JP2008263868A - ポリアミノ酸合成酵素とそれをコードする遺伝子 - Google Patents

ポリアミノ酸合成酵素とそれをコードする遺伝子 Download PDF

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一也 山中
Kichiju Hamano
吉十 濱野
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Abstract

【課題】ポリアミノ酸を効率よく製造する方法を提供すること。
【解決手段】本発明は、リボソーム非依存的ペプチド合成酵素（ＮＲＰＳ）様式でアミノ酸の重合を触媒する酵素およびそれをコードする遺伝子を提供する。
【選択図】なし

Description

本発明は、新規ポリアミノ酸合成酵素とそれをコードする遺伝子に関する。
ポリアミノ酸を合成する方法としては、従来から化学合成によるもの、酵素的に合成するもの等が知られている。
近年、社会的貢献度の高い様々な生理活性ペプチドが見出されている。これらペプチドの合成法として化学合成法と酵素合成法がある。後者では有害な薬品を使用せず製造でき、環境負荷などの問題点も克服可能で、低コスト化も期待できる。
酵素的にポリアミノ酸を合成する方法の１つとして、アスパラギン酸骨格とアルギニン側鎖からなる非タンパク質アミノ酸ポリマーであるシアノフィシン（multi-L-arginyl-poly（L-aspartic acid））を酵素的に合成する方法が知られている（非特許文献１、非特許文献２）。また、ポリ−γ−グルタミン酸を酵素的に合成する方法も報告されている（特許文献３）。
しかし、これらポリアミノ酸の酵素合成は複合酵素系の触媒作用によって達成されるため、制御が難しく、工業生産への応用はなされていない。また、シアノフィシン、ポリ−γ−グルタミン酸の酵素合成を除くと、ジペプチド以上の鎖長の長いオリゴペプチドまたはアミノ酸ホモポリマーを酵素的に合成できた例は無い。
さらに、抗菌性ポリアミノ酸ε−ポリ−Ｌ−リジンの生合成については、微生物発酵法によるものが報告されている（特許文献４）。
Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７，５５６１−５５７０（２０００） ＡＰＰＬ．ＥＮＶＩＲＯＮ．ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ．Ｖｏｌ．６７，Ｎｏ．５，Ｍａｙ ２００１，ｐ．２１７６−２１８２ ＡＰＰＬ．ＥＮＶＩＲＯＮ．ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ．Ｖｏｌ．７０，Ｎｏ．７，Ｊｕｌｙ ２００４，ｐ．４２４９−４２５５ ＡＰＰＬ．ＥＮＶＩＲＯＮ．ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ．Ｖｏｌ．６８，Ｎｏ．７，Ｊｕｌｙ ２００２，ｐ．３５７５−３５８１
このような状況下で、より長鎖の任意アミノ酸ペプチドあるいはアミノ酸類縁体ホモポリマーを効率よく製造する方法が求められている。
本発明者らは、このような要求に応えるため鋭意研究を重ねた結果、Ｌ−リジンの重合を触媒するリボソーム非依存的ペプチド合成酵素（ＮＲＰＳ）を見出した。
したがって、本発明は、以下に示すポリアミノ酸合成酵素、それをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクター、該ポリアミノ酸合成酵素の製造方法、該ポリアミノ酸合成酵素を使用するポリアミノ酸の製造方法、該ポリヌクレオチドの部分配列を含むプライマー、該ポリヌクレオチドもしくはその相補配列にハイブリダイズし得るプローブ、該酵素に対する抗体、該プライマーもしくはプローブもしくは該抗体を使用するポリアミノ酸合成酵素のスクリーニング方法等を提供する。
（１）（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および／もしくは付加を有するアミノ酸配列からなるポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｖ）配列番号１のヌクレオチド配列、
（ｖ）配列番号１のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得る、ポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列、または
（ｖｉ）配列番号１のヌクレオチド配列と６５％以上の同一性を有する、ポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列、
のいずれかを含む、ポリヌクレオチド。
（１ａ）（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および／もしくは付加を有するアミノ酸配列からなるポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列、または
（ｉｉｉ）配列番号１のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列に高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得る、ポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列、
のいずれかを含む、ポリヌクレオチド。
（２）（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列、または
（ｉｉ）配列番号１のヌクレオチド配列、
のいずれかを含む、ポリヌクレオチド。
（３）上記ポリアミノ酸合成酵素が、ポリリジン合成酵素である、上記（１）または（２）に記載のポリヌクレオチド。
（４）ＤＮＡまたはＲＮＡである、上記（１）〜（３）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（５）（ｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列からなる縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインをコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および／もしくは付加を有するアミノ酸配列からなる、縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインをコードするヌクレオチド配列、または
（ｉｉｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインをコードするヌクレオチド配列、
（ｉｖ）配列番号１２、１４、１６、もしくは１８のヌクレオチド配列、
（ｖ）配列番号１２、１４、１６、もしくは１８のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得る、縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインをコードするヌクレオチド配列、または
（ｖｉ）配列番号１２、１４、１６、もしくは１８のヌクレオチド配列と６５％以上の同一性を有する、縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインをコードするヌクレオチド配列、
のいずれかを含む、ポリヌクレオチド。
（５ａ）（ｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および／もしくは付加を有するアミノ酸配列からなるポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列、または
（ｉｉｉ）配列番号１２、１４、１６、もしくは１８のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列に高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得る、ポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列、
のいずれかを含む、ポリヌクレオチド。
（６）（ｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列からなる縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインをコードするヌクレオチド配列、または
（ｉｉ）配列番号１２、１４、１６、もしくは１８のヌクレオチド配列、
のいずれかを含む、ポリヌクレオチド。
（７）ＤＮＡまたはＲＮＡである、上記（５）または（６）に記載のポリヌクレオチド。
（８）（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および／もしくは付加を有するアミノ酸配列、または
（ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
のいずれかを含む、ポリアミノ酸合成酵素。
（８ａ）（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および／もしくは付加を有するアミノ酸配列、または
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
のいずれかを含む、ポリアミノ酸合成酵素。
（９）ポリリジン合成酵素である、上記（８）に記載のポリアミノ酸合成酵素。
（１０）（ｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および／もしくは付加を有するアミノ酸配列、または
（ｉｉｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
のいずれかを含む縮合反応触媒ドメイン。
（１０ａ）（ｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および／もしくは付加を有するアミノ酸配列、または
（ｉｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
のいずれかを含む縮合反応触媒ドメイン。
（１１）上記（１０）に記載の縮合反応触媒ドメインを含むポリアミノ酸合成酵素。
（１２）ポリリジン合成酵素である、上記（１１）に記載のポリアミノ酸合成酵素。
（１３）（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および／もしくは付加を有するアミノ酸配列からなるポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｖ）配列番号１のヌクレオチド配列、
（ｖ）配列番号１のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得る、ポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列、または
（ｖｉ）配列番号１のヌクレオチド配列と６５％以上の同一性を有する、ポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列、
のいずれかを含有する、組換えベクター。
（１３ａ）（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および／もしくは付加を有するアミノ酸配列からなるポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列、または
（ｉｉｉ）配列番号１のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列に高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得る、ポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列、
のいずれかを含有する、組換えベクター。
（１４）（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列、または
（ｉｉ）配列番号１のヌクレオチド配列、
のいずれかを含有する、組換えベクター。
（１５）上記ポリアミノ酸合成酵素が、ポリリジン合成酵素である、上記（１３）または（１４）に記載の組換えベクター。
（１６）（ｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列からなる縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインをコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および／もしくは付加を有するアミノ酸配列からなる、縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインをコードするヌクレオチド配列、または
（ｉｉｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインをコードするヌクレオチド配列、
（ｉｖ）配列番号１２、１４、１６、もしくは１８のヌクレオチド配列、
（ｖ）配列番号１２、１４、１６、もしくは１８のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得る、縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインをコードするヌクレオチド配列、または
（ｖｉ）配列番号１２、１４、１６、もしくは１８のヌクレオチド配列と６５％以上の同一性を有する、縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインをコードするヌクレオチド配列、
のいずれかを含有する、組換えベクター。
（１６ａ）（ｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および／もしくは付加を有するアミノ酸配列からなるポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列、または
（ｉｉｉ）配列番号１２、１４、１６、もしくは１８のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列に高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得る、ポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列、
のいずれかを含有する、組換えベクター。
（１７）（ｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列からなる縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインをコードするヌクレオチド配列、または
（ｉｉ）配列番号１２、１４、１６、もしくは１８のヌクレオチド配列、
のいずれかを含有する、組換えベクター。
（１８）上記（１３）、（１５）、または（１６）に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
（１９）上記（１４）または（１７）に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
（２０）上記（１３）、（１５）、もしくは（１６）のいずれかに記載の組換えベクターまたは上記（１８）に記載の形質転換体を用いる、ポリアミノ酸合成酵素の製造方法。
（２１）上記（１４）もしくは（１７）に記載の組換えベクターまたは上記（１９）に記載の形質転換体を用いる、ポリアミノ酸合成酵素の製造方法。
