JPWO2011108585A1 - 遺伝子組換えＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属放線菌による有用物質生産法 - Google Patents

Abstract

本発明は、Streptomyces属放線菌のゲノムに由来し、Streptomyces属放線菌において対数増殖期以降に特異的に導入遺伝子の発現を誘導することができるプロモーター、および対数増殖期以降に高い二次代謝産物生産能、前駆体供給能を有する放線菌宿主、これらを組み合わせた有用物質生産法を提供する。

Description

本発明は、遺伝子組換えStreptomyces属放線菌による有用物質生産法に関する。

Streptomyces 属放線菌は、抗生物質や免疫抑制剤に代表される医薬品・医薬品中間体をはじめ様々な有用物質の生産菌として世界中で広く利用されており、産業上非常に有用な微生物である。近年の遺伝子工学の発展にも関わらず、Streptomyces 属を含め放線菌における有用物質高生産株の育種には、未だに古典的な変異剤処理による方法が主流であり、染色体への相同組換えや、ベクターとしての遺伝子導入・形質転換は、一部の菌株に限定されているのが現状である。

近年Streptomyces 属放線菌においてもゲノム配列が決定されたことから、今後ゲノム情報に基づいた新規生理活性物質研究が活発化するものと思われる。しかし、そのためには、これらの遺伝子情報を、有用物質やその合成を触媒する酵素タンパク質の生産に繋げることが重要であり、そのツールとなる宿主ベクター系が不可欠である。

大腸菌や酵母などの微生物を宿主とする遺伝子発現系が広く普及し、利用されているが、これら汎用発現系で実際に活性のある形で発現するたんぱく質は限られている。同様に産業上重要な放線菌由来の遺伝子（P-450など）も、近縁のStreptomyces 属では発現しても、これら汎用系では活性型タンパク質、酵素として発現しない場合が多い。

Streptomyces 属における幾つかの遺伝子発現系が開発されており、中には細胞内全可溶性タンパク質の40％にも及ぶ大量の組換えタンパク質を生産できる強力なシステムも存在する（非特許文献１：Herai et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Sep 28;101(39):14031-5. Epub 2004 Sep 17.)。しかし、これらは組換えタンパク質の生産を目的としたものであり、組換え微生物による有用化合物生産に応用できる放線菌宿主-ベクター系は殆ど知られていない。これは組換え微生物を利用した二次代謝産物の大量生産を達成するには、宿主固有の二次代謝産物生産に適した時期での特異的な遺伝子発現誘導や、宿主の前駆体供給能の改良も同時に必要とされるためである。

一方、生物及びそれらが有する生体触媒（酵素）が触媒する反応に目を向けると、ATP依存性酵素が触媒する反応には、生理学的にも工業的にも有用な反応が多い。しかし、ATPは非常に高価であるため、工業生産において著量のATPを原料として使用することは不可能である。そのため、一旦反応で消費されたATPを他のエネルギー物質を利用して再生するATP再生系が多く報告されている(非特許文献２：Zhao & ven der Donk, Curr Opin Biotechnol. 2003 Dec;14(6):583-9.)。

一例を示すと、最近では、大腸菌内でジペプチド合成酵素であるATP依存性D-アラニン-D-アラニンリガーゼと共に耐熱性ポリリン酸キナーゼを共発現させ、この組換え大腸菌を用いて休止菌体反応を行なうことで、反応に伴って消費されたATPを再生しながらジペプチド合成を達成した例が報告されている（非特許文献３：Sato et al., J Biosci Bioeng. 2007 Feb;103(2):179-84.)。この方法ではATPを系外から添加することなく、加えたD-アラニンとして80％ (mol / mol)の収率でジペプチド合成を達成しているが、その生産量は高くなく、0.02 mol/l程度であり、反応に利用可能なATP量も0.02 mol/l程度であったことを示している。

数種のStreptomyces属放線菌、更にはKitasatospora属放線菌およびEpichloe属糸状菌の一部が、食品保存料として日本国内、韓国やアメリカにおいて幅広く利用されるε-ポリ-L-リジンを細胞外に分泌生産することが報告されている（非特許文献４：Nishikawa & Ogawa, Appl Environ Microbiol. 2002 Jul;68(7):3575-81.)。これらのε-ポリ-L-リジン生産菌の中でもS. albulus NBRC14147は、顕著に高い生産性を示すことから、産業上、特に有用である。

近年S. albulusにおけるε-ポリ-L-リジン合成酵素（Pls）及びその遺伝子(pls遺伝子)が同定され、ε-ポリ-L-リジンが前駆体L-リジンとATPから直接合成されることも明らかにされている（非特許文献５：Yamanaka et al., Nat Chem Biol. 2008 Dec;4(12):766-72. Epub 2008 Nov 9.，特許文献１：特開2008-263868）。また、S. albulusから変異処理によって、ε-ポリ-L-リジン高生産変異株が育種されており（非特許文献６：Hiraki et al., Seibutsu-kogaku Kaishi 76(12) pp.487-493 19981225；非特許文献７：Kahar et al., J Biosci Bioeng. 2001;91(2):190-4.）、実際にε-ポリ-L-リジンの工業生産に利用されている。

特開2008-263868

Herai et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Sep 28;101(39):14031-5. Epub 2004 Sep 17. Zhao & ven der Donk, Curr Opin Biotechnol. 2003 Dec;14 (6):583-9. Sato et al., J Biosci Bioeng. 2007 Feb;103(2):179-84. Nishikawa & Ogawa, Appl Environ Microbiol. 2002 Jul;68 (7):3575-81. Yamanaka et al., Nat Chem Biol. 2008 Dec;4(12):766-72. Epub 2008 Nov 9. Hiraki et al., Seibutsu-kogaku Kaishi 76(12) pp.487-493 19981225 Kahar et al., J Biosci Bioeng. 2001;91(2):190-4.

このような背景から、高い物質生産能及び前駆体供給能を有する放線菌（例：Streptomyces 属）において導入遺伝子の特異的な発現制御が可能であり、新規生理活性物質研究や有用生理活性物質生産のツールとなり得る宿主-ベクター系の開発が求められている。また、有用物質の大量生産へ応用可能な、より効率的ATP再生系の開発もまた求められている。

