JPWO2011129446A1 - 人工多能性幹細胞の製造方法 - Google Patents
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Abstract
本発明の目的は、侵襲性が低く、かつ、高い効率でｉＰＳ細胞を製造する方法を提供することである。末梢血由来の単核球集団を、抗ＣＤ３抗体の存在下で３〜１４日間培養する工程と、培養した単核球集団に脱分化処理する工程とを含む方法によって、高い効率でｉＰＳ細胞を製造することができる。
Description
本発明は、人工多能性幹細胞の製造方法に関する。
人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は、様々な疾患に対する移植療法において有用であり、再生医療への応用が期待されている。近年、繊維芽細胞や肝細胞等の体細胞に、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、およびｃ−Ｍｙｃ遺伝子を導入し発現させた細胞からＦｂｘ１５遺伝子を発現する細胞を選択することによってｉＰＳ細胞を作製できることが報告されている（例えば、ＷＯ２００７/０６９６６６国際公開公報、Takahashi K, Yamanaka S. (2006). “Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors”. Cell 126: 663-676、Takahashi K, Okita K, Nakagawa M, Yamanaka S. (2007). “Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures”. Nature Protocols 2: 3081-3089、Aoi T, Yae K, Nakagawa M, Ichisaka T, Okita K, Takahashi K, Chiba T, Yamanaka S. (2008). “Generation of pluripotent stem cells from adult mouse liver and stomach cells”. Science 321(5889): 699-702 参照）。
しかしながら、従来のｉＰＳ細胞作製方法では、皮膚や肝臓等の組織を採取する必要があるため患者の負担が大きく、また、ｉＰＳ細胞作製効率も低かった。そこで、侵襲性が低く、かつ、高い効率でｉＰＳ細胞を製造する方法を提供することを目的とする。
本発明に係る人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の製造方法は、末梢血由来の単核球集団を材料とすることを特徴とする。
上記ｉＰＳ細胞の製造方法は、（イ）末梢血由来の単核球集団を抗ＣＤ３抗体およびインターロイキン２の存在下で３〜１４日間培養する工程と、（ロ）培養後の前記単核球集団に対して脱分化処理を行う工程とを含むことが好ましい。
また、工程（ロ）において、前記単核球集団に脱分化因子の導入操作を行うことがさらに好ましい。前記脱分化因子の導入操作において、前記脱分化因子を発現する組み換え発現ベクターの導入操作を行ってもよい。
ここで、脱分化因子がＳｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃであることが好ましく、組み換え発現ベクターがセンダイウイルスベクターであることがより好ましい。
本発明に係るｉＰＳ細胞の製造方法は、（ハ）脱分化処理を行った前記単核球集団を、増殖因子の存在下で１４〜２５日間培養する工程をさらに含むことが好ましい。また、末梢血がヒト由来であることが好ましい。
なお、本明細書で「遺伝子」、「ｃＤＮＡ」などが付加されず、「Ｓｏｘ２」、「Ｏｃｔ３／４」、「Ｋｌｆ４」、「ｃ−Ｍｙｃ」というように因子名のみで用いられた場合、これらの遺伝子の遺伝子産物であるタンパク質を指すこととする。
＝＝クロスリファレンス＝＝
本出願は、２０１０年４月１６日付で出願した日本国特許出願２０１０−９５４０４に基づく優先権を主張するものであり、当該基礎出願を引用することにより、本明細書に含めるものとする。
本出願は、２０１０年４月１６日付で出願した日本国特許出願２０１０−９５４０４に基づく優先権を主張するものであり、当該基礎出願を引用することにより、本明細書に含めるものとする。
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J. G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.等の標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例等は、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
以下に、末梢血由来の単核球集団を材料としてｉＰＳ細胞を製造する方法を詳述する。
末梢血は、哺乳動物に由来することが好ましく、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ネコ、イヌ、サル等の動物に由来してもよいが、ヒトに由来することがより好ましい。これらの動物の成長段階は、成体、仔、胎児、胚のいずれであってもよく、単核球の含まれる末梢血が得られる範囲内で制限されない。採血方法は、動物のサイズや採血量を考慮して当業者が周知の方法から適宜選択すればよく、特に制限されないが、動物の負担を軽減するためには注射器で採血することが好ましい。
