産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるもの等を含む。尚、本発明で使用される抗体は、本発明で使用されるタンパク質と特異的に結合することが好ましい。
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め37℃程度に加温したPEG溶液(例えば平均分子量1000−6000程度)を通常30−60%(w/v)の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞(ハイブリドーマ)を形成する。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去する。
ジフテリアトキシンA鎖(Diphtheria toxin A Chain)(Langone J.J.,et al., Methods
in Enzymology (1983) 93, 307-308)
シュードモナスエンドトキシン(Pseudomonas Exotoxin)(Nature Medicine (1996) 2, 350-353)
リシン鎖(Ricin A Chain)(Fulton R.J. et al., J.Biol.Chem. (1986) 261, 5314-5319; Sivam G. et al., Cancer Res. (1987) 47, 3169-3173; Cumber A.J. et al., J.Immunol.Methods (1990) 135,15-24; Wawrzynczak E.J. et al., Cancer Res. (1990) 50, 7519-7562; Gheeite V. et al., J.Immunol.Methods (1991) 142,223-230)
無糖鎖リシンA鎖(Deglicosylated Ricin A Chain)(Thorpe P.E. et al., Cancer Res. (1987) 47, 5924-5931)
アブリンA鎖(Abrin A Chain)(Wawrzynczak E.J. et al., Br.J.Cancer (1992) 66, 361-366; Wawrzynczak E.J.,et al. Cancer Res. (1990) 50, 7519-7562; Sivam G.,et al. Cancer Res. (1987) 47, 3169-3173; Thorpe P.E. et al., Cancer Res. (1987) 47, 5924-5931)
ゲロニン(Gelonin)(Sivam G. et al., Cancer Res. (1987) 47, 3169-3173; Cumber A.J. et al., J.Immunol.Methods (1990) 135, 15-24; WawrzynczakE.J. et al. Cancer Res., (1990) 50, 7519-7562; Bolognesi A. et al., Clin.exp.Immunol. (1992) 89, 341-346)
ポークウイード抗ウィルス蛋白(PAP-s; Pokeweed anti-viral protein fromseeds)(Bolognesi A. et al., Clin.exp.Immunol. (1992) 89, 341-346)
ブリオジン(Briodin)(Bolognesi A. et al., Clin.exp.Immunol. (1992) 89, 341-346)
サポリン(Saporin)(Bolognesi A.,et al., Clin.exp.Immunol. (1992) 89, 341-346)モモルジン(Momordin)(Cumber A.J. et al., J.Immunol.Methods (1990) 135, 15-24;
Wawrzynczak E.J. et al., Cancer Res. (1990) 50, 7519-7562; Bolognesi A. et al., Clin.exp.Immunol. (1992) 89, 341-346)
モモルコキン(Momorcochin)(Bolognesi A. et al., Clin.exp.Immunol. (1992) 89, 341-346)
ジアンシン32(Dianthin 32)(Bolognesi A. et al., Clin.exp.Immunol. (1992) 89, 341-346)
ジアンシン30(Dianthin 30)(Stirpe F.,Barbieri L., FEBS letter (1986) 195, 1-8)
モデッシン(Modeccin)(Stirpe F., Barbieri L., FEBS letter (1986) 195, 1-8)
ビスカミン(Viscumin)(Stirpe F., Barbieri L.,FEBS letter (1986) 195, 1-8)
ボルケシン(Volkesin)(Stirpe F., Barbieri L., FEBS letter (1986) 195, 1-8)
ドデカンドリン(Dodecandrin)(Stirpe F., Barbieri L., FEBS letter (1986) 195,1-8)
トリチン(Tritin)(Stirpe F., Barbieri L., FEBS letter (1986) 195,1-8)
ルフィン(Luffin)(Stirpe F., Barbieri L., FEBS letter (1986) 195,1-8)
トリコキリン(Trichokirin)(Casellas P., et al., Eur.J.Biochem. (1988) 176, 581-588; Bolognesi A., et al., Clin.exp.Immunol., (1992) 89, 341-346)。
