JPWO2013018169A1 - 抗菌活性増強剤 - Google Patents
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Abstract
Description
この他にも、ラクトフェリンのペプシン消化物から得られるラクトフェリン由来ペプチドであるラクトフェリシン(登録商標)が抗菌活性を有することが知られている(非特許文献3、4)。
さらには、上記ラクトフェリンやラクトフェリン分解物にラクトフェリン類以外の成分を組み合わせて、抗菌活性を増強する方法が検討されている。
しかしながら、ラクトフェリン類の抗菌効果を顕著な程度に高める組み合わせはほとんど知られていない。
特に、ラクトフェリン類に添加する量が極めて少量であっても、ラクトフェリン類の抗菌活性を高める方法が求められていた。
さらには、日常的な摂取による副作用がなく、安全性の高い抗菌剤が求められていた。
そして、上記成分の中から、自らが抗菌活性を有しない乳由来の蛋白質であるリボヌクレアーゼ−4が、ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物の抗菌活性を顕著に高めることを確認し、本発明を完成するに至った。
(a)乳原料を陽イオン交換樹脂に接触させて乳原料中の蛋白質を陽イオン交換樹脂に吸着処理する工程、
(b)前記吸着処理後の陽イオン交換樹脂を洗浄処理し、溶出溶媒を通液して、等電点が8.0〜10.0の画分を溶出する工程、
(c)前記溶出した蛋白質画分をゲル濾過担体によりゲル濾過処理して分子量30kDa以下の画分を回収する工程、を有することを特徴とする、方法である。
(a)乳原料を陽イオン交換樹脂に接触させて乳原料中の蛋白質を陽イオン交換樹脂に吸着処理する工程、
(b)前記吸着処理後の陽イオン交換樹脂を洗浄処理し、溶出溶媒を通液して、等電点が8.0〜10.0の画分を溶出する工程、
(c)前記溶出した蛋白質画分を分画分子量30kDaの限外濾過膜により膜濾過処理して膜透過画分を回収する工程、
(d)前記膜透過画分をゲル濾過担体によりゲル濾過処理して分子量30kDa以下の画分を回収する工程、
を有することを特徴とする方法である。
本発明の抗菌活性増強剤は、ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物が本来的に有する抗菌活性を増強する効果を有するものである。
本発明の抗菌活性増強剤は、リボヌクレアーゼ−4のみからなるものであってもよいが、リボヌクレアーゼ−4を有効成分として含む限り、他の成分、例えば後述する製剤化に用いられる成分を含んでいてもよい。また、本発明の抗菌活性増強剤は、リボヌクレアーゼ−4を有効成分として含む限り、リボヌクレアーゼ−4以外の乳由来の蛋白質(但し、ラクトフェリンを除く)を含んでいてもよいが、抗菌活性増強剤中に含まれる蛋白質に対するリボヌクレアーゼ−4の純度は、好ましくは0.01%以上、より好ましくは0.1%以上、特に好ましくは1.0%以上である。ラクトフェリンの混在量については後述する。
また、本発明の抗菌活性増強剤は、ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物と液体同士で混合してもよく、粉末同士で混合してもよい。粉末化して混合することで、錠剤、トローチ等の製剤化の際に操作が容易となる。
抗菌活性の増強の程度の評価は、一定量のラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物に、本発明の抗菌活性増強剤を種々の量で加えたときに、最も高い抗菌活性を示す条件で行うことが好ましい。
なお、本発明の抗菌活性増強剤は、抗菌作用増強用医薬組成物、抗菌作用増強剤、及び抗菌作用増強用添加剤として使用することも可能である。
従って、本発明の抗菌活性増強剤は、除菌補助剤又は殺菌補助剤と言い換えることができる。同様に、本発明の抗菌活性増強剤は、除菌組成物又は殺菌組成物と言い換えることができる。