なお、本発明に係る方法で製造したｉＰＳ細胞を何らかの疾病に罹患した患者あるいは患獣の治療に用いる場合には、末梢血は、患者や患獣と同種の動物に由来することが好ましく、患者や患獣自身に由来することがより好ましい。
単核球集団は、単核球以外の末梢血由来の細胞や成分と混在していても、単核球のみが含まれてもよいが、ｉＰＳ細胞の製造効率を考慮すると、単核球が高い割合で含まれていることが好ましい。末梢血から単核球集団を調製する方法は、周知の方法から当業者が適宜選択することができ、例えば、密度勾配遠心法、リンフォクイック法（One Lambda社）、免疫磁気ビーズ法等を用いてもよい。密度勾配遠心法の比重液としては、例えば、ショ糖溶液やフィコール溶液、または、フィコール・コンレイ、フィコール・ハイパック等のショ糖とエピクロロヒドリンとの水溶性共重合体の溶液、あるいは、パーコール等のポリビニルピロリドンで被覆したコロイドシリカの溶液等の周知の溶液から当業者が適宜選択すればよい。なお、末梢血は、新鮮なものであることが好ましいが、冷蔵・冷凍保存されたものであっても構わない。
＝＝末梢血由来の単核球集団の培養＝＝
まず、末梢血から調製した単核球集団を、抗ＣＤ３抗体およびインターロイキンの存在下で３〜１４日間、好ましくは３〜７日間培養する。この培養により、単核球のうち、ＣＤ３陽性Ｔ細胞の増殖が特異的に促進されると考えられる。
まず、末梢血から調製した単核球集団を、抗ＣＤ３抗体およびインターロイキンの存在下で３〜１４日間、好ましくは３〜７日間培養する。この培養により、単核球のうち、ＣＤ３陽性Ｔ細胞の増殖が特異的に促進されると考えられる。
培養条件は、当業者が適宜選択すればよく、例えば５％ＣＯ２存在下で３５〜４０℃、好ましくは３７℃で培養すればよい。培地は単核球の培養に通常用いられる培地から当業者が適宜選択でき、例えば、ＫＢＭ５０２、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＤＭＥＭ、ＫＢＭ５３０、ＫＢＭ５４０、ＫＢＭ５６０、ＲＰＭ１６４０であってもよいが、ＫＢＭ５０２であることが好ましい。
ここで、抗ＣＤ３抗体は、培養皿や培養管に固定されていても、あるいは、液体培地中に浮遊した状態であってもよい。抗ＣＤ３抗体が固定化されている場合、例えば、共有結合、または、静電相互作用等の非共有結合を介して、培養皿や培養管を構成するプラスチック等に固定化されていてもよいが、固定化方法は特に制限されず、当業者に周知の方法から適宜選択できる。また、抗ＣＤ３抗体の固定化された培養皿等は、BD BioCoat社等から購入することもできる。液体培地中の抗ＣＤ３抗体の濃度は、当業者が最適濃度を設定すればよいが、最終的なｉＰＳ細胞の収率を考慮すると、１〜１００μｇ／ｍｌであることが好ましい。なお、抗ＣＤ３抗体は、材料となる単核球のＣＤ３抗原に対して特異的に刺激を与え、ＣＤ３抗原陽性単核球の増殖を促進することのできる抗体であればよく、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよく、また、何れの動物から得られた抗体であっても特に制限されない。ここで、抗体は、可変領域を含む抗原結合部位を含む抗体の一部であってもよく、例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント等であってもよい。
インターロイキンは、周知のいずれのインターロイキンであってもよく、例えば、インターロイキン１、インターロイキン２、インターロイキン４、インターロイキン６、インターロイキン８、インターロイキン１１、インターロイキン１２等が挙げられるが、取り扱いや調製の容易さを考慮すると、市販されているインターロイキン２を用いることが好ましい。
なお、上記抗体やインターロイキンに加え、単核球の培養に通常添加される１種類以上の物質が、培地に含まれていてもよい。このような物質として、例えば、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）や上皮成長因子（ＥＧＦ）等の増殖因子、ＦＢＳやknockout serum replacement (Invitrogen 社)、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸、ペニシリンやストレプトマイシン等の抗生物質、メルカプトエタノール等が挙げられるが、これらに限定されない。
＝＝単核球集団の脱分化処理＝＝
次に、単核球集団に対して脱分化処理を行う。
次に、単核球集団に対して脱分化処理を行う。