・エフェクター細胞の調製
CBA/Nマウスなどから脾臓を摘出し、RPMI1640培地(GIBCO社製)中で脾臓細胞を分離する。10%ウシ胎児血清(FBS、HyClone社製)を含む同培地で洗浄後、細胞濃度を5×106/mlに調製し、エフェクター細胞を調製する。
Baby Rabbit Complement(CEDARLANE社製)を10% FBS含有培地(GIBCO社製)にて10倍希釈し、補体溶液を調製する。
本発明で使用されるタンパク質発現細胞(癌幹細胞など)を0.2 mCiの51Cr-sodium chromate(Amersham Pharmacia Biotech社製)とともに、10% FBS含有DMEM培地中で37℃にて1時間培養することにより放射性標識する。放射性標識後、細胞を10% FBS含有RPMI1640培地にて3回洗浄し、細胞濃度を2×105/mlに調製して、標的細胞を調製する。
96ウェルU底プレート(Becton Dickinson社製)に、標的細胞と、本発明で使用される抗体を50μlずつ加え、氷上にて15分間反応させる。その後、エフェクター細胞100μlを加え、炭酸ガスインキュベーター内で4時間培養する。抗体の終濃度は0または10μg/mlとする。培養後、100μlの上清を回収し、ガンマカウンター(COBRAIIAUTO-GMMA、MODEL D5005、Packard Instrument Company社製)で放射活性を測定する。細胞傷害活性(%)は
(A−C)/(B−C)×100
により求めることができる。Aは各試料における放射活性(cpm)、Bは1%NP-40(半井社製)を加えた試料における放射活性(cpm)、Cは標的細胞のみを含む試料の放射活性(cpm)を示す。
96ウェル平底プレート(Becton Dickinson社製)に、標的細胞と、本発明で使用される抗体を50μlずつ加え、氷上にて15分間反応させる。その後、補体溶液100μlを加え、炭酸ガスインキュベーター内で4時間培養する。抗体の終濃度は0または3μg/mlとする。培養後、100μlの上清を回収し、ガンマカウンターで放射活性を測定する。細胞傷害活性はADCC活性の測定と同様にして求めることができる。
本発明の癌幹細胞阻害剤の有効投与量は、一回につき体重1 kgあたり0.001 mgから1000 mgの範囲で選ばれる。あるいは、患者あたり0.01〜100000 mg/bodyの投与量を選ぶことができる。しかしながら、本発明の阻害剤はこれらの投与量に制限されるものではない。また、本発明の阻害剤の投与時期としては、疾患の臨床症状が生ずる前後を問わず投与することができる。本発明の阻害剤は、常法にしたがって製剤化することができ(Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, 米国)、医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。このような担体および医薬添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン(HSA)、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤等が挙げられる。実際の添加物は、本発明の阻害剤の剤型に応じて上記の中から単独で又は適宜組み合わせて選ばれるが、もちろんこれらに限定するものではない。例えば、注射用製剤として使用する場合には、溶剤、例えば生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液等に溶解し、これに吸着防止剤、例えばTween80、Tween20、ゼラチン、ヒト血清アルブミン等を加えたものを使用することができる。あるいは、使用前に溶解再構成する剤形とするために凍結乾燥したものであってもよく、凍結乾燥のための賦形剤としては、例えば、マンニトール、ブドウ糖等の糖アルコールや糖類を使用することができる。本発明の阻害剤は通常非経口投与経路で、例えば注射剤(皮下注、静注、筋注、腹腔内注など)、経皮、経粘膜、経鼻、経肺などで投与されるが、経口投与も可能である。
結腸癌検体は、PharmaLogicals Research(シンガポール)およびParkway Laboratory Services(シンガポール)の倫理委員会の承認の下で、同意を得た患者から入手したものである。腫瘍片を剪刀で細かく刻み、NOGマウスの側腹部に移植した。ヒト結腸癌異種移植片は、実験動物中央研究所(日本)より供与されたNOGマウス中で継代することにより維持した。本実験で使用したマウスは、PharmaLogicals Researchの動物実験ガイドラインに従って処置した。組織病理学的試験のため、ヒト組織の外科的検体の小片および異種移植腫瘍の小片を、4℃で16〜24時間、4%パラホルムアルデヒドで固定し、AMeX法によりパラフィンに包埋した(Sato Y, et al., (1986) Am J Pathol, 125; 431-435.、Sato Y, et al., (1992) Am J Pathol, 140; 775-779.、Suzuki M, et al. (2002) J Toxicol Sci, 27; 165-172.)。エオシンおよびヘマトキシリンで薄片を染色し、顕微鏡観察によって調べた。