本発明の有効成分であるリボヌクレアーゼ−4は、哺乳類(例えば、ヒト、ウシ、水牛、ウマ、ヤギ、ヒツジ等)の初乳、移行乳、常乳、末期乳等、これらの処理物である脱脂乳を乳原料として用いて陽イオン交換処理、限外膜濾過処理、及びゲル濾過担体によるゲルろ過処理によって調製することができるものである。
また、リボヌクレアーゼ−4は、乳原料中にホエイ(乳清)蛋白質が含まれるものであれば特に制限なく調製することができる。
例えば、ウシ由来のリボヌクレアーゼ−4は、147アミノ酸残基、分子量が17kD、等電点が9.18のタンパクである。リボヌクレアーゼ−4は、リボヌクレアーゼ活性や癌細胞に対する細胞毒性を示すことが知られるが、これまでその他の生理活性については知られていなかった。
さらに、リボヌクレアーゼ−4は、乳や乳製品を原料として得られるリボヌクレアーゼ−4に限られず、乳に含まれるリボヌクレアーゼ−4と同等の構造を有する限り、乳以外の動物の体液や組織から得られる蛋白質、又は、化学合成品もしくは組換え蛋白質であってもよい。また、リボヌクレアーゼ−4又はそのフラグメントは、配列番号4のアミノ酸配列を有するものに限られず、それらの保存的バリアントであってもよい。保存的バリアントとしては、配列番号4のアミノ酸配列において、1又は数個、例えば1〜10個、好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜3個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位等を含む配列を有する蛋白質、又は、配列番号4のアミノ酸配列と80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する蛋白質であって、ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物の抗菌活性を増強する作用を有する蛋白質が挙げられる。
本発明において抗菌活性の増強の対象となるラクトフェリンは、市販品の他、哺乳類(例えば、ヒト、ウシ、水牛、ウマ、ヤギ、ヒツジ等)の初乳、移行乳、常乳、末期乳等、これらの処理物である脱脂乳、ホエイ等からイオン交換クロマトグラフィー等の常法により分離したラクトフェリン、ラクトフェリンから常法により鉄を除去したアポラクトフェリン、アポラクトフェリンに鉄、銅、亜鉛、マンガン等の金属を一部又は完全にキレートさせた金属不飽和ラクトフェリン、または金属飽和ラクトフェリンのいずれであっても使用することができる。
また、組換えDNA技術により得られる組換え真菌、組換え乳牛(トランスジェニック・カウ)等により生産されるヒト・ラクトフェリン等も、同様に本発明に使用することができる。
本発明において抗菌活性の増強の対象となるラクトフェリン加水分解物は、市販品の他、本発明のラクトフェリンを酸又は酵素で加水分解して得られる加水分解物を使用することができ、例えば特願平3−171736号の発明に記載された方法によって得ることができる。
ラクトフェリン由来ペプチドとしては、例えば、ラクトフェリシン(登録商標)を例示することが可能であって、ヒト・ラクトフェリシン(ラクトフェリシンH)、ウシ・ラクトフェリシン(ラクトフェリシンB)のそれぞれが挙げられる。
図8は、ヒト・ラクトフェリシン(ラクトフェリシンH)の一次構造(アミノ酸配列:配列番号1、2)、図9はウシ・ラクトフェリシン(ラクトフェリシンB)の一次構造(アミノ酸配列:配列番号3)をそれぞれ示す。
本発明における抗菌活性増強剤の有効成分は、リボヌクレアーゼ−4からなっており、当該成分が、ラクトフェリン又はラクトフェリン分解物の抗菌活性を増強する作用効果を有している。
リボヌクレアーゼ−4は、ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物の抗菌活性を増強する作用を有する限り、断片であってもよい。
本発明の抗菌活性増強剤は、、ラクトフェリン又はラクトフェリン分解物に対して使用する場合、抗菌活性増強剤中のリボヌクレアーゼ−4:ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物(質量比)は、好ましくは1:80〜1:1、より好ましくは1:80〜1:10、より好ましくは1:60〜1:10、さらに好ましくは1:40〜1:10である。