単核球集団の脱分化処理は、当業者に周知の方法によって行うことができ、所望のｉＰＳ細胞が作製できる範囲で制限されない。例えば、脱分化因子を用いても、あるいは、単核球の脱分化を促進する周知の薬剤を投与してもよい。脱分化因子を用いる場合、ｉＰＳ細胞を作製する際に通常用いられる脱分化因子（初期化因子）を用いることができる。例えばTakahashiらの論文(Cell 2007 vol.131： 861-872)に記載された初期化方法を用いることができ、本刊行物を引用することにより、本明細書に含めるものとする。特に、Ｏｃｔ遺伝子群、Ｋｌｆ遺伝子群、Ｓｏｘ遺伝子群のそれぞれから選択された遺伝子産物の組み合わせを含むことが好ましく、Ｍｙｃ遺伝子群の遺伝子産物をさらに含むことが好ましい。Ｏｃｔ遺伝子群に属する遺伝子としては、Ｏｃｔ３／４、Ｏｃｔ１Ａ、Ｏｃｔ６等の各遺伝子が挙げられる。Ｋｌｆ遺伝子群に属する遺伝子としては、Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ５等の各遺伝子が挙げられる。Ｓｏｘ遺伝子群に属する遺伝子としては、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ７、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１７、Ｓｏｘ１８等の各遺伝子が挙げられる。Ｍｙｃ遺伝子群に属する遺伝子としては、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎ−Ｍｙｃ、Ｌ−Ｍｙｃ等の各遺伝子が挙げられる。さらに、これら遺伝子の組み合わせに加え、サイトカインや化合物を補助因子として培地に添加しても良い。
上記以外の脱分化因子の組み合わせとして、Ｏｃｔ遺伝子群の遺伝子産物、Ｓｏｘ遺伝子群の遺伝子産物に加え、Ｎａｎｏｇ遺伝子の遺伝子産物、ｌｉｎ−２８遺伝子の遺伝子産物等を含む組み合わせが例示できる。また、これらの脱分化因子の組み合わせに加え、例えば、ＳＶ４０ ＬａｒｇｅＴ抗原遺伝子産物、およびＴＥＲＴ遺伝子産物、不死化誘導因子等を用いてもよい。
なお、脱分化因子により脱分化される単核球において、上記の脱分化因子のいずれか、または複数がすでに発現している場合には、その脱分化因子を省略することもできる。また、特定の脱分化因子の機能を代替できる化合物があれば、その脱分化因子の代わりに用いてもよい。例えば、Ｍｙｃ遺伝子群の遺伝子産物は、サイトカインや化合物で置換できる場合があり、この場合のサイトカインとして、ＳＣＦやｂＦＧＦ等が挙げられる。また、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子やＫｌｆ４遺伝子を代替できる化合物として、例えばバルプロ酸などが挙げられる。
脱分化因子をコードする遺伝子は、いずれも脊椎動物で高度に保存されている遺伝子であり、本明細書では特に動物名を示さない限り、ホモログを含めた遺伝子を表すものとする。また、遺伝子多型を含め、変異を有する遺伝子の遺伝子産物であっても野生型の遺伝子産物と同等の機能を有する遺伝子産物、例えば、野生型遺伝子産物の１〜１０、好ましくは１〜６、より好ましくは１〜４、さらに好ましくは１〜３、特に好ましくは１〜２アミノ酸が置換、挿入、または欠失した変異遺伝子産物もまた、含まれるものとする。
以上のような脱分化因子を用いた、単核球集団の脱分化処理方法は特に制限されないが、例えば、単核球集団に対し、脱分化因子の導入操作を行うことによって脱分化処理することができる。具体的には、SAINT-PhD（コスモ・バイオ株式会社）やCellvader（GE Healthcare 社）等の陽イオン性脂質試薬と脱分化因子との複合体、あるいは、Protein Transduction Domain（PTD）と呼ばれるペプチドと脱分化因子との複合体等を調製する。これらの複合体を単核球集団の培地に添加し、単核球集団に接触させることにより、脱分化因子を単核球に導入することができる。こうして脱分化因子が導入された単核球は脱分化し、多能性を獲得する。なお、添加する脱分化因子の量は、当業者が適宜決定できる。
一方、単核球集団に対し、脱分化因子を発現させることのできる発現ベクターの導入操作を行うことによって、単核球集団の脱分化処理を行ってもよい。ＤＮＡベクターの場合、脱分化因子をコードする遺伝子（脱分化因子遺伝子）を、単核球で発現させるための適切なプロモーターの下流に導入し、組み換え発現ベクターを調製する。あるいはセンダイウイルスのようなマイナス鎖ＲＮＡウイルスの場合は、ウイルス由来のプロモーターを利用して脱分化因子遺伝子を発現させるが、このようなウイルス由来のＲＮＡベクターの場合、脱分化因子をコードするＲＮＡをゲノムに有する組み換えウイルスベクターを調製する。この時、１つのベクターに２種類以上の脱分化因子遺伝子を挿入してもよい。ここで、使用する発現ベクターは、所望の脱分化誘導機能を有する範囲で特に制限されず、野生型、変異型、天然型、人為的改変型等のいずれであっても制限されないが、ウイルスベクターであることが好ましい。例えば、センダイウイルス由来、レトロウイルス由来、アデノウイルス由来、アデノ随伴ウイルス由来、ボックスウイルス由来等のウイルスベクターであってもよいが、宿主染色体への転移による融合を起こさないという特徴を有するセンダイウイルス由来のベクターであることが好ましい。
このようなセンダイウイルスベクターは、単核球における脱分化の誘導機能を果たすために、Ｎタンパク質、Ｐタンパク質、およびＬタンパク質等の、ゲノム複製に必要なタンパク質をコードする遺伝子を有することが好ましい。ここで、人為的改変型のセンダイウイルスベクターは、細胞傷害性や温度感受性についての変異を有するセンダイウイルスベクターであってもよい。例えば、マイナス鎖ＲＮＡウイルス由来のＦ遺伝子、Ｈ遺伝子、ＨＮ遺伝子、またはＧ遺伝子等のウイルスのエンベロープタンパク質や外殻タンパク質をコードする遺伝子に変異または欠損を有しているセンダイウイルスベクターであってもよい（ＷＯ００／７００５５、ＷＯ００／７００７０、Li, H.-O. et al., J. Virol. 74(14) 6564-6569 (2000) 参照）。このようなセンダイウイルスベクターは、単核球においてゲノムを複製できるが感染性ウイルス粒子を形成できないため、安全性が高い。特に、Ｆ遺伝子欠失型センダイウイルスベクターを用いることが好ましい。