（２２）（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および／もしくは付加を有するアミノ酸配列、または
（ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
のいずれかを含むポリアミノ酸合成酵素を用いてポリアミノ酸を合成する工程を包含する、ポリアミノ酸の製造方法。
（２２ａ）（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および／もしくは付加を有するアミノ酸配列、または
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
のいずれかを含むポリアミノ酸合成酵素を用いてポリアミノ酸を合成する工程を包含する、ポリアミノ酸の製造方法。
（２３）（ｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および／もしくは付加を有するアミノ酸配列、または
（ｉｉｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
のいずれかを含むポリアミノ酸合成酵素を用いてポリアミノ酸を合成する工程を包含する、ポリアミノ酸の製造方法。
（２３ａ）（ｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および／もしくは付加を有するアミノ酸配列、または
（ｉｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
のいずれかを含むポリアミノ酸合成酵素を用いてポリアミノ酸を合成する工程を包含する、ポリアミノ酸の製造方法。
（２４）上記ポリアミノ酸が、ポリリジンである、上記（２２）または（２３）に記載の方法。
（２５）上記ポリリジンが、ε−ポリ−Ｌ−リジンである、上記（２４）に記載の方法。
（２６）（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および／もしくは付加を有するアミノ酸配列からなるポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
（ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
（ｉｖ）配列番号１のヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
（ｖ）配列番号１のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得る、ポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、または
（ｖｉ）配列番号１のヌクレオチド配列と６５％以上の同一性を有する、ポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
のいずれかにおける少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドからなるプライマー。
（２６ａ）（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および／もしくは付加を有するアミノ酸配列からなるポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、または
（ｉｉｉ）配列番号１のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列に高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得る、ポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
のいずれかにおける少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドからなるプライマー。
（２７）（ｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列からなる縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインをコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
（ｉｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および／もしくは付加を有するアミノ酸配列からなる縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインをコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
（ｉｉｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインをコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
（ｉｖ）配列番号１２、１４、１６、または１８のヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
（ｖ）配列番号１２、１４、１６、または１８のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得る、縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインをコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、または
（ｖｉ）配列番号１２、１４、１６、または１８のヌクレオチド配列と６５％以上の同一性を有する、縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインをコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
のいずれかにおける少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドからなるプライマー。
（２７ａ）（ｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および／もしくは付加を有するアミノ酸配列からなるポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
（ｉｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、または
（ｉｉｉ）配列番号１２、１４、１６、または１８のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列に高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得る、ポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
のいずれかにおける少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドからなるプライマー。
（２８）（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
（ｉｉ）配列番号１のヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
（ｉｉｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列からなる縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインをコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、または
（ｉｖ）配列番号１２、１４、１６、または１８のヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
のいずれかにおける少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドからなるプライマー。
（２９）（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および／もしくは付加を有するアミノ酸配列からなるポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
（ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列
（ｉｖ）配列番号１のヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
（ｖ）配列番号１のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得る、ポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、または
（ｖｉ）配列番号１のヌクレオチド配列と６５％以上の同一性を有する、ポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
のいずれかのヌクレオチド配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得る少なくとも１５ヌクレオチド長のヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチドプローブ。
（２９ａ）（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および／もしくは付加を有するアミノ酸配列からなるポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、または
（ｉｉｉ）配列番号１のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列に高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得る、ポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
のいずれかのヌクレオチド配列に高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得る少なくとも１５ヌクレオチド長のヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチドプローブ。
（３０）（ｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列からなる縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインをコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
（ｉｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および／もしくは付加を有するアミノ酸配列からなる縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインをコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
（ｉｉｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインをコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列
（ｉｖ）配列番号１２、１４、１６、または１８のヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
（ｖ）配列番号１２、１４、１６、または１８のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得る、縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインをコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、または
（ｖｉ）配列番号１２、１４、１６、または１８のヌクレオチド配列と６５％以上の同一性を有する、縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインをコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
のいずれかのヌクレオチド配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得る少なくとも１５ヌクレオチド長のヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチドプローブ。
（３０ａ）（ｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および／もしくは付加を有するアミノ酸配列からなるポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
（ｉｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、または
（ｉｉｉ）配列番号１２、１４、１６、または１８のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列に高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得る、ポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
のいずれかのヌクレオチド配列に高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得る少なくとも１５ヌクレオチド長のヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチドプローブ。
（３１）（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
（ｉｉ）配列番号１のヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
（ｉｉｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列からなる縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインをコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、または
（ｉｖ）配列番号１２、１４、１６、または１８のヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
のいずれかのヌクレオチド配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得る少なくとも１５ヌクレオチド長のヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチドプローブ。
（３２）（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および／もしくは付加を有するアミノ酸配列、または
（ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
のいずれかを含むポリアミノ酸合成酵素に特異的に結合する、抗体。
