JPWO2010001601A1 - カルシウムイオン溶出を制御した人工骨材料 - Google Patents

Abstract

【課題】 本発明は，細胞毒性，及び炎症反応を抑制できるカルシウムイオン溶出制御人工骨材料を提供することを目的とする。【解決手段】 本発明は，カルシウム系物質を含む移植用人工骨材料に表面処理を行うか、表面処理剤を含ませることで，担体からのカルシウムイオンの溶出を効果的に抑制することができるという知見に基づくものである。さらに，このようなカルシウムイオン溶出制御担体を用いることで，細胞毒性を抑制することができ，さらに炎症反応も抑制することができるという知見に基づくものである。【選択図】 図２

Description

本発明は，生体内に埋入する医療用のカルシウムイオン溶出制御人工骨材料に関する。

従来，治療目的で体内に埋入する人工骨材料としてカルシウム系物質を用いるものが広く使用されている。例えば，特開２００６−３４６１５９号公報には，生体組織補填材が開示されている。同公報は，リン酸カルシウムから多孔性の生体組織補填材を製造している。

また，特開２００２−２４８１１９号公報には，ヒドロキシアパタイトとコラーゲンを含む人工椎体が開示されている。ＷＯ２００５／０３２４５６号パンフレットには，リン酸カルシウムを含む人工器官インプラントが開示されている。

このようにカルシウム系物質は生体材料として幅広く使用されているが，生体材料として治療に用いたとき，十分な治療効果を得にくいという問題があった。

特開２００６−３４６１５９号公報 特開２００２−２４８１１９号公報 ＷＯ２００５／０３２４５６号パンフレット

本発明は，細胞毒性，及び炎症反応を抑制できるカルシウムイオン溶出制御人工骨材料を提供することを目的とする。

これまで骨補填剤や骨充填剤などの人工骨材料からカルシウムイオンが溶出することは全く考えられていなかった。本発明者は，人工骨材料を埋入すると，細胞増殖が阻害される場合があることを見出した。そして，その一因が人工骨材料から溶出するわずかなカルシウムイオンであるとの仮説を立て，実験を行ったところ，この仮説を指示する実験結果を得た。そこで，本発明は，カルシウム系物質を含む移植用人工骨材料に表面処理を行うか、表面処理剤を含ませることで，担体からのカルシウムイオンの溶出を効果的に抑制することができるという知見に基づくものである。さらに，このようなカルシウムイオン溶出制御担体を用いることで，細胞毒性を抑制することができ，さらに炎症反応も抑制することができるという知見に基づくものである。表面処理によって，移植用人工骨材料から溶出したカルシウムイオンを除去することができる。そして，移植用人工骨材料に表面処理剤を含ませることによって，移植用人工骨材料からカルシウムイオンが溶出することを防ぐことができる。

本発明の第１の側面は，カルシウムイオン溶出制御人工骨材料の製造方法に関する。本発明の製造方法は，カルシウム系物質を含有する移植用人工骨材料を洗浄処理する工程を含む。この工程により，前記人工骨材料が生体内に埋入された際に前記人工骨材料表面から遊離するカルシウムイオンを除去し,これにより，前記カルシウムイオンにより惹起される，前記人工骨が埋入された部位付近の組織における炎症反応及び細胞毒性を防止できるカルシウムイオン溶出制御人工骨材料を製造することができる。前記カルシウムイオン溶出制御人工骨材料は，前記人工骨材料が埋入された部位付近の組織における組織の雰囲気の下で，洗浄前の前記人工骨材料に比べて，カルシウムイオンの放出量が５０％以下に制御されるものが好ましい。このようにカルシウムイオンの溶出を防止することで，カルシウムイオンにより細胞増殖が抑制される事態を防止できる。

本発明の第１の側面の好ましい態様は，前記人工骨材料が焼結された人工骨材料である。すなわち，特に人工骨材料が焼結されたものである場合，カルシウムイオンの溶出量が多かった。よって，本発明は，そのような焼結された人工骨に所定の処理を施してカルシウムイオンの溶出を抑えることに有効に用いることができる。前記洗浄処理する工程では，純水，ｐＨ緩衝液，キレート剤溶液，キャッピング剤溶液，又はカップリング剤溶液を用いて，前記人工骨材料を洗浄する。

本発明の第１の側面の好ましい態様は，さらに，前記洗浄処理をしたカルシウムイオンを除去した移植用人工骨材料に，表面処理剤を浸透させる浸透工程とを含む。前記浸透工程は，前記浸透工程は，前記カルシウムイオンを除去した移植用人工骨材料に表面処理剤を塗布するか，または前記カルシウムイオンを除去した移植用人工骨材料を表面処理剤の溶液に浸漬する工程である。このような工程を含むことよって，カルシウムイオンの溶出を制御できる人工骨材料を製造することができる。

本発明の第１の側面の好ましい態様は，移植用人工骨材料を，グルコン酸溶液を用いて洗浄処理する工程と，前記洗浄処理した移植用人工骨材料に，グルコン酸を浸透させる工程とを含む，カルシウムイオン溶出制御人工骨材料の製造方法である。後述する実施例で示されたとおり，グルコン酸はカルシウムイオンを効果的にキレートすることができる。よって，グルコン酸用溶液を用いて洗浄処理することにより，移植用人工骨材料から遊離し，材料表面等に付着しているカルシウムイオンを効果的に除去することが可能になる。また，洗浄処理した移植用人工骨材料に，グルコン酸を浸透させておくことで，患部へ投与した後，人工骨材料からカルシウムイオンが遊離することを防ぐことができる。さらに，投与部位での炎症反応を抑制することができる。

本発明の第１の側面の好ましい態様は，移植用人工骨材料に，コハク酸を浸透させる工程と，前記コハク酸を浸透させた移植用人工骨材料を純水で洗浄処理する工程と，前記洗浄処理した移植用人工骨材料にトレハロースを浸透させる工程とを含む，カルシウムイオン溶出制御人工骨材料の製造方法である。コハク酸などのジカルボン酸は，リン酸カルシウム系物質の層間化合物となる。また，コハク酸は，リン酸オクタカルシウム（ＯＣＰ）と接触すると，コハク酸イオンがＯＣＰのリン酸イオンと置換すると考えられる（Ｈｉｄｅｋｉ Ｍｏｎｍａ ａｎｄ Ｍａｓａｒｕ Ｇｏｔｏ，“Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ−ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ Ｏｃｔａｃａｌｃｉｕｍ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ”Ｂｕｌｌ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｊｐｎ．，５６，ｐｐ．３８４３−３８４４（１９８３））。このため，コハク酸を浸透させることで，リン酸イオンとコハク酸イオンとが置換され，これにより，カルシウムイオンが強固に固定される。よって，コハク酸を浸透させた移植用人工骨材料を生体内に埋入した際に，カルシウムイオンが溶出する事態を防止できると考えられる。そして，後述する実施例で示されたとおり，このような工程で製造したカルシウムイオン溶出制御人工骨材料は，人工骨材料からのカルシウム溶出を防ぐことができ，細胞増殖を促進することができた。

本発明の第２の側面は，カルシウム系物質を含む移植用人工骨材料と，前記移植用人工骨材料に塗布された表面処理剤，又は前記移植用人工骨材料に浸漬された表面処理剤を含む，カルシウムイオン溶出制御人工骨材料に関する。本発明のカルシウム溶出制御人工骨材料は，前記移植用人工骨材料からのカルシウムイオンの溶出を防ぐことにより，カルシウムイオンによる炎症反応及び細胞毒性を抑制することができる。後述する実施例に示されたとおり，本発明のカルシウムイオン溶出制御人工骨材料は，効果的にカルシウムイオンの溶出を抑制することができ，投与部位での炎症反応を抑制することができる。

本発明の第２の側面の好ましい態様は，前記表面処理剤は，酸性溶液，キレート剤，キャッピング剤，又はカップリング剤のいずれか１種または２種以上の混合物である。このような表面処理剤を用いることによって，効果的に移植用人工骨材料からカルシウムイオンの溶出を抑制することができ，担体投与部位での炎症反応を抑制することができるようになる。