したがって、本発明は、以下のプロモーター、発現ベクター、宿主細胞、および所望の有用物質の生産方法を提供する。
（１）Streptomyces属放線菌において対数増殖期以降に特異的に遺伝子発現を誘導することができるプロモーター。
（２）上記Streptomyces属放線菌が、ε−ポリ−L−リジン生産菌である、上記（１）に記載のプロモーター。
（３）ε−ポリ−L−リジン生産菌のpls遺伝子の開始コドン（ATG又はGTG）から上流約350-bp以内に存在する、上記（２）に記載のプロモーター。
（４）配列番号１、配列番号２、配列番号３、または配列番号４のヌクレオチド配列を含む、上記（１）〜（３）のいずれか一項に記載のプロモーター。
（５）配列番号４のヌクレオチド配列を含む、上記（１）〜（４）のいずれか一項に記載のプロモーター。
（６）上記（１）〜（５）のいずれか一項に記載のプロモーターを含む発現ベクター。
（７）ε−ポリ−L−リジン生産菌において目的の遺伝子を発現させるために使用される、上記（６）に記載の発現ベクター。
（８）上記ε−ポリ−L−リジン生産菌が、Streptomyces属放線菌、Kitasatospora属放線菌、またはEpichloe属糸状菌である、上記（７）に記載の発現ベクター。
（９）上記Streptomyces属放線菌がS.albulusである、上記（８）に記載の発現ベクター。
（１０）ターミネーターを上記プロモーターの下流にさらに含む、上記（６）〜（９）のいずれか一項に記載の発現ベクター。
（１１）上記ターミネーターのヌクレオチド配列が、配列番号７または配列番号８のヌクレオチド配列を含む、上記（１０）に記載の発現ベクター。
（１２）タグ配列を上記プロモーターの制御下にさらに含む、上記（１０）または（１１）に記載の発現ベクター。
（１３）上記タグ配列が、配列番号９または配列番号１０のヌクレオチド配列を含む、上記（１２）に記載の発現ベクター。
（１４）上記プロモーターの制御下に目的の遺伝子を含む、上記（６）〜（１３）のいずれか一項に記載の発現ベクター。
（１５）上記目的の遺伝子が上記ε−ポリ−L−リジン生産菌と同種または異種の生物由来の遺伝子または遺伝子クラスターである、上記（１４）に記載の発現ベクター。
（１６）上記目的の遺伝子が、pls遺伝子、bpsA遺伝子、hasA遺伝子、mhasA遺伝子、hasB遺伝子、hasBホモログ遺伝子、hasD遺伝子、またはhasDホモログ遺伝子である、上記（１５）に記載の発現ベクター。
（１７）配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５のヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
（１８）上記（１）〜（５）のいずれか一項に記載のプロモーターおよびその制御下にある目的の遺伝子、または上記（１４）〜（１６）に記載の発現ベクターが導入された宿主細胞。
（１９）Streptomyces属放線菌、Kitasatospora属放線菌、またはEpichloe属糸状菌である、上記（１８）に記載の宿主細胞。
（２０）ε−ポリ−L−リジン生産菌である、上記（１９）に記載の宿主細胞。
（２１）宿主細胞において、上記（１）〜（５）のいずれか一項に記載のプロモーターの制御下で目的の遺伝子を発現させることにより、該遺伝子によってコードされるタンパク質またはポリペプチドを生産することを含む、有用物質の生産方法。
（２２）上記（１４）〜（１６）のいずれか一項に記載の発現ベクターを、上記宿主細胞に導入することを含む、上記（２１）に記載の方法。
（２３）上記（１８）〜（２０）のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養することを含む、有用物質の生産方法。
（２４）S.albulus、及びその他のε−ポリ−L−リジン生産菌のpls遺伝子欠損又は破壊株を培養することを含む、上記（２１）に記載の有用物質の生産方法。
（２５）上記（１４）〜（１６）のいずれか一項に記載の発現ベクターを、上記pls遺伝子欠損又は破壊株に導入することを含む、上記（２４）に記載の有用物質の生産方法。
（２６）上記有用物質が、１段階または多段階の反応により生合成される化合物である、上記（２１）〜（２５）のいずれか一項に記載の有用物質の生産方法。

本発明のプロモーター、発現ベクター、宿主細胞、または有用物質生産方法を使用することにより、従来実現することができなかった組換えε−ポリ−Ｌ−リジン合成酵素（組換えPls）を効率的に生産蓄積することができる。本発明により、ε−ポリ−Ｌ−リジン高生産が実現される。

また、本発明のプロモーター、発現ベクター、宿主細胞、または有用物質生産方法を使用することにより、所望の有用物質の効率的生産が可能になる。

図１ａは、S. albulus NBRC14147をε-ポリ-L-リジン生産培地中、Jar-fermentorで30時間好気的に培養した際のpH（黒丸）、ε-ポリ-L-リジン（白四角）の生産量、および菌糸体（mycelium）の生産量の変化を示すグラフである。図１ｂは、図１ａに示す各時間における菌体から抽出した全RNAを確認するために行ったアガロースゲル電気泳動の写真を示す図である。図１ｃは、全RNAからRT-PCRを行った結果を示すアガロースゲル電気泳動の写真を示す図である。 ε-ポリ-L-リジン生合成遺伝子クラスターの推定プロモーター領域を示す図である。それぞれのpositionは、pls遺伝子の開始コドン(ATG)からの位置を、配列中の下線は推定される翻訳開始点を示す。 Streptomyces 属放線菌において利用可能な、plsプロモーター 誘導型遺伝子発現ベクターを示す図である。 S. albulus △pls / pDC009-pls株 から精製した組換えC-末端His-tag融合Pls のSDS-PAGEの結果を示す図である。 図５ａは、S. albulus △pls / pDC009-bpsA株を25 μg/ml アプラマイシン及び50 μg/ml ネオマイシンを含むε-ポリ-L-リジン生産培地中で3L容Jar-fermentor中、30℃で好気的に培養した際のindigoidineの生産量およびpHの経時変化を示すグラフ（■，×）、ならびにS. albulus △pls/ pDC009-mhasA株を25 μg/ml アプラマイシン及び50 μg/ml ネオマイシンを含むε-ポリ-L-リジン生産培地中で3L容Jar-fermentor中、30℃で好気的に培養した際のヒアルロン酸（HA）の生産量およびｐHの経時変化を示すグラフ（◆，●）である。図５ｂは、S. albulus △pls/ pDC009-pls株を図５ａと同様に培養した際のε-ポリ-Lーリジン（ε-PL)生産量およびpHの経時変化を示すグラフである。図５ｃは、indigoidine及びε-PL生産に消費されたATP量の経時的推移（ indigoidine 及びε-PL生産量から算出）を示すグラフである。 グルコースから最終生産物ヒアルロン酸までの生合成経路を示す図である。 mhasA、sav5025、およびsav3561遺伝子が直列に配置された人工ヒアルロン酸生合成遺伝子クラスターを模式的に示す図である。

１．本発明のプロモーター
本発明は、１つの実施形態において、Streptomyces属放線菌において、二次代謝産物生産に適した対数増殖期以降に、特異的に遺伝子の発現を誘導するプロモーターを提供する。

本発明のプロモーター配列は、典型的には、Streptomyces属放線菌のゲノムに由来し、pls遺伝子の開始コドン（ATG）から上流約350bp以内の領域に存在する。本発明のプロモーターには、典型的には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、または配列番号４のヌクレオチド配列を含むプロモーターが含まれるがこれに限定されず、その機能的等価物、すなわち、ε−ポリ−L−リジン生産菌に由来し、対数増殖期以降に特異的にε−ポリ−L−リジン合成酵素(pls)遺伝子の発現を誘導する任意のプロモーターが含まれる。本発明のプロモーター配列は、pls遺伝子のクラスター周辺領域を、例えば、後述の実施例において具体的に示すようなプロモーター予測プログラムを使用して、またはそれに準じる方法を利用して探索することによって特定することができる。必要に応じて、後述の実施例において具体的に示すような方法を用いたpls遺伝子の発現解析の方法またはそれに準じる方法を用いることによって、本発明のプロモーター領域を特定しうる。

本発明のプロモーターを利用することによって、対数増殖期以降における放線菌、典型的にはε−ポリ−L−リジン生産菌、特にS.albulusの高い二次代謝産物生産能および強力かつ持続的なATPの再生能力（前駆体供給能力）を利用できるため、任意の導入遺伝子産物(酵素タンパク質など)による有用物質の生産が可能となるという利点がある。任意の有用物質を生産するために、本発明のプロモーターとその下流（制御下）に配置された任意の目的遺伝子が、発現ベクターに担持されてε−ポリ−L−リジン生産菌（例：S.albulus）内に導入され得る。あるいは、発現ベクターを使用せずに任意の目的遺伝子が該プロモーターの下流に配置されるように、ε−ポリ−L−リジン生産菌（例：Streptomyces属放線菌（例：S. albulus））染色体上に相同組換え等によって挿入されてもよい。ε−ポリ−L−リジン生産菌としては、例えばS.albulusのような、対数増殖期以降での高い二次代謝産物生産能および強力かつ持続的なATP再生能力（前駆体供給能力）を有する菌体を使用すると有利である。

本明細書中、「プロモーター」とはmRNA合成（転写）開始時にRNAポリメラーゼが結合する領域を指す。「plsプロモーター」とはpls遺伝子上流343-bpの領域を指す。

本明細書中、「pls遺伝子」とは、ε−ポリ−L−リジン合成酵素をコードする遺伝子を指す（Yamanaka et al., Nat Chem Biol. 2008 Dec;4(12):766-72. Epub 2008 Nov 9.，特許文献１：特開2008-263868を参照）。

本明細書中、「有用物質」または「有用化合物」という用語は、例えば、ε−ポリ−L−リジンのような産業上有用な物質、またはε−ポリ−L−リジンを合成する酵素タンパク質等の産業上有用な物質であって、本発明の有用物質生産法によって（直接または間接に）生産し得る物質を意味する。