本発明の抗菌剤組成物は、本発明の抗菌活性増強剤と、ラクトフェリン、及びラクトフェリン加水分解物からなる群から選択される1又は2以上とを含有し、ラクトフェリン、及びラクトフェリン加水分解物に対する抗菌活性増強剤中のリボヌクレアーゼ−4の質量比が1/80以上であることを特徴としている。ラクトフェリン、及びラクトフェリン加水分解物に対するリボヌクレアーゼ−4の質量比は、1/80以上であれば特に制限されないが、好ましくは1/60以上、より好ましくは1/40以上である。ラクトフェリン、及びラクトフェリン加水分解物に対する抗菌活性増強剤中の乳由来の蛋白質の質量比の上限は特に制限されないが、例えば、1/1以下、又は1/10以下でも高い抗菌活性が期待できる。
尚、通常のホエイ中に含まれるリボヌクレアーゼ−4とラクトフェリンの質量比は、およそ1:200である。
本発明の抗菌剤組成物は、医薬品、飲食品、飼料、化粧品、医薬部外品等に配合することができる。
本発明の医薬品は、本発明の抗菌剤組成物、又は、本発明の抗菌活性増強剤とラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物を含有することを特徴としている。
本発明の医薬品の形態としては特に制限されず、公知の方法により種々の態様に製剤化して投与することができ、好適な実施の態様において経口投与することができる。製剤化する際には、本発明の抗菌活性増強剤とラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物を混合した状態で使用される。
製剤化する場合、製剤中のラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物の含有量は特に限定されるものではない。基本的に本発明の抗菌活性増強剤とラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物による副作用はほとんどないと考えられるが、医薬品中における抗菌活性増強剤とラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物からなる組成物の含有量としては、0.1〜60質量%、好ましくは10〜50質量%である。そして、医薬品中における抗菌活性増強剤とラクトフェリシン(登録商標)からなる組成物の含有量としては、通常0.01〜6質量%、好ましくは1〜5質量%である。
抗菌活性増強剤と、ラクトフェリン、及びラクトフェリン加水分解物との量比は、抗菌剤組成物について記載したのと同様である。
なお、抗菌用の医薬組成物としては、歯みがきや口腔内洗浄液等の医薬品又は医薬部外品等を例示することができる。
本発明の飲食品は、本発明の抗菌剤組成物、又は、本発明の抗菌活性増強剤とラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物を含有することを特徴としている。
本発明の飲食品中における抗菌活性増強剤とラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物からなる組成物の含有量としては、0.1〜60質量%、好ましくは10〜50質量%である。そして、飲食品中における抗菌活性増強剤とラクトフェリシン(登録商標)からなる組成物の含有量としては、通常0.01〜6質量%、好ましくは1〜5質量%である。
抗菌活性増強剤と、ラクトフェリン、及びラクトフェリン加水分解物との量比は、抗菌剤組成物について記載したのと同様である。
また、飲食品の好適な形状としては、液状、タブレット状のサプリメント等を例示することができる。
本発明の飼料は、本発明の抗菌剤組成物、又は、本発明の抗菌活性増強剤とラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物を含有することを特徴としている。