本発明の第２の側面の好ましい態様は，前記表面処理剤は，キレート剤であり，前記キレート剤は，グルコン酸，鎖状ポリリン酸，アスパラギン酸，エチレンジアミン四酢酸，メタリン酸，クエン酸，ニトリロ三酢酸，及びメチルグリシン二酢酸からなる群より選ばれる１種または２種以上の混合物である。キレート剤は，カルシウムイオンと反応することで，安定するので，移植用人工骨材料から溶出されるカルシウムイオンを効果的にキレートすることができる。後述する実施例にも示されたとおり，キレート剤を用いることで，効果的に担体からのカルシウムイオンの溶出を防ぐことができる。

本発明の第２の側面の好ましい態様は，前記表面処理剤は，キャッピング剤であり，前記キャッピング剤は，アミノ酸，ペプチド，多糖類，二糖類，レクチン，プロテオグリカン，糖タンパク，及び糖脂質からなる群より選ばれる１種または２種以上の混合物である。このようなキャッピング剤を用いることで，効果的に移植用人工骨材料からのカルシウムイオンの溶出を防ぐことができ，投与部位での炎症反応を抑制することができる。よって，好適に治療に用いることができる。

本発明の第２の側面の好ましい態様は，前記表面処理剤は，トレハロースである。後述する実施例で示されたとおり，移植用人工骨材料からのカルシウムイオンの溶出を防ぐことができるので，投与部位での細胞毒性が抑制される。

本発明の第２の側面の好ましい態様は，カップリング剤であり，前記カップリング剤は，アルミネート系カップリング剤，チタノール系カップリング剤，又はシラノール系カップリング剤である。カップリング剤は，効率的にカルシウムイオンと反応し，移植用人工骨材料からカルシウムイオンが溶出するのを抑制する。また，これらのカップリング剤は，生体適合性に優れているので，好適に用いることができる。

本発明の第２の側面の好ましい態様は，上記したカルシウムイオン溶出制御人工骨材料は，さらに薬剤を含む。本発明のカルシウムイオン溶出制御人工骨材料に，投与する部位の疾患の治療剤・予防剤を含ませることで，治療効果を効果的に高め，回復を早めることができる。

薬剤としては，細胞膜保護剤，又は抗炎症剤のいずれか又は両方を含む。本発明のカルシウムイオン溶出制御人工骨材料は，カルシウムイオンの溶出が制御されているので，移植用人工骨材料から溶出したカルシウムイオンによって，投与部位での炎症反応を抑えることができる。しかしながら，投与部位周辺の細胞が，カルシウムイオン溶出制御人工骨材料を投与することによる物理的刺激を受けて反応する可能性がある。よって，本発明のように，カルシウムイオン溶出制御人工骨材料に細胞膜保護剤，又は抗炎症剤のいずれか又は両方を含むことで，投与部位の細胞を物理的刺激から防ぐことができる。また，物理的刺激を受けて細胞が炎症反応を起こすことを防ぐことができる。よって，このように細胞膜保護剤，又は抗炎症剤のいずれか又は両方を含むことで，治療予後の回復を早めることができる。

本発明によれば，細胞毒性，及び炎症反応を抑制できるカルシウムイオン溶出制御人工骨材料を提供することができる。

図１は，担体から溶出されるカルシウムイオンが細胞増殖に与える影響を示す図面に替わるグラフである。 図２は，グルコン酸がカルシウムイオンをキレートすることを示す図面に替わるグラフである。 図３は，グルコン酸がカルシウムイオンによって誘導される炎症反応を抑制することを示す図面に替わるグラフである。図３Ａは，５ｍＭ塩酸カルシウムを用いたとき，グルコン酸がカルシウムイオンによって誘導される炎症反応を抑制することを示す図面に替わるグラフである。図３Ｂは，７．５ｍＭ塩酸カルシウムを用いたとき，グルコン酸がカルシウムイオンによって誘導される炎症反応を抑制することを示す図面に替わるグラフである。

本発明は基本的には，人工骨材料を洗浄し，遊離するであろうＣａイオンを材料表面より除去する。洗浄液としては純水，ＰＨ緩衝液、塩溶液，キレート溶液などを使用して，前記カルシウムイオンによる移植用人工骨材料近接組織の炎症反応及び細胞毒性を抑制するものである。通常の人工骨は強度を高める目的で焼結する。この際の温度はβＴＣＰで８００度，αＴＣＰで１１００度である。この温度で焼結すると混入した発熱性物質やエンドトキシン等の有機物は全て気化する。このようにして製造した人工骨は，カルシウムイオンが溶出しやすくなっているが，一般には，あえて後処理を加えることはリスクを増やすことになるので行わない。本発明では，あえて人工骨材料に所定の処理を施すものである。このような処理を行うことで，人工骨材料から遊離するであろうカルシウムイオンを除去されたカルシウム溶出制御人工骨を得ることができる。また，表面処理剤を人工骨材料に含ませることで，人工骨材料からのカルシウムイオン溶出が防止されたカルシウムイオン溶出制御人工骨を得ることができる。

本発明は，カルシウムイオン溶出制御担体に関する。そして，カルシウムイオン溶出制御担体は，カルシウム系物質を含む移植用人工骨材料（以下，「カルシウムイオン溶出制御担体」，又は「移植用人工骨材料」ともよぶ）と，前記移植用人工骨材料に塗布された表面処理剤，又は前記移植用人工骨材料に浸漬された表面処理剤とを含む。前記移植用人工骨材料からのカルシウムイオンの溶出を防ぐことにより，カルシウムイオンによる炎症反応および細胞毒性を制御することができるカルシウムイオン溶出制御担体である。前記カルシウムイオン溶出制御担体は，カルシウム系物質を含み，骨欠損部位への注入する補填剤として好適に使用することができる。以下，本発明の各要素について説明する。

［カルシウムイオン溶出制御人工骨］
カルシウムイオン溶出制御人工骨は，カルシウムイオンの溶出を防ぐことができ，例えば顆粒状やブロック状などの形状を有する物体であり，生体内の骨欠損部や骨変形部などに投与するものがあげられる。カルシウムイオン溶出制御人工骨は，次第に骨組織と置換される性質を有する。カルシウムイオン溶出制御人工骨に表面処理剤を含むので，人工骨の構成成分であるカルシウム系物質からカルシウムイオンが溶出することを防止することができる。

［移植用人工骨材料の製造方法］
移植用人工骨材料は，カルシウム系物質を含む組成物から製造され，例えば顆粒状やブロック状などの形状を有する物体である。移植用人工骨材料の形状は上記した形状に限定されるものではなく，例えば，顆粒状移植用人工骨材料，ブロック状移植用人工骨材料に加えて，投与部位の形状に合わせたオーダーメイド移植用人工骨材料，歯根用インプラント，又は硬化型人工骨などがあげられる。顆粒状の移植用人工骨材料は，ブロック状の移植用人工骨材料を砕いたものである。ブロック状の移植用人工骨材料は，テトラポッド状など，複数の突起部を有する形状のものがあげられる。その場合，複数個の移植用人工骨材料を患部に投与等することとなる。また，移植用人工骨材料は，インプラントのように患者の骨形状を考慮して設計された形状（オーダーメイド移植用人工骨材料）を有してもよい。そのような移植用人工骨材料は，通常，外科手術などにより患部に埋入され，次第に骨組織と置換される。