異種移植片からの癌細胞の単一細胞浮遊液を、組織を剃刀で刻むことによって調製し、コラゲナーゼ/ディスパーゼ(Roche)およびDNaseI(Roche)を含むDPBS中、37℃で3時間インキュベーションした後、40μmセルストレーナー(BD Biosciences)で濾過し、溶解バッファー(BD Biosciences)に懸濁して、赤血球を除いた。得られた異種移植片由来の細胞を、5% CO2雰囲気下、37℃で、N-2サプリメント(Invitrogen)、20 ng/mL ヒトEGF(Invitrogen)、10 ng/mL ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子(Sigma)、4 μg/mL ヘパリン(Sigma)、4 mg/mL BSA(Invitrogen)、20 μg/mL ヒトインスリン、亜鉛溶液(Invitrogen)、および2.9 mg/mL グルコース(Sigma)を含む、DMEM/F12培地(Invitrogen)で培養した(Todaro M, et al. (2007) Cell Stem Cell 1; 389-402.)。付着CSCおよび浮遊CSCを培養するために、ポリスチレン処理した通常の細胞培養フラスコ(BD Biosciences)および超低接着細胞培養フラスコ(Corning)をそれぞれ使用した。
連続希釈によって、細胞懸濁液を調製した。Hanks平衡塩溶液(Invitrogen)中の癌細胞懸濁液100μLを、50%マトリゲル(BD Bioscience)を用いてマウスの側腹部に皮下接種した。腫瘍の発達を、7週間モニタリングした。単一細胞の接種のために、細胞をFITC標識マウス抗ヒトCD326(EpCAM)抗体(Miltenyi Biotec)で標識し、テラサキプレート(Termo Fisher Scientific)に播種した。単一細胞は蛍光顕微鏡下で確認した。単一細胞を、50%マトリゲル50μlを用いてマウスの側腹部に接種した。腫瘍の発達を、10週間モニタリングした。
NM_018490(Lgr4)、NM_001017403(Lgr5)、およびNM_003667(Lgr6)の配列に基づくPCRによって、全長ヒトLgr4、Lgr5、およびLgr6 cDNAをクローニングした。クローニングした遺伝子のN末端にHAタグを付加または付加せずに、発現させた。Gene Pulser(BioRad)を用いて、チャイニーズハムスター卵巣細胞株CHO DG44(Invitrogen)に発現プラスミドをトランスフェクトした。G418を用いて、安定な細胞株であるHA-Lgr4/DG、HA-Lgr5/DG、およびHA-Lgr6/DGを選択した。
可溶性のLgr5(アミノ酸1〜555)タンパク質を、CHO DG44のマウスIgG2aのFc部分との融合タンパク質として発現させた。ヤギ抗マウスIgG2a(Bethyl labotratories)およびHRPラット抗マウスIgG2amAb(Serotec)を用いるサンドイッチELISAにより、トランスフェクタントをスクリーニングした。sLgr5-Fcを最も豊富に生じたクローンを2D3と命名した。2D3培養上清を回収し、Lgr5-Fcタンパク質をプロテインA-セファロースカラムによってアフィニティ精製した(Pharmacia)。Lgr5-Fcはタンパク質免疫化およびELISAスクリーニングのための抗原として働いた。
完全フロイントアジュバント中に乳化させた50μgのLgr5-Fcを用いて、Balb/cマウス(Charles River Japan)を皮下免疫した。2週間後、フロイント不完全アジュバント中の同量を用いて2週間にわたり週1回の注射を繰り返した。細胞融合の3日前、マウスに25μgのLgr5Fcを静脈注射した。免疫化マウスに由来する脾臓リンパ球を、従来法(Kremer L and Marquez G (2004) Methods Mol Biol., 239; 243 - 260)により、P3-X63Ag8U1マウスミエローマ細胞(ATCC)と融合させた。ELISAを用いて、sLgr5-Fcとの反応性を有する抗体についてハイブリドーマ培養上清をスクリーニングした。Lgr5特異的マウスmAb 2L36、2T15E-2および2U2E-2を樹立した。
結腸CSCを標識抗体でインキュベーションし、EPICS ALTRA(Beckman Coulter)およびFACSCalibur(Becton Dickinson)を用いて解析した。使用した抗体は、PE標識マウス抗ヒトCD133抗体(Miltenyi Biotec)、PE標識マウス抗ヒトCD44抗体(BD Pharmingen)、FITC標識マウス抗ヒトCD326(EpCAM)抗体(Miltenyi Biotec)、PE標識マウス抗ヒトCD166抗体(R&D Systems)、PE標識マウス抗ヒトCD24抗体(BD Pharmingen)、PE標識マウス抗ヒトCD26抗体(BD Pharmingen)、およびPE標識マウス抗ヒトCD29抗体(BD Pharmingen)であった。
Complete Miniプロテアーゼインヒビターカクテル(Roche)を添加したRIPAバッファー(Sigma)を用いて、タンパク質を抽出した。タンパク質をNuPAGEゲル(Invitrogen)で分画し、PVDF膜に転写した。1%スキムミルク含有PBSでブロッキングした後、膜を、ウサギ抗ヒトβカテニン抗体(Sigma)、ウサギ抗ヒトホスホc-JUN抗体 (Sigma)、ウサギ抗ヒトTCF1抗体 (Cell Signaling)、ウサギ抗ヒトTCF3抗体 (Cell Signaling)、ウサギ抗ヒトTCF4抗体 (Cell Signaling)、ウサギ抗ヒトLgr5抗体 (Abcam)、マウス抗ヒトEカドヘリン抗体 (Abcam)、ウサギ抗ヒトSnail 抗体(Abcam)、および、マウス抗ヒトGAPDH抗体 (Santa Cruz)でプローブした。BCIP/NBT基質(KPL)を用いて反応性のバンドを検出した。
RNeasy Mini Kit including DNAase treatment(Qiagen)を用いて、全RNAを単離した。cDNAは、First-Strand cDNA Synthesis Kit(SABiosciences)を用いて合成した。定量的リアルタイムPCR(QRT-PCR)解析は、Mx3005P Real-Time PCR System(Stratagene)において、SYBR Green/Rox qPCR(SABiosciences)を用いて実施した。誘導倍率の値は、2-ΔΔCt法を用いて算出した。GAPDHおよびACTBを参照として用いた。実験はすべて3回ずつ行った。