本明細書中、所望の有用物質または有用化合物について「高生産株」とは、該所望の有用物質または有用化合物を高効率で大量に生産する菌株のことをいうものとする。

本明細書中、「二次代謝産物」という用語は、当該分野で通常使用される意味で使用される。すなわち、一次代謝（primary metabolizm）は、多くの生物に共通してみられる生化学反応（例：エネルギー代謝、アミノ酸・タンパク質・核酸等の生合成）をいうのに対して、生命の維持の上で重要な役割をもたず、各種の動植物または微生物でアルカロイド・テルペノイド・フェノール類・抗生物質・色素などが大量に蓄積されることがあり、これらの生合成反応を二次代謝といい、それによって産生される上記アルカロイド等の物質を二次代謝産物という。二次代謝産物の多くは個体の発生の特定の時期、あるいは特定の組織だけで生成される（岩波 生物学事典 第４版 １９９６年３月２１日第１刷発行を参照）。

本明細書中、「目的の遺伝子」または「目的遺伝子」とは、生産することが望まれる所望の任意のタンパク質（もしくはポリペプチド）、所望の有用物質を合成する酵素タンパク質等をコードする遺伝子を指す。「目的の遺伝子」には、例えば、後述の実施例において示すpls遺伝子、bpsA遺伝子、hasA遺伝子、mhasA遺伝子、hasB遺伝子、hasBホモログ遺伝子（例：sav5025）、hasD遺伝子、hasDホモログ遺伝子（例：sav3561）等が含まれるが、これらに限定されず、ε-ポリ-L-リジン生産菌と同種または異種の生物由来の任意の遺伝子および複数の遺伝子のクラスターが含まれる。

２．本発明の発現ベクター
本発明は、さらなる実施形態において、本発明のプロモーターを担持した発現ベクターを提供する。本発明の発現ベクターは、放線菌、好ましくはStreptomyces属放線菌、より好ましくはε−ポリ−L−リジン生産放線菌において所望の目的遺伝子を発現させるために使用することができる。ε−ポリ−L−リジン生産菌には、ε−ポリ−L−リジンを生産することが知られている任意の菌体が含まれる。例えば、Streptomyces属放線菌（例：S. albulus、S. mashuense、S. roseoverticillatus、S. lavendulae）、Kitasatospora属放線菌（例：K. kifnense）、糸状菌（Epichloe sp.）等が含まれるが、これらに限定されない。

本発明の発現ベクターは、上記プロモーターの下流にさらにターミネーター配列を含んでいてもよい。ターミネーター配列は、典型的には、配列番号７または配列番号８のヌクレオチド配列の一部または全部を含むものであるが、これに限定されず、その機能的等価物、すなわち、上記プロモーターの制御下に配置された目的遺伝子の発現において、ターミネーター（転写終了のシグナル）として機能する任意のヌクレオチド配列も含まれる。本発明の発現ベクターにおいて使用されるターミネーター配列は、例えば、S.albulusのε-ポリ-L-リジン生合成遺伝子クラスター下流に見出され得る。ターミネーター配列を本発明の発現ベクターに含ませることによって、目的遺伝子の転写翻訳の安定化および／または効率化を図ることができる。

本発明の発現ベクターを用いて産生されるタンパク質は、アフィニティー精製に便利なように、タグタンパク質との融合タンパク質として生産されてもよい。そのために、本発明の発現ベクターは、目的の遺伝子に加えて、タグ配列を含んでいてもよい。タグ配列の具体例としては、後述する実施例に示される配列番号９または配列番号１０のヌクレオチド配列が含まれる。融合させるタグの例としては、His-tag、GST(グルタチオンS-トランスフェラーゼ)-tag等が含まれるが、これらに限定されない。タグ融合タンパク質として発現させることによって、組換えタンパク質の生産（回収）において、例えば、アフィニティー精製を利用することができるという利点が提供される。

本発明の発現ベクターの非限定的な具体例は、本発明の実施例に、配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５の発現ベクターとして示されている。

３．本発明のプロモーターまたは発現ベクターを導入した宿主細胞
本発明は、さらなる実施形態において、上記本発明のプロモーターの制御下に目的の遺伝子が配置されるように遺伝子導入された、または目的の遺伝子を上記プロモーターの制御下に含む上記本発明の発現ベクターを導入した宿主細胞を提供する。本発明の宿主細胞として使用されうる細胞には、Streptomyces属、Kitasatospora属、Rhodococcus属を含む放線菌細胞などが含まれるが、これらに限定されない。典型的には、ε−ポリ−L−リジン生産菌細胞が本発明の宿主細胞として使用されうる。

任意の有用物質の生産に本発明の宿主細胞を用いる場合、例えば、後述の参考例および実施例に示す、S. albulus△pls株のような、その宿主細胞が元々有するpls遺伝子を予め破壊したものを使用すると、対数増殖期以降での二次代謝産物生産能およびATP再生能が、その菌体の主生産物であるε−ポリ−L−リジン生産に消費されなくなるため、より効率的な有用物質生産を実現しうるため有利である。

４．有用物質の生産方法
本発明はまた、さらなる実施形態において、本発明のプロモーターまたは本発明の発現ベクターを利用した有用物質の効率的な生産方法を提供する。この方法は、放線菌、典型的には、ε−ポリ−L−リジン生産菌において、上述の本発明のプロモーター制御下で目的の遺伝子を発現させることを含む。

代替的に、上記本発明の発現ベクターを、当業者に周知の技術を用いて上記ε−ポリ−L−リジン生産菌に導入することによって、目的の遺伝子のコードする目的のタンパク質を生産してもよい。

代替的に、上記本発明の発現ベクターを導入した宿主細胞を培養することによって、任意の有用物質を生産してもよい。培養条件（培養液組成、培養期間等）は、目的に応じて当業者が適宜設定できる。

以下、実施例により、本発明をより具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されない。

［参考例］
ε-ポリ-L-リジンの発酵生産過程においてS. albulusは、対数増殖期以降の自身の生育には適さない酸性条件下でのみ、著量のε-ポリ-L-リジンを生産するという特徴的性質を示す。この特性は、ε-ポリ-L-リジン生産過程では、前駆体L-リジン及びエネルギー物質としてのATPを、自身の生育（一次代謝）より二次代謝産物であるε-ポリ-L-リジンの生産に優先的に利用している事を意味する。

Kaharら（J Biosci Bioeng. 2001;91(2):190-4.）によれば、S. albulus S410株（S. albulus NBRC14147の誘導株）は、8日間の培養で、実に48.3 g/lのε-ポリ-L-リジンを培養液中に生産蓄積する。従って、S. albulus又はその誘導株は、ε-ポリ-L-リジン高生産株であると同時に、前駆体であるL-リジンの高生産株であると言える。更に、もう一方の前駆体であるATPは、ε-ポリ-L-リジン合成反応に伴ってAMPへと変換されるため（特開2008-263868）、ε-ポリ-L-リジン生産菌細胞内において、一部新生されるATPもあろうが、AMPからATPへの再生系が持続的且つ強力に機能していることも明らかである。

ε-ポリ-L-リジン中の1リジン残基あたりの質量数は128であり、従って、48.3 g/lのε-ポリ-L-リジン中のL-リジン残基は≒0.38 mol/lとなる。ε-ポリ-L-リジンの平均重合度は30merであるため、1分子中のペプチド結合数は30-1＝29である。Plsは1回のリジン同士のペプチド結合形成（縮合反応）あたりATP1分子を要求するので、消費したATPは0.38 mol/l ×29/30 = 0.37 mol/lとなる。そうすると、S. albulus S410株では8日間の培養中に0.37 mol/lのATPを消費して、48.3 g/lのε-ポリ-L-リジンを生産していることになり、前述の耐熱性ポリリン酸キナーゼにより再生されるATP量よりはるかに多い。（ATP・2Na塩として実に203.9g/lに相当する。）
従って、ε-ポリ-L-リジン生産菌S. albulus NBRC14147又はその誘導株を宿主とする遺伝子発現系であれば、S. albulusが有する酸性条件下での高い二次代謝産物生産能及び強力且つ持続的ATP再生能力を利用することができ、課題である有用物質の大量生産へ応用可能な効率的ATP再生、及び放線菌による任意の有用物質生産の双方を同時に解決する強力な手段になると考えられた。