移植用人工骨材料の大きさは，投与部位の形状に合わせたオーダーメイド移植用人工骨材料，歯根用インプラント，又は硬化型人工骨などにするときは，投与部位に合わせて適宜調整すればよい。他方，顆粒状，またはブロック状の形状で用いる場合は，移植用人工骨材料の大きさ（移植用人工骨材料を収容できる球の直径の大きさ）として，１×１０^−２〜５ｍｍがあげられ，好ましくは，本発明のブロック状の移植用人工骨材料の形状として，複数の突起部を有する形状があげられる。好ましくは，５×１０^−２ｍｍ〜３ｍｍであり，さらに好ましくは１×１０^−１ｍｍ〜２ｍｍであり，より好ましくは２×１０^−１ｍｍ〜１．５ｍｍである。複数の突起部が線対称，面対称，または空間的に対称となるように設計されたものである。好ましい具体的な形状として，テトラポッド状（正四面体の中心から各頂点へ向けた方向に伸びる４つの突起部を有する形状），または正ｎ面体（ｎ＝６，８，１２など）の中心から各頂点へ向けた方向に伸びるｎ個の突起部を有する形状のものがあげられる。しかしながら，本発明の移植用人工骨材料は，上記具体例に限定されるものではない。

移植用人工骨材料の製造方法は，公知の方法を用いることができる。たとえば，特開２００３−１４６７７３号公報である。以下では，簡単に移植用人工骨材料の製造方法の例を説明する。この移植用人工骨材料の製造方法は，混練工程と，成形工程と，脱バインダ（脱脂）工程と，焼結工程とを含む。混練工程は，カルシウム系物質を含む原材料，及びバインダを含む材料を混練するための工程である。成形工程は，混練工程で得られた混練物を用いて，金型を有する射出成形機を用いた射出成形により所定の形状を持った成形体を得るための工程である。脱バインダ（脱脂）工程は，成形工程で得られた成形体に含まれるバインダを取り除き脱脂体を得るための工程である。焼結工程は，脱バインダ工程後の脱脂体を加熱し，焼結し焼結体を得るための工程である。なお，成形体の後処理を行うための後処理工程など公知の工程を適宜含んでもよい。

［カルシウム系物質］
カルシウム系物質は，カルシウムイオン溶出制御担体の主成分を構成するものである。カルシウム系物質は，骨の成分に近いものであればよく，特に限定されない。このようなカルシウム系物質として，リン酸カルシウム系物質，炭酸カルシウム系物質，乳酸カルシウム及びグルコン酸カルシウムがあげられる。これらの中ではリン酸カルシウム系物質又は炭酸カルシウム系物質が好ましい。原料粉末としてのリン酸カルシウム系物質を，より具体的に説明すると，水酸アパタイト，炭酸アパタイト，フッ素アパタイト，塩素アパタイト，β−ＴＣＰ，α−ＴＣＰ，メタリン酸カルシウム，リン酸四カルシウム，リン酸八カルシウム，リン酸水素カルシウム，リン酸水素カルシウム，リン酸二水素カルシウム，ピロリン酸カルシウム，それらの塩，又はそれらの溶媒和物のうちいずれか１種又は２種以上があげられ，これらの中ではβ−ＴＣＰ，又は水酸アパタイトが好ましい。また，炭酸カルシウム系物質として，炭酸カルシウム及び炭酸水素カルシウムがあげられ，これらの中では炭酸カルシウムが好ましい。上記のカルシウム系物質は，上記の化合物が主成分であれば，上記以外の化合物などが適宜含まれていてもよい。このようなカルシウム系物質を用いることによって，多孔質のカルシウムイオン溶出制御担体を作製することができる。患部に投与する場合，多孔質の担体であれば，孔内に細胞や増殖因子などが入り，再生治療効果を高めることができる。しかしながら，担体からカルシウムイオンが溶出すると細胞毒性や炎症反応を惹起してしまう。そのため，カルシウムイオンが溶出する表面積が小さい方が好ましいので，多孔質でない方が予後が良好となる。しかしながら，本発明の担体は，表面処理剤を含ませることで，効果的にカルシウムイオンの溶出を防ぐことができるようになったので，好適に骨欠損部位などの患部に投与することができる。

本発明において，カルシウム系物質を含む移植用人工骨材料中のカルシウム系物質の割合は，移植用人工骨材料の重量を１００重量部としたときに，７０〜９５重量部があげられる。本発明の移植用人工骨材料は，カルシウム系物質及び表面処理剤のほかに，副材として，アクリル系樹脂などのバインダなど，担体の成形に必要な材料を含んでもよい。このような副材は，当業者であれば，適宜用いることができる。

［洗浄処理工程］
カルシウム系物質を含む移植用人工骨材料表面のカルシウムイオンは，洗浄処理用溶液で洗浄することによって除去することができる。よって，本発明のカルシウムイオン溶出制御人工骨材料の製造方法の好ましい態様は，表面処理剤で処理する前に，洗浄処理を施すものである。本工程において，カルシウムイオンの除去は，カルシウムイオンを洗浄処理溶液中に拡散させて取り除くことだけでなく，カルシウムイオンを除去用溶液中の成分と反応させて，塩を形成させ，移植用人工骨材料表面に残した状態も含む。このような洗浄処理溶液として，純水，蒸留水，ｐＨ緩衝液やキレート剤溶液，キャッピング剤溶液，カップリング剤溶液などがあげられる。洗浄処理工程での移植用人工骨材料の洗浄として，浸漬洗浄，液中振とう洗浄，液流洗浄などを用いることができる。

浸漬洗浄は，移植用人工骨材料を除去溶液中に浸漬させ静置し，一定時間経過後，移植用人工骨材料を引き上げ，新しい除去溶液中に再度浸漬し静置する工程を繰り返す。移植用人工骨材料を除去溶液中に浸漬させ静置し，一定時間経過後，移植用人工骨材料を引き上げる工程を１回とカウントすると，繰り返しは１〜５０回があげられ，２〜３０回が好ましく，４〜１５回がより好ましい。移植用人工骨材料を洗浄処理用溶液中に浸漬する浸漬時間は，１秒〜１時間があげられ，１０秒〜３０分が好ましい。さらに，浸漬と引き上げを繰り返す場合，浸漬時間は，一定でもよいが，徐々に浸漬時間を長くしていくことが好ましい。移植用人工骨材料に対する洗浄処理用溶液の量は，洗浄処理用溶液に浸漬する全移植用人工骨材料の容積を１としたときに，洗浄処理用溶液の容積としては，２〜５０倍があげられるが，５０倍を超えてもよい。当業者であれば，適宜調整することができる。

液中振とう洗浄は，洗浄処理用溶液中で移植用人工骨材料を振とうする。振とう洗浄は，公知の振とう機を用いることができる。振とう方法は，例えば，水平動振とう，上下動振とう，旋回振とう，または回転振とう等があげられる。水平動振とうは，水平面を保って一方向を往復する振とうであり，１往復を１回とする。水平動振とうを行う場合の振とう速度は，１〜５０回／分があげられ，５〜３０回／分が好ましく，１０〜２０回／分がより好ましい。上下動振とうは，シーソー状態での振とうである。上下動振とうにおいての１回とは，例えば，上下動振とう用装置が，振とう用容器を載置する板の中心に支点を有し，板の両端が上下に動く場合，板が水平の状態から，一端が上方向または下方向に動き，その後，反対の方向に動き，そして水平の状態に戻るという１サイクルを１回とカウントする。上下動振とうを行う場合の振とう速度は，１〜５０回／分があげられ，５〜３０回／分が好ましく，１０〜２０回／分がより好ましい。シーソー状態の上下動をする角度は，培養用容器を水平に置いた位置を０度としたときに，±１〜４５度があげられ，±５〜４０度が好ましく，±１０〜３０度がより好ましい。旋回振とうは，水平面を保ち一定方向に旋回する振とう培養である。旋回振とうにおいての１回とは，１回転をさす。旋回振とうを行う場合の振とう速度は，１〜５０回／分があげられ，１０〜４０回／分が好ましく，１５〜３０回／分がより好ましい。回転振とうは，円筒状の容器など公知の回転振とう用の容器を用い，公知の装置を用いて行うことができる。回転振とうを行う場合の回転速度は，１〜３０回転／分があげられ，５〜２５回転／分が好ましく，１０〜２０回転／分がより好ましい。このように振とう洗浄することで，移植用人工骨材料表面のカルシウムイオンが除去用溶液中に拡散しやすくなり，効率よくカルシウムイオンを除去することができる。また，上記した速度で振とうすることによって，移植用人工骨材料との界面にある除去用溶液が，移植用人工骨材料表面のカルシウムイオンと反応しやすい速度で循環することになり，効率よくカルシウムイオンを除去することができるようになる。