以下のプライマーを、反応性の転写産物を増幅するために用いた。
Lgr5:
フォワードプライマー5'-AGTTTATCCTTCTGGTGGTAGTCC-3'(配列番号:1)、
リバースプライマー5'-CAAGATGTAGAGAAGGGGATTGA-3'(配列番号:2)、
GAPDH:
フォワードプライマー5'-CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC-3'(配列番号:3)、
リバースプライマー5'-ACGACCAAATCCGTTGACTC-3'(配列番号:4)、
ACTB:
フォワードプライマー5'-AAGTCCCTTGCCATCCTAAAA-3'(配列番号:5)、
リバースプライマー5'-ATGCTATCACCTCCCCTGTG-3'(配列番号:6)、
Bmi1:
フォワードプライマー5'-AACCATTGTTTGGATTTGGAAG-3'(配列番号:21)
リバースプライマー5'-ACAAACTATGGCCCAATGCT-3'(配列番号:22)
Hopx:
フォワードプライマー5'-CGTAACCTCGGCATACTTTCA-3'(配列番号:23)
リバースプライマー5'-CGAGCAAGGACCTGAAAAAC-3'(配列番号:24)
浮遊細胞および付着細胞を、それぞれウェルあたり浮遊細胞約100個および付着細胞1×104個で、96ウェルプレートに播種した。0および3日目に、製造元のプロトコールに従って、Cell Counting Kit-8アッセイ(Doujindo)により生細胞数を測定した。0日目の平均吸光度を100%と表した。化学感受性分析のため、浮遊細胞および付着細胞を、それぞれウェルあたり浮遊細胞約100個および付着細胞1×104個で、96ウェルプレートに播種し、24時間インキュベーションした後、10μg/mLの5-FU (Hospira)、10μg/mLのイリノテカン(Hospira)、50 mMのTCFインヒビターFH535 (Merck)、および50 mMのβカテニンインヒビターであるカルダモニン(Merck)を添加した。薬物存在下で3日間培養した後、Cell Counting Kit-8を細胞に加えた。DMSOまたは培地のみに曝露した細胞の平均吸光度を100%と表した。実験はすべて3回ずつ行った。
免疫蛍光細胞化学のために、4%パラホルムアルデヒドおよびメタノールで固定した細胞を、マウス抗ヒトE-カドヘリン抗体(Abcam)、ウサギ抗ヒトSnail抗体(Abcam)、またはウサギ抗ヒトβ-カテニン抗体(Sigma)と共にインキュベーションし、その後、それぞれAlexaFluor 488で標識したヤギ抗マウスIgG抗体またはヤギ抗ウサギIgG抗体を用いて可視化した。免疫蛍光組織化学のために、上記の固定細胞および異種移植腫瘍のパラフィンブロック由来の薄片をマウス抗ヒトLgr5抗体(2U2E-2)またはウサギ抗ヒトSnail抗体(Abcam)、ウサギ抗ヒトHLA-DMA抗体(Sigma)、ウサギ抗TMEM173抗体(Abcam)、ウサギ抗ヒトZMAT3抗体(Abcam)、ウサギ抗ヒトGPR110抗体(Abcam)とと共にそれぞれインキュベーションした。一次抗体とインキュベーションした後、Lgr5タンパク質を、ポリマー-HRP(DAKO)と結合したヤギ抗マウス抗体によって検出し、AlexaFluor 488標識チラミド(tyramide)(Invitrogen)によって可視化した。ビオチン化ヤギ抗ウサギ抗体(VECTOR)によってSnailタンパク質、HLA-DMAタンパク質、およびTMEM173タンパク質を検出し、AlexaFluor 568標識ストレプトアビジン(Invitrogen)によって可視化した。これらの細胞および検体も、DAPI(Invitrogen)で染色した。ポリマーHRP(DAKO)と結合したヤギ抗ウサギ抗体によってZMAT3タンパク質およびGPR110タンパク質を検出し、ジアミノベンチジンによって可視化した。これらの細胞および検体はマイヤーヘマトキシリン(武藤化学薬品)で染色した。
Lgr5陽性CSCがpKH67色素(Sigma)で教示書にしたがって染色された。Lgr5陽性CSCの分化のために、96ウェルプレート中の各ウェルの50%マトリゲル(BD Bioscience)レイヤー上に播種された当該細胞が、熱不活化された5%の仔牛血清および5%のマトリゲルを含むstem cell培地中で培養された。対称および非対称の細胞分裂は蛍光顕微鏡によってモニターされた。
既報(Fujii E. et al. (2008) Establishment and characterization of in vivo human tumor models in the NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse. Pathol Int 58:559-567.)のとおり、本発明者らは、NOD/Shi-scid、IL-2Rγnull(NOG)マウスを用いて11種のヒト結腸癌異種移植片を樹立した(表1;免疫欠損NOGマウスにおいて樹立したヒト結腸直腸癌細胞株の数)。
表1に示すように、53例のヒト結腸直腸癌患者の試料から、17例の結腸癌異種移植片が樹立された。17例の異種移植片の他に、19例において、付随するEBV感染リンパ腫細胞(これはNOGマウスの状態を悪化させた)が生じ、14例において他の種類の感染が起こり、3例においては腫瘍増殖が起こらなかった。これら17例の異種移植片のうち、11例の異種移植片は、凍結融解後でさえ生存し、腫瘍再構築能を保持し、かつ元の腫瘍と類似した組織病理学的特徴を示した。これら11例の異種移植片のうち、10例はグレード2の中分化型腺癌に由来し、1例はグレード3の低分化型腺癌に由来した。