本発明の飼料中における抗菌活性増強剤とラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物からなる組成物の含有量としては、0.1〜60質量%、好ましくは10〜50質量%である。そして、飼料中における抗菌活性増強剤とラクトフェリシン(登録商標)からなる組成物の含有量としては、通常0.01〜6質量%、好ましくは1〜5質量%である。
抗菌活性増強剤と、ラクトフェリン、及びラクトフェリン加水分解物との量比は、抗菌剤組成物について記載したのと同様である。
本発明の抗菌活性増強剤の有効成分であるリボヌクレアーゼ−4は、例えば乳由来の原料を出発原料として以下の工程を有する方法により製造することができる。
すなわち、(a)乳原料を陽イオン交換樹脂に接触させて乳原料中の蛋白質を陽イオン交換樹脂に吸着処理する工程、(b)前記吸着処理後の陽イオン交換樹脂を洗浄処理し、溶出溶媒を通液して、等電点が8.0〜10.0の画分を溶出する工程、(c)前記の溶出した蛋白質画分を分画分子量30kDaの限外濾過膜により膜濾過処理して膜透過画分を回収する工程、(d)前記膜透過画分をゲル濾過担体によりゲル濾過処理して分子量30kDa以下の画分を回収する工程、を有する方法である。
その場合、有効成分であるリボヌクレアーゼ−4の蛋白質純度は96質量%以上であれば良く、それ以外の成分としてラクトフェリンが4.0質量%以下であれば、製造した抗菌活性増強剤それ自体は実質的に抗菌活性は示さないものである。
すなわち、本発明の抗菌活性増強剤をラクトフェリン、ラクトフェリン分解物、又はラクトフェリン由来ペプチドの抗菌活性を増強するために用いられる場合は、(c)の工程を実施せずに、(b)の工程の直後に(d)の工程を実施する方法によって製造されたリボヌクレアーゼ−4の画分を本発明の抗菌活性増強剤として用いたとしても、ラクトフェリン、ラクトフェリン分解物、又はラクトフェリン由来ペプチドの抗菌活性の抗菌活性増強に影響のない範囲であるものである。
これにより、本発明の抗菌活性増強剤以外の用途にリボヌクレアーゼ−4を使用する場合であっても、本発明の製造方法を用いることによって、様々な用途のために高純度のリボヌクレアーゼ−4を提供することが可能であるという効果も兼ね備えているのである。
乳原料としては、前記抗菌活性増強作用を有する蛋白質を含む限り特に制限されず、哺乳類(例えば、ヒト、ウシ、水牛、ウマ、ヤギ、ヒツジ等)の生乳の他、脱脂乳等の加工乳、ホエイ等の分画物、組換え乳牛(トランスジェニック・カウ)等により生産される乳等が挙げられる。乳は、初乳、移行乳、常乳、末期乳等のいずれであってもよい。
本発明に好ましく使用することができる市販のプレパックカラムとしては、Hiprep CMFF16/10(GEヘルスケア社製、交換基:カルボキシメチル基)、Hiprep SPFF16/10(GEヘルスケア社製、交換基:スルホプロピル基)、TOYOPEARL CM−650シリーズ(東ソー社製、交換基:カルボキシメチル基)、TOYOPEARL SP−650シリーズ(東ソー社製、交換基:スルホプロピル基)等が挙げられる。
硬質タイプは、イオン強度またはpHによってイオン交換体自身の体積はほとんど変化せず、また流速の変化等により陽イオン交換体にかかる圧力が変化しても陽イオン交換体自体の体積はほとんど変わらない。したがって、硬質タイプは、陽イオン交換体をカラム内に保持して高流速で通液するカラム連続法により適している。
なお、前記のセパビーズFP−CM13(三菱化学社製)、CM−セファロースFF(GEヘルスケア社製)、SP−セファロースFF(GEヘルスケア社製)、SP−セファロースビッグビーズ(GEヘルスケア社製)は硬質タイプであり、CM−セファデックスC−50(アマシャム社製)は軟質タイプである。
該溶出溶媒としては、イオン強度を上記の範囲に調整した中性又は弱酸性領域の緩衝液を用いることもできる。しかしながら、製造コストの面から考慮すると塩類のみを溶解した水溶液(塩類溶液)を用いることがより好ましい。本願で使用できる塩類は必要に応じて一種あるいは二種以上の組合せを任意で選択可能である。