このように調製した組み換え発現ベクターやウイルス粒子を単核球に導入する。この際、プラスミド等の組み換え発現ベクター、あるいは、ウイルス粒子を培地に添加することにより、単核球に目的遺伝子を導入することができる。プラスミド等の組み換え発現ベクターを添加した場合、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法等の周知の遺伝子導入方法に従って処理することによって組み換え発現ベクターを単核球に導入することができる。一方、組み換えセンダイウイルスなどのウイルス粒子を添加した場合、単核球にウイルスが感染することによって単核球に目的遺伝子が導入される。
組み換え発現ベクターが導入された単核球では脱分化因子が発現するため、その単核球は発現した脱分化因子によって脱分化する。なお、添加する組み換え発現ベクターの量は、当業者が適宜決定できる。
なお、単核球集団に対する脱分化因子導入操作の間、無血清培地中で１〜５日、好ましくは２日間、５％ＣＯ２存在下、３５℃〜４０℃、好ましくは３７℃で培養する。無血清培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＶＰ−ＳＦＭ、ＤＭＥＭ、ＫＢＭ５３０、ＫＢＭ５４０、ＫＢＭ５６０、ＲＯＭ１６４０、あるいはＫＢＭ５０２であってもよいが、ＫＢＭ５０２であることが好ましい。この際、ＭＥＦ（マウス胚性繊維芽細胞）やＳＮＬ（株化マウス胚性繊維芽細胞）等で作製したフィーダー細胞を用いてもよい。
＝＝脱分化処理後の培養＝＝
以上のようにして脱分化処理した単核球集団を１０〜３０日、好ましくは１４〜２５日、より好ましくは２０日間、ｉＰＳ細胞を培養する一般的な条件下で培養する。例えば、増殖因子含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２を用い、５％ＣＯ２存在下、３５℃〜４０℃、好ましくは３７℃で培養すればよい。あるいは、ＤＭＥＭ等の培地を用いてもよく、ＭＥＦやＳＮＬ等で作製したフィーダー細胞を用いてもよい。また、増殖因子は特に制限されず、周知の増殖因子から当業者が適宜選択できるが、例えば、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）や上皮成長因子（ＥＧＦ）であってもよい。
以上のようにして脱分化処理した単核球集団を１０〜３０日、好ましくは１４〜２５日、より好ましくは２０日間、ｉＰＳ細胞を培養する一般的な条件下で培養する。例えば、増殖因子含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２を用い、５％ＣＯ２存在下、３５℃〜４０℃、好ましくは３７℃で培養すればよい。あるいは、ＤＭＥＭ等の培地を用いてもよく、ＭＥＦやＳＮＬ等で作製したフィーダー細胞を用いてもよい。また、増殖因子は特に制限されず、周知の増殖因子から当業者が適宜選択できるが、例えば、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）や上皮成長因子（ＥＧＦ）であってもよい。
なお、上記増殖因子に加え、単核球の培養に通常添加される１種類以上の物質が、培地に含まれていてもよい。このような物質として、ＦＢＳ等の血清やknockout serum replacement (Invitrogen 社)、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸、ペニシリンやストレプトマイシン等の抗生物質、メルカプトエタノール等が挙げられるがこれらに限定されない。
本実施例では、本発明に係るｉＰＳ細胞製造方法によって、末梢血由来単核球集団から効率的にｉＰＳ細胞を製造できることを示す。なお、培養は全て３７℃、５％ＣＯ２条件下で行った。
＝＝単核球分画の調製＝＝
慶應大学病院倫理委員会で承認されたプロトコールに従って、インフォームドコンセントを行った各健常人ボランティア（１１歳〜６６歳、男女、計５名）から、１〜２０ｍｌの末梢血を採血した。フィコール・ハイパック（GE Healthcare 社）を比重液とし、遠心分離（３０分間、４００×ｇ）を行い、末梢血から単核球分画を単離した。
慶應大学病院倫理委員会で承認されたプロトコールに従って、インフォームドコンセントを行った各健常人ボランティア（１１歳〜６６歳、男女、計５名）から、１〜２０ｍｌの末梢血を採血した。フィコール・ハイパック（GE Healthcare 社）を比重液とし、遠心分離（３０分間、４００×ｇ）を行い、末梢血から単核球分画を単離した。
＝＝組み換えセンダイウイルスベクター＝＝
以下（１）〜（４）の脱分化因子遺伝子を公知の方法（ＷＯ２０１０／００８０５４）に従って、ＳｅＶ１８＋／ＴＳΔＦベクター（ＷＯ２０１０／００８０５４）に導入したセンダイウイルスの調製を行った。
（１）Ｏｃｔ３／４遺伝子
（２）Ｋｌｆ４遺伝子
（３）ｃ−Ｍｙｃ遺伝子
（４）Ｓｏｘ２遺伝子