また、宿主S. albulusが有するpls遺伝子を予め破壊しておくことで（S. albulus△pls株）、酸性条件下での二次代謝産物生産能及びATP再生能が、本菌の主生産物であるε-ポリ-L-リジン生産に消費されなくなるため、より効率的な任意の有用物質生産を達成できると考えられた。

S. albulusが元々有している環状プラスミドｐNO33を元に、S. albulusを含むStreptomyces 属放線菌において利用可能な大腸菌-放線菌シャトルベクターpLAE001が既に開発されている（特開2005-237335）。また、その誘導体で汎用性の高い薬剤耐性マーカー(aphII; カナマイシン-ネオマイシン耐性遺伝子)を有するpLAE003（Hamano et al., J Biosci Bioeng. 2005 Jun;99(6):636-41.）及びpLAE003に恒常発現プロモーター(erm E )を付加したS. albulusにおける遺伝子発現ベクターpLAE006（Hamano et al., Appl Microbiol Biotechnol. 2007 Sep;76(4):873-82. Epub 2007 Jul 5.）が構築されており、その有効性も確認されている。

従って、宿主としてS. albulus△pls株（特開2008-263868）、遺伝子発現ベクターとしてpLAE006を用いることで、課題である任意の有用物質工業生産が可能と考えられた。この可能性を検証するために、本発明者らは遺伝子発現ベクターとして前述のpLAE006を利用することで、宿主S. albulus△pls株のATP供給特性を最大限に利用できる酸性条件下で、実際に目的遺伝子を活性型タンパク質、酵素として発現し、二次代謝産物生産が可能か否かを検証した。検証は、pls遺伝子を挿入したpLAE006をS. albulus △pls株に形質転換し、酸性条件下で培地中に生産されるε-ポリ-L-リジンの有無から挿入遺伝子産物（ε-ポリ-L-リジン合成酵素、Pls）の発現を確認することで行った。以下にその方法を説明する。

pLAE006のBamHＩ-HindIIIサイトにpls遺伝子（ORF上流にリボソーム結合領域、終止コドン直下にHis x8 -tagを含む）を挿入して構築したpLAE006-plsを、特許文献１に記載の方法に従って大腸菌S17-1株との接合によりS. albulus △plsに形質転換した。得られた形質転換体S. albulus △pls / pLAE006-plsを、25 μg/ml アプラマイシン及び50 μg/ml ネオマイシンを含むε-ポリ-L-リジン生産培地（Kahar et al., J Biosci Bioeng. 2001;91(2):190-4.）中で30℃/48ｈ好気的に培養した。

培養終了後、培養上清のε-ポリ-L-リジン生産量を特開2008-263868に記載のHPLC法にて測定したところ、ε-ポリ-L-リジンの生産は認められたが、その量は極めて少なく、痕跡量程度でしかなかった。また、定法に従ってNiアフィニティークロマトグラフィーにより、組換えPlsの精製を試みたが、その発現量が極めて微量であったため、精製Plsを得ることはできなかった。

本法を用いて、一部Plsの機能解析も行なわれたが（平成２１年度日本生物工学会大会P.194）、以上の結果は、pLAE006が有しているerm Eのような恒常発現プロモーター誘導下では、対数増殖期以降の酸性条件下では、自身の遺伝子であっても殆ど発現せず、課題である微生物による有用物質高生産を達成できないことを示している。

従って、S. albulusにおいて物質生産に適した“対数増殖期以降の酸性条件下で特異的に遺伝子発現を誘導するプロモーター”の探索が必要であった。

［実施例１］RT-PCRによるpls遺伝子発現プロファイルの解析
S. albulusが対数増殖期以降の酸性条件下で著量のε-ポリ-L-リジンを生産するという事実から、pls遺伝子の発現は、この特徴的な条件下でのみ特異的に誘導される可能性が考えられた。

そこでRT-PCR法によりS. albulusにおけるpls遺伝子の発現時期の特定を試みた。
特開2008-263868に記載の方法に従い、S. albulus NBRC14147を3L容Jar-fermentorで30ｈ好気的に培養した（図１a）。また、培養に伴うpH低下後は、適宜10％アンモニア水を添加して培養液pHをε-ポリ-L-リジン生産に適した4.2に維持した。

培養中、適宜培養液の一部をサンプリングし、菌体から定法に従って全RNAを抽出した（図１b）。この全RNAから、下記に示すε-PL-NRPS-Rプライマー及びTOYOBO社製の逆転写酵素Rever Tra Aceを用いてpls遺伝子を逆転写(RT)した。また、対照として下記に示すAsk-C4プライマーを用いてL-リジン合成の鍵酵素、アスパルトキナーゼ遺伝子(ask)も逆転写により同様に調製した。
ε-PL-NRPS-F; 5’-GGGGGATCCTCGTCGCCCCTTCTCGAATCG-3’（配列番号１６）
ε-PL-NRPS-R; 5’-ACCAAGCTTTCACGCGGCCGCACCTCCCTC-3’ （配列番号１７）
Ask-C4; 5’-ACCAAGCTTTCATCGCCCGGTGCCGCCGTA-3’ （配列番号１８）
Ask-N4; 5’-GGGGGATCCGGCCTTGTCGTGCAGAAGTAC-3’ （配列番号１９）
得られた逆転写産物(pls遺伝子)を鋳型にε-PL-NRPS-Ｆおよびε-PL-NRPS-Rのプライマーを用いてＰＣＲを行った。また、同様にAsk-C4 およびAsk-N4プライマーを用いて、対照の逆転写産物（ask遺伝子）に対してもＰＣＲを行った（図１c）。

その結果、対照として用いたask遺伝子は、培養の初期から発現しており、培養液ｐＨ が低下し始める対数増殖期後期以降は、その発現量が顕著に低下することが確認された。AskはL-リジン合成の鍵酵素であるため、細胞増殖との密接に関連するask遺伝子の発現挙動は合理的なものといえる。

一方、pls遺伝子はask遺伝子とは対照的に、培養液pHが低下し始める対数増殖期後期以降から発現が認められ、ε-ポリ-L-リジン生産が認められるpH4.2付近で最大となった。また、細胞増殖が殆ど認められない24時間後にも高いレベルの発現が維持されていた。以上のRT-PCR解析の結果から、pls遺伝子は、細胞増殖が鈍化する対数増殖期後期から定常期、且つ二次代謝産物生産に適した低いpH環境下で特異的に発現誘導されることが確認された。通常、このような細胞増殖が認められない定常期付近では、遺伝子発現（タンパク質の新生）は殆ど起こらない。しかしpls遺伝子は、この時期に特異的且つ持続的に発現していることから本遺伝子の発現制御は極めて特殊であると言える。

また、前述のように数種の放線菌及び一部の糸状菌がε-ポリ-L-リジンを生産することが知られているが、これらは何れも共通して培養に伴うpH低下後（< pH4.5）にのみε-ポリ-L-リジンを生産する。従って、これらの生産菌においても、Plsは培養液pHの低下に伴って特異的に発現誘導されると考えられる。

この結果から、この特徴的発現挙動を与えるpls遺伝子発現を制御しているプロモーターを有する遺伝子発現ベクターと、ε-ポリ-L-リジン生産菌を宿主として用いることで、課題である任意の有用物質の生産に応用できると考えられた。

［実施例２］pls遺伝子のプロモーター領域(plsプロモーター)の特定とこれを有する組換えベクターpDC007の構築
pls遺伝子の発現制御に関わるプロモーター領域の特定を試みた。pls遺伝子を含む33-kbのDNA配列が既に明らかとなっている（GeneBank, accession No. AB385841）。また、pls遺伝子下流にトランスレーションカップリングしているメタロプロテアーゼ遺伝子がS. albulusにおける主要なε-ポリ-L-リジン分解酵素(PldII、エンド型)であることも確認されていることから（平成２０年度日本生物工学会大会講演要旨集p.206）、plsおよびpldII遺伝子はε-ポリ-L-リジン生合成遺伝子クラスターを形成しているといえる。
本遺伝子クラスター周辺領域をNeural Network Promoter Prediction (http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html) プログラムを用いて解析したところ、有意なスコアー（＞0.8）を与えるプロモーター領域は見出されなかった。