好ましい塩類溶液は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、及び塩化マグネシウム等からなる群から選ばれる1種又は2種以上の混合物からなる塩類の水溶液であり、具体的には1〜5%の塩化ナトリウム溶液、好ましくは1.5〜3.5%の塩化ナトリウム溶液等が例示される。
なお、前者の通常の限外濾過法を用いた場合には、限外濾過の後に、透析やゲル濾過等の方法で脱塩処理を行うことが好ましい。
限外濾過膜の材質は有機材料製又は無機材料製の何れであっても使用可能であり、コスト面、汎用性等を考慮して選択すればよい。
限外濾過処理時の溶出液の温度は、使用する膜の耐熱温度以下であれば(例えばGR−61pp膜なら80℃以下)実施可能であるが、蛋白質の変性を防ぐ観点からは、0〜60℃、例えば25〜60℃、又は0〜25℃が挙げられる。
使用する限外濾過膜モジュールは、管型、中空糸型、平膜型、スパイラル型等いずれの形式でも可能である。ただし、中空糸型内圧式等のモジュールでは、中空糸内に沈澱物が生成した場合に流路閉塞を起こす可能性があるので、圧力等を考慮して行うことが好ましい。
まず、実施例及び試験例で使用した手法及び試験法について記載する。
[SDS−PAGE(SDSゲル電気泳動法)]
本発明の抗菌活性増強剤の成分組成を特定するために、NuPAGE 4−12%Bis−Trisゲル(Invitrogen社製)を用いて、SDS−PAGEを行った。さらに、SimplyBlue SafeStain(Invitrogen社製)を用いて染色した。
SDS−PAGEにより得られた染色後のゲルは、デンシトグラフ(ATTO社製)で撮影し、解析ソフトによるバンドの確認を行った。得られたスポットをゲルから切り出し、目的の蛋白画分を脱色し、還元アルキル化及びトリプシン処理によるゲル内消化を行った後、MALDI−TOF/MS装置(商品名:AutoflexII、BRUKER社製)にて質量分析した。
測定結果は、Matrix Science社製のMASCOTソフトウェアを使用して、NCBI(National Center for Biotechnology information)のデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)検索により、蛋白質を同定した。
抗菌活性増強試験は、本発明の抗菌活性増強剤をラクトフェリン又はラクトフェリン分解物等に混合した試料について、抗菌活性を測定するものである。対照として、ラクトフェリン又はラクトフェリン分解物等のみの試料についても抗菌活性を測定した。
具体的な試験の手順は、例えば下記のとおりである。
少なくとも下記の試料を調製した。ラクトフェリンの試験では、試料2について抗菌活性増強剤の濃度が異なる2種類を調製する。
検討試料1:ラクトフェリン又はラクトフェリン分解物等
検討試料2:ラクトフェリン又はラクトフェリン分解物等、及び抗菌活性増強剤の混合物
検討試料3:抗菌活性増強剤
また、1%のBacto peptone培地を用い、5mLのポリスチレンチューブに大腸菌K−12株を植菌し、37℃のインキュベーター内で6時間前培養し、これを試験用菌液とする。
96穴プレート上にて上記の試料と共に前培養した大腸菌を106cells/mLとなるよう添加し、37℃にて設定時間培養する。設定時間培養後に大腸菌を含む培養液を0.85%生理食塩水にて段階希釈し、寒天培地上にプレーティングした後、37℃、設定時間培養後に生じたコロニー数(CFU:Colony Forming Units)を測定する。
なお、上記検討試料の他、前記培地溶液のみで大腸菌を培養したものをコントロールとする。
各検討試料のCFUの値から抗菌活性を評価する。抗菌活性の増強の程度については、試験後に残存した大腸菌数(CFU)同士を比較して算出する。例えば、試験後の試料1のCFUが100で、試料2のCFUが10のとき、試料2の抗菌活性は、試料1の10倍であるとすることができる。
本発明の抗菌活性増強剤を製造した。
陽イオン交換樹脂としてCM−セファデックス(CM-Sephadex)C−50(GEヘルスケア社製)を用いた。当該陽イオン交換樹脂170mLを充填したカラムに、未殺菌の脱脂乳20リットルを通液して陽イオン交換樹脂に乳蛋白質を吸着させた。