液流洗浄は，移植用人工骨材料に除去用溶液を噴射する。液流洗浄において，噴射速度は５〜３００ｍ／秒があげられる。通常液流洗浄を行う際は，噴射速度が速い方が洗浄力を高めることができるので好ましい。しかしながら，本発明は，除去用溶液とカルシウムイオンを反応させて除去するため，噴射速度が速いと十分にカルシウムイオンを除去することができない。そのため，噴射速度は，１０〜５０ｍ／秒が好ましく，２０〜３０ｍ／秒がより好ましい。このような速度とすることで，効果的にカルシウムイオンを除去することができる。噴霧液量，液流洗浄時間は，適宜調整することができる。人工骨材料が埋入された部位付近の組織における組織の雰囲気の下で，洗浄前の人工骨材料に比べて，カルシウムイオン溶出制御人工骨材料によるカルシウムイオンの放出量が５０％以下になるように，前記洗浄処理により人工骨材料からカルシウムイオンとして溶解する成分が除去されるものが好ましい。

［ジカルボン酸溶液］
移植用人工骨材料は，先に説明したとおり，洗浄されることが好ましい。洗浄される前，又は洗浄された後の移植用人工骨材料は，コハク酸を浸透させることが好ましい。コハク酸は，リン酸オクタカルシウム（ＯＣＰ）と接触すると，コハク酸イオンがＯＣＰのリン酸イオンと置換すると考えられる（Ｈｉｄｅｋｉ Ｍｏｎｍａ ａｎｄ Ｍａｓａｒｕ Ｇｏｔｏ，“Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ−ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ Ｏｃｔａｃａｌｃｉｕｍ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ”Ｂｕｌｌ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｊｐｎ．，５６，ｐｐ．３８４３−３８４４（１９８３））。このため，コハク酸を浸透させることで，リン酸イオンとコハク酸イオンとが置換され，これにより，カルシウムイオンが強固に固定される。よって，コハク酸を浸透させた移植用人工骨材料を生体内に埋入した際に，カルシウムイオンが溶出する事態を防止できると考えられる。そして，後述する実施例で示されたとおり，このような工程で製造したカルシウムイオン溶出制御人工骨材料は，人工骨材料からのカルシウム溶出を防ぐことができ，細胞増殖を促進することができた。

本発明の製造方法は，さらにカルシウム系物質を含有する人工骨材料に表面処理剤を浸透させる工程を含むことが好ましい。

［表面処理剤］
表面処理剤は，移植用人工骨材料に塗布又は浸漬することによって浸透させる。浸透とは，移植用人工骨材料表面またはその内部に表面処理剤を含んだ状態をいう。表面処理剤は，酸性水溶液，キレート剤，キャッピング剤，又はカップリング剤のいずれか１種又は２種以上の混合物があげられる。本発明の表面処理剤は，移植用人工骨材料を製造する材料に混合するか，表面処理剤を溶解できる公知の溶液に溶解して移植用人工骨材料に浸透させればよい。表面処理剤を溶解する溶液は，用いる表面処理剤を溶解できる公知の溶液に溶解すればよいが，好ましくは水，生理食塩水，アルコールなどである。表面処理剤溶液の濃度は，表面処理剤が溶解しうる濃度であれば特に限定されない。しかし，濃度が高すぎると粘度が高くなり，常圧下では，表面処理剤が移植用人工骨材料に浸透しにくくなるので，陰圧下，又は加圧下で行うことが好ましい。表面処理剤の浸透を陰圧下，または加圧下で行う場合は，常圧下で表面処理剤を浸透させる時よりも，短時間で高粘度（高濃度）の表面処理剤溶液を浸透させることが可能になる。陰圧下，又は加圧下で表面処理剤溶液に浸漬し，移植用人工骨材料に表面処理剤溶液を浸透させる条件は，表面処理剤溶液や移植用人工骨材料の性質に応じて，当業者が適宜設定すればよい。本発明の表面処理剤は，異なる表面処理剤を２種以上混合して用いてもよい。表面処理剤の混合比は，特に限定されない。等比で混合してもよいし，用いる表面処理剤の性質に応じて，当業者が適宜混合比を調整すればよい。表面処理剤を混合することで，表面処理剤を単独で用いるよりも，効果的にカルシウムイオンの溶出を防ぐことができるようになる。

本発明の移植用人工骨中に含まれる表面処理剤の重量が多くなると，移植用人工骨として十分な強度を得ることができなくなり，少なすぎるとカルシウム溶出を制御できなくなり好ましくない。本発明において，前記移植用人工骨材料と前記表面処理剤の重量比は，１×１０^２：１〜１×１０^５：１があげられ，１．５×１０^２：１〜１×１０^４：１が好ましく，２×１０^２：１〜１×１０^３：１がより好ましい。このような重量比とすることで，十分な強度を有し，カルシウムイオン溶出制御能も有する人工骨材料となる。

本発明のカルシウムイオン溶出制御人工骨材料として，移植用人工骨材料からのカルシウムイオンの遊離量が，表面処理剤を含まない移植用人工骨材料と比較して，２５〜１００％抑制されているものがあげられる。好ましくは，５０％以上であり，より好ましくは７０％以上，さらに好ましくは８５％以上である。このような範囲とすることで，カルシウムイオンの遊離が抑制されるので，埋入した部位付近の組織における炎症反応及び細胞毒性を防止でき得，好適に用いることができるカルシウムイオン溶出制御人工骨材料とすることができる。本発明のカルシウムイオン溶出制御人工骨材料は，人工骨材料が埋入された部位付近の組織における組織の雰囲気の下で，洗浄前の前記人工骨材料に比べて，カルシウムイオンの放出量が制御されるものが好ましい。

［酸性溶液］
本発明の酸性溶液として，アルギン酸，シュウ酸，乳酸，テレフタル酸，フィチン酸，又は，アルミン酸からなる郡より選ばれる１種又は２種以上の混合物の溶液があげられる。これらの中では，アルギン酸又は乳酸のいずれか又は両方を含む溶液が好ましい。このような酸物質を溶解する溶液には，酸物質が溶解でき，溶液を酸性に保つことができる公知の溶液を用いればよい。例えば，水，生理食塩水，アルコールなどがあげられる。通常であれば，生体に投与する生体材料には，生体材料に物質が残る場合，生体内のｐＨに合わせて，中性の物質を採用する。酸性物質やアルカリ性物質は生体内細胞に障害をきたす可能性があるからである。しかしながら，本発明においては，あえて酸性溶液を用いることが好ましい。このような酸性溶液は，カルシウムイオンと反応して，不溶性物質を形成する。このような酸性溶液を用いることで，効果的に担体からカルシウムイオンが溶出するのを防ぐことができる。

［キレート剤］
本発明のキレート剤として，グルコン酸，鎖状ポリリン酸，アスパラギン酸，エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ），フェナントロリン，メタリン酸，クエン酸，リンゴ酸，ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ），メチルグリシン二酢酸，１，２−シクロヘキサンジアミン四酢酸，ジエチレントリアミン酢酸，ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ)，２−ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ），トリエチレンテトラアミン六酢酸（ＴＴＨＡ），２−ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ），ジカルボキシメチルグルタミン酸四ナトリウム（ＧＬＤＡ），ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（ＤＨＥＧ），ジメチルグリオキシム，ジチゾン，オキシン，アセチルアセトン，又はそれらの薬学的に許容される塩からなる群から選ばれる１種又は２種以上の混合物があげられる。これらの中では，グルコン酸，鎖状ポリリン酸，アスパラギン酸，エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ），メタリン酸，クエン酸，リンゴ酸，ニトリロ三酢酸，及びメチルグリシン二酢酸からなる郡より選ばれる１種又は２種以上の混合物が望ましい。さらに，後述する実施例に示されたとおり，グルコン酸を含むものが好ましい。移植用人工骨材料にキレート剤を浸透させる場合，常圧下では，キレート剤溶液の濃度は，０．１〜４０重量％が挙げられ，１〜１０重量％でもよく，５〜１５重量％でもよい。陰圧下，又は加圧下で浸透を行う場合は，キレート剤が溶解しうる濃度であれば，４０重量％を超える濃度であってもよい。陰圧，又は加圧の条件は，担体の材質，キレート剤溶液の粘度等に応じて，当業者は適宜調整することができる。