本発明者らは、結腸CSCを単離するために2種類のMDCC異種移植片、すなわちPLR59およびPLR123を使用した。これらの異種移植片を本発明者らが選択したのは、NOGマウスで10回の継代を経た後でさえ、迅速に増殖する一方で上皮管および小さな出芽クラスタを有する腫瘍を再構築する能力を保持していた(図1)からである。したがってこれらの異種移植片から安定なCSCが得られると考えられた。
Lgr5タンパク質の発現を調べるため、本発明者らは、それぞれ免疫組織化学分析用およびフローサイトメトリー分析用の、3種類のLgr5特異的モノクローナル抗体(2L36、2T15E-2および2U2E-2)を作製した。本発明者らの抗体はLgr5に高度に特異的であったが、Lgr5に対して両方とも高い相同性を有するLgr4およびLgr6に対しては交差反応しなかった(図28、29)。これらの抗体を用いることにより、本発明者らは、付着性のCSCにLgr5が発現することを立証した。いくつかの研究では、ALDHは腫瘍発生において結腸直腸癌幹細胞に特異的なマーカーとなることが記載されているが他方では、マーカーとしてのALDH活性の関与は、CD44陽性またはCD133陽性に関する該マーカーの共存と共にしか示されていなかったことが報告されている(Chu P, et al. (2009) Characterization of a subpopulation of colon cancer cells with stem cell-like properties. Int J Cancer 124:1312-1321.,Huang EH, et al. (2009) Aldehyde dehydrogenase 1 is a marker for normal and malignant human colonic stem cells (SC) and tracks SC overpopulation during colon tumorigenesis. Cancer Res 69:3382-3389.)。本発明者らの実験において、Lgr5陽性の付着細胞はALDH陽性である一方、Lgr5陰性の浮遊細胞はALDH陰性であった。
結腸癌の幹細胞群の特徴がWntシグナル伝達であるならば、インビボではLgr5陽性の付着細胞しか腫瘍を形成することができない。これが本当なのかどうか確かめるため、本発明者らは、Lgr5陽性の付着細胞およびLgr5陰性の浮遊細胞の腫瘍形成能を調べた。
Lgr5の発現と一致して、Lgr5陽性細胞ではβ-カテニン、TCF1、TCF3、およびTCF4タンパク質のレベルがアップレギュレーションされたが、Lgr5陰性細胞では認められなかった(図7および図21)。
CSCの特徴の1つは、化学療法剤に対する抵抗性であるため、本発明者らは、5-FUおよびイリノテカンに対する結腸CSCの感受性を調べた。前述のように、Lgr5陽性細胞は倍加時間約2.5日で増殖したが、Lgr5陰性CSCは増殖という観点からは静止状態であった。5-FUおよびイリノテカンはどちらもLgr5陽性の結腸CSCの増殖を有意に阻害したが、Lgr5陰性の結腸CSCの増殖および生存には影響を与えなかった(図10および図24)。Lgr5陽性の結腸CSCを5-FUまたはイリノテカンに3日間曝露した後、これらの化学療法剤に対して抵抗性を有する細胞が現れた。驚くべきことに、該薬物抵抗性細胞はLgr5陰性であり、かつその形態が変化しており(図11、図32、および図25)、これは、Lgr5陽性状態からLgr5陰性状態への変化を示すものである。
核β-カテニンを発現している間葉様細胞は、EMTを受ける、移動性CSCおよび転移形成CSCであると考えられる(Brabletz T, Jung A, Spaderna S, Hlubek F, Kirchner T (2005) Opinion: migrating cancer stem cells - an integrated concept of malignant tumour progression. Nat Rev Cancer 5:744-749.)。Lgr5陽性の結腸CSCの形態が間葉細胞に似ているため、本発明者らはLgr5陽性の結腸CSCは移動性CSCに相当するかどうか試験した。ウエスタンブロット分析によって、Lgr5陽性の結腸CSCにおける、低レベルの細胞表面E-カドヘリン、高レベルのSnail、および核局在β-カテニンの発現(これはEMTの特徴である)が明らかになった(図13、図14、および図26)。これに対して、Lgr5陰性の結腸CSCはいかなるEMTの兆候も示さず、すなわち、細胞表面E-カドヘリンが高発現し、Snailが低発現し、かつβ-カテニンの核局在は認められなかった。さらに、異種移植腫瘍組織で、出芽性領域でEMTを受けている細胞における、SnailとLgr5の同時発現が観察され(図15)、これは、Lgr5陽性の結腸CSCが移動性幹細胞に相当するとの見解を支持するものである。近年、Pangらにより、CD26+ CSCの亜集団が高度な転移能を有していることが報告された(Pang R, et al. (2010) A subpopulation of CD26+ cancer stem cells with metastatic capacity in human colorectal cancer. Cell Stem Cell 6:603-615.)。本発明者らの結果により、Lgr5陽性およびLgr5陰性のCSCのどちらも細胞表面でCD26を発現していたことが明らかになり、このことは、転移におけるCD26の重要性をさらに調査する必要があることを示唆するものである。