次いで、カラム内の陽イオン交換樹脂を脱イオン水で十分に洗浄し、0.27M塩化ナトリウム(国産化学株式会社製)を通液して、樹脂に吸着した蛋白質を溶出させた。続いて、溶出溶媒として1.7M塩化ナトリウムを通液し、樹脂に吸着した蛋白質画分を溶出させ、蛋白質画分の溶出した溶出液を回収した。
本発明の抗菌活性増強剤を製造した。
陽イオン交換樹脂としてCM−セファデックス(CM-Sephadex)C−50(GEヘルスケア社製)を用いた。当該陽イオン交換樹脂170mLを充填したカラムに、未殺菌の脱脂乳20リットルを通液して陽イオン交換樹脂に乳蛋白質を吸着させた。
次いで、カラム内の陽イオン交換樹脂を脱イオン水で十分に洗浄し、0.27M塩化ナトリウム(国産化学株式会社製)を通液して、樹脂に吸着した蛋白質を溶出させた。続いて、溶出溶媒として1.7M塩化ナトリウムを通液し、樹脂に吸着した蛋白質画分を溶出させ、蛋白質画分の溶出した溶出液を回収した。
ウシラクトフェリン(森永乳業社製)95gに対して、実施例1と同一の方法により製造した抗菌活性増強剤を5g添加して均一混合し、ラクトフェリンの抗菌活性を増強した抗菌用医薬品を製造した。
ウシラクトフェリン(森永乳業社製)95gに対して、実施例2と同一の方法により製造した抗菌活性増強剤を5g添加して均一混合し、混合物の添加量が10質量%となるように発酵乳に添加して発酵乳食品を製造した。
[試験例1]
本試験例1では、実施例1及び実施例2にて製造した抗菌活性増強剤の成分について、物理的性質の検討を行った。
実施例1及び実施例2で製造した抗菌活性増強剤の成分組成を特定するために、NuPAGE 4−12%Bis−Trisゲル(Invitrogen社製)を用いて、SDS−PAGEを行った。
さらに、SimplyBlue SafeStain(Invitrogen社製)で染色した。
実施例1、実施例2の各抗菌活性増強剤について、それぞれSDS−PAGE(図3、図4に相当)により分画・検出された染色後の各ゲルの中から14kDa付近のバンドαをゲルから切り出し、ゲル中の蛋白質部分を脱色し、還元アルキル化及びトリプシン処理によるゲル内消化を行い、MALDI−TOF/MS装置(商品名:AutoflexII、BRUKER社製)にてペプチドの質量分析を行った。
質量分析の結果は、Matrix Science社製のMASCOTソフトウェアを使用して、NCBI(National Center for Biotechnology Information)のデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)検索により蛋白質を同定した。
実施例1、実施例2の各抗菌活性増強剤について、それぞれSDS−PAGEにより分画・検出された染色後の各ゲル(図3、図4におけるそれぞれ右図)を、デンシトグラフ(ATTO社製)で撮影し、解析ソフトによるバンドの確認を行った。図6は、実施例1の抗菌活性増強剤におけるデンシトグラムである。また、図7は、実施例2の抗菌活性増強剤におけるデンシトグラムである。
換言すれば、実施例1に記載された方法により、乳由来の原料からリボヌクレアーゼ−4を製造することにより、高純度でリボヌクレアーゼ−4を回収できることを意味するものである。
なお、図4において、80kDa付近にわずかに染色されたバンドβについて、デンシトグラムからピークβとして検出され、ピークβは抗菌活性増強剤に3.2質量%の割合で含有していることが確認された。
本試験は、本発明の抗菌活性増強剤がラクトフェリンの抗菌活性を増強する作用を有することを確認するために行った。
ラクトフェリンとしてウシ・ラクトフェリン(森永乳業社製)を脱イオン水で希釈して使用した。
一方、実施例1に記載された方法により製造された抗菌活性増強剤(リボヌクレアーゼ−4を100質量%含有)を脱イオン水で希釈して使用した。
前記のウシ・ラクトフェリンと抗菌活性増強剤を用いて、以下の試料1〜5を調製した。
・試料1:ウシ・ラクトフェリン(2mg/mL)
・試料2:ウシ・ラクトフェリン(2mg/mL)及び抗菌活性増強剤(32μg/mL)の混合物