［キャッピング剤］
本発明のキャッピング剤として，アミノ酸，ペプチド，多糖類，二糖類，レクチン，プロテオグリカン，糖タンパク，及び糖脂質のいずれか１種以上を含むのが好ましい。

キャッピング剤に含まれるアミノ酸として，“アラニン,アルギニン,アスパラギン,アスパラギン酸,システイン,グルタミン,グルタミン酸,グリシン,ヒスチジン,イソロイシン,ロイシン,リシン,メチオニン,フェニルアラニン,プロリン,セリン,スレオニン,トリプトファン,チロシン,及びバリン”からなる群から選ばれるアミノ酸，アミノ酸の誘導体，またはそれらの薬学的に許容される塩のいずれか１種又は２種以上を含むものがあげられる。アミノ酸は天然に存在するＬ体であることが好ましい。常圧下で浸透を行う場合のアミノ酸溶液の濃度としては，０．０１〜１０ｍｏｌ／Ｌが好ましく，０．０５〜５ｍｏｌ／Ｌがより好ましく，０．１〜２ｍｏｌ／Ｌがさらに好ましい。陰圧下，又は加圧下で浸透を行う場合は，アミノ酸が溶解しうる濃度であれば，１０ｍｏｌ／Ｌを超える濃度であってもよい。陰圧，又は加圧の条件は，担体の材質，キャッピング剤溶液の粘度等に応じて，当業者は適宜調整することができる。

キャッピング剤に含まれるペプチドとして，“アラニン,アルギニン,アスパラギン,アスパラギン酸,システイン,グルタミン,グルタミン酸,グリシン,ヒスチジン,イソロイシン,ロイシン,リシン,メチオニン,フェニルアラニン,プロリン,セリン,スレオニン,トリプトファン,チロシン,及びバリン”からなる群から選ばれ任意の組み合わせによりなるジペプチド，トリペプチド，テトラペプチド，ペンタペプチド，またはそれらの薬学的に許容される塩のいずれか１種又は２種以上を含むものがあげられる。ペプチドの中では，キャッピング剤を移植用人工骨材料に早く浸透させるため，ペプチド鎖が短い，ジペプチド又はトリペプチドが好ましい。常圧下で浸透を行う場合のペプチド溶液の濃度としては，０．０１〜１０ｍｏｌ／Ｌが好ましく，０．０５〜５ｍｏｌ／Ｌがより好ましく，０．１〜２ｍｏｌ／Ｌがさらに好ましい。陰圧下，又は加圧下で浸透を行う場合は，ペプチドが溶解しうる濃度であれば，１０ｍｏｌ／Ｌを超える濃度であってもよい。陰圧，又は加圧の条件は，担体の材質，キャッピング剤溶液の粘度等に応じて，当業者は適宜調整することができる。

キャッピング剤に含まれる多糖類として，プルラン，グァーガム，ラムダカラギナン，トラガントガム，ペクチン，マンナン，デキストラン，マルトデキストラン，グルコマンナン，アミロース，アミロペクチン，アガロース，タマリンドシードガム，カラギーナン，ジェランガム，カルボキシメチルセルロース，キサンタンガム，カラヤガム，アラビアガム，ガッディガム，アラビノガラクタン，カードランまたはこれらの酸性塩（例えば硫酸塩）のうち，いずれか又は２種以上があげられる。これらの中では，プルラン，デキストラン，またはマルトデキストランが好ましく，デキストランがより好ましい。常圧下で浸透を行う場合の多糖類溶液の濃度としては，１〜４０重量％が好ましく，５〜３０重量％がより好ましく，１５〜２５重量％がさらに好ましい。陰圧下，又は加圧下で浸透を行う場合は，多糖類が溶解しうる濃度であれば，４０重量％を超える濃度であってもよい。陰圧，又は加圧の条件は，担体の材質，キャッピング剤溶液の粘度等に応じて，当業者は適宜調整することができる。

キャッピング剤に含まれる二糖類として，マルトース，イソマルトース，セロビオース，ゲンチオビオース，ニゲロース，ラミナリビオース，コージビオース，スホロース，メリビオース，ラクトース，ツラノース，ソホロース，トレハロース，イソトレハロース，スクロース，ラクトース及びイソサッカロースがあげられる。これらの中では，トレハロース，イソトレハロース，マルトース，イソマルトース、セロビオース，またはゲンチオビオースが好ましく，トレハロースがより好ましい。後述する実施例で示されたとおり，トレハロースを含むことで効果的にカルシウムイオンの溶出を防ぐことができる。常圧下で浸透を行う場合の２糖類溶液の濃度としては，１〜４０重量％が好ましく，５〜３０重量％がより好ましく，１５〜２５重量％がさらに好ましい。陰圧下，又は加圧下で浸透を行う場合は，多糖類が溶解しうる濃度であれば，４０重量％を超える濃度であってもよい。陰圧，又は加圧の条件は，担体の材質，キャッピング剤溶液の粘度等に応じて，当業者は適宜調整することができる。

キャッピング剤に含まれる糖タンパクとして，プロテオグリカン，ムチン，またはアビジンがあげられ，プロテオグリカンが好ましい。プロテオグリカンとしてムコ多糖とタンパク質の複合体があげられる。さらにムコ多糖の例として，ヒアルロン酸，コンドロイチン硫酸，へパラン硫酸，ケラタン硫酸，デルマタン硫酸，へパリンなどがあげられる。糖タンパクの溶液濃度としては，１〜３０重量％があげられ，好ましくは１５〜２５重量％である。キャッピング剤に含まれる糖脂質として，ガラクト脂質，スルホ脂質，スフィンゴ脂質（セレブロシド，ガングリオシド），糖スフィンゴリン脂質などがあげられる。糖脂質の濃度としては，１〜３０重量％があげられ，好ましくは１０〜２０重量％である。このような濃度の溶液を用いることで，効果的に表面処理を行うことができる。

［カップリング剤］
表面処理剤に含まれるカップリング剤として，アルミネート系カップリング剤,チタノール系カップリング剤，またはシラノール系カップリング剤などがあげられる。これらの中では，シラノール系カップリング剤が好ましい。カップリング剤溶液の濃度としては，１〜１５重量％があげられ，好ましくは５〜１０重量％である。そして，本発明においてカップリング剤は，弱酸性（ｐＨ４．５〜６．５）の溶液で溶解することが好ましい。このようなｐＨの溶液を用いることで，表面処理剤としての効果を高めることができる。

本発明の第１の側面の好ましい態様は，カルシウムイオン放出制御担体は，さらに薬剤を含む。このような薬剤として，細胞膜保護剤，抗炎症剤，骨再生剤，成長因子などがあげられる。

［細胞膜保護剤］
本発明の細胞膜保護剤としては，多糖類，二糖類，糖タンパク，糖脂質，脂肪酸などがあげられる。好ましくは，二糖類であり，マルトース，イソマルトース，セロビオース，ゲンチオビオース，ニゲロース，ラミナリビオース，コージビオース，スホロース，メリビオース，ラクトース，ツラノース，ソホロース，トレハロース，イソトレハロース，スクロース，ラクトース及びイソサッカロースがあげられるが，スクロース，ラクトース，トレハロース，マルトースがより好ましく，トレハロース，スクロースがさらに好ましい。