具体的には、（１）〜（４）の遺伝子を含む、マイナス鎖ＲＮＡウイルスゲノムＲＮＡ（マイナス鎖）またはその相補鎖（プラス鎖）をコードするｃＤＮＡの組み換えウイルスゲノムを発現するプラスミドベクター、及びウイルスの自己複製に必要な蛋白質（Ｆ、Ｎ、Ｐ、Ｌ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ）を発現するプラスミドベクターを２９３Ｔ／１７細胞に導入し、さらにＦタンパク質を発現するＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ／Ａ細胞を重層して培養を行い、生成したウイルスを含む培養上清を回収することにより製造した。
以下（１）〜（４）の脱分化因子遺伝子を公知の方法（ＷＯ２０１０／００８０５４）に従って、ＳｅＶ１８＋／ＴＳΔＦベクター（ＷＯ２０１０／００８０５４）に導入したセンダイウイルスの調製を行った。
（１）Ｏｃｔ３／４遺伝子
（２）Ｋｌｆ４遺伝子
（３）ｃ−Ｍｙｃ遺伝子
（４）Ｓｏｘ２遺伝子
具体的には、（１）〜（４）の遺伝子を含む、マイナス鎖ＲＮＡウイルスゲノムＲＮＡ（マイナス鎖）またはその相補鎖（プラス鎖）をコードするｃＤＮＡの組み換えウイルスゲノムを発現するプラスミドベクター、及びウイルスの自己複製に必要な蛋白質（Ｆ、Ｎ、Ｐ、Ｌ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ）を発現するプラスミドベクターを２９３Ｔ／１７細胞に導入し、さらにＦタンパク質を発現するＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ／Ａ細胞を重層して培養を行い、生成したウイルスを含む培養上清を回収することにより製造した。
＝＝フィーダー細胞の調製＝＝
（株化マウス胚性繊維芽細胞、ＳＮＬ）
ディッシュに０．１％ゼラチンを加え、３７℃で約１時間静置し、ディッシュをコーティングした。ＳＮＬ（ＥＧＡＣＣ社）を１．５×１０５細胞／ｍｌの密度に調製し、１ディッシュ（直径１０ｃｍ）あたり１０ｍｌを加え、一晩培養し、フィーダー細胞を調製した。
（株化マウス胚性繊維芽細胞、ＳＮＬ）
ディッシュに０．１％ゼラチンを加え、３７℃で約１時間静置し、ディッシュをコーティングした。ＳＮＬ（ＥＧＡＣＣ社）を１．５×１０５細胞／ｍｌの密度に調製し、１ディッシュ（直径１０ｃｍ）あたり１０ｍｌを加え、一晩培養し、フィーダー細胞を調製した。
＝＝抗ＣＤ３抗体を用いた単核球集団の培養＝＝
抗ＣＤ３抗体（BD Biosciences 社）をＰＢＳで１０μｇ／ｍｌに調製した。この抗体希釈液で６ウェルディッシュの底面を覆い、３７℃で３０分間〜３時間インキュベートした。使用直前に抗体希釈液を取り除き、ＰＢＳで洗浄して抗ＣＤ３抗体結合ディッシュとした。
抗ＣＤ３抗体（BD Biosciences 社）をＰＢＳで１０μｇ／ｍｌに調製した。この抗体希釈液で６ウェルディッシュの底面を覆い、３７℃で３０分間〜３時間インキュベートした。使用直前に抗体希釈液を取り除き、ＰＢＳで洗浄して抗ＣＤ３抗体結合ディッシュとした。
末梢血由来単核球集団を、１×１０５〜１×１０６細胞／ｍｌの密度で抗ＣＤ３抗体結合ディッシュに播種し、含有ＫＢＭ５０２培地（２０Ｕ／ｍｌ組み換えインターロイキン２が含有されている）１０ｍｌにおいて５日間培養した。
＝＝単核球の脱分化処理＝＝
（脱分化処理１日目）
抗ＣＤ３抗体を用いて培養した単核球集団を７．５×１０５細胞／ｍｌの密度に調製し、ここにＭＯＩ １、３、５、１０、あるいは２０でセンダイウイルスを添加することによって、組み換えベクターを導入した後、ＫＢＭ５０２培地中で２４時間培養した。
（脱分化処理１日目）
抗ＣＤ３抗体を用いて培養した単核球集団を７．５×１０５細胞／ｍｌの密度に調製し、ここにＭＯＩ １、３、５、１０、あるいは２０でセンダイウイルスを添加することによって、組み換えベクターを導入した後、ＫＢＭ５０２培地中で２４時間培養した。
（脱分化処理２日目）
セルスクレーパーで細胞を剥がし取り、細胞を含む培地を、ウェル毎にチューブに回収した。２０℃、８００〜１０００ｒｐｍで５分間遠心した後、ペレットにＫＢＭ５０２培地２ｍｌを加え、数回ピペッティングし、ペレットをシングルセルにならない程度に破壊し、懸濁した。この懸濁液を、元のディッシュのウェルに戻し、ＫＢＭ５０２培地中で２４時間培養した。
セルスクレーパーで細胞を剥がし取り、細胞を含む培地を、ウェル毎にチューブに回収した。２０℃、８００〜１０００ｒｐｍで５分間遠心した後、ペレットにＫＢＭ５０２培地２ｍｌを加え、数回ピペッティングし、ペレットをシングルセルにならない程度に破壊し、懸濁した。この懸濁液を、元のディッシュのウェルに戻し、ＫＢＭ５０２培地中で２４時間培養した。
（脱分化処理３日目）
セルスクレーパーで細胞を剥がし取り、細胞を含む培地をウェル毎にチューブに回収した。ピペッティングによって、細胞をシングルセルにし、細胞数を計数した。２０℃、８００〜１０００ｒｐｍで５分間遠心した後、ペレットに適量のＫＢＭ５０２培地を加えた。ピペッティングによって、ペレットをシングルセルにし、１０ｃｍディッシュに調製したフィーダー細胞（ＳＮＬ）上に、５×１０４、５×１０５、５×１０６／ディッシュの密度で単核球を播種し、ＫＢＭ５０２培地中で２４時間培養した。
セルスクレーパーで細胞を剥がし取り、細胞を含む培地をウェル毎にチューブに回収した。ピペッティングによって、細胞をシングルセルにし、細胞数を計数した。２０℃、８００〜１０００ｒｐｍで５分間遠心した後、ペレットに適量のＫＢＭ５０２培地を加えた。ピペッティングによって、ペレットをシングルセルにし、１０ｃｍディッシュに調製したフィーダー細胞（ＳＮＬ）上に、５×１０４、５×１０５、５×１０６／ディッシュの密度で単核球を播種し、ＫＢＭ５０２培地中で２４時間培養した。