増殖型および休止型のCSCはLgr5抗体(2U2E-2)、HLA-DMA抗体およびEREG抗体を用いた組織免疫染色によって決定された(図55および表6)。増殖型CSCはLgr5陽性細胞を表し、休止型HLA-DMA陽性かつEREG陽性の細胞を表す(表6)。HLA-DMAおよびEREGに対してともに陽性を示すLgr5陽性細胞、ならびにHLA-DMAおよびEREGに対してともに陽性を示すLgr5陰性細胞は、大腸癌患者から単離された原発性(プライマリー)および転移性の大腸癌検体に僅かであったが存在した(図55)。ヒト大腸癌組織の12検体のうち、8例ではLgr5陽性細胞およびLgr5陰性細胞の双方が検出され、残る4例ではLgr5陽性細胞またはLgr5陰性細胞のいずれかが観察された。全検体中0.003から1.864%がLgr5陽性細胞で、0.001-10.243%がLgr5陰性細胞であった(表6)。
Claims (65)
- 細胞マーカーであるLgr5が陽性であり、無血清培養で付着性であることを特徴とする、単離された癌幹細胞。
- 間葉性細胞である、請求項1に記載の癌幹細胞。
- 細胞マーカーであるLgr5が陰性であり、無血清培養で浮遊性であることを特徴とする、単離された癌幹細胞。
- 上皮細胞である、請求項3に記載の癌幹細胞。
- 消化器癌由来である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の癌幹細胞。
- 消化器癌が大腸癌である、請求項5に記載の癌幹細胞。
- 細胞マーカーであるCD133、CD44、EpCAM、CD166、CD24、CD26、CD29、EREGのいずれか一つ以上が陽性である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の癌幹細胞。
- 細胞マーカーであるCD133、CD44、EpCAM、CD166、CD24、CD26、CD29およびEREGが陽性である、請求項7に記載の癌幹細胞。
- ALDH活性の細胞マーカーが陽性もしくはLCK、FGFBP1、ROR1および/またはPIGUの細胞マーカーが陽性である、請求項1、2、5〜8のいずれか一項に記載の癌幹細胞。
- ALDH活性の細胞マーカーが陰性もしくはHLA-DMA、TMEM173、ZMAT3、TNFSF15、AMIGO2、PROM2、GPR87、BLNK、HLA-DMB、GPR172B、GNAI1、FAS、GM2A、FLRT3、STOM、GJB5、ABCA1、SLC6A14、BMPR2、CLDN1、および/またはGPR110の細胞マーカーが陽性である、請求項3〜8のいずれか一項に記載の癌幹細胞。
- 癌組織の階層構造を再現する特徴を有する癌幹細胞である、請求項1、2、5〜9のいずれか一項に記載の癌幹細胞。
- 癌組織の階層構造を再現する特徴を有する癌幹細胞である、請求項3〜8、10のいずれか一項に記載の癌幹細胞。
- 上皮間葉移行能を有する癌幹細胞である、請求項1、2、5〜9、11のいずれか一項に記載の癌幹細胞。
- 上皮間葉移行能を有する癌幹細胞である、請求項3〜8、10、12のいずれか一項に記載の癌幹細胞。
- 請求項1、2、5〜9、11、13のいずれか一項に記載の癌幹細胞を含む、実質的に均質な癌幹細胞集団。
- 請求項3〜8、10、12、14のいずれか一項に記載の癌幹細胞を含む、実質的に均質な癌幹細胞集団。
- 癌幹細胞または癌幹細胞を含む細胞集団を付着培養する工程を含む、請求項1、2、5〜9、11、13のいずれか一項に記載の癌幹細胞または請求項15に記載の実質的に均質な癌幹細胞集団を製造する方法。
- 癌幹細胞または癌幹細胞を含む細胞集団を、浮遊培養する工程または増殖抑制剤存在下において培養する工程を含む、請求項3〜8、10、12、14のいずれか一項に記載の癌幹細胞または請求項16に記載の実質的に均質な癌幹細胞集団を製造する方法。
- 以下の(a)〜(c)の工程を含む医薬品のスクリーニング方法;
(a)請求項1、2、5〜9、11、13のいずれか一項に記載の癌幹細胞を含む実質的に均質な癌幹細胞集団を準備する工程、
(b)前記癌幹細胞集団または前記癌幹細胞集団に含まれる癌幹細胞を被検物質で処理する工程、
(c)前記被検物質で処理された癌幹細胞集団または癌幹細胞の生物学的特性の変化を検出する工程。 - 医薬品が抗癌剤または転移もしくは再発抑制剤である、請求項19に記載のスクリーニング方法。
- 以下の(a)〜(c)の工程を含む医薬品のスクリーニング方法;
(a)請求項3〜8、10、12、14のいずれか一項に記載の癌幹細胞を含む実質的に均質な癌幹細胞集団を準備する工程、
(b)前記癌幹細胞集団または前記癌幹細胞集団に含まれる癌幹細胞を被検物質で処理する工程、
(c)前記被検物質で処理された癌幹細胞集団または癌幹細胞の生物学的特性の変化を検出する工程。 - 医薬品が抗癌剤である、請求項21に記載のスクリーニング方法。
- 以下の(a)〜(c)の工程を含む医薬品のスクリーニング方法;
(a)請求項1、2、5〜9、11、13のいずれか一項に記載の癌幹細胞を含む実質的に均質な癌幹細胞集団を準備する工程、
(b)非ヒト動物に前記細胞集団または前記癌幹細胞集団に含まれる癌幹細胞および被検物質を投与する工程、
(c)前記非ヒト動物における腫瘍の形成を検出する工程。 - 以下の(a)〜(c)の工程を含む医薬品のスクリーニング方法;
(a)請求項3〜8、10、12、14のいずれか一項に記載の癌幹細胞を含む実質的に均質な癌幹細胞集団を準備する工程、
(b)非ヒト動物に前記細胞集団または前記癌幹細胞集団に含まれる癌幹細胞および被検物質を投与する工程、
(c)前記非ヒト動物における腫瘍の形成を検出する工程。 - 以下の(a)〜(d)の工程を含む医薬品のスクリーニング方法;
(a)請求項1、2、5〜9、11、13のいずれか一項に記載の癌幹細胞を含む実質的に均質な癌幹細胞集団を準備する工程、
(b)非ヒト動物に前記細胞集団または前記癌幹細胞集団に含まれる癌幹細胞および増殖抑制剤を投与する工程、
(c)被験物質を投与する工程、