そこで、下限スコアーを更に下げて（＞0.4）再度検索を行なったところ、図2に示す３箇所の推定プロモーター領域が見出されたが、何れもスコアーは低く、プロモーター領域の特定には至らなかった。また、本遺伝子クラスター周辺領域を詳細に解析した結果、本遺伝子クラスター直下にはターミネーター配列は見出されたが、制御遺伝子などは見出されなかった。

しかしながら、本クラスター周辺領域には他にプロモーター候補領域が存在しなかったことから、本クラスターのプロモーター領域は上記３つの推定領域のいずれかであると予想された。そこで、この３箇所の推定領域のいずれかに本クラスターのプロモーターが含まれることを次の方法で確認した。

３箇所の推定領域の何れもpls遺伝子開始コドン(ATG)から上流350-bp以内の比較的近い領域に集中していたため、下記に示すeplP-FおよびeplP-Rプライマーを用い、S. albulus染色体DNAを鋳型としてＰＣＲを行い、３つの推定プロモーター領域全てを含む343-bpを増幅した。このＰＣＲ増幅断片を前述のpLAE003のFseＩ-BamHＩサイトに挿入し、図３に示すpDC007を構築した。

次に、本ベクターの機能及び有効性を、以下のpls遺伝子を用いた発現検討により確認した。下記のplsnde-Fおよびplshind-Rプライマーを用い、S. albulus染色体DNAを鋳型としたPCRによりpls遺伝子をPCR増幅後、増幅断片を制限酵素NdeＩ及びHindIIIで消化した。
plsnde-F; 5’-GGAATTCCATATGTCGTCGCCCCTTCTCG-3’（配列番号２２）（下線部はNdeＩサイト）
plshind-R; 5’-ACCCAAGCTTTCACGCGGCCGCACCTCC-3’（配列番号２３）（下線部はHindIIIサイト）
制限酵素消化後のpls遺伝子をpDC007の推定plsプロモーター下流に位置するNdeＩ-HindIIIサイトに挿入してpDC007-plsを構築し、これを参考文献4に記載の方法に従って大腸菌S17-1株との接合によりS. albulus △plsに形質転換した。得られた形質転換体S. albulus △pls / pDC007-plsを、25 μg/ml アプラマイシン及び50 μg/ml ネオマイシンを含むε-ポリ-L-リジン生産培地中で、特開2008-263868に記載の方法に従い、3L容Jar-fermentorで30℃/30ｈ好気的に培養した。

培養終了後、培養上清のε-ポリ-L-リジン量を定量した結果、本組換えベクターのみ（pls遺伝子の挿入なし）を導入したS. albulus △pls / pDC007株は当然ながらpls遺伝子の破壊によりε-ポリ-L-リジン生産能を欠質していたが、pDC007-plsを導入したS. albulus △pls / pDC007-pls株の培養液中には著量のε-ポリ-L-リジン生産蓄積が認められた。

また、その生産量はS. albulus △plsの親株（特開2005-237335、S. albulus NBRC14147から前述のpNO33を脱落させて構築された株であり、S. albulus NBRC14147と同等のε-ポリ-L-リジン生産性を示す。）が30時間の培養で1.32 g/lであったのに対し、驚くべきことにS. albulus △pls/pDC007-pls株は2.73 g/lと野生株（NBRC14147）の約2倍の生産性を示した。

以上の結果から、ε-ポリ-L-リジン生合成遺伝子クラスターの発現を制御する領域(plsプロモーター)が、pls遺伝子開始コドン(ATG)から上流343-bpの範囲にあることを特定した。従って、以下、本明細書中ではpls遺伝子開始コドン(ATG)から上流343-bpの領域をplsプロモーター（配列番号４）と呼ぶ。

また、この結果によってプロモーター領域を特定したと同時に、これを利用することで課題であったS. albulusにおいて二次代謝産物合成前駆体の供給が高まる対数増殖期以降の酸性条件下で、特異的に目的遺伝子の発現を誘導する遺伝子発現ベクターpDC007の構築にも成功した。

この結果は、plsプロモーター支配下で発現した組換えPlsが、S. albulus△pls株の細胞内で再生（一部新生も含む）されるATPを利用して、目的化合物であるε-ポリ-L-リジンを合成したことを実証するものであり、S. albulus及びplsプロモーターを有する遺伝子発現ベクターの有用物質生産のツールとしての有効性が確認された。

また、上記ベクターを利用することで、期待を上回るε-ポリ-L-リジン高生産株の樹立にも成功した。この生産量向上の理由は、元来染色体上に1コピーしか存在しないpls遺伝子が、ベクターとして形質転換したことで、pls遺伝子が宿主細胞内に複数コピー存在することになり、その結果、翻訳産物であるPlsの蓄積量、更にはPls反応産物であるε-ポリ-L-リジンの生産量が向上したものと考えられる。

従って、本実施例の結果はplsプロモーター及び任意有用物質生産宿主としてのS. albulusの有効性を示すものであり、組換えベクターのplsプロモーター以外のベクター領域は、宿主であるε-ポリ-L-リジン生産菌内で安定に自立複製され得るものであれば、本実施例で用いたpNO33の自立複製領域を有したpLAE001、又は003の誘導体でなくても良いと考えられる。また、同じ理由で、宿主内での組換えベクターのコピー数は高い方が、plsプロモーターの効果が顕著に得られると考えられる。更に、発現ベクターを用いなくても、任意の目的遺伝子がplsプロモーター下流に配置されるように、S. albulus染色体上に相同組換えによって挿入しても、コピー数効果が得られないため若干目的化合物の生産量は低下するであろうが、同様の効果を得ることができると考えられる。

また、前述のように数種の放線菌及び一部の糸状菌がε-ポリ-L-リジンを生産することが知られており、これらの生産菌においても、Plsは培養液pHの低下に伴って特異的に発現誘導されると考えられる。従って、S. albulus以外のε-ポリ-L-リジン生産菌に由来するε-ポリ-L-リジン生合成遺伝子クラスターのプロモーター領域を用いても同様の効果が得られると考えられる。

近年のゲノム解析により、種々の放線菌から新規二次代謝産物を生合成すると考えられる遺伝子及び遺伝子群（クラスター）が多数見出されている。これらの遺伝子（クラスター）は、潜在的に弱い又は機能しないプロモーター支配下にあるため、実際には二次代謝産物を生産せず、世界中で精力的に行なわれてきた有用生理活性物質探索研究の網を潜り抜けてきた。従って、これらの新規に見出された二次代謝産物生合成遺伝子（クラスター）の潜在プロモーターに換えて本発明のplsプロモーターを利用して、これら遺伝子（クラスター）を強制的に発現させ、S. albulus内の豊富な前駆体を利用して実際に二次代謝産物を生産させることで、新規生理活性物質探索及びその生産研究にも新たな道を切り開くであろう。その意味でも本発明の遺伝子誘導発現システムは、有効である。

［実施例３］pDC007誘導体の構築
続いて、本発明のplsプロモーターを有する遺伝子発現ベクターを、有用物質生産のツールとしてだけではなく、組み換えタンパク質生産にも応用するためにpDC007誘導体を構築した。

RNAポリメラーゼによるリードスルーを抑制し、転写翻訳の安定化及び効率化を図るために、下記方法によりpDC007のマルチクローニングサイト下流に、ε-ポリ-L-リジン生合成遺伝子クラスター下流に見出されたターミネーター配列を導入した。