・試料3:ウシ・ラクトフェリン(2mg/mL)及び抗菌活性増強剤(64μg/mL)の混合物
・試料4:ウシ・ラクトフェリン(2mg/mL)及び抗菌活性増強剤(100μg/mL)の混合物
・試料5:抗菌活性増強剤(100μg/mL)
さらに、1%のBacto peptone培地(Becton Dickinson社製)を用い、5mLのポリスチレンチューブに大腸菌K−12株(NBRC 3301)を106cells/mLとなるよう植菌し、37℃のインキュベーター内で6時間前培養して、試験用菌液とした。
96穴プレート上にて前記の試料とともに試験用菌液を106cells/mLとなるよう添加し、37℃にて17時間培養した。
17時間培養した後に、大腸菌を含む培養液を0.85%生理食塩水にて段階希釈し、寒天培地(ラピッドメディアRM-SPC、森永乳業社製)上にプレーティングした後、37℃で16時間培養して、培地上に生じたコロニー数(CFU:Colony Forming Units)を測定することにより、各試料の抗菌活性を評価した。
なお、試料1〜5の他に、前記培地溶液のみで大腸菌を培養したものをコントロールとした。
本試験の結果を表3に示す。表3において、有意差検定はp<0.001である。
その結果、培地のみで培養したコントロールでは、17時間後に菌数が1.7×108CFU/mLに増加したのに対し、ラクトフェリンを含む試料1では、菌数が初菌数よりも低減して、3.6×105CFU/mLの範囲となった。
さらに、抗菌活性増強剤の量を1/2に減量した試料2でも、3.6×104CFU/mLとなり、試料3と同様に菌数が減少した。
試料1と試料2の菌数の比較によれば、試料2の抗菌活性は試料1の抗菌活性の約19倍以上であった。また、試料1と試料3の菌数の比較によれば、試料3の抗菌活性は試料1の抗菌活性の約10倍以上であった。
本試験結果から、本発明の抗菌活性増強剤にはラクトフェリンの抗菌活性を増強する作用を有することが判明した。
これによりラクトフェリン等の抗菌物質と本発明を組み合わせた組成物を製造することにより、従来の抗菌物質の効果を顕著に高めた優れた抗菌用組成物を提供できることが明らかになった。
本試験は、本発明の抗菌活性増強剤がラクトフェリン加水分解物であるラクトフェリシン(商標登録)の抗菌活性を増強することを確認することを目的とした。
(1)試料の調製
試験例2で使用したウシ・ラクトフェリン(森永乳業社製)をペプシンで加水分解し、高速液体クロマトグラフィーにて精製し、凍結乾燥して得られたウシ・ラクトフェリシン粉末を用いた。
ウシ・ラクトフェリシン粉末は、脱イオン水で希釈して使用した。
一方、実施例1で得られた抗菌活性増強剤を脱イオン水で希釈して使用した。
試料6:ウシ・ラクトフェリシン(16μg/mL)
試料7:ウシ・ラクトフェリシン(16μg/mL)及び抗菌活性増強剤(32μg/mL)の混合物。
試料8:抗菌活性増強剤(32μg/mL)
試験例2と同様の試験方法にて試験した。試料6〜8の他に、培地のみで大腸菌を培養したものをコントロールとした。
試験例3の結果を表4に示す。表4で、培地のみで培養したコントロールでは17時間後に菌数が1.0×108CFU/mLに増加した。
ここで、試料6と試料7の菌数の比較によれば、試料7の抗菌活性は試料6の抗菌活性の約72倍以上であった。
本試験結果から、ウシ・ラクトフェリン分解物と本発明の抗菌活性増強剤の組み合わせにより、顕著な抗菌活性の増加が認められた。
本発明の有効成分であるリボヌクレアーゼ−4は、哺乳類(例えば、ヒト、ウシ、水牛、ウマ、ヤギ、ヒツジ等)の初乳、移行乳、常乳、末期乳等、これらの処理物である脱脂乳を乳原料として用いて陽イオン交換処理、限外膜濾過処理、及びゲル濾過担体によるゲルろ過処理によって調製することができるものである。
また、リボヌクレアーゼ−4は、乳原料中にホエイ(乳清)蛋白質が含まれるものであれば特に制限なく調製することができる。
例えば、ウシ由来のリボヌクレアーゼ−4は、147アミノ酸残基、分子量が17kDa、等電点が9.18のタンパクである。リボヌクレアーゼ−4は、リボヌクレアーゼ活性や癌細胞に対する細胞毒性を示すことが知られるが、これまでその他の生理活性については知られていなかった。