［抗炎症剤］
本発明の抗炎症剤としては，スタチン系，ステロイド系，非ステロイド系などがあげられる。スタチン系としては，ロスバスタチン（ｒｏｓｕｖａｓｔａｔｉｎ），ピチバスタチン（ｐｉｔｉｖａｓｔａｔｉｎ），シンバスタチン（ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ），プラバスタチン（ｐｒａｖａｓｔａｔｉｎ），セリバスタチン（ｃｅｒｉｖａｓｔａｔｉｎ），メバスタチン（ｍｅｖａｓｔａｔｉｎ）、ベロスタチン（ｖｅｌｏｓｔａｔｉｎ），フルバスタチン，ロバスタチン（ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ）フルインドスタチン（ｆｌｕｉｎｄｏｓｔａｔｉｎ），又はアトルバスタチン（ａｔｏｒｖａｓｔａｔｉｎ）などがあげられる。スタチン系は，細胞膜保護作用も有しており，スタチン系を含むカルシウムイオン溶出制御担体は，生体内への投与に好適に用いることができる。

ステロイド系としては，デキサメタゾン，トリアムシノロンアセトニド，プロピオン酸ベクロメタゾン，コハク酸ヒドロコルチゾン，コハク酸メチル，プレドニゾロン，酢酸デキサメタゾン，酢酸ヒドロコルチゾン，酢酸プレドニゾロン，デキサメタゾンメタスルホ酸安息香酸，トリアムシノロンジアセテート，ブチル酢酸プレドニゾロン，リン酸デキサメタゾン，リン酸ヒドロコルチゾン，リン酸プレドニゾロン，リン酸ベタメタゾン，コハク酸プレドニゾロン，酢酸コルチゾン，酢酸パラメタゾン，酢酸メチルプレドニゾロン，トリアムシノロン，ヒドロコルチゾン，プレドニゾロン，ベタメタゾン，吉草酸酢酸プレドニゾロン，吉草酸ジフルコルトロン，吉草酸デキサメタゾン，吉草酸ベタメタゾン，酢酸ジフルプレドナート，酢酸ジフロラゾン，ジフルプレドナート，ジプロピオン酸ベタメタゾン，ピバル酸フルメタゾン，フルオシノニド，フルオシノロンアセトニド，プロピオン酸アルクロメタゾン，プロピオン酸ベクロメタゾン，酪酸クロベタゾン，酪酸ヒドロコルチゾン，酪酸プロピオン酸ヒドロコルチゾン，酢酸フルドロコルチゾン，パルチミン酸デキサメタゾン，メチルプレドニゾロンなどがあげられる。

非ステロイド系としては，ブフェキサマク，イブプロフェンピコノール，スプロフェン，ウフェナマート，インドメタシン，ピロキシカム，アンピロキシカム，メロキシカム，ロルノキシカム，ベンザダック，ケトプロフェン，イブプロフェン，フルルビプロフェン，ナプロキセン，ロキソプロフェン，アルミノプロフェン，フェルビナク，ジクロフェナクナトリウム，スリンダック，フルフェナム酸，メフェナム酸，トルフェナム酸，グリチルレチン酸及びその塩，グリチルリチン酸及びその塩，サリチル酸グリコール，サリチル酸メチルなどがあげられる。

[骨再生剤]
骨再生剤として，カルモジュリン，アクチノマイシンＤ，サイクロスポリンＡ，硫酸グルコサミン，塩酸グルコサミン，骨髄エキス，リン酸カルシウム，乳酸／グリコール酸／ε−カプロラクトン共重合体，多血小板血漿，又はヒト骨髄間葉細胞のいずれか1種又は2種以上の混合物があげられる。これらはいずれも公知の方法により得ることができる。

［成長因子］
成長因子とは，個体の初期発生から個体の維持さらに老化に至る多細胞動物の過程において，細胞の増殖や分化の調節因子として機能する因子である。具体的な例として，上皮成長因子（ＥＧＦ：Epidermal Growth Factor），インスリン様成長因子（ＩＧＦ：Insulin−like Growth Factor），トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ：Transforming Growth Factor），血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ：Vascular Endothelial Growth Factor），肝細胞成長因子（ＨＧＦ：Hepatocyte Growth Factor），血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ：Platelet−derived Growth Factor），胎児型平滑筋ミオシン重鎖（ＳＭｅｍｂ：Embryonic Smooth Mascule Myosin heavy chain），骨形成因子（ＢＭＰ：Bone Morphogenetic protein），顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ：Granulocyte colony−stimulating Factor），エリスロポエチン（ＥＰＯ：Erythropoietin），トロンボポエチン（ＴＰＯ：thrombopoietin），又は，塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ：basic Fibroblast Growth Factor）などがあげられる。成長因子を含むことで，カルシウムイオン溶出制御担体を患部に投与した際，患部での細胞増殖等を促進することができ，治療効果を高めることができる。これら成長因子は，公知の方法で得ることができ，１種または２種以上を混合して含ませてもよい。また，カルシウムイオン溶出制御担体を骨欠損部位などに投与する場合は，これら成長因子のなかでも，骨成長因子を含むことが好ましい。

［骨成長因子］
骨成長因子とは，上記のような成長因子のうち骨成長に関与する生体内で産生されうる因子である。例えば，上皮成長因子（ＥＧＦ），トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β），インシュリン様成長因子（ＩＧＦ），血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ），肝細胞成長因子（ＨＧＦ），血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）,胎児型平滑筋ミオシン重鎖（ＳＭｅｍｂ），骨形成因子（ＢＭＰ）などがあげられる。このような骨成長因子は公知の方法で得ることができ，１種または２種以上を混合して，骨成長剤としても使用できる。後述する実施例で示されたとおり，本発明の担体は，担体用移植用人工骨材料の構成物であるカルシウム系物質からカルシウムイオンが溶出するのを防ぐことができ，投与部位での炎症反応，細胞毒性などを抑制することができる。よって，本発明の担体に骨成長因子等を含ませることによって，治療効果を効果的に高めることが可能となる。

本発明は，また，カルシウムイオン溶出制御人工骨材料の製造方法に関する。本発明のカルシウムイオン溶出制御人工骨材料の製造方法は，カルシウム系材料を含有する人工骨材料を，洗浄処理する工程を含む。この工程により，前記人工骨材料が生体内に埋入された際に前記人工骨材料表面から遊離するカルシウムイオンを除去し，これにより，前記カルシウムイオンにより惹起される，前記人工骨材料が埋入された部位付近の組織による炎症反応及び細胞毒性を防止できるカルシウムイオン溶出制御人工骨材料を製造することができる。本発明の製造方法において，洗浄処理する工程は，純水，ｐＨ緩衝液，キレート剤溶液，キャッピング剤，又はカップリング剤溶液を用いて洗浄する。キレート剤，キャッピング剤，カップリング剤としては,上記した物質等を用いることができる。本発明において，純水は，蒸留水だけでなく，精製水や超純水，滅菌水なども含む。また，人工材料製造で使用される公知の水を使うことができる。