クラスター直下に見出されたターミネーター配列（下記配列下線部分）に基づき、下記に示すTerm-F及びTerm-Rの2つの互いに相補する一本鎖オリゴDNAを合成した。これらを混合後、加熱冷却して二本鎖DNAとし、pDC007のPstＩ-HindIIIサイトに挿入して図3に示すpDC008を構築した。
Term-F;
5’-GGCATGCAAGCTTGAGCGCTCCGCGTGCCCGGTGGCGGACGGTACCCCGTCCGCCACCGGGCACGGCCGGC-3’（配列番号５）(下線部は推定ターミネーター領域)
Term-R;
5’-AGCTGCCGGCCGTGCCCGGTGGCGGACGGGGTACCGTCCGCCACCGGGCACGCGGAGCGCTCAAGCTTGCATGCCTGCA-3’（配列番号６）(下線部は推定ターミネーター領域）
組換えたんぱく質の生産においては、アフィニティー精製が可能なタグ配列融合タンパク質として発現できるベクターである方が有利である。そこで上記の方法により構築したpDC008を基に、挿入遺伝子産物をC-末端His-tag融合タンパクとして発現可能な誘導体を構築した。

下記に示すHis8C-F及びHis8C-Rの2つの互いに相補する一本鎖オリゴDNAを合成した。これらを混合後、加熱冷却して二本鎖DNAとし、pDC008のPstＩ- HindIIIサイトに挿入して図3に示すpDC009を構築した。

［実施例４］ε-ポリ-L-リジン高生産株の樹立と組換えPlsの発現及び精製
本発明のplsプロモーターを有する遺伝子発現ベクターが、組換えタンパク質生産にも有効であることを確認するために、上述の挿入遺伝子産物をC-末端His-tag融合タンパクとして発現可能なpDC009を用いて、組換えPlsの生産及び精製を試みた。
下記のplsnde-Fおよびplshindhis8-Rプライマーを用い、S. albulus染色体DNAを鋳型としたPCRによりpls遺伝子をPCR増幅後、増幅断片を制限酵素NdeＩ及びHindIIIで消化した。
plsnde-F; 5’-GGAATTCCATATGTCGTCGCCCCTTCTCG-3’（配列番号２４）（下線部はNdeＩサイト）
plshindhis8-R; 5’- GTGGTGAAGCTTCGCGGCCGCACCTC-3’（配列番号２５）（下線部はHindIIIサイト）
末端が制限酵素NdeＩ及びHindIIIにより消化されたpls遺伝子を、pDC009のNdeＩ-HindIIIサイトに挿入してpDC009-plsを構築し、これを参考文献4に記載の方法に従って大腸菌S17-1株との接合によりS. albulus △plsに形質転換した。得られた形質転換体S. albulus △pls / pDC009-plsを、25 μg/ml アプラマイシン及び50 μg/ml ネオマイシンを含むε-ポリ-L-リジン生産培地中で、特開2008-263868に記載の方法に従い、3L容Jar-fermentorで30℃/30ｈ好気的に培養した。

培養終了後、培養上清のε-ポリ-L-リジン量を特開2008-263868に記載のHPLC法にて定量した結果、S. albulus △pls/ pDC009-pls株は3.21 g/lのε-ポリ-L-リジン生産性を示し、前述のS. albulus △pls / pDC007-pls株の生産性と比較してその生産性は更に向上していた。この理由は、マルチクローニングサイト下流に配置したターミネーター配列により、pDC007と比較して転写翻訳が安定化又は効率化されたためと考えられる。

次に、遠心分離にて回収した菌体15ｇ（湿重量）を45mlの50mM Tris-HCl、30％(w/v) glycerol、0.5M NaCl、2% (w/v) Triton X-100、5mM DTTから成る破砕緩衝液(pH7.8)に懸濁し、特開2008-263868に記載の方法に従い超音波破砕、続いて遠心分離し、得られた上清を粗酵素液とした。これを定法に従い、His-tag融合タンパク質精製用クロマトグラフィー担体Ni Sepharose 6 fast flow (GE Healthcare社製)を用いてHis-tag融合組換えPlsを精製した。

その結果、図4のSDS-PAGE分析結果に示すように、高純度の精製組換えPlsが得られ、特開2008-263868に記載の方法に従って測定した精製組換えPlsの収量（タンパク量）は1.8mgであった。従来、Plsは6回膜貫通型酵素であるため、その精製には多くの工数を要し、収量も70ｇの菌体から約2.9mgのPls精製標品を得られる程度である（特開2008-263868）。従って、収量は約3倍に向上したことになる。

組換え膜貫通型タンパク質の構築が容易ではないことは良く知られている。同様に、Plsは、6回膜貫通型酵素であるため、大腸菌や酵母、更には放線菌Streptomyces lividans等の微生物を宿主とする汎用遺伝子発現システムの何れを用いても、組換えPlsの構築を構築することはできなかった。しかし、対数増殖期後期以降の低いpH環境下で特異的に遺伝子発現を誘導するplsプロモーター支配下において持続的にpls遺伝子を発現させることで、ε-ポリ-L-リジンの高生産株を樹立できるばかりでなく、従来不可能であった組換えPlsを効率的に生産蓄積させることにも成功した。

以上のように、本発明のplsプロモーター及びこれを有する遺伝子発現ベクターの有効性はpls遺伝子を用いて示したが、産業上重要な遺伝子を同様に本ベクターに挿入し、S. albulus △plsに形質転換することで、本菌の高い二次代謝産物生合成の前駆体供給能を最大限に生かした任意有用物質生産を行なうことも当然可能である。この場合、ATP以外の前駆体が不足する場合は、系外から添加することも可能である。

また、本発明のS. albulus 及びplsプロモーターを有する遺伝子発現ベクターを用いる遺伝子誘導発現システムは、大腸菌におけるpETシステムのような、いわゆる高発現システムではない。しかし、一般に二次代謝産物は、培養の後期の限られた条件下で生産されるものが多いため、課題とする二次代謝産物の組換え微生物生産においては培養の初期から構成的（恒常的）、且つ大量に遺伝子を発現させることは、必ずしも好ましいものではない。また、遺伝子発現の誘導制御が可能なシステムであっても、タンパク質新生が殆ど起こらない二次代謝産物生産に適した培養後期では、充分に機能しない場合も多い。その意味でも本発明の遺伝子誘導発現システムは、有効である。

[実施例5] ε-ポリ-L-リジン以外の任意化合物の生産１
本発明のプロモーター及びそれを有する組換えベクター、さらにS. albulusを宿主として用いる任意有用物質生産法の有効性を、次の方法で確認した。D-サイクロセリン生産放線菌Streptomyces lavendulaeに特異的に存在するbpsA遺伝子は、単一モジュール型の非リボソームペプチド合成酵素をコードしており、青色素indigoidine生合成遺伝子として機能する（Takahashi et al.（J Biol Chem. 2007 Mar 23;282(12):9073-81. Epub 2007 Jan 19.)；特開2007-189969）。

当該遺伝子産物BpsAは、2分子のL-グルタミンと2分子のATPを基質として、indigoidine１分子を生成する反応を触媒する。従って、bpsA遺伝子を本発明の宿主ベクター系で発現させ、生産される青色素量を定量、更に色素量から反応に消費したATP量を算出することで、本発明の遺伝子誘導発現システムの有効性を容易に確認できる。

そこで、本発明の遺伝子誘導発現システムが、異種放線菌由来遺伝子を用いた任意の物質生産にも有効であることを、S. lavendulae NBRC12340 (Takahashi et al.( J Biol Chem. 2007 Mar 23;282(12):9073-81. Epub 2007 Jan 19.)及び特開2007-189969に記載のATCC11924と同一株)由来のbpsA遺伝子を用いて確認した。

下記のbpsAnde-F及びbpsAhind-Rプライマーを用い、S. lavendulae染色体DNAを鋳型としたPCRによりbpsA遺伝子を増幅後、増幅断片を制限酵素Nde I及びHind IIIで消化した。
bpsAnde-F； 5’-GGAATTCCATATGACTCTTCAGGAGACCAGCGTGCTCGAG-3’（配列番号２６）
(下線部は制限酵素Nde Iサイト)
bpsAhind-R； 5’-CCCAAGCTTCTCGCCGAGCAGGTAGCGGATGTGC-3’（配列番号２７）
(下線部は制限酵素Hind IIIサイト）
制限酵素消化断片をpDC009のNde I-Hind IIIサイトに挿入してpDC009-bpsAを構築し、これを大腸菌S17-1株との接合によりS. albulus △plsに形質転換した。得られた形質転換体S. albulus △pls/ pDC009-bpsAを、25 μg/ml アプラマイシン及び50 μg/ml ネオマイシンを含むε-ポリ-L-リジン生産培地中で、特開2008-263868に記載の方法に従い、3L容Jar-fermentor中、30℃で好気的に培養した。なお培養時間は生産されるindigoidineが非水溶性であることを考慮して、培養開始後21ｈ（培養液pHが4.0付近まで低下＝遺伝子発現誘導後、約10ｈ）までとした。培養初期から培養液pHが低下するまでは、培養液の色調変化は殆ど無かったが、pH低下後は著しい培養液の青変が観察された。