（３３）（ｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および／もしくは付加を有するアミノ酸配列、または
（ｉｉｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
のいずれかを含む縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインまたは該ドメインを含むポリアミノ酸合成酵素に特異的に結合する、抗体。
（３４）上記（２６）〜（２８）のいずれかに記載のプライマーを使用する、ポリアミノ酸合成酵素をコードするポリヌクレオチドのスクリーニング方法。
（３５）さらに上記（２９）〜（３１）のいずれかに記載のプローブを使用する、上記（３４）に記載のスクリーニング方法。
（３６）上記（３２）または（３３）に記載の抗体を使用する、ポリアミノ酸合成酵素のスクリーニング方法。
本発明によりポリアミノ酸（例：ε−ポリ−Ｌ−リジン）を酵素的に合成することがきる。酵素的合成法は、微生物発酵法や化学合成法よりも省エネルギーであり、望ましくない副反応も抑えられるため、高純度のポリアミノ酸を製造することが可能であるという利点がある。さらに、シアノフィシン、ポリ−γ−グルタミン酸を含む微生物により生産されるペプチドやポリアミノ酸の多くは、複合酵素系の触媒作用で生合成されるため、酵素的工業生産は難しいが、本発明のポリアミノ酸合成酵素は、単一のチオテンプレート型リボソーム非依存的ペプチド合成酵素（ＮＲＰＳ）であるため、制御が容易で酵素的工業生産に適している、という利点がある。
斯くして、本発明は、従来よりもさらに効率よくポリアミノ酸を製造する方法を提供することができる。さらに、本発明のポリヌクレオチド含有組換えベクターおよび形質転換体を使用することで、様々な有用ポリアミノ酸生合成への応用が可能である。
本発明者らは、ε−ポリ−Ｌ−リジン生産菌ストレプトミセス・アルブラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｕｌｕｓ）ＩＦＯ１４１４７株から膜結合型のε−ポリ−Ｌ−リジン生合成酵素を単離精製し、そのアミノ酸配列（配列番号２）およびそれをコードする遺伝子の塩基配列（配列番号１）を決定した。本発明のε−ポリ−Ｌ−リジン生合成酵素のアミノ酸配列およびＤＮＡ配列を、ＮＣＢＩ配列データベースで相同性検索すると、アミノ酸配列では最も高いもので54.1％同一（77.3％類似）、ＤＮＡ配列では最も高いもので64.2％同一、局部的（重要ドメイン（470位〜795位）の領域）において８０％以上同一）のものが存在した。
本発明の１つの実施形態では、ポリリジン生合成酵素およびそれをコードする遺伝子が提供される。また、本発明の酵素は、ＮＲＰＳとしてはこれまでに知られていない唯一の膜酵素である。したがって、本発明のさらなる実施形態では、膜結合型のＮＲＰＳが提供される。
これまでに、医薬へも応用可能な生理活性を有する微生物生産ペプチドが多数見出されており、これらペプチドの多くは、非リボソーム型ペプチド合成酵素（NRPS, non-ribosomal peptide synthetase）と呼ばれる多モジュール複合酵素の触媒作用により生合成される。
ＮＲＰＳはアミノ酸の活性化を触媒するアデニレーションドメイン（A-Domain）、ペプチジルキャリヤードメイン又はチオレーションドメイン（PCP-Domain）と呼ばれるアミノ酸あるいはペプチド中間体分子を結合するドメイン、そして基質の縮合を触媒するコンデンセーションドメイン（C-Domain）、生合成の最終ステップであるペプチドの環状化やNRPSからのペプチドの遊離に関与するチオエステラーゼドメイン（TE-Domain）からなるモジュールを基本単位として構成されている（図１)。チオレーションドメインにはアミノ酸や中間体を結合するための補助因子である4’-ホスホパンテテイン（P-pant）アームが結合している（不図示)。モジュールにはさらにエピメリ化やメチル化などペプチドの修飾に係わるドメインが付加されている場合もある。
ＮＲＰＳの各ドメインにはペプチド合成酵素に共通して保存されている領域が複数あり、例えば、ミクロシスチン生合成遺伝子は、これらの塩基配列情報をもとにPCR増幅により得られた断片をプローブとしてクローニングされている。
本発明のポリリジン生合成酵素においても、データベース、例えばＣＤＤ（Conserved Domain Database：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml/）などの類似のドメイン構造をもつタンパク質との構造比較から機能予測する解析ツールを用いて解析すると、多くのNRPS同様にN末端にはA-Domain、ペプチド中間体分子を結合するPCP-Domainの存在が確認された。しかしながら、Ｃ末端側約７００アミノ酸残基は、従来のいずれのC-DomainやTE-Domainとも全く相同性の無い新規（未知）ドメインであることが明らかとなった。また、従来のＮＲＰＳは多モジュール複合酵素であるが、本酵素の構造はドメイン構造解析及び酵素精製の結果から、単一モジュール単一酵素であることが強く示唆された。このように本発明の酵素においては、単一モジュールのみでポリアミノ酸合成が達成されることから、Ｃ末端側７００アミノ酸残基の新規ドメインは、「繰り返し縮合反応」を触媒すると考えられる。したがって、本発明の１つの実施形態では、上記Ｃ末端側の約７００アミノ酸残基を含むポリリジン生合成酵素が提供される。
さらに、従来のＮＲＰＳは何れも細胞質（可溶性画分）に局在するが、本酵素はＮＲＰＳとしてはこれまでに知られていない唯一の膜酵素であり、膜結合（膜貫通）領域もC末端新規ドメインに存在すると考えられた。そこで、アミノ酸配列から膜タンパク質などの二次構造の予測を行う解析ツールを用いて、本発明の酵素のＣ末端新規ドメインを更に詳細に解析した。SOSUI（http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/）によれば、予想されたとおりC末端新規ドメインには6箇所の膜貫通領域と推定される領域が確認され、「繰り返し縮合反応」を触媒すると考えられる新規ドメインは3つのサブドメインＩＣ１、ＩＣ２及びＩＣ３−Ｄｏｍａｉｎから構成される可能性が示唆された（図１Ｂおよび図２）。したがって、本発明の別の実施形態では、上記３つのサブドメインのいずれかを含むポリリジン生合成酵素が提供される。
以下、本発明について詳細に説明する。
１．本発明のポリアミノ酸合成酵素およびそれをコードするポリヌクレオチド
本発明は、ポリアミノ酸合成酵素およびそれをコードする遺伝子を提供する。具体的には、本発明は、（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および／もしくは付加を有するアミノ酸配列、または（ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、のいずれかを含む、ポリアミノ酸合成酵素を提供する。
本発明はまた、（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および／もしくは付加を有するアミノ酸配列、または（ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、のいずれかからなるポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、（ｉ）配列番号１のヌクレオチド配列、（ｉｉ）配列番号１のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得る、ポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列、または（ｉｉｉ）配列番号１のヌクレオチド配列と６５％以上の同一性を有する、ポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列、のいずれかを含む、ポリヌクレオチドを提供する。
好ましい実施形態において、上記ポリアミノ酸合成酵素は、ポリリジン合成酵素であり、さらに好ましくは、ε−ポリ−Ｌ−リジン合成酵素である。上記ポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得、好ましくは、ＤＮＡである。
また、本明細書中、「本発明のポリアミノ酸合成酵素」という場合、（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリアミノ酸合成酵素のみならず、配列番号２のアミノ酸配列と高い相同性を有するアミノ酸配列からなるポリアミノ酸合成酵素、例えば、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および／もしくは付加を有するアミノ酸配列からなるポリアミノ酸合成酵素、および（ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列と高い（例：約６０％以上の）同一性を有するアミノ酸配列からなるポリアミノ酸合成酵素も含むものとする。また、ポリアミノ酸合成酵素の酵素活性は、例えば、川合らの方法（Biochem Biophys Res Commun. 2003 Nov 21;311(3):635-40）などによって測定および／または確認することができる。
「配列番号２のアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および／もしくは付加を有するアミノ酸配列からなるポリアミノ酸合成酵素」の例としては、配列番号２のアミノ酸配列において、例えば、１〜５０個、１〜４０個、１〜３９個、１〜３８個、１〜３７個、１〜３６個、１〜３５個、１〜３４個、１〜３３個、１〜３２個、１〜３１個、１〜３０個、１〜２９個、１〜２８個、１〜２７個、１〜２６個、１〜２５個、１〜２４個、１〜２３個、１〜２２個、１〜２１個、１〜２０個、１〜１９個、１〜１８個、１〜１７個、１〜１６個、１〜１５個、１〜１４個、１〜１３個、１〜１２個、１〜１１個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個（１〜数個）、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、１個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリアミノ酸合成酵素が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の数は、一般的には小さい程好ましい。
「配列番号２のアミノ酸配列と高い同一性を有するアミノ酸配列からなるポリアミノ酸合成酵素」の例としては、配列番号２のアミノ酸配列と約６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、または９９．９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリアミノ酸合成酵素が挙げられる。上記同一性の数値は一般的に大きい程好ましい。なお、本明細書中、用語「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」と「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」とは区別して用いるものとする。例えば、アミノ酸配列間のホモロジー（相同性）をいう場合、同じ性質を持つアミノ酸（グルタミン酸とアスパラギン酸など）はひとつのグループとして扱うが、同一性を考える場合は区別される。すなわち、同一性は一致性をさす。
本明細書中、ヌクレオチド配列について「ハイブリダイズする」とは、ヌクレオチド配列同士の相補性が高い場合、二本鎖を形成することをいう。通常、二本鎖は、互いの核酸が相補的になるように設計されているが、必要に応じて（例えば、核酸を検出に使用する場合は、その目的上、問題が生じない範囲において）、その核酸中に、１または数個（例えば、２〜３個）のミスマッチを含んでいてもよい。存在してもよいミスマッチの数は、例えば、要求される検出精度、ヌクレオチド配列（または塩基配列もしくは核酸（配列）もしくはポリヌクレオチド）の長さに応じて変化し得る。なお、ヌクレオチド配列と、それがハイブリダイズする相手のヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーション条件を適宜変更することにより、ミスマッチが存在する場合を排除したり、許容できるミスマッチの数を調整したりすることができることは当業者に周知である。
ハイブリダイゼーションの方法としては、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法またはサザンハイブリダイゼーション法などを用いることができる（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ３ｒｄ Ｅｄ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９８７−１９９７を参照）。
本明細書中、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、５０％（ｗ／ｖ）ホルムアミド、３２℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、５０％（ｗ／ｖ）ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、５０％（ｗ／ｖ）ホルムアミド、５０℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い同一性を有するＤＮＡが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、核酸の濃度、核酸の長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えば、Ａｌｋｐｈｏｓ Ｄｉｒｅｃｔ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（アマシャムファルマシア社製）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコルにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを５５℃の条件下で０．１％ （ｗ／ｖ） ＳＤＳを含む１次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたポリヌクレオチドを検出することができる。
所望のヌクレオチド配列（例えば、配列番号１のヌクレオチド配列）に「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチド配列」の例としては、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどの相同性（または同一性）検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメーターを用いて計算したときに、該所望のヌクレオチド配列と約６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、９９．９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列をあげることができる。
なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８７， ２２６４−２２６８， １９９０； Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０， ５８７３， １９９３）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ， ｅｔ ａｌ： Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５： ４０３， １９９０）。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴＸを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いことができる。
２．本発明のポリアミノ酸合成酵素のＣ末端ドメインおよびそれをコードするポリヌクレオチド
従来のＮＲＰＳは多モジュール複合酵素の触媒作用でペプチド又はポリアミノ酸を重合するが、本発明のポリアミノ酸合成酵素は、ドメイン構造解析及び酵素精製の結果から、単一モジュール単一酵素であることが強く示唆される（図１ＡおよびＢを参照）。本発明のポリアミノ酸合成酵素においては、単一モジュールのみでポリアミノ酸合成が達成されることから、本発明のＣ末端側約７００アミノ酸残基の新規ドメインは、「繰り返し縮合反応」を触媒すると考えられる。また、ＣＤＤなどのタンパク質構造解析ツールを用いて解析した結果、上記Ｃ末端ドメインには、３つのサブドメインとそれらの境界に６つの膜貫通領域が存在することが推定された（図１Ｂを参照）。
したがって、本発明はまた、別の実施形態において、本発明のポリアミノ酸合成酵素のＣ末端側約７００アミノ酸残基を含有するＣ末端ドメイン（以下、「縮合反応触媒ドメイン」と呼ぶ。）、および縮合反応触媒ドメインを含むポリアミノ酸合成酵素、ならびに該ドメインおよび該酵素をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを提供する。なお、本明細書中で単に「縮合反応触媒ドメイン」という場合、ポリアミノ酸合成酵素の縮合反応触媒ドメインを意味するものとする。
本発明の縮合反応触媒ドメインは、代表的には、図２Ａ−Ｄおよび図３Ａ−Ｄに示されるように、配列番号２で表される本発明のε−ポリ−Ｌ−リジン合成酵素のアミノ酸配列のほぼ６１１位〜１３１９位に相当するアミノ酸配列（塩基配列においては１８３１位〜３９５７位）を含むポリペプチドからなる機能的ドメインであり、そのアミノ酸配列およびそれをコードする塩基配列は、それぞれ配列番号１３および配列番号１２で表される。また、このドメインを構成する３つのより小さいドメイン（ＩＣ１、ＩＣ２及びＩＣ３−Ｄｏｍａｉｎ）は、代表的には、それぞれ配列番号２で表される本発明のε−ポリ−Ｌ−リジン合成酵素のアミノ酸配列のほぼ６７６位〜８４７位、９１４位〜１０８３位、および１１４７位〜１２９９位のアミノ酸配列の領域に相当する（塩基配列においては、それぞれ２０２６位〜２５４１位、２７４０位〜３２４９位、および３４３９位〜３８９７位）。これら３つのサブドメインのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１５、１７、および１９で表され、これらのアミノ酸配列をコードする塩基配列はそれぞれ配列番号１４、１６、および１８で表される。
本明細書中、「本発明の縮合反応触媒ドメイン」という場合、（ｉ）配列番号１３のアミノ酸配列からなる縮合反応触媒ドメインのみならず、配列番号１３のアミノ酸配列と高い相同性を有するアミノ酸配列からなる縮合反応触媒ドメイン、例えば、（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および／もしくは付加を有するアミノ酸配列からなる縮合反応触媒ドメイン、および（ｉｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列と高い（例：約６０％以上の）同一性を有するアミノ酸配列からなる縮合反応触媒ドメインも含むものとする。
また、本明細書中、「本発明の（縮合反応触媒ドメインの）サブドメイン」という場合、（ｉ）配列番号１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列からなる（縮合反応触媒ドメインの）サブドメインのみならず、配列番号１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列と高い相同性を有するアミノ酸配列からなる（縮合反応触媒ドメインの）サブドメイン、例えば、（ｉｉ）配列番号１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および／もしくは付加を有するアミノ酸配列からなる（縮合反応触媒ドメインの）サブドメイン、および（ｉｉｉ）配列番号１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列と高い（例：約６０％以上の）同一性を有するアミノ酸配列からなる（縮合反応触媒ドメインの）サブドメインも含むものとする。
したがって、本発明はまた、（ｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および／もしくは付加を有するアミノ酸配列、または（ｉｉｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、のいずれかを含む縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメイン、および該ドメインを含むポリアミノ酸合成酵素を提供する。なお、縮合反応が起きているか否かは、例えば、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳなどで重合物（酵素反応生成物）を検出することによって確認することができる。
本発明はまた、（ｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および／もしくは付加を有するアミノ酸配列、または（ｉｉｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、のいずれかからなる縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメイン、または該ドメインを含むポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、（ｉ）配列番号１２、１４、１６、もしくは１８のヌクレオチド配列、（ｉｉ）配列番号１２、１４、１６、もしくは１８のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得る、縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインをコードするヌクレオチド配列、または（ｉｉｉ）配列番号１２、１４、１６、もしくは１８のヌクレオチド配列と６５％以上の同一性を有する、縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインをコードするヌクレオチド配列、のいずれかを含むポリヌクレオチドを提供する。
「配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および／もしくは付加を有するアミノ酸配列からなる縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインまたは該ドメインを含むポリアミノ酸合成酵素」の例としては、配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列において、例えば、１〜５０個、１〜４０個、１〜３９個、１〜３８個、１〜３７個、１〜３６個、１〜３５個、１〜３４個、１〜３３個、１〜３２個、１〜３１個、１〜３０個、１〜２９個、１〜２８個、１〜２７個、１〜２６個、１〜２５個、１〜２４個、１〜２３個、１〜２２個、１〜２１個、１〜２０個、１〜１９個、１〜１８個、１〜１７個、１〜１６個、１〜１５個、１〜１４個、１〜１３個、１〜１２個、１〜１１個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個（１〜数個）、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、１個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインまたは該ドメインを含むポリアミノ酸合成酵素が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の数は、一般的には小さい程好ましい。
「配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列と高い同一性を有するアミノ酸配列からなる縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインまたは該ドメインを含むポリアミノ酸合成酵素」の例としては、配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列と約６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、または９９．９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインまたは該ドメインを含むポリアミノ酸合成酵素が挙げられる。上記同一性の数値は一般的に大きい程好ましい。なお、本明細書中、用語「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」と「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」とは区別して用いるものとする。例えば、アミノ酸配列間のホモロジー（相同性）をいう場合、同じ性質を持つアミノ酸（グルタミン酸とアスパラギン酸など）はひとつのグループとして扱うが、同一性を考える場合は区別される。すなわち、同一性は一致性をさす。
「配列番号１２、１４、１６、または１８のヌクレオチド配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチド配列」の例としては、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどの相同性（または同一性）検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメーターを用いて計算したときに、該所望のヌクレオチド配列と約６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、９９．９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列をあげることができる。
３．本発明の組換えベクター、形質転換体、およびそれらを用いるポリアミノ酸合成酵素の製造方法
本発明はまた、本発明のポリアミノ酸合成酵素をコードするポリヌクレオチドを挿入物として含有する組換えベクターに関する。具体的には、本発明は、（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および／もしくは付加を有するアミノ酸配列、または（ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、のいずれかからなるポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列を含有する、組換えベクターを提供する。
さらに本発明は、（ｉ）配列番号１のヌクレオチド配列、（ｉｉ）配列番号１のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得る、ポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列、または（ｉｉｉ）配列番号１のヌクレオチド配列と６５％以上の同一性を有する、ポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列、のいずれかからなるポリヌクレオチドを含有する、組換えベクターを提供する。
さらに本発明は、本発明の縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインをコードするポリヌクレオチドまたは該縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインを含むポリアミノ酸合成酵素をコードするポリヌクレオチドを挿入物として含有する組換えベクターに関する。具体的には、本発明は、（ｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および／もしくは付加を有するアミノ酸配列、または（ｉｉｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、のいずれかからなる縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインをコードするポリヌクレオチドまたは該縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインを含むポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列を含有する、組換えベクターを提供する。
さらに本発明は、（ｉ）配列番号１２、１４、１６、または１８のヌクレオチド配列、（ｉｉ）配列番号１２、１４、１６、または１８のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得る、縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインをコードするヌクレオチド配列、または（ｉｉｉ）配列番号１２、１４、１６、または１８のヌクレオチド配列と６５％以上の同一性を有する、縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインをコードするヌクレオチド配列、のいずれかからなるポリヌクレオチドを含有する、組換えベクターを提供する。
本発明の好ましい態様において、組換えベクターは、その挿入物を発現させ得る組換え発現ベクターである。そのような組換えベクターは、当該技術分野における公知の任意の方法で作製することができる。
本発明において、本発明のポリアミノ酸合成酵素を発現させるために用いるベクターには、無細胞発現系（インビトロ トランスクリプション−トランスレーション）に、および宿主細胞、例えば大腸菌、酵母または動物培養細胞を用いるタンパク質発現系に適するベクターとすることができ、そのようなベクターは市販されているかまたは公知のベクターから容易に作製することができる。例えば、インビトロトランスレーションおよび動物培養細胞における発現に用いるベクターは、ヒトサイトメガロウイルスのimmeadiate-early エンハンサー／プロモター領域を組込み、その下流域にＴ７のプロモター配列／マルチクローニング部位を有するｐＴａｒｇｅｔＴベクターやＳＶ４０エンハンサーとＳＶ４０のｅａｒｌｙプロモターを有するｐＳＩベクター（プロメガ社）、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＭＶ−ＴａｇおよびｐＢＫ−ＲＳＶ（ストラタジーン社）などである。また、大腸菌、酵母などの微生物宿主における発現に適するベクターは、例えば大腸菌系のＴ７のプロモターを有するｐＥＴシリーズベクター発現システム（例えばｐＥＴ３ａ，ｐＥＴ２７ｂ（＋）やｐＥＴ２８ａ（＋）；ノバジェン社）、および酵母系においてはアルコールオキシダーゼのプロモターを有するピチア発現系ベクターｐＩＣシリーズベクター（例えばｐＰＩＣ９ＫやＰＩＣ３.５Ｋ；インビトロゲン社）などである。