＝＝脱分化処理後の培養＝＝
上記のように脱分化処理した細胞を、フィーダー細胞（ＳＮＬ）上に播種し、培地を１０ｎｇ／ｍｌヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ、和光純薬工業）添加ｉＰＳ細胞培地（１０ｍｌ／１０ｃｍディッシュ）に交換した。その後、４８時間毎に培地を交換し、２０日間培養を続けた。なお、ｉＰＳ細胞培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Invitrogen 社）、２０％knockout serum replacement （Invitrogen 社）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、（Invitrogen 社）、１×１０-４Ｍ 非必須アミノ酸（Invitrogen 社）、１×１０-４Ｍ２−メルカプトエタノール（Invitrogen 社）、０．５％ペニシリン−ストレプトマイシン（和光純薬工業）から成る。
上記のように脱分化処理した細胞を、フィーダー細胞（ＳＮＬ）上に播種し、培地を１０ｎｇ／ｍｌヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ、和光純薬工業）添加ｉＰＳ細胞培地（１０ｍｌ／１０ｃｍディッシュ）に交換した。その後、４８時間毎に培地を交換し、２０日間培養を続けた。なお、ｉＰＳ細胞培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Invitrogen 社）、２０％knockout serum replacement （Invitrogen 社）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、（Invitrogen 社）、１×１０-４Ｍ 非必須アミノ酸（Invitrogen 社）、１×１０-４Ｍ２−メルカプトエタノール（Invitrogen 社）、０．５％ペニシリン−ストレプトマイシン（和光純薬工業）から成る。
＝＝アルカリフォスファターゼ染色およびクリスタルバイオレット染色＝＝
脱分化処理により得られたコロニーに対し、アルカリフォスファターゼ染色、および、クリスタルバイオレット染色を行った。まず、コロニーを１０％中性緩衝ホルマリン液（和光純薬工業）で固定した後、1-Step NBT/BCIP（Pierce 社）で染色した。さらに、クリスタルバイオレットをメタノールに溶解して４％クリスタルバイオレット溶液を調製し、細胞に添加して３０分間染色した。なお、アルカリフォスファターゼは幹細胞で発現することが知られており、幹細胞のマーカーとして用いられている（例えば、Riekstina U. et al., Stem Cell Rev. 2009 Dec 5(4): 378-386 参照）。また、クリスタルバイオレット染色により生細胞のみが染色される。さらに、ＤＡＰＩ（Molecular Probes 社）を用いて適宜核の対比染色を行った。
脱分化処理により得られたコロニーに対し、アルカリフォスファターゼ染色、および、クリスタルバイオレット染色を行った。まず、コロニーを１０％中性緩衝ホルマリン液（和光純薬工業）で固定した後、1-Step NBT/BCIP（Pierce 社）で染色した。さらに、クリスタルバイオレットをメタノールに溶解して４％クリスタルバイオレット溶液を調製し、細胞に添加して３０分間染色した。なお、アルカリフォスファターゼは幹細胞で発現することが知られており、幹細胞のマーカーとして用いられている（例えば、Riekstina U. et al., Stem Cell Rev. 2009 Dec 5(4): 378-386 参照）。また、クリスタルバイオレット染色により生細胞のみが染色される。さらに、ＤＡＰＩ（Molecular Probes 社）を用いて適宜核の対比染色を行った。
図１に示すように、ＭＯＩ ３〜２０のいずれで脱分化処理を行った場合でも、生細胞の８０〜９０％のコロニーがアルカリフォスファターゼ陽性であった
＝＝免疫組織化学的染色による幹細胞マーカータンパク質発現の解析＝＝
上記アルカリフォスファターゼ陽性細胞のコロニーのうち、３コロニーをランダムにクローニングし、これらの細胞がｉＰＳ細胞であることを確認するため、ＤＡＰＩ染色およびアルカリフォスファターゼ染色を行い形態学的観察を行ったところ、３つのクローンとも、胚性幹細胞あるいはｉＰＳ細胞に典型的な形態を有し、アルカリフォスファターゼ陽性であった。
上記アルカリフォスファターゼ陽性細胞のコロニーのうち、３コロニーをランダムにクローニングし、これらの細胞がｉＰＳ細胞であることを確認するため、ＤＡＰＩ染色およびアルカリフォスファターゼ染色を行い形態学的観察を行ったところ、３つのクローンとも、胚性幹細胞あるいはｉＰＳ細胞に典型的な形態を有し、アルカリフォスファターゼ陽性であった。
次に、脱分化処理により得られたクローンのコロニーを、１０％中性緩衝ホルマリン液（和光純薬工業）で固定した後、抗Ｎａｎｏｇ抗体（リプロセル社、１０００倍希釈）、抗Ｏｃｔ３／４抗体（Santa Cruz 社、１００倍希釈）、抗ＳＳＥＡ３抗体（Millipore 社、２００倍希釈）、抗ＳＳＥＡ４抗体（Millipore 社、２００倍希釈）、抗Ｔｒａｌ６０抗体（Millipore 社、２００倍希釈）、抗Ｔｒａｌ８１抗体（Millipore 社、２００倍希釈）と反応させた。その後、Ａｌｅｘａ４８８またはＡｌｅｘａ５６８で標識された抗ウサギＩｇＧ抗体、抗マウスＩｇＧ抗体あるいは抗マウスＩｇＭ抗体を二次抗体（全てMolecular Probes 社）として適宜用いた。染色した細胞を蛍光顕微鏡（ＩＸ７０、オリンパス株式会社）下で観察したところ、図３に示すように、３つのクローン全てにおいて、調べた全ての幹細胞マーカーのタンパク質が検出された。