培養終了後、培養液を高速遠心分離に供し、生産された著量の青色素を菌体と共に回収した。得られた沈殿物を純水及びメタノールに再懸濁後、再び高速遠心分離し、青色素及び菌体を洗浄した。更にこの操作を２度繰り返して充分に洗浄した後、乾燥させた。この青色素を含む乾燥物にジメチルホルムアミド（DMF）を加えて青色素が溶解するまで充分に超音波処理し、その後高速遠心分離及び0.2μmメンブランフィルターにて菌体残渣を除いたものを粗青色素溶液とした。更に特開2007-189969に記載の方法に従って、得られた粗青色素溶液に過剰量（10倍溶量）の純水を加えて青色素を析出させ、高速遠心分離にて回収、乾燥させたものを精製青色素とした。

精製青色素のDMF中での吸収スペクトルを測定した結果、λmax=600nmであった。またEI-MSスペクトル(m/z=248)もTakahashi et al.( J Biol Chem. 2007 Mar 23;282(12):9073-81. Epub 2007 Jan 19.)に記載のindigoidineの測定値とよく一致したことから、S. albulus △pls/ pDC009-bpsAによって生産された青色素がindigoidineであることを確認した。

また、生産されたindigoidine量の測定は、DMF中における600nmの分光光度測定により行なった（logε=4.37）。その結果、培養液pHが4.2付近に低下後、急速なindigoidine生産蓄積が認められ、その生産量は僅か21時間の培養で1.13 g/lに達した(図５ａ)。また、indigoidine合成に消費された培地1LあたりのATP量（indigoidine生産量から算出）は、S. albulus △pls / pDC009-pls株 においてε-ポリ-L-リジン生産に消費されたそれと同等であった(図５ｂ，ｃ)。

この結果は、異種生物由来の遺伝子であっても、本発明の宿主ベクター系を用いることで、二次代謝産物生産に適した対数期後期に特異的且つ効率よく発現させることが可能であり、更にS. albulus細胞内で強力に再生（一部新生も含む）される理論上の利用可能ATPをほぼ100％利用して、目的化合物であるindigoidineを合成したことを示している。

また、驚くべきことに、S. albulus △pls株は前駆体であるL-グルタミンを系外から添加することなく著量のindigoidineを生産した。このことは、S. albulusがindigoidine生産に必要な著量のＬ-グルタミンをも自ら合成したことを示している。この理由は明らかではないが、S. albulusはATPのみならず、消費されたアミノ酸などの化合物の菌体内プールを一定に保つ機構を有している可能性が考えられる。

[実施例6] ε-ポリ-L-リジン以外の任意化合物の生産２
ε-ポリ-L-リジン及びIndigoidineといったATPを直接的に且つ１段階の反応で要求する化合物生産においては、本発明のプロモーター及びそれを有する組換えベクター、さらにS. albulusを宿主として用いる任意有用物質生産法の有効性が確認された。しかし、天然有用化合物の多くは、多段階の反応により生合成され、その生合成に間接的にATPを要求するケースも多い。そこで、本発明のプロモーター及びそれを有する組換えベクター、さらにS. albulusを宿主として用いる任意有用物質生産法が、多段階反応により生合成され、且つその生合成に間接的にATPを要求する任意化合物生産にも適用可能であるか否かを次の方法で検証した。

病原性乳酸菌Streptococcus zooepidemicusに存在するhasA遺伝子はヒアルロン酸合成酵素をコードしており、当該遺伝子産物のHasAは、UDP-N-アセチルグルコサミンとUDP-グルクロン酸を基質として、グルクロン酸とN-アセチルグルコサミンの繰り返し構造からなるポリマー構造のヒアルロン酸を合成する（J Mol Evol.2008 Jul;67(1):13-22. Epub 2008 Jun 13）。また、図６に示すように、グルコースから最終生産物ヒアルロン酸の構成糖であるグルクロン酸とN-アセチルグルコサミンの二糖単位合成には、間接的に3分子のATPを要求する。そこで、本発明の有効性をヒアルロン酸生産により検証した。

HasAは膜結合型酵素であること、更に放線菌遺伝子が平均GC含量約70％であるのに対し乳酸菌遺伝子は約40％前後と使用コドンが大幅に異なることから、Streptococcus zooepidemicus由来hasA遺伝子はS. albulus内で機能的に発現しない可能性が考えられた。そこで先ず初めにhasA遺伝子をS.albulus内で機能的に発現させるため、乳酸菌Streptococcus zooepidemicus由来のhasA遺伝子を放線菌固有のコドン使用頻度を考慮して改変（40％GC→63％GC）し、人工遺伝子mhasA（配列番号２８）を合成した。

また、S.albulus内でヒアルロン酸を効率よく生産させるには、ヒアルロン酸合成前駆体となるUDP−グルクロン酸及びN-アセチルグルコサミンが十分量供給される必要がある。したがってUDP-グルクロン酸合成活性を有する酵素であるUDP-グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子（hasB）及びUDP-N-アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ遺伝子（hasD）をhasA遺伝子と下記方法により共発現させた。

データベース検索により見出されたStreptomyces avermitilis 由来のhasBホモログ遺伝子(sav5025)を、Streptomyces avermitilis NBRC14893染色体DNAを鋳型としてsav5025-assembleF及びsav5025-hindRプライマーを用いてPCR増幅した。
sav5025-assembleF； 5’-CTCGCATGAGCCTCAAGATCACCGTGATCGGCACCGG-3’（配列番号２９）
sav5025-assembleR； 5’-ATGGCGCTCATGCGGTGGCCTCCCCCATCGCGCGGTACGTCCAGC-3’（配列番号３０）

また、同様にデータベース検索により見出されたStreptomyces avermitilis由来の hasDホモログ遺伝子（sav3561）を、Streptomyces avermitilis NBRC14893染色体DNAを鋳型としてsav3561-assembleF及びsav3561-hindRプライマーを用いてPCR増幅した。
sav3561-assembleF； 5’-CGATGGGGGAGGCCACCGCATGAGCGCCATCCGCCCGGCAGCCGT-3’（配列番号３１）
sav3561-hindR； 5’- CCCAAGCTTTCAGTCTTCGCCTTCCGGCTTCCGGGAA-3’（配列番号３２）
(下線部は制限酵素Hind IIIサイト）

次にmhasA遺伝子とsav5025、sav3561遺伝子をOverlap expression PCR法により単一断片としてアッセンブルし、mhasA、sav5025、sav3561遺伝子が直列に配置された人工ヒアルロン酸生合成遺伝子クラスターを構築した（図７、配列番号３３）。

本遺伝子クラスター（mhasA-sav5025-sav3561 ）をXba I及びHind IIIで制限酵素消化後、pDC009のXba I-Hind IIIサイトに挿入してpDC009-mhasA-sav5025-sav3561を構築した。本遺伝子クラスターは、本発明のプロモーターにより単一ユニットとして転写され、且つ各遺伝子ORF上流にはリボソーム結合サイトを付与してあるため、各遺伝子は効率的に翻訳され得る。また比較対照としてmhasAのみをpDC009のXba I-Hind IIIに挿入したpDC009-mhasAも同時に構築した。これらを大腸菌S17-1株との接合によりS. albulus △plsに形質転換し、得られた形質転換体S. albulus △pls / pDC009-mhasA-sav5025-sav3561、S. albulus △pls / pDC009-mhasAを、25 μg/ml アプラマイシン及び50 μg/ml ネオマイシンを含むε-ポリ-L-リジン生産培地中で、特開2008-263868に記載の方法に従い、3L容Jar-fermentor中、30℃で好気的に培養した。