また、精製のためのペプチド配列としては、当該技術分野にて用いられているペプチド配列とすることができるが、例えば、ヒスチジン残基が４個以上、好ましくは６個以上連続したヒスチジンタグ配列、モノクローナル抗体への結合能を持つエピトープタグ配列、グルタチオンＳ−トランストランスフェラーゼのグルタチオンへの結合ドメインまたはプロテインＡをコードする配列などが包含される。これらペプチド配列をコードするＤＮＡを挿入物として含有するベクターは市販されている。例えば、大腸菌、酵母などの微生物宿主に用いるベクターは、大腸菌系のＴ７のプロモターを有し、ヒスチジン残基を１０個をアミノ末端に融合発現ベクター（例えばｐＥＴ１６ｂ；ノバジェン社）、ヒスチジン残基を６個をアミノ末端に有する発現ベクター（例えばｐＨＢ６；ロッシュダイアグノスチィック社、pＴｒｃ−Ｈｉｓシリーズベクター；インビトロゲン社、ｐＨＡＴベクターシリーズ；クローンテック社）などである。動物培養細胞における発現に用いるベクターは、ヒスチジン残基６個をアミノ末端に融合発現するベクター（例えば、ｐＨＭ６やｐＶＭ６；ロッシュダイアグノスチィック社）の使用が可能である。昆虫培養細胞系ではバキュロウイルス系のヒスチジン残基６個をアミノ末端に融合発現するベクター（例えば、pＢａｃPＡK−Ｈｉｓベクター；クローンテック社）。また、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼと融合発現するpＧＥＸシリーズベクター（ファルマシア）、プロテインＡを発現するｐＲＩＴ２またはｐＥＺＺ１８ベクター（ファルマシア）が使用可能である。
本発明のポリアミノ酸合成酵素を製造するためのインビトロトランスレーションは、公知の方法、例えばSpirin, A.S., et.al., Science 242: 1162-1164(1988年)および Patnaik, R. & Swartz, J.M. Biotechniques 24: 862-868(1998年)に記載の方法で実施することができ、市販のインビトロトランスレーションキット（例えば、ＴＮＴ−インビトロトランスクリプション−トランスレーションキット、プロメガ社製）を用いてもよい。
本発明または、上述の組換えベクターで形質転換した形質転換体（例えば、宿主細胞（例：微生物（大腸菌、酵母など））および動物培養細胞（昆虫培養細胞、哺乳類培養細胞（例：ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ７細胞）））に関する。
本発明はまた、上記本発明の組換えベクターまたは上記本発明の形質転換体を用いるポリアミノ酸合成酵素の製造方法に関する。本発明のポリアミノ酸合成酵素の製造方法は、例えば、本発明の組換え発現ベクターを用いてインビトロトランスクリプション−トランスレーションを実施することからなる。あるいは、上記組換え発現ベクターで形質転換した宿主細胞を培養し、所望のタンパク質を単離することからなる。
本発明のポリアミノ酸合成酵素の製造方法において、発現させたタンパク質は、宿主細胞の培養後、その培地からまたは菌体の可溶性画分から単離することができる。
本発明のポリアミノ酸合成酵素の製造方法において、発現させたタンパク質は公知の方法により単離・精製されるが、その精製法としては公知の任意の方法から適宜選択することができる。例えば、本発明のポリアミノ酸合成酵素が上述した精製のためのペプチド配列を包含する場合、これを用いて精製するのが好ましい。具体的には、ヒスチジンタグ配列にはニッケルキレートアフィニティークロマト法、Ｓ−トランストランスフェラーゼのグルタチオンへの結合ドメインにはグルタチオン結合ゲルによるアフィニティークロマト法、プロテインＡまたは他のタンパク質の配列の場合には抗体アフィニティークロマト法を用いることができる。
４．本発明のポリアミノ酸製造方法
本発明はまた、本発明のポリアミノ酸の製造方法に関する。具体的には、本発明は、
（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および／もしくは付加を有するアミノ酸配列、または
（ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
のいずれかを含むポリアミノ酸合成酵素を用いてポリアミノ酸を合成する工程を包含する、ポリアミノ酸の製造方法を提供する。
本発明はまた、
（ｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および／もしくは付加を有するアミノ酸配列、または
（ｉｉｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
のいずれかを含むポリアミノ酸合成酵素を用いてポリアミノ酸を合成する工程を包含する、ポリアミノ酸の製造方法を提供する。
好ましくは、上記ポリアミノ酸は、ポリリジンであり、より好ましくは、ε−ポリ−Ｌ−リジンである。
本発明のポリアミノ酸の製造方法は、上記ポリアミノ酸合成酵素を利用して、その存在下に、アミノ酸を反応させることにより実施される。ここで、反応させるアミノ酸としては、代表的には、Ｌ−リジンを例示できるが、これのみに限定されず、例えば、Ｌ-リジンエチルエステル、Ｌ-リジンメチルエステル（生成物は共にε−ポリ−Ｌ−リジン）等も本発明のアミノ酸合成酵素によるポリアミノ酸合成に使用し得る。また、Ｄ−リジン、ＤＬ−５−ヒドロキシ−リジン、Ｎε−メチル−Ｌ−リジン、Ｌ−リジン−ヒドロキサム酸、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン等も本発明のポリアミノ酸の製造方法において使用できる可能性がある。
本発明のポリアミノ酸合成方法における上記酵素によるアミノ酸の重合反応は、反応の至適ｐH、7〜９付近であるのが好ましい。
本発明のポリアミノ酸合成酵素の添加配合量は、特に限定はない。一般に本発明のポリアミノ酸合成酵素の添加配合量は、原料アミノ酸１ｇから数時間（例：２〜５時間）の反応で重合物を得るためには、通常約１万単位以上、好ましくは約２万〜４万単位の範囲、より好ましくは、約３万単位から選択されるのが望ましい。また上記反応の温度は、酵素が作用できる限り特に限定はされず、例えば１５℃程度の低温でも反応は進行するが、酵素が効率よく、かつ安定に作用することを前提として、通常約２０〜４０℃程度の温度で行われるのが望ましい。反応時間は用いるアミノ酸の濃度、酵素添加量等に応じて適宜決定できるが、通常０．５〜５時間程度、長くとも２４時間以内とするのが適当である。
このようにして得られたポリアミノ酸は、典型的には、重合度３〜１００ｍｅｒ、平均分子量403〜21835である。好ましくは、重合度は４〜５０ｍｅｒ、より好ましくは、４〜２０ｍｅｒであり、平均分子量は、好ましくは、531〜6427、より好ましくは、531〜2581である。
本発明によって得られるポリアミノ酸は、抗菌剤等として使用することができ、トイレタリー用品、化粧品、飼料添加物、医薬、農薬、食品添加物、電子材料等の様々な用途に使用することができる。
５．本発明のプライマーおよびプローブならびにこれらを用いたスクリーニング方法
本発明のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）の部分断片は、例えば、これをプローブ、またはＰＣＲプライマーとして用いることにより、本発明のポリアミノ酸合成酵素またはそれをコードするポリヌクレオチドの相同体をスクリーニングするために使用することができる。
したがって、本発明は、
（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および／もしくは付加を有するアミノ酸配列からなるポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
（ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
（ｉｖ）配列番号１のヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
（ｖ）配列番号１のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得る、ポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、または
（ｖｉ）配列番号１のヌクレオチド配列と６５％以上の同一性を有する、ポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
のいずれかにおける少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドからなるプライマーも提供する。
また、本発明は、
（ｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列からなる縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインをコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
（ｉｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および／もしくは付加を有するアミノ酸配列からなる縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインをコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
（ｉｉｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインをコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
（ｉｖ）配列番号１２、１４、１６、または１８のヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
（ｖ）配列番号１２、１４、１６、または１８のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得る、縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインをコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、または
（ｖｉ）配列番号１２、１４、１６、または１８のヌクレオチド配列と６５％以上の同一性を有する、縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインをコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
のいずれかにおける少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドからなるプライマーも提供する。
本発明はまた、
（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および／もしくは付加を有するアミノ酸配列からなるポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
（ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列
（ｉｖ）配列番号１のヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
（ｖ）配列番号１のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得る、ポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、または
（ｖｉ）配列番号１のヌクレオチド配列と６５％以上の同一性を有する、ポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
のいずれかのヌクレオチド配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得る少なくとも１５ヌクレオチド長のヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチドプローブを提供する。
本発明はまた、
（ｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列からなる縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインをコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
（ｉｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および／もしくは付加を有するアミノ酸配列からなる縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインをコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
（ｉｉｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインをコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列
（ｉｖ）配列番号１２、１４、１６、または１８のヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
（ｖ）配列番号１２、１４、１６、または１８のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得る、縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインをコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、または
（ｖｉ）配列番号１２、１４、１６、または１８のヌクレオチド配列と６５％以上の同一性を有する、縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインをコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
のいずれかのヌクレオチド配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得る少なくとも１５ヌクレオチド長のヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチドプローブを提供する。
本発明はまた、上記のプライマーを使用する、ポリアミノ酸合成酵素をコードするポリヌクレオチドのスクリーニング方法を提供する。好ましくは、該スクリーニング方法は、さらに上記のプローブを使用する。
本発明のプライマーまたはプローブは、具体的には、例えば検体中の本発明のポリアミノ酸合成酵素の相同体の存在を、上記プライマーおよび／またはプローブを用いたノーザンハイブリダイゼーションや半定量的なリバースＰＣＲ（Ｓｏｕｒｖｉｎｏｓ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１８，４９６８，（１９９９））により解析したり、あるいは検体中の本発明のポリアミノ酸合成酵素をコードする遺伝子の変異の有無や、変異の位置をＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８６，２７６６，（１９８９））等で検知することに用いることができる。
プライマーまたはプローブの大きさは、上記解析または検知が可能な長さであれば特に制限されないが、通常、プライマーとしては約１０〜１００、より好ましくは、約１５〜８０、より好ましくは、約２０〜６０、最も好ましくは、約２０〜４０ヌクレオチド長の長さのものが用いられ、プローブとしては、例えば、約１０〜１０００、約１５〜１５００、好ましくは、約２０〜１０００、より好ましくは、約３０〜８００、より好ましくは、約５０〜７００、さらに好ましくは約１００〜５００、最も好ましくは、約２００〜５００ヌクレオチド長のものが用いられ得る。