＝＝ＲＴ−ＰＣＲ法による幹細胞マーカー遺伝子発現の解析＝＝
さらに、各クローンの細胞について各種幹細胞マーカーのタンパク質および遺伝子発現を、免疫組織学的染色および逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法により解析した。ＲＴ−ＰＣＲ法では、脱分化処理前の単核球、および、脱分化処理後の単核球について同様に解析を行い、陽性コントロール細胞としてヒト胚性幹細胞を用いた（ＫｈＥＳ−２、京都大学より入手）。
さらに、各クローンの細胞について各種幹細胞マーカーのタンパク質および遺伝子発現を、免疫組織学的染色および逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法により解析した。ＲＴ−ＰＣＲ法では、脱分化処理前の単核球、および、脱分化処理後の単核球について同様に解析を行い、陽性コントロール細胞としてヒト胚性幹細胞を用いた（ＫｈＥＳ−２、京都大学より入手）。
各クローンの細胞から、ＴＲＩＺＯＬ（Invitrogen 社）を用いて全ＲＮＡを単離した。この全ＲＮＡから、Superscript First-Strand Synthesis System（Invitorgen 社）を用いてｃＤＮＡを調製した。このｃＤＮＡを鋳型とし、下記のプライマーを用いてＫＯＤ ｐｌｕｓ（ＤＮＡポリメラーゼ、東洋紡社）によるＲＴ−ＰＣＲを行ったところ、図４に示すように、ヒト胚性幹細胞に発現する幹細胞マーカー遺伝子が、３クローン全ての細胞において検出された。
プライマー：
Nanog-F: CAGCCCCGATTCTTCCACCAGTCCC（配列番号１）
Nanog-R: CGGAAGATTCCCAGTCGGGTTCACC（配列番号２）
Oct 3/4-F: GACAGGGGGAGGGGAGGAGCTAGG（配列番号３）
Oct 3/4-R: CTTCCCTCCAACCAGTTGCCCCAAAC（配列番号４）
Sox 2-F: GGGAAATGGGAGGGGTGCAAAAGAGG（配列番号５）
Sox 2-R: TTGCGTGAGTGTGGATGGGATTGGTG（配列番号６）
Klf 4-F: ACGATCGTGGCCCCGGAAAAGGACC（配列番号７）
Klf 4-R: TGATTGTAGTGCTTTCTGGCTGGGCTCC（配列番号８）
cMyc-F: GCGTCCTGGGAAGGGAGATCCGGAGC（配列番号９）
cMyc-R: TTGAGGGGCATCGTCGCGGGAGGCTG（配列番号１０）
GDF 3-F: CTTATGCTACGTAAAGGAGCTGGG（配列番号１１）
GDF 3-R: GTGCCAACCCAGGTCCCGGAAGTT（配列番号１２）
Rex 1-F: CAGATCCTAAACAGCTCGCAGAAT（配列番号１３）
Rex 1-R: GCGTACGCAAATTAAAGTCCAGA（配列番号１４）
DPPA 4-F: GGAGCCGCCTGCCCTGGAAAATTC（配列番号１５）
DPPA 4-R: TTTTTCCTGATATTCTATTCCCAT（配列番号１６）
DPPA 2-F: CCGTCCCCGCAATCTCCTTCCATC（配列番号１７）
DPPA 2-R: ATGATGCCAACATGGCTCCCGGTG（配列番号１８）
GAPDH-F: CAGAACATCATCCCTGCCTCTAG（配列番号１９）
GAPDH-R: TTGAAGTCAGAGGAGACCACCTG（配列番号２０）
プライマー：
Nanog-F: CAGCCCCGATTCTTCCACCAGTCCC（配列番号１）
Nanog-R: CGGAAGATTCCCAGTCGGGTTCACC（配列番号２）
Oct 3/4-F: GACAGGGGGAGGGGAGGAGCTAGG（配列番号３）
Oct 3/4-R: CTTCCCTCCAACCAGTTGCCCCAAAC（配列番号４）
Sox 2-F: GGGAAATGGGAGGGGTGCAAAAGAGG（配列番号５）
Sox 2-R: TTGCGTGAGTGTGGATGGGATTGGTG（配列番号６）
Klf 4-F: ACGATCGTGGCCCCGGAAAAGGACC（配列番号７）
Klf 4-R: TGATTGTAGTGCTTTCTGGCTGGGCTCC（配列番号８）
cMyc-F: GCGTCCTGGGAAGGGAGATCCGGAGC（配列番号９）
cMyc-R: TTGAGGGGCATCGTCGCGGGAGGCTG（配列番号１０）
GDF 3-F: CTTATGCTACGTAAAGGAGCTGGG（配列番号１１）
GDF 3-R: GTGCCAACCCAGGTCCCGGAAGTT（配列番号１２）
Rex 1-F: CAGATCCTAAACAGCTCGCAGAAT（配列番号１３）
Rex 1-R: GCGTACGCAAATTAAAGTCCAGA（配列番号１４）
DPPA 4-F: GGAGCCGCCTGCCCTGGAAAATTC（配列番号１５）
DPPA 4-R: TTTTTCCTGATATTCTATTCCCAT（配列番号１６）