(d)前記非ヒト動物における腫瘍の形成を検出する工程。 - 前記細胞集団を投与する工程が皮下投与あるいは静脈内投与である、請求項23〜25のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
- 医薬品が抗癌剤または転移もしくは再発抑制剤である、請求項23〜26のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
- 以下の(a)〜(c)の工程を含む、請求項1、2、5〜9、11、13のいずれか一項に記載の癌幹細胞または請求項15に記載の実質的に均質な癌幹細胞集団を分離または検出する方法;
(a)癌幹細胞を含む細胞集団を準備する工程、
(b)前記細胞集団または前記細胞集団に含まれる細胞とLgr5抗体とを接触させる工程、
(c)前記細胞集団または細胞から、Lgr5が陽性な細胞集団または細胞を分離または検出する工程。 - 以下の(a)〜(c)の工程を含む、請求項1、2、5〜9、11、13のいずれか一項に記載の癌幹細胞または請求項15に記載の実質的に均質な癌幹細胞集団を分離または検出する方法;
(a)癌幹細胞を含む細胞集団を準備する工程、
(b)前記細胞集団または前記細胞集団に含まれる細胞とE-カドヘリン抗体、Snail抗体、LCK抗体、FGFBP1抗体、ROR1抗体、PIGU抗体、および/またはβカテニン抗体とを接触させる工程、
(c)前記細胞集団または細胞から、細胞表面のE-カドヘリンが陰性である、Snailが陽性である、LCKが陽性である、FGFBP1が陽性である、ROR1が陽性である、PIGUが陽性である、および/またはβカテニンが核に局在している細胞集団または細胞を分離または検出する工程。 - 以下の(a)〜(c)の工程を含む、請求項3〜8、10、12、14のいずれか一項に記載の癌幹細胞または請求項16に記載の実質的に均質な癌幹細胞集団を分離または検出する方法;
(a)癌幹細胞を含む細胞集団を準備する工程、
(b)前記細胞集団または前記細胞集団に含まれる細胞とLgr5抗体とを接触させる工程、
(c)前記細胞集団または細胞から、Lgr5が陰性な細胞集団または細胞を分離または検出する工程。 - 以下の(a)〜(c)の工程を含む、請求項3〜8、10、12、14のいずれか一項に記載の癌幹細胞または請求項16に記載の実質的に均質な癌幹細胞集団を分離または検出する方法;
(a)癌幹細胞を含む細胞集団を準備する工程、
(b)前記細胞集団または前記細胞集団に含まれる細胞とE-カドヘリン抗体、Snail抗体、βカテニン抗体、HLA-DMA抗体、TMEM173抗体、ZMAT3抗体、TNFSF15抗体、AMIGO2抗体、PROM2抗体、GPR87抗体、BLNK抗体、HLA-DMB抗体、GPR172B抗体、GNAI1抗体、FAS抗体、GM2A抗体、FLRT3抗体、STOM抗体、GJB5抗体、ABCA1抗体、SLC6A14抗体、BMPR2抗体、CLDN1抗体、および/またはGPR110抗体とを接触させる工程、
(c)前記細胞集団または細胞から、細胞表面のE-カドヘリンが陽性である、Snailが陰性である、βカテニンが核に局在していない、HLA-DMAが陽性である、TMEM173が陽性である、ZMAT3が陽性である、TNFSF15が陽性である、AMIGO2が陽性である、PROM2が陽性である、GPR87が陽性である、BLNKが陽性である、HLA-DMBが陽性である、GPR172Bが陽性である、GNAI1が陽性である、FASが陽性である、GM2Aが陽性である、FLRT3が陽性である、STOMが陽性である、GJB5が陽性である、ABCA1が陽性である、SLC6A14が陽性である、BMPR2が陽性である、CLDN1が陽性である、および/またはGPR110が陽性である細胞集団または細胞を分離または検出する工程。 - Lgr5抗体を含有することを特徴とする、請求項28〜31に記載の方法に用いるためのキット又はセット。
- 以下の(a)および(b)の工程を含む、請求項1、2、5〜9、11、13のいずれか一項に記載の癌幹細胞または請求項15に記載の実質的に均質な癌幹細胞集団の存在を検出・同定又は定量する方法;
(a)癌幹細胞を含む細胞集団を準備する工程、
(b)前記細胞集団または前記細胞集団に含まれる細胞とLgr5抗体とを接触させる工程。 - Lgr5抗体を含有することを特徴とする、請求項33に記載の方法に用いるためのキット又はセット。
- 高い増殖能を有する癌幹細胞と低い増殖能を有する癌幹細胞とを分離または検出する方法。
- 付着培養により分離することを特徴とする、請求項35に記載の方法。
- 増殖抑制剤存在下における培養により分離または検出することを特徴とする、請求項35に記載の方法。
- 浮遊培養により分離することを特徴とする、請求項35に記載の方法。
- 細胞マーカーであるLgr5を用いて分離することを特徴とする、請求項35〜38のいずれか一項に記載の方法。
- さらに、細胞マーカーであるHLA-DMA、TMEM173、ZMAT3、TNFSF15、AMIGO2、PROM2、GPR87、BLNK、HLA-DMB、GPR172B、GNAI1、FAS、GM2A、FLRT3、STOM、GJB5、ABCA1、SLC6A14、BMPR2、CLDN1、および/またはGPR110を用いて分離することを特徴とする、請求項39に記載の方法。
- 増殖能が異なる癌幹細胞へと誘導する方法。
- 高い増殖能を有する癌幹細胞を浮遊培養することにより、低い増殖能を有する癌幹細胞へと誘導する、請求項41に記載の方法。
- 高い増殖能を有する癌幹細胞を低接着性プレートで培養することにより、高い増殖能を有する癌幹細胞を低い増殖能を有する癌幹細胞へと誘導する、請求項41または42に記載の方法。
- 増殖抑制剤を用いることにより、高い増殖能を有する癌幹細胞を低い増殖能を有する癌幹細胞へと誘導する、請求項41に記載の方法。