本発明のプライマーが用いられる増幅法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ; Saiki et al.，1988）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ; Landgren et al.，1988; Wu & Wallace，1989; Barany，1991）、核酸配列をベースとする増幅（ＮＡＳＢＡ; Guatelli et al.，1990; Compton，1991）、転写をベースとする増幅システム（ＴＡＳ; Kwoh et al.，1989）、鎖置換増幅（ＳＤＡ; Duck，1990; Walker et al.，1992）またはＱβレプリカーゼによる増幅（Lizardi et al.，1988; Lomeli et al.，1989）、プライマー伸長を用いて核酸分子を増幅させるための他の適切な方法等であり得る。増幅の間、増幅産生物は、好都合には、標識プライマーを用いるかまたは標識ヌクレオチドを取り込むことによって標識することができる。標識は、同位体（32Ｐ、35Ｓなど）であってもまたは非同位体（ビオチン、ジゴキシゲニンなど）であってもよい。増幅反応は、２０〜７０回、好都合には、２５〜４５回繰り返す。
６．本発明の抗体
本発明はまた、抗原として本発明のポリアミノ酸合成酵素またはその断片を抗原として作製され、かつ該抗原と特異的に結合する抗体、例えばポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体に関する。具体的には、本発明は、
（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および／もしくは付加を有するアミノ酸配列、または
（ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
のいずれかを含むポリアミノ酸合成酵素に特異的に結合する、抗体を提供する。
本発明はまた、
（ｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および／もしくは付加を有するアミノ酸配列、または
（ｉｉｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
のいずれかを含む縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインまたは該ドメインを含むポリアミノ酸合成酵素に特異的に結合する、抗体を提供する。
本発明のポリアミノ酸合成酵素に特異的に結合する抗体は、本発明のポリアミノ酸合成酵素を抗原として用い、当業者に公知の抗体（または抗血清）製造法に従って製造することができる。抗原として、抽出した天然のタンパク質、組換えタンパク質、これらのタンパク質の部分的分解物、または本発明のポリアミノ酸合成酵素のアミノ酸配列に基づく合成ペプチドを用いることができる。そのような抗原は、例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列の少なくとも５個の連続したアミノ酸配列、好ましくは１０〜１５アミノ酸残基からなるポリペプチドである。本発明の抗体は、常法（例えば、Harlow, E. &Lane, D, in Antibodies-Laboratory manual Cold Spring Harbor LaboratoryPress., pp53-138 (1988年)）に従って作製することができる。
本発明の抗体は、本発明のポリアミノ酸合成酵素、ならびに該タンパク質と配列相同性のある他のポリアミノ酸合成酵素の検出および検索に使用することができる。本発明のスクリーニング方法によれば、分類上に近種ポリアミノ酸合成酵素を容易に取得することが可能である。
上述のスクリーニング方法は、例えば他のポリアミノ酸合成酵素を包含している他の生物もしくはその組織の粗抽出物を試料として、本発明の抗体が結合するタンパク質を検出・検索することからなる。そのような検出手段としては、例えばイムノブロット、イムノアフィ二ティクロマトグラフィーを挙げることができる。また、他のポリアミノ酸合成酵素を包含している他の生物もしくはその組織のＤＮＡライブラリーについて、本発明の抗体を用いてエクスプレッション クローニング（Sambrook, J., Fritsch,E.F., & Maniatis,T., Molecular Cloning − a Laboratory Mannual, second edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. pp12.3-12.44 (1989年)）を実施して、新規なポリアミノ酸合成酵素をコードするＤＮＡを直接得ることができる。
以下では、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
実施例１ ε-ポリ-L-リジン生産菌ストレプトミセス・アルブラス（Streptomyces albulus）IFO14147株からのε-ポリ-L-リジン生合成酵素の精製及び酵素科学的性質検討
（1）ε-ポリ-L-リジン生産株ストレプトミセス・アルブラスIFO14147株の培養
本菌の培養はM3G培地（グルコース5%、酵母エキス0.5%、硫酸アンモニウム1%、K2HPO4 0.08%、KH2PO4 0.136%、MgSO4・7H2O 0.05%、ZnSO4・7H2O 0.004%、FeSO4・7H2O 0.003%（pH 6.8））で行なった。３０℃で２０時間好気的に培養して得た100ｍｌの前培養液を2Lの培地に加え、3L容ジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ社製）を使用して30℃、500rpm、通気量2.5L/minで好気的に培養した。菌体の増殖に伴って培養液のｐHは徐々に低下したため、ε-ポリ-L-リジン生産に適したｐH4.2に達した時点から10%アンモニア水を添加して培養液pHを4.2に維持した。32時間培養後、培養液から遠心分離により菌体を回収した。収量は湿重量で約240ｇであった。
（2）ε-ポリ-L-リジン生産株ストレプトミセス・アルブラスIFO14147株からのε-ポリ-L-リジン生合成酵素の精製
全ての精製工程は4℃、又は氷上で行なった。湿重量75ｇの菌体を150ｍｌの100ｍMトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、20％(w/v) グリセロール、0.2M NaCl、2ｍM EDTA、5ｍM DTTからなる緩衝液A（ｐH8.0）に懸濁し、超音波処理により菌体を破砕した。処理液を10,000ｇ、20分間遠心分離して残渣を除き、粗酵素液を調製した。これを160,000ｇで1ｈ超遠心分離（ベックマンコールター社製）し、沈殿を細胞膜画分として回収した。得られた細胞膜画分は30ｍｌの100mMトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、20(w/v)％ グリセロール、1.0M NaCl、5ｍM DTTからなる緩衝液B（ｐH8.0）に懸濁、超音波処理した後、同様に超遠心分離により回収し、塩洗浄細胞膜画分とした。塩洗浄細胞膜画分を30ｍｌの100mMトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、30％(w/v) グリセロール、1％ (w/v) NP-40（IGEPAL CA-630、MP-Biomedicals社製）、5ｍM DTTからなる緩衝液C（ｐH8.6）に懸濁、同様に超音波処理、超遠心分離し、得られた上清をε-ポリ-L-リジン生合成酵素を含むNP-40可溶化細胞膜画分とした。
NP-40可溶化細胞膜画分を50ｍM トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、30％(w/v) グリセロール、0.4％ (w/v) NP-40、2ｍM DTTからなる緩衝液D（ｐH8.6）で平衡化したDEAE TOYOPEARL 650Mカラム（2.5x10ｃｍ、東ソー社製）に吸着させた。カラムを同緩衝液で洗浄後、NaCl濃度勾配法（0〜0.3M）により酵素を溶出した。活性画分を回収し、0.1M酢酸溶液によりｐH8.2に調整後、緩衝液D（ｐH8.2）で平衡化したAF-Blue TOYOPEARL 650Mカラム（1.5x6.5ｃｍ、東ソー社製）に吸着させた。カラムを同緩衝液で洗浄後、NaCl濃度勾配法（0〜2M）により酵素を溶出した。活性画分を集め、限外ろ過（YM-50、アミコン社製）により濃縮した後、0.2M NaClを含む緩衝液D（ｐH8.2）で平衡化したSephacryl S-300 HRカラム（1.5ｘ45ｃｍ、アマシャムバイオサイエンス社製）に添加し、同緩衝液により流速0.15ｍｌ/minで溶出した。以上の操作によって精製ε-ポリ-L-リジン生合成酵素2.9ｍｇを調製できた。この精製酵素標品はSDS-ポリアクリルアミド電気泳動において均一であった。ε−ポリ−Ｌ−リジン生合成酵素の精製収率を下記の表１に示す。
Figure 2008263868
また、ε−ポリ−Ｌ−リジン生合成酵素の精製過程における各画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を図４に示す。
（3）ε-ポリ-L-リジン生合成酵素の酵素科学的性質検討
精製酵素標品を用いて酵素科学的性質検討を行なった。
ε-ポリ-L-リジン生合成活性の測定は、川合らの方法（Biochem Biophys Res Commun. 2003 Nov 21;311(3):635-40）を改良した方法で行なった。92.5 kBq/ml L-[U-14C]リジン（アマシャムバイオサイエンス社製）を含む１ｍＭ L-リジン、5mM MgCl2、 5mM ATP、 1mM DTT、20%(w/v) グリセロール、0.2% (w/v) NP-40、100 mM TAPS-NaOH緩衝液(pH8.5)及び酵素を含む反応液（40μｌ）を30℃でインキュベートした。反応液の10μｌを直径2.1ｃｍのガラス繊維ろ紙（ワットマン社製）にスポットし、直ちに氷冷した5％(w/v)トリクロロ酢酸 - 0.25％(w/v)タングステン酸ナトリウム溶液に浸した。20分間静置した後、5分間穏やかに振とうした。フィルターを再度同溶液中で5分間振とう後、エタノールでリンスし、乾燥させた。フィルターに結合した放射能量を液体シンチレーションカウンター（アロカ社製）で測定した。この反応条件で1秒間に1pmolのL-リジンをε-ポリ-L-リジンに取り込む酵素量を1ユニットと定めた。比活性はタンパク質1ｍｇあたりのユニットとした。なお、タンパク質の定量は、ブラッドフォード法により行なった。検量線は、牛血清アルブミン(和光純薬社製)を用いて作成した。
L-リジン及びその他のアミノ酸のアデニル化活性は、ATP-PPi交換反応により測定した。1ｍM L-リジン又はその他のアミノ酸、5mM MgCl2、5mM ATP、1mM DTT、20%(w/v) グリセロール、0.2% (w/v) NP-40、0.2mM 2リン酸ナトリウム、51.8 kBq/ml [32P]2リン酸ナトリウム、100 mM TAPS-NaOH緩衝液(pH8.5)及び酵素を含む反応液（40μｌ）を30℃でインキュベートした。1.2% (w/v) 活性炭、0.1M 2リン酸ナトリウム及び 0.35M過塩素酸を含む溶液1.0ｍｌを加えて反応を停止した。活性炭を純水で洗浄した後、活性炭に結合した放射能量を液体シンチレーションカウンター（アロカ社製）で測定した。
酵素合成されたε-ポリ-L-リジンの重合度分析及び定量は、次の条件でHPLCにより行なった。
カラム： ODS-80Ts （4.6 x 250 mm、東ソー社製）
溶媒A： 10ｍM リン酸二水素ナトリウム、10ｍM オクタンスルホン酸ナトリウム、100ｍM 過塩素酸ナトリウム
溶媒B： 溶媒A + 60％アセトニトリル
グラジエント： 42％溶媒B（0min）→65％溶媒B(45min)
流速： 0.8ｍｌ/min
検出： 210nm
ε-ポリ-L-リジン生合成反応において生成するATP分解物の分析は、次の条件でHPLCにより行なった。検量線はチッソ製ε-ポリ-L-リジンを用いて作成した。
カラム： ODS-80Ts （4.6 x 250 mm、東ソー社製）
溶媒A： 20ｍM リン酸二水素ナトリウム、5ｍM テトラブチルアンモニウムブロミド
溶媒B： 溶媒A + 60％メタノール
グラジエント： 35％溶媒B（0min）→100％溶媒B(30min)
流速： 0.7ｍｌ/min
検出： 260nm
酵素合成されたε-ポリ-L-リジンのLC-ESI-MS/MS分析は、次の条件で行なった。
HPLC装置： Agilent 1200 (Agilent社製)
カラム：Develosil Praqueous-AR-5（2.0 x 150 mm、野村化学社製）
溶媒A： 0.1％ ヘプタフルオロ酪酸
溶媒B： 0.1％ ヘプタフルオロ酪酸 +アセトニトリル
グラジエント： 10％溶媒B（0〜5min）→45％溶媒B(45min)
流速： 0.4ｍｌ/min
検出： 210nm
質量分析装置： esquire 4000（Bruker社製）
イオン化モード：ポジティブモード
酵素合成ε-ポリ-L-リジンの結合様式の確認は、次の方法で行なった。15ｍｌの酵素反応液（25℃、16ｈ）から次の条件でHPLCによりε-ポリ-L-リジンを精製し（約0.8ｍｇ）、凍結乾燥した。
カラム： ODS-80Ts （4.6 x 250 mm、東ソー社製）
溶媒A： 0.1％ トリフルオロ酢酸
溶媒B： 0.1％ トリフルオロ酢酸 + アセトニトリル
グラジエント： 0％溶媒B（0-10min）→30％溶媒B(30min)
流速： 0.7ｍｌ/min
検出： 210nm
これを島ら（Agric. Biol. Chem. 1981 45:2503-2508）の方法に従い、ジニトロフェニル化(DNP化）した。DNP化ε-ポリ-L-リジンは6N HCl中で100℃、20ｈ加水分解し、次の条件の薄層クロマトグラフィーにより分析した。
薄層板：シリカゲル60TLCプレート(メルク社製)
展開溶媒：ブタノール、酢酸、ピリジン、水（4：1：1：2）
発色：ニンヒドリン
まず、精製酵素標品22μｇを用いて酵素反応（0.5ｍｌ）を行い、生成物をESI-LC-MS/MSにて解析した。発酵で得られるε-ポリ-L-リジンは30mer中心の重合度分布であるのに対し、酵素合成されたε-ポリ-L-リジンは14又は15mer中心の重合度分布を示したが、LCにおける保持時間、MSスペクトル、MS/MSフラグメンテーションパターンの何れもε-ポリ-L-リジン標準品の部分加水分解物と一致した（図５および図６）。また、薄層クロマトグラフィーによる分析において、DNP化した酵素合成ε-ポリ-L-リジンを塩酸加水分解することにより、ε-ポリ-L-リジン標準品と同じくNα-2,4-DNP-L-リジンが生じたことから、酵素反応産物がL-リジンのε−アミノ基とα-カルボキシル基が結合したイソペプチド、すなわちε-ポリ-L-リジンであることが示され（図７）、本酵素がε-ポリ-L-リジン生合成酵素であることが確認された。なお、ε-ポリ-L-リジンは、下記の構造を有する。
Figure 2008263868
次に、HPLCにて酵素反応生成物を解析したところ、反応時間依存的なε-ポリ-L-リジンの増加が確認されが、生成するε-ポリ-L-リジンの重合度は反応時間に依存せず、常に一定の分布を示した。また、ATPは反応に伴ってAMPへ変換され、L-リジンのアデニル化活性も認められた。これらのことから、γ-ポリグルタミン酸（Appl Environ Microbiol. 2004 Jul;70(7):4249-55）やシアノフィシンの生合成酵素（Appl Environ Microbiol. 2001 May;67(5):2176-82）がリガーゼ様式で基質アミノ酸を重合するのに対して、本酵素がチオテンプレート型リボソーム非依存的ペプチド合成酵素（NRPS）様式でL-リジンを重合することが強く示唆された。