さらに、リボヌクレアーゼ−4は、乳や乳製品を原料として得られるリボヌクレアーゼ−4に限られず、乳に含まれるリボヌクレアーゼ−4と同等の構造を有する限り、乳以外の動物の体液や組織から得られる蛋白質、又は、化学合成品もしくは組換え蛋白質であってもよい。また、リボヌクレアーゼ−4又はそのフラグメントは、配列番号4のアミノ酸配列を有するものに限られず、それらの保存的バリアントであってもよい。保存的バリアントとしては、配列番号4のアミノ酸配列において、1又は数個、例えば1〜10個、好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜3個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位等を含む配列を有する蛋白質、又は、配列番号4のアミノ酸配列と80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する蛋白質であって、ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物の抗菌活性を増強する作用を有する蛋白質が挙げられる。
ルロース、ポリビニルピロリドン、フタル酸セルロースアセテート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メチルメタクリレート、及びメタアクリル酸重合体等により被膜することもできる。
使用する限外濾過膜モジュールは、管型、中空糸型、平膜型、スパイラル型等いずれの形式でも可能である。ただし、中空糸型内圧式等のモジュールでは、中空糸内に沈澱物が生成した場合に流路閉塞を起こす可能性があるので、圧力等を考慮して行うことが好ましい。
さらに、抗菌活性増強剤の量を1/2に減量した試料2でも、1.8×104CFU/
mLとなり、試料3と同様に菌数が減少した。
Claims (8)
- リボヌクレアーゼ−4を有効成分とするラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物の抗菌活性増強剤。
- 請求項1に記載の抗菌活性増強剤と、ラクトフェリン、及びラクトフェリン加水分解物からなる群から選択される1又は2以上とを含有し、ラクトフェリン、及びラクトフェリン加水分解物に対するリボヌクレアーゼ−4の質量比が1/80以上である、抗菌剤組成物。
- 請求項2に記載の抗菌剤組成物を含有する抗菌用医薬品。
- 請求項2に記載の抗菌剤組成物を含有する飲食品。
- 請求項2に記載の抗菌剤組成物を含有する飼料。
- ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物の抗菌活性増強剤の製造におけるリボヌクレアーゼ−4の使用。
- ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物の抗菌活性増強剤を製造する方法であって、
(a)乳原料を陽イオン交換樹脂に接触させて乳原料中の蛋白質を陽イオン交換樹脂に吸着処理する工程、
(b)前記吸着処理後の陽イオン交換樹脂を洗浄処理し、溶出溶媒を通液して、等電点が8.0〜10.0の画分を溶出する工程、
(c)前記溶出した蛋白質画分をゲル濾過担体によりゲル濾過処理して分子量30kDa以下の画分を回収する工程、
を有することを特徴とする、方法。 - リボヌクレアーゼ−4を製造する方法であって、
(a)乳原料を陽イオン交換樹脂に接触させて乳原料中の蛋白質を陽イオン交換樹脂に吸着処理する工程、
(b)前記吸着処理後の陽イオン交換樹脂を洗浄処理し、溶出溶媒を通液して、等電点が8.0〜10.0の画分を溶出する工程、
(c)前記溶出した蛋白質画分を分画分子量30kDaの限外濾過膜により膜濾過処理して膜透過画分を回収する工程、
(d)前記膜透過画分をゲル濾過担体によりゲル濾過処理して分子量30kDa以下の画分を回収する工程、
を有することを特徴とする、方法。
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