- 増殖抑制剤の存在下において培養することを特徴とする、請求項44に記載の方法。
- 高い増殖能を有する癌幹細胞を保持する非ヒト動物に増殖抑制剤を投与することを特徴とする、請求項44に記載の方法。
- 低い増殖能を有する癌幹細胞を付着培養することにより、高い増殖能を有する癌幹細胞へと誘導する、請求項41に記載の方法。
- 低い増殖能を有する癌幹細胞を接着性プレートで培養することにより、高い増殖能を有する癌幹細胞へと誘導する、請求項41または47に記載の方法。
- 低い増殖能を有する癌幹細胞を非ヒト動物に移植することにより、高い増殖能を有する癌幹細胞へと誘導する請求項41に記載の方法。
- 請求項35、36、39〜41、47〜49のいずれか一項に記載の方法により分離および/または誘導された、高い増殖能を有する癌幹細胞。
- 請求項35、38〜46のいずれか一項に記載の方法により分離および/または誘導された、低い増殖能を有する癌幹細胞。
- 請求項35、38〜46のいずれか一項に記載の方法により分離および/または誘導された癌幹細胞を用いた、抗癌剤のスクリーニング方法。
- 請求項35、36、39〜41、47〜49のいずれか一項に記載の方法により分離および/または誘導された癌幹細胞を用いた、化合物の評価方法。
- βカテニン抑制剤およびTCF阻害剤とを組み合わせてなる、請求項1、2、5〜9、11、13のいずれか一項に記載の癌幹細胞の増殖抑制剤。
- 癌幹細胞の増殖抑制剤が抗癌剤である、請求項54に記載の癌細胞の増殖抑制剤。
- 5-FU、オキサリプラチン、またはイリノテカンを有効成分として含有する、請求項1、2、5〜9、11、13のいずれか一項に記載の癌幹細胞の転移または再発抑制剤。
- 以下の(a)および(b)の工程を含む、請求項1〜14のいずれか一項に記載の癌幹細胞または請求項15もしくは16に記載の実質的に均質な癌幹細胞集団の存在を検出・同定又は定量するための方法。
(a)癌患者から取得したサンプルを準備する工程、
(b)前記サンプルとLgr5抗体、HLA-DMA抗体、TMEM173抗体、ZMAT3抗体、TNFSF15抗体、AMIGO2抗体、PROM2抗体、GPR87抗体、BLNK抗体、HLA-DMB抗体、GPR172B抗体、GNAI1抗体、FAS抗体、GM2A抗体、FLRT3抗体、STOM抗体、GJB5抗体、ABCA1抗体、SLC6A14抗体、BMPR2抗体、CLDN1抗体、および/またはGPR110抗体とを接触させる工程。 - 検出・同定又は定量するための方法が、癌の診断、癌患者の選別、薬剤の有効性の予見、治療のモニタリング、癌のイメージングである請求項57に記載の方法。
- Lgr5抗体を含有することを特徴とする、請求項57または58に記載の方法に用いるためのキット又はセット。
- 以下の(a)〜(c)のいずれかに記載のヌクレオチド配列からなる遺伝子によりコードされるタンパク質の調節剤を含有する癌幹細胞阻害剤。
(a)配列番号:7〜13のいずれかに記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
(b)配列番号:7〜13のいずれかに記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、配列番号:7〜13のいずれかに記載のヌクレオチド配列からなる遺伝子によりコードされるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
(c)配列番号:7〜13のいずれかに記載のヌクレオチド配列からなる遺伝子によりコードされるタンパク質の少なくとも一つのアミノ酸残基が付加、欠失、又は置換されたタンパク質であって、配列番号:7〜13のいずれかに記載のヌクレオチド配列からなる遺伝子によりコードされるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド - 前記調節剤が、前記タンパク質に結合する抗体である、請求項60に記載の癌幹細胞阻害剤。
- 前記抗体が、キメラ抗体、ヒト型化抗体、ヒト抗体、抗体断片、又は二重特異性抗体である、請求項61に記載の癌幹細胞阻害剤。
- 前記調節剤が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー、およびsiRNA、からなる群から選択される、1個またはそれ以上の物質を含む、請求項60に記載の癌幹細胞阻害剤。
- 抗癌剤と組み合わせて用いることを特徴とする、請求項60〜63のいずれか一項に記載の癌幹細胞阻害剤。
- 以下の(a)〜(c)のいずれかに記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド又は該ヌクレオチド配列からなる遺伝子によりコードされるタンパク質、それらの一部、又はそれらの修飾体を含有する癌幹細胞ワクチン。
(a)配列番号:7〜13のいずれかに記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
(b)配列番号:7〜13のいずれかに記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、配列番号:7〜13のいずれかに記載のヌクレオチド配列からなる遺伝子によりコードされるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
(c)配列番号:7〜13のいずれかに記載のヌクレオチド配列からなる遺伝子によりコードされるタンパク質の少なくとも一つのアミノ酸残基が付加、欠失、又は置換されたタンパク質であって、配列番号:7〜13のいずれかに記載のヌクレオチド配列からなる遺伝子によりコードされるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
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