更に本酵素の酵素科学的性質を詳細に検討したところ、本酵素は次の性質を有していることが明らかとなった。
１）合成反応の至適ｐH：ｐH8.5
２）合成反応至適温度：25〜30℃
３）温度安定性： 30℃における活性半減期は180分、35℃では80分、40℃では19分であった。（0.2M NaClを含む緩衝液D（ｐH8.2））
４）金属イオン要求性：活性発現には2価カチオンの添加が必須である。5ｍM Mg2+および5ｍM Mn2+の添加で最大活性を示す。Ca2+の添加でもわずかに活性化。
５）基質特異性： L-リジン以外に、D-リジン、5−ヒドロキシ-L-リジンなど図８に示すL-リジンのアナログ体をアデニル化。
６）ヌクレオチド特異性：ATP特異的。GTP、UTP、CTPでは基質アミノ酸は活性化されない。
７）サブユニット分子量：還元条件下でのSDS-ポリアクリルアミド電気泳動により、約130ｋDaと算出される（図４）。
８）分子量：ゲルろ過クロマトグラフィー（Sephacryl S-300 HR、アマシャム-バイオサイエンス社製）により約270ｋDaと算出される。
上記7）、8）の結果から本酵素はホモダイマーであると推定された。
実施例２ ε-ポリ-L-リジン生合成酵素遺伝子のクローニング
（1）ε-ポリ-L-リジン生合成酵素のアミノ酸配列解析
アミノ酸配列はLC-MS/MSにより解析した。ε-ポリ-L-リジン生合成酵素をSDS-ポリアクリルアミド電気泳動により分画し、CBB-R250で染色後、ε-ポリ-L-リジン生合成酵素のバンドを切り出した。試料ゲル片にトリプシンを含むトリス緩衝液（ｐH8.0）を加え、35℃、20時間ゲル内消化した。ゲル片から抽出したトリプシン消化ペプチド溶液をLC-MS/MS分析に供した。LC-MS/MS分析は次の条件で行なった。
HPLC装置：MAGIC 2002 nano LC system (Michrom Bioresources社製)
カラム：Magic C18 column (0.1×50mm,Michrom Bioresources社製)
溶媒A： 0.1％ギ酸 + 2％アセトニトリル
溶媒B： 0.1％ギ酸 + 90％アセトニトリル
グラジエント：10％溶媒B（0〜1min）→50％溶媒B（21min）
流速：250〜300nl/min
質量分析装置：Q-Tof 2（Waters Micromass社製）
イオン化モード：ポジティブモード
得られたMS/MSデータをMassLynxソフトウェア（Waters Micromass社製）でデノボシークエンス解析した結果、3ペプチドのアミノ酸配列MAGAAWPAPAWQRSR（配列番号３）、(I/L)E(I/L)GE(I/L)DAA(I/L)AA(I/L)PGVR（配列番号４）およびA(I/L)AGT(I/L)KPGAYPR（配列番号５）を得た。
（2）ε-ポリ-L-リジン生合成酵素遺伝子の取得
ストレプトミセス・アルブラスIFO14147株をスクロース103ｇ/L、トリプトン10ｇ/L、イーストエキス5ｇ/L、NaCl 5ｇ/Lからなる培地100mlに植菌し、30℃で24時間振盪培養した。この培養液から遠心分離により菌体を回収し、常法に従い染色体DNAを調製した。また、決定したε-ポリ-L-リジン生合成酵素の内部アミノ酸配列（peptide 1;N-A（I/L）AGT（I/L）KPGAYPR-C（配列番号６）, peptide 2;N-MAGAAWPAPAWQRSR-C（配列番号７））を基に次の4種類のプライマーを設計した。
pr-pp1F; 5'-AC(C/G)(A/C)T(C/G)AAGCC(C/G)GG(C/G)GC(C/G)TACCC-3'（配列番号８）
pr-pp2R; 5'-CTGCCA(G/C)GC(G/C)GG(G/C)GC(G/C)GGCCA(G/C)GC-3'（配列番号９）
pr-pp2F; 5'-GC(C/G)TGGCC(C/G)GC(C/G)CC(C/G)GC(C/G)TGGCA-3'（配列番号１０）
pr-pp1R; 5'-GGGTA(G/C)GC(G/C)CC(G/C)GGCTT(G/C)A(T/G)(G/C)GT -3'（配列番号１１）
これらプライマーと染色体DNAを鋳型としたPCRを行ったところ、pr-pp1F/pr-pp2Rの組み合わせで約500bpの特異的な増幅断片を得た。この増幅断片をプラスミドpGEMT-easyにクローニングし、このクローニングした断片をECL標識キット（GEヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて標識した。標識した遺伝子断片をプローブとして用い、本菌株の染色体DNAから作製したコスミドライブラリー（Supercos I, STRATAGENE社）に対してスクリーニングを行い、さらに、本プローブがハイブリダイズするKpnI 6.0kb断片を得た。この断片をプラスミドpTSR193（参考文献、Actinomycetologica (2006)Vol.20, p.35-41）にサブクローニングし、塩基配列を決定した。
実施例３ ε-ポリ-L-リジンの酵素的生産
2mM L-リジン、5mM MgCl2、 5mM ATP、 1mM DTT、20% グリセロール、 0.2% (w/v) NP-40、100 mM TAPS-NaOH 緩衝液(pH8.5)及び約10μｇの精製酵素標品を含む反応液（200μｌ）を1.5ｍｌ容マイクロチューブに入れ、25℃で120分間インキュベートした。反応開始20,40,80,120分後、実施例１に記載の方法で生成したε-ポリ-L-リジンを定量した結果を表２に示した。
Figure 2008263868
ポリアミノ酸の酵素的合成法は、微生物発酵法や化学合成法よりも省エネルギーであり、望ましくない副反応も抑えられるため高純度のポリアミノ酸を製造することができる。本発明によって製造される各種アミノ酸のポリマーは、抗菌剤等として使用することができ、トイレタリー用品、化粧品、飼料添加物、医薬、農薬、食品添加物、電子材料等の様々な用途に使用することができる。さらに、本発明のポリヌクレオチド含有組換えベクターおよび形質転換体を使用することで、様々な有用ポリアミノ酸生合成への応用が期待できる。
（Ａ）従来のＮＲＰＳの多モジュール構造；（Ｂ）本発明の一実施形態におけるポリアミノ酸合成酵素の単一モジュール構造をそれぞれ模式的に表した図である。 本発明のポリアミノ酸合成酵素のＣ末端側に位置する縮合反応触媒ドメインおよびそのサブドメインのアミノ酸配列を示す。図中「ｔｍｒ」は膜貫通領域を意味する。 本発明のポリアミノ酸合成酵素のＣ末端側に位置する縮合反応触媒ドメインのサブドメインのＤＮＡ配列を示す。 本発明のポリアミノ酸合成酵素のＣ末端側に位置する縮合反応触媒ドメインのＤＮＡ配列を示す。図中「ｔｍｒ」は膜貫通領域を意味する。 本発明のε−ポリ−Ｌ−リジン生合成酵素の精製過程における各画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す写真である。レーン1および11：分子量マーカー（リコンビナントタンパク質、バイオラッド社）、レーン2：粗酵素液、レーン3： 可溶性画分、 レーン4：細胞膜画分、 レーン5： 塩可溶化画分、レーン6：塩洗浄細胞膜画分、レーン7：NP-40 可溶化画分、 レーン8： DEAE TOYOPEARLカラムからの溶出画分、レーン9：AF-Blue TOYOPEARLカラムからの溶出画分、レーン10： Sephacryl S-300カラムからの溶出画分。 （Ａ）酵素反応液中のε−ポリ−Ｌ−リジンをＨＰＬＣで分析した結果を示すグラフである。（Ｂ）ε−ポリ−Ｌ−リジン標準品を用いて検量線を作成し、図５（Ａ）の結果から算出した反応液中のε−ポリ−Ｌ−リジン濃度を示すグラフである。 （Ａ）液体クロマトグラフィー（ＬＣ）による分離パターンを示すグラフである。（Ｂ）ε−ポリ−Ｌ−リジン標準品塩酸加水分解物１４ｍｅｒの質量分析結果を示すグラフである。（Ｃ）酵素合成ε−ポリ−Ｌ−リジン１４ｍｅｒの質量分析結果を示すグラフである。 ＤＮＰ化ε−ポリ−Ｌ−リジン塩酸加水分解物の薄層クロマトグラフィー分析の結果を示すグラフである。レーン 1：L-リジン、レーン2：α-ポリ-L-リジン（和光純薬製）のDNP化物を塩酸加水分解して生じたもの、レーン3：ε-ポリ-L-リジン標準品（チッソ製）のDNP化物を塩酸加水分解して生じたもの、レーン4： 酵素合成ε-ポリ-L-リジンのDNP化物を塩酸加水分解して生じたもの、レーン 5： Nα-2,4-DNP-L-リジン、レーン 6： Nε-2,4-DNP-L-リジン。 本発明のアミノ酸合成酵素のアミノ酸活性化（アデニル化）反応における基質特異性を示すグラフである。Ｌ−リジンに対する活性を１００％として相対活性で示した。なお、Ｌ−Ａｌａ、Ｌ−Ｖａｌ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｐｒｏ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ａｓｎ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−Ａｓｐ、Ｌ−Ｇｌｕは何れもアデニル化されなかった。

Claims (36)

  1. （ｉ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列、
    （ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および／もしくは付加を有するアミノ酸配列からなるポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列、
    （ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列、
    （ｉｖ）配列番号１のヌクレオチド配列、
    （ｖ）配列番号１のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得る、ポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列、または
    （ｖｉ）配列番号１のヌクレオチド配列と６５％以上の同一性を有する、ポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列、
    のいずれかを含む、ポリヌクレオチド。
  2. （ｉ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列、または
    （ｉｉ）配列番号１のヌクレオチド配列、
    のいずれかを含む、ポリヌクレオチド。
  3. 前記ポリアミノ酸合成酵素が、ポリリジン合成酵素である、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド。
  4. ＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１〜３のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
  5. （ｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列からなる縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインをコードするヌクレオチド配列、
    （ｉｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および／もしくは付加を有するアミノ酸配列からなる、縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインをコードするヌクレオチド配列、または
    （ｉｉｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインをコードするヌクレオチド配列、
    （ｉｖ）配列番号１２、１４、１６、もしくは１８のヌクレオチド配列、
    （ｖ）配列番号１２、１４、１６、もしくは１８のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得る、縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインをコードするヌクレオチド配列、または
    （ｖｉ）配列番号１２、１４、１６、もしくは１８のヌクレオチド配列と６５％以上の同一性を有する、縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインをコードするヌクレオチド配列、
    のいずれかを含む、ポリヌクレオチド。
  6. （ｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列からなる縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインをコードするヌクレオチド配列、または
    （ｉｉ）配列番号１２、１４、１６、もしくは１８のヌクレオチド配列、
    のいずれかを含む、ポリヌクレオチド。
  7. ＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項５または６に記載のポリヌクレオチド。
  8. （ｉ）配列番号２のアミノ酸配列、
    （ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および／もしくは付加を有するアミノ酸配列、または
    （ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
    のいずれかを含む、ポリアミノ酸合成酵素。
  9. ポリリジン合成酵素である、請求項８に記載のポリアミノ酸合成酵素。
  10. （ｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列、
    （ｉｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および／もしくは付加を有するアミノ酸配列、または
    （ｉｉｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
    のいずれかを含む縮合反応触媒ドメイン。
  11. 請求項１０に記載の縮合反応触媒ドメインを含むポリアミノ酸合成酵素。
  12. ポリリジン合成酵素である、請求項１１に記載のポリアミノ酸合成酵素。
  13. （ｉ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列、
    （ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および／もしくは付加を有するアミノ酸配列からなるポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列、
    （ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列、
    （ｉｖ）配列番号１のヌクレオチド配列、
    （ｖ）配列番号１のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得る、ポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列、または
    （ｖｉ）配列番号１のヌクレオチド配列と６５％以上の同一性を有する、ポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列、
    のいずれかを含有する、組換えベクター。