［ｐＨ緩衝液］
本発明の製造工程において，ｐＨ緩衝液は，公知のｐＨ緩衝液を用いることができる。たとえば，リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ），グリシン−ＨＣｌ緩衝液，クエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液，酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液，コハク酸ナトリウム−ＮａＯＨ緩衝液，カコジル酸ナトリウム−ＨＣｌ緩衝液，リンゴ酸ナトリウム−ＮａＯＨ緩衝液，トリス−リンゴ酸緩衝液，ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液，ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液，ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液，イミダゾール−ＨＣｌ緩衝液，リン酸緩衝液，ＴＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液，ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液，トリシン−ＨＣｌ緩衝液，トリス−ＨＣｌ緩衝液，ＥＰＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液，グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝液，ＴＡＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液，ホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液，グリシン−ＮａＯＨ緩衝液，炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム緩衝液，炭酸ナトリウム−ＮａＯＨ緩衝液などがあげられる。これら緩衝液の調整は，公知の方法で行えばよく，使用濃度も当業者であれば適宜調整することができる。これら緩衝液の中では，使用ｐＨ範囲が酸性領域の緩衝液が好ましい。通常であれば，生体に投与する物質を洗浄する緩衝液としては，生理的条件に近いｐＨ領域（ｐＨ７〜８）の緩衝液を用いる。しかしながら，本発明では，使用ｐＨ範囲が酸性領域（ｐＨ２〜７）の緩衝液が好ましい。上記した緩衝液中，酸性領域の緩衝液として，グリシン−ＨＣｌ緩衝液，クエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液，酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液，コハク酸ナトリウム−ＮａＯＨ緩衝液，カコジル酸ナトリウム−ＨＣｌ緩衝液，リンゴ酸ナトリウム−ＮａＯＨ緩衝液，トリス−リンゴ酸緩衝液，又はＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液があげられる。このような酸性領域の緩衝液を用いることで，効果的にカルシウムイオンを除去することができる。

本発明は，また，移植用人工骨材料を，グルコン酸溶液を用いて洗浄処理する工程と，前記洗浄処理した移植用人工骨材料に，グルコン酸溶液を浸透させる工程とを含むカルシウムイオン溶出制御人工骨材料の製造工程に関する。このようなグルコン酸溶液の濃度として，洗浄処理工程では，０．１重量％〜２０重量％があげられ，好ましくは０．２〜１０重量％であり，さらに好ましくは０．５重量％〜５重量％である。また，浸透工程に用いるグルコン酸溶液の濃度は，０．１重量％〜２０重量％があげられ，好ましくは０．５重量％〜１５重量％であり，さらに好ましくは，２重量％〜１０重量％である。このようなグルコン酸を溶解させる溶液としては，水やエタノールなど公知のものを適宜用いればよい。洗浄処理工程や浸透工程は，下記のような工程を適宜用いることができる。

このような製造工程によって，カルシウム溶出制御人工骨材料からのカルシウムイオンの遊離量が，本発明の製造工程を経ない移植用人工骨材料と比較して，２５〜１００％抑制されているものを製造することができる。目的とするカルシウムイオン遊離抑制効果を得るためには，下記に記載した洗浄処理工程又は浸透工程を適宜調整して行う。カルシウムイオン抑制率として，好ましくは，５０％以上であり，より好ましくは７０％以上，さらに好ましくは８５％以上である。以下，本発明の製造工程について具体的に説明するが，本発明は以下の例に限定されるものでなく，当業者であれば，適宜変更を加えることができる。

［浸透工程］
前記移植用人工骨材料に表面処理剤を浸透させる工程は，移植用人工骨材料に表面処理剤を塗布するか，又は移植用人工骨材料を表面処理剤の溶液に浸漬する工程である。表面処理剤を浸漬又は塗布するための工程は，移植用人工骨材料に表面処理剤を含浸又は塗布できる方法であれば特に限定されない。移植用人工骨材料の製造工程において，原料として表面処理剤を混合してもよい。浸透工程としては，浸漬，スプレー塗布，スピンコート塗布があげられる。具体的な浸漬方法は，移植用人工骨材料を表面処理剤溶液中に浸漬し，常温常圧にて１時間〜６時間静置することにより，表面処理剤を含浸させるものがあげられる。また，表面処理剤を含浸させる工程は，陰圧下，又は加圧下で行ってもよい。陰圧下，または加圧下で含浸させることで，常圧下より短時間で表面処理剤を移植用人工骨材料に浸透させることができる。陰圧，または加圧時の条件は，当業者であれば，移植用人工骨材料や表面処理剤溶液に応じて，適宜調整することができる。表面処理剤を塗布する方法としては，スプレー塗布，またはスピンコート塗布を用いることもできる。表面処理剤を浸透させた移植用人工骨材料は，滅菌処理を行ってもよい。

［表面処理剤の乾燥工程］
本発明の好ましい態様は，さらに前記表面処理剤を浸透させた移植用人工骨材料を乾燥させる乾燥工程を含む。表面処理剤を浸透させた移植用人工骨材料を乾燥させた後に薬剤を含ませる工程を行うことで，薬剤をむらなく移植用人工骨材料に含ませることができる。乾燥工程は，表面処理剤の性質等に応じて適宜調整すればよいが，例えば，３０〜２００℃の乾燥機中に静置する方法があげられる。乾燥時間は２分〜６０分があげられるが，６０分を超えてもよい。乾燥時間を短縮するために，送風下に静置してもよい。風速としては０．１〜５ｍ／秒があげられるが，送風速度が速すぎたり，遅すぎたりすると，むらができてしまう。また，遅すぎると乾燥に時間がかかり製造効率が低下する。よって，風速は０．２〜３ｍ／秒が好ましく，０．５〜１．５ｍ／秒がより好ましい。

以下，実施例を用いて本発明を具体的に説明する。しかしながら，本発明は，以下の実施例に限定されるものではない。本発明には，当業者にとって自明な範囲内で適宜設計変更を行うことができるものも含まれる。

製造例１
移植用人工骨材料の製造
α−ＴＣＰ（太平科学産業株式会社製）を主原料として，Ｚプリンター４０６（Ｚｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を用いて移植用人工骨材料を製造した。この移植用人工骨材料を硬化液に浸漬した。硬化液は，０．２ｍｏｌ／Ｌのコハク酸水溶液（ｐＨ６）を使用した。硬化液に浸漬後，テトラポッド型カルシウムイオン溶出制御担体を大塚蒸留水で２回洗浄し，真空低温乾燥機（ヤマト科学社製）を用いて，１２時間減圧乾燥した。

カルシウムイオン上昇と細胞毒性の検討
トレハロース処理人工骨材料からのカルシウムイオン溶出抑制効果
カルシウムイオンの溶出による細胞毒性は，トレハロース処理を行った人工骨材料と未処理の人工骨材料を，それぞれマウス骨芽様細胞ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１と共培養し，細胞増殖を測定することで評価を行った。培養培地は，１０％ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）と，１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｄ−ＭＥＭ）を使用した。製造例１の移植用人工骨材料（未処理テトラ）と，さらに４．５％トレハロース溶液で処理（トレハロース溶液に浸漬）を行ったもの（処理テトラ）を用意した。９６ウェルプレートの各ウェルに未処理テトラ，または処理テトラを加えた。また，対照実験として移植用人工骨材料を加えないものも用意した（テトラ０個）。その後，マウス骨芽様細胞ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１を２５００個／ウェルとなるように播種した。７２時間培養後，Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（同仁科学研究所社製）を加え，呈色反応を行った。反応後，マイクロプレートリーダーを用いて吸光度（４５０ｎｍ）を測定し，細胞増殖を調べた。その結果を図１に示した。

図１は，担体から溶出されるカルシウムイオンが細胞増殖に与える影響を示す。図１の縦軸は，細胞増殖の指標を示す吸光度の値を示す。すなわち，吸光度の値が大きいほど，細胞増殖が良いことを意味する。また，図中「テトラ」とは，テトラポッド状の担体を示す。結果，トレハロースを処理していない担体（未処理テトラ）がウェル内に含まれている条件では，テトラ０個及び処理テトラ２個と比較して，吸光度が低いことが分かった。すなわち，未処理テトラを含むウェルは，テトラ０個のウェル又は処理テトラを含むウェルよりも細胞数が少ないことが分かった。このことより，移植用人工骨材料は，かえって細胞増殖を抑制するか，又は毒性を有することがわかる。一方，処理テトラ２個のものは，テトラ０個のものや未処理テトラに比べて細胞数が多い。これにより，移植用人工骨材料表面がトレハロースで覆われることによって，担体からのカルシウムイオン溶出が抑制された可能性が示唆された。