培養終了後、培養液を遠心分離に供して菌体を除去した。得られた培養上清に3倍量のエタノールを加えて、ヒアルロン酸を含む多糖類を沈殿させた後、遠心分離により分取した。ついで、該沈殿物を0.3mol/Lの塩化ナトリウム水溶液に溶解させ、再び3倍量のエタノールを加えて多糖類を沈殿させた後、沈殿物をイオン交換水に溶解し、粗精製液として回収した。生産されたヒアルロン酸含量は、カルバゾール硫酸法（Anal Biochem. 1962 Oct;4:330-4.）により測定した。

その結果、S. albulus △pls / pDC009-mhasAの培養液中にはヒアルロン酸生産は認められなかったが、S. albulus △pls/ pDC009-mhasA-hasB-sav3561は、培養液pHが4.2付近に低下後、著量のヒアルロン酸を生産し、その生産量は僅か30時間の培養で2.2g/lに達した (図５ａ)。また、ヒアルロン酸合成に消費された培地1LあたりのATP量（ヒアルロン酸生産量から算出）は、S. albulus △pls / pDC009-pls株 においてε-ポリ-L-リジン生産に消費されたそれとほぼ同等であった(図５ｂ，ｃ)。また、この結果はS. albulus細胞内で強力に再生（一部新生も含む）される理論上の利用可能ATPを効率的に利用して、目的化合物であるヒアルロン酸を合成したことを示している。

以上の結果から、本発明が、多段階反応により生合成される有用物質生産、また生合成に間接的にATPを要求する化合物生産においても非常に有効であることが証明された。

ポリリジン、indigoidin、ヒアルロン酸に限らず、本発明のプロモーター及びそれを有する組換えベクター、さらにS. albulusを宿主として用い、更に必要に応じて導入遺伝子のコドン改変及び前駆体供給遺伝子強化など上記の実施例と同様の手法をとることで、あらゆる任意の有用化合物を大量に生産することが可能である。

また、ここに示した物質生産性に関する実施例では、培養-発酵生産過程において、糖質を補給することなく比較的短時間で評価しているが、消費される糖質を持続的にフィードすることで、本発明の有用物質生産法においてもKahar et al.（J Biosci Bioeng. 2001;91(2):190-4.）に記載のε-ポリ-L-リジン生産と同じく8日間程度、目的化合物の生産蓄積を持続することが可能である。

[実施例7] plsプロモーターの宿主適合性
plsプロモーターがS. albulusだけでなく、他の放線菌、特にε-ポリ-L-リジン非生産菌に於いても機能することを次の方法で検証した。
実施例4で構築済みのpDC009-plsを参考資料（Practical Streptomyces Genetics （2000）P.301-302）に記載の方法に従い、Streptomyces lividans TK23株（ε-ポリ-L-リジン非生産放線菌）に導入した。得られた形質転換体を650μg/mlのネオマイシンを含むε-ポリ-L-リジン生産培地（3L容Jar-fermentor）中で30℃/30ｈ好気的に培養した。

培養終了後、実施例4と同様に遠心分離にて回収した菌体15ｇ（湿重量）からHis-tag融合タンパク質精製用クロマトグラフィー担体Ni Sepharose 6 fast flow (GE Healthcare社製)を用いて精製を行い、His-tag融合組換えPlsの発現の有無を確認したところ、S. albulusを宿主とした場合と同じく約1mgの組換えPlsを得ることができた。このように、plsプロモーターを有する発現ベクターは、S. albulus以外の放線菌、且つε-ポリ-L-リジン非生産放線菌に於いても充分に機能し、組換えタンパク質生産に利用可能であった。

また、培養上清のε-ポリ-L-リジン量を特開2008-263868に記載のHPLC法にて定量した結果、培養液中へのε-ポリ-L-リジンの生産蓄積も認められたが、その量は極めて少なく、30ｈ培養で0.1ｇ/ｌの生産性であった。これは宿主として用いたS. lividansの前駆体（L-リジン又はATP）供給能が充分ではないためと考えられる。この結果から任意の有用物質生産においては、宿主としてε−ポリ−L−リジン生産菌（例：S. albulus）を用いることで、より効率的に導入遺伝子産物(酵素タンパク質など)による有用物質の生産を達成できることが確認された。

本発明は、所望の有用物質生産のために有用である。

本発明は、ゲノム解析による遺伝子情報を、有用物質、その合成を触媒する酵素などの生産に繋げるためのツールとなる宿主ベクター系として有用である。

Claims (26)

1. Streptomyces属放線菌において対数増殖期以降に特異的に遺伝子発現を誘導することができるプロモーター。
2. 前記Streptomyces属放線菌が、ε−ポリ−L−リジン生産菌である、請求項１に記載のプロモーター。
3. ε−ポリ−L−リジン生産菌のpls遺伝子の開始コドン（ATG又はGTG）から上流約350-bp以内に存在する、請求項２に記載のプロモーター。
4. 配列番号１、配列番号２、配列番号３、または配列番号４のヌクレオチド配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のプロモーター。
5. 配列番号４のヌクレオチド配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のプロモーター。
6. 請求項１〜５のいずれか一項に記載のプロモーターを含む発現ベクター。
7. ε−ポリ−L−リジン生産菌において目的の遺伝子を発現させるために使用される、請求項６に記載の発現ベクター。
8. 前記ε−ポリ−L−リジン生産菌が、Streptomyces属放線菌、Kitasatospora属放線菌、またはEpichloe属糸状菌である、請求項７に記載の発現ベクター。
9. 前記Streptomyces属放線菌がS.albulusである、請求項８に記載の発現ベクター。
10. ターミネーターを前記プロモーターの下流にさらに含む、請求項６〜９のいずれか一項に記載の発現ベクター。
11. 前記ターミネーターのヌクレオチド配列が、配列番号７または配列番号８のヌクレオチド配列を含む、請求項１０に記載の発現ベクター。
12. タグ配列を前記プロモーターの制御下にさらに含む、請求項１０または１１に記載の発現ベクター。
13. 前記タグ配列が、配列番号９または配列番号１０のヌクレオチド配列を含む、請求項１２に記載の発現ベクター。
14. 前記プロモーターの制御下に目的の遺伝子を含む、請求項６〜１３のいずれか一項に記載の発現ベクター。
15. 前記目的の遺伝子が前記ε−ポリ−L−リジン生産菌と同種または異種の生物由来の遺伝子または遺伝子クラスターである、請求項１４に記載の発現ベクター。
16. 前記目的の遺伝子が、pls遺伝子、bpsA遺伝子、hasA遺伝子、mhasA遺伝子、hasB遺伝子、hasBホモログ遺伝子、hasD遺伝子、またはhasDホモログ遺伝子である、請求項１５に記載の発現ベクター。
17. 配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５のヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
18. 請求項１〜５のいずれか一項に記載のプロモーターおよびその制御下にある目的の遺伝子、または請求項１４〜１６に記載の発現ベクターが導入された宿主細胞。
19. Streptomyces属放線菌、Kitasatospora属放線菌、またはEpichloe属糸状菌である、請求項１８に記載の宿主細胞。
20. ε−ポリ−L−リジン生産菌である、請求項１９に記載の宿主細胞。
21. 宿主細胞において、請求項１〜５のいずれか一項に記載のプロモーターの制御下で目的の遺伝子を発現させることにより、該遺伝子によってコードされるタンパク質またはポリペプチドを生産することを含む、有用物質の生産方法。
22. 請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の発現ベクターを、前記宿主細胞に導入することを含む、請求項２１に記載の方法。
23. 請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養することを含む、有用物質の生産方法。
24. S.albulus、及びその他のε−ポリ−L−リジン生産菌のpls遺伝子欠損又は破壊株を培養することを含む、請求項２１に記載の有用物質の生産方法。
25. 請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の発現ベクターを、前記pls遺伝子欠損又は破壊株に導入することを含む、請求項２４に記載の有用物質の生産方法。
26. 前記有用物質が、１段階または多段階の反応により生合成される化合物である、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の有用物質の生産方法。