  14. （ｉ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列、または
    （ｉｉ）配列番号１のヌクレオチド配列、
    のいずれかを含有する、組換えベクター。
  15. 前記ポリアミノ酸合成酵素が、ポリリジン合成酵素である、請求項１３または１４に記載の組換えベクター。
  16. （ｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列からなる縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインをコードするヌクレオチド配列、
    （ｉｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および／もしくは付加を有するアミノ酸配列からなる、縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインをコードするヌクレオチド配列、または
    （ｉｉｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインをコードするヌクレオチド配列、
    （ｉｖ）配列番号１２、１４、１６、もしくは１８のヌクレオチド配列、
    （ｖ）配列番号１２、１４、１６、もしくは１８のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得る、縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインをコードするヌクレオチド配列、または
    （ｖｉ）配列番号１２、１４、１６、もしくは１８のヌクレオチド配列と６５％以上の同一性を有する、縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインをコードするヌクレオチド配列、
    のいずれかを含有する、組換えベクター。
  17. （ｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列からなる縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインをコードするヌクレオチド配列、または
    （ｉｉ）配列番号１２、１４、１６、もしくは１８のヌクレオチド配列、
    のいずれかを含有する、組換えベクター。
  18. 請求項１３、１５、または１６に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
  19. 請求項１４または１７に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
  20. 請求項１３、１５、もしくは１６のいずれかに記載の組換えベクターまたは請求項１８に記載の形質転換体を用いる、ポリアミノ酸合成酵素の製造方法。
  21. 請求項１４もしくは１７に記載の組換えベクターまたは請求項１９に記載の形質転換体を用いる、ポリアミノ酸合成酵素の製造方法。
  22. （ｉ）配列番号２のアミノ酸配列、
    （ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および／もしくは付加を有するアミノ酸配列、または
    （ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
    のいずれかを含むポリアミノ酸合成酵素を用いてポリアミノ酸を合成する工程を包含する、ポリアミノ酸の製造方法。
  23. （ｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列、
    （ｉｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および／もしくは付加を有するアミノ酸配列、または
    （ｉｉｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
    のいずれかを含むポリアミノ酸合成酵素を用いてポリアミノ酸を合成する工程を包含する、ポリアミノ酸の製造方法。
  24. 前記ポリアミノ酸が、ポリリジンである、請求項２２または２３に記載の方法。
  25. 前記ポリリジンが、ε−ポリ−Ｌ−リジンである、請求項２４に記載の方法。
  26. （ｉ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
    （ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および／もしくは付加を有するアミノ酸配列からなるポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
    （ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
    （ｉｖ）配列番号１のヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
    （ｖ）配列番号１のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得る、ポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、または
    （ｖｉ）配列番号１のヌクレオチド配列と６５％以上の同一性を有する、ポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
    のいずれかにおける少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドからなるプライマー。
  27. （ｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列からなる縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインをコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
    （ｉｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および／もしくは付加を有するアミノ酸配列からなる縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインをコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
    （ｉｉｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインをコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
    （ｉｖ）配列番号１２、１４、１６、または１８のヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
    （ｖ）配列番号１２、１４、１６、または１８のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得る、縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインをコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、または
    （ｖｉ）配列番号１２、１４、１６、または１８のヌクレオチド配列と６５％以上の同一性を有する、縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインをコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
    のいずれかにおける少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドからなるプライマー。
  28. （ｉ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
    （ｉｉ）配列番号１のヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
    （ｉｉｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列からなる縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインをコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、または
    （ｉｖ）配列番号１２、１４、１６、または１８のヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
    のいずれかにおける少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドからなるプライマー。
  29. （ｉ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
    （ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および／もしくは付加を有するアミノ酸配列からなるポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
    （ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列
    （ｉｖ）配列番号１のヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
    （ｖ）配列番号１のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得る、ポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、または
    （ｖｉ）配列番号１のヌクレオチド配列と６５％以上の同一性を有する、ポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
    のいずれかのヌクレオチド配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得る少なくとも１５ヌクレオチド長のヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチドプローブ。
  30. （ｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列からなる縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインをコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
    （ｉｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および／もしくは付加を有するアミノ酸配列からなる縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインをコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
    （ｉｉｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインをコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列
    （ｉｖ）配列番号１２、１４、１６、または１８のヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
    （ｖ）配列番号１２、１４、１６、または１８のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得る、縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインをコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、または
    （ｖｉ）配列番号１２、１４、１６、または１８のヌクレオチド配列と６５％以上の同一性を有する、縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインをコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
    のいずれかのヌクレオチド配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得る少なくとも１５ヌクレオチド長のヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチドプローブ。
  31. （ｉ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリアミノ酸合成酵素をコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
    （ｉｉ）配列番号１のヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
    （ｉｉｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列からなる縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインをコードするヌクレオチド配列もしくはその相補配列、または
    （ｉｖ）配列番号１２、１４、１６、または１８のヌクレオチド配列もしくはその相補配列、
    のいずれかのヌクレオチド配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得る少なくとも１５ヌクレオチド長のヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチドプローブ。
  32. （ｉ）配列番号２のアミノ酸配列、
    （ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および／もしくは付加を有するアミノ酸配列、または
    （ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
    のいずれかを含むポリアミノ酸合成酵素に特異的に結合する、抗体。
  33. （ｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列、
    （ｉｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および／もしくは付加を有するアミノ酸配列、または
    （ｉｉｉ）配列番号１３、１５、１７、もしくは１９のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
    のいずれかを含む縮合反応触媒ドメインもしくはそのサブドメインまたは該ドメインを含むポリアミノ酸合成酵素に特異的に結合する、抗体。
  34. 請求項２６〜２８のいずれかに記載のプライマーを使用する、ポリアミノ酸合成酵素をコードするポリヌクレオチドのスクリーニング方法。
  35. さらに請求項２９〜３１のいずれかに記載のプローブを使用する、請求項３４に記載のスクリーニング方法。
  36. 請求項３２または３３に記載の抗体を使用する、ポリアミノ酸合成酵素のスクリーニング方法。
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