DPPA 2-F: CCGTCCCCGCAATCTCCTTCCATC（配列番号１７）
DPPA 2-R: ATGATGCCAACATGGCTCCCGGTG（配列番号１８）
GAPDH-F: CAGAACATCATCCCTGCCTCTAG（配列番号１９）
GAPDH-R: TTGAAGTCAGAGGAGACCACCTG（配列番号２０）
これらの結果は、本実施例において作製した細胞はｉＰＳ細胞であることを示している。
このように、末梢血由来単核球集団からＦＡＣＳなどを用いて抗ＣＤ３陽性Ｔ細胞を単離せず、末梢血由来単核球集団を抗ＣＤ３抗体の存在下で培養した後、脱分化処理することにより、高い効率でｉＰＳ細胞が作製できる。
[比較例１]
比較例では、ＦＡＣＳにより末梢血単核球分画からＴ細胞を選別し、ｉＰＳ細胞を製造する。
比較例では、ＦＡＣＳにより末梢血単核球分画からＴ細胞を選別し、ｉＰＳ細胞を製造する。
まず、実施例で用いたのと同量の末梢血由来単核球分画から、ＦＡＣＳによりＣＤ３陽性Ｔ細胞を選別した。この選別により末梢血由来単核球分画の約３０〜４０％がＣＤ３陽性Ｔ細胞として得られた。選別されたＴ細胞を抗ＣＤ３抗体結合ディッシュに播種し、組み換えインターロイキン２（２０Ｕ／ｍｌ）含有ＫＢＭ５０２培地１０ｍｌにおいて５日間培養した。
培養後のＴ細胞を７．５×１０５細胞／ｍｌの密度に調製し、実施例と同様にＭＯＩ ３あるいは２０で組み換えセンダイウイルスを添加することによって、組み換えベクターを導入し、ＣＤ３陽性Ｔ細胞の脱分化処理を行った。
脱分化処理により得られたコロニーの細胞において、アルカリフォスファターゼ染色、および、クリスタルバイオレット染色を行った。
本比較例でＭＯＩ ２０で脱分化処理を行った場合のコロニー数を、実施例でＭＯＩ ２０で脱分化処理を行った場合のコロニー数と比較したグラフを図５に示す。比較例で得られたコロニーは、アルカリフォスファターゼ陽性、陰性を含めても数コロニーであった。
比較例の結果を実施例の結果と比較すると、実施例の方法では、比較例の方法に比較して、ｉＰＳ細胞樹立の効率が約１００倍高いことが示された。
［比較例２］
本比較例では、実施例に記載の単核球集団からｉＰＳ細胞を作製する際、抗ＣＤ３抗体およびインターロイキン２の存在下で単核球集団を培養する工程が必要であることを示す。
本比較例では、実施例に記載の単核球集団からｉＰＳ細胞を作製する際、抗ＣＤ３抗体およびインターロイキン２の存在下で単核球集団を培養する工程が必要であることを示す。
まず、実施例の記載に従い、末梢血から取得した単核球集団を抗ＣＤ３抗体結合ディッシュに播種し、インターロイキン２存在下で５日間培養した細胞を脱分化させてｉＰＳ細胞を樹立した（抗ＣＤ３＋ＩＬ２＋群）。一方、末梢血から取得した単核球集団を、抗ＣＤ３抗体の結合していないディッシュに播種し、インターロイキン２を含有しないＫＢＭ５０２培地を用いて５日間培養した細胞を脱分化させてｉＰＳ細胞を樹立した（抗ＣＤ３−ＩＬ２−群）。なお、抗ＣＤ３＋ＩＬ２＋群、抗ＣＤ３−ＩＬ２−群共に、単核球の脱分化処理は、単核球集団に、ＭＯＩ ３で、初期化因子を発現するセンダイウイルスを添加して行った。
以上のｉＰＳ樹立工程において、センダイウイルスを添加した単核球数に対するアルカリフォスファターゼ陽性コロニー数の割合（％）をｉＰＳ細胞樹立効率として算出したところ、図６に示すように、ｉＰＳ細胞樹立効率は抗ＣＤ３−ＩＬ２−群では０％であったが、抗ＣＤ３＋ＩＬ２＋群では０．０１６％であった。
このように、単核球集団からｉＰＳ細胞を作製するためには、抗ＣＤ３抗体およびインターロイキン２の存在下での培養工程が必要である。
本発明により、末梢血由来の単核球から高効率でｉＰＳ細胞を製造することが可能になった。
Claims (8)
- 人工多能性幹細胞の製造方法であって、
末梢血由来の単核球集団を材料とすることを特徴とする方法。 - 請求項１に記載の人工多能性幹細胞の製造方法であって、
（イ）末梢血由来の単核球集団を抗ＣＤ３抗体およびインターロイキン２の存在下で３〜１４日間培養する工程と、
（ロ）培養後の前記単核球集団に対して脱分化処理を行う工程と
を含むことを特徴とする方法。 - 請求項２に記載の人工多能性幹細胞の製造方法であって、
前記工程（ロ）において、前記単核球集団に脱分化因子の導入操作を行うことを特徴とする方法。 - 請求項３に記載の人工多能性幹細胞の製造方法であって、
前記脱分化因子の導入操作において、前記脱分化因子を発現する組み換え発現ベクターの導入操作を行うことを特徴とする方法。 - 請求項３または４に記載の人工多能性幹細胞の製造方法であって、
前記工程（ロ）において、前記脱分化因子がＳｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃであることを特徴とする方法。 - 請求項４または５に記載の人工多能性幹細胞の製造方法であって、
前記組み換え発現ベクターがセンダイウイルスベクターであることを特徴とする方法。 - 請求項２〜６のいずれかに記載の人工多能性幹細胞の製造方法であって、
（ハ）脱分化処理を行った前記単核球集団を、増殖因子の存在下で１４〜２５日間培養する工程をさらに含むことを特徴とする方法。 - 請求項１〜７のいずれかに記載の人工多能性幹細胞の製造方法であって、
前記末梢血がヒト由来であることを特徴とする方法。
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