グルコン酸のキレート効果検討
グルコン酸によるカルシウムイオンのキレート効果を確認するために，カルシウムイオン電極を用いて，グルコン酸存在下でのカルシウムイオン濃度を測定した。その結果を図２に示した。図２の縦軸は，カルシウムイオン（Ｃａ^２＋）の濃度（ｍｇ／Ｌ）を示す。２．５ｍＭＣａＣｌ_２−０．２５％〜２．５％グルコン酸溶液（Ｇｌｕ）（ｐＨ７．０）を調整し，カルシウムイオン濃度を測定したところ，グルコン酸濃度が高くなるに従い，カルシウムイオン濃度が低下することが分かった。この結果は，グルコン酸によってカルシウムイオンがキレートされた結果であると考えられる。
よって,移植用人工骨材料を，グルコン酸溶液を用いて洗浄処理することで，移植用人工骨材料から遊離し，移植用人工骨材料の表面などに付着したカルシウムイオンを，グルコン酸がキレートしていくので，移植用人工骨材料の表面などに付着したカルシウムイオンを，効果的に除去することができる。または移植用人工骨材料にグルコン酸溶液を浸透させることで，移植用人工骨材料から遊離してくるカルシウムイオンをグルコン酸溶液がキレートしていくので，移植用人工骨材料からカルシウムイオンが遊離されるのを防ぐことができる。

グルコン酸による炎症反応抑制効果
細胞外カルシウムイオン濃度が上昇すると，細胞内カルシウムイオンの増加や細胞外カルシウムイオンの感知機構によって，炎症反応経路が活性化される。そこで，カルシウムイオンのキレートによって，カルシウムイオン増加による炎症反応の誘導を抑制できるかを検討した。ＮａＯＨを用いてそれぞれのｐＨを７付近に調製した５ｍＭ ＣａＣｌ_２−０．３８４％グルコン酸および７．５ｍＭ ＣａＣｌ_２−０．３８４％グルコン酸（Ｃａ^２＋Ｇｌｕｃ．Ａｃｉｄと表記）を調製し，１時間室温で静置した。前日に１μＣｉ［^３Ｈ］アラキドン酸でラベルしたマウスマクロファージ様細胞ＲＡＷ２６７．４を，各種ＣａＣｌ２-グルコン酸溶液で１時間処理した後，放出される脂質メディエーター（ｌｉｐｉｄ ｍｅｄｉａｔｏｒ）を液体シンチレーションカウンターで測定した。その結果を図３に示す。

図３は，グルコン酸がカルシウムイオンによって誘導される炎症反応を抑制することを示す図面に替わるグラフである。図３Ａ及び図３Ｂの縦軸は，アラキドン酸放出（［^３Ｈ］アラキドン酸が放出された率）を示す。すなわち，値が高いほど，アラキドン酸が放出され，主要炎症反応であるアラキドン酸カスケードが活性化されたことを示す。図３において，モック（ｍｏｃｋ）は，ＣａＣｌ_２及び，グルコン酸を添加していない状態であり，比較対象として用意した。結果，モックと比較して，ＣａＣｌ_２を添加することによって，脂質メディエーターの放出が増加し，主要な炎症反応経路の一つであるアラキドン酸カスケードが活性化するが，グルコン酸存在下ではアラキドン酸カスケードの活性化が抑制されることが明らかとなった。これは，カルシウムイオンがグルコン酸にキレートされることで，遊離カルシウムイオン濃度が低下し，アラキドン酸カスケードの活性化が抑制されたためと考えられる。よって，グルコン酸を用いることで，カルシウムイオンによる炎症反応が抑制されるといえる。移植用人工骨材料をグルコン酸溶液を用いて洗浄処理することで，移植用人工骨材料から遊離し，移植用人工骨材料の表面などに付着したカルシウムイオンを除去し，または移植用人工骨材料にグルコン酸溶液を浸透させることで，移植用人工骨材料から遊離されるのを防ぐことができるの。よって，移植用人工骨材料を，グルコン酸溶液を用いて洗浄処理する，または移植用人工骨材料に浸透させることで，これら移植用人工骨を埋入した部位において，炎症反応抑制効果を得ることができる。

本発明のカルシウムイオン溶出制御担体は，例えば骨欠損部位へ投与など，医療分野で好適に用いることができる。

Claims (15)

1. カルシウム系物質を含有する人工骨材料を，洗浄処理する工程を含み，
   これにより，前記人工骨材料が生体内に埋入された際に前記人工骨材料表面から遊離するカルシウムイオンを除去し，
   前記カルシウムイオンにより惹起される，前記人工骨材料が埋入された部位付近の組織における炎症反応及び細胞毒性を防止できるカルシウムイオン溶出制御人工骨材料を製造する，
   カルシウムイオン溶出制御人工骨材料の製造方法。
2. 前記カルシウムイオン溶出制御人工骨材料は，
   前記人工骨材料が埋入された部位付近の組織における組織の雰囲気の下で，洗浄前の前記人工骨材料に比べて，カルシウムイオン溶出制御人工骨材料によるカルシウムイオンの放出量が５０％以下になるように，前記洗浄処理により人工骨材料からカルシウムイオンとして溶解する成分が除去される，
   請求項１に記載のカルシウムイオン溶出制御人工骨材料の製造方法。
3. 前記人工骨材料が焼結された人工骨材料である，
   請求項１に記載のカルシウムイオン溶出制御人工骨材料の製造方法。
4. 前記洗浄処理する工程は，
   純水，ｐＨ緩衝液，キレート剤溶液，キャッピング剤溶液，又はカップリング剤溶液を用いて，前記人工骨材料を洗浄する工程である，
   請求項１に記載のカルシウムイオン溶出制御人工骨材料の製造方法。
5. さらに，洗浄処理された人工骨材料に表面処理剤を浸透させる工程を含む，
   請求項１に記載のカルシウムイオン溶出制御人工骨材料の製造方法。
6. 前記洗浄処理する工程は，グルコン酸溶液を用いて人工骨材料を洗浄する工程であり，
   さらに，前記洗浄処理した移植用人工骨材料に，グルコン酸を浸透させる工程を含む，
   請求項1に記載のカルシウムイオン溶出制御人工骨材料の製造方法。
7. 前記カルシウム系物質を含有する人工骨材料が，コハク酸を浸透させたものであり，
   前記洗浄処理する工程は，前記コハク酸を浸透させた人工骨材料を洗浄する工程であり，
   前記洗浄処理した移植用人工骨材料にトレハロースを浸透させる工程を，さらに含む，請求項１に記載のカルシウムイオン溶出制御人工骨材料の製造方法。
8. カルシウム系物質を含む移植用人工骨材料と，
   前記移植用人工骨材料に塗布された表面処理剤，又は前記移植用人工骨材料に浸漬された表面処理剤と，を含む，
   カルシウムイオン溶出制御処理が施された人工骨材料であって，
   前記表面処理剤は，前記移植用人工骨材料からカルシウムイオンが溶出することを防ぐことにより，前記カルシウムイオンによる移植用人工骨材料近接組織の炎症反応及び細胞毒性を抑制するものである，
   カルシウムイオン溶出制御人工骨材料。
9. 前記表面処理剤は，
   ＰＨ緩衝液，キレート剤，キャッピング剤，又はカップリング剤のいずれか１種または２種以上の混合物である，
   請求項８に記載のカルシウムイオン溶出制御人工骨材料。
10. 前記表面処理剤は，キレート剤であり，
    前記キレート剤は，グルコン酸，鎖状ポリリン酸，アスパラギン酸，エチレンジアミン四酢酸，メタリン酸，クエン酸，リンゴ酸，ニトリロ三酢酸，及びメチルグリシン二酢酸からなる群より選ばれる１種または２種以上の混合物である，
    請求項８に記載のカルシウムイオン溶出制御人工骨材料。
11. 前記表面処理剤は，キャッピング剤であり，
    前記キャッピング剤は，
    アミノ酸，ペプチド，多糖類，二糖類，レクチン，プロテオグリカン，糖タンパク，及び糖脂質からなる群より選ばれる１種または２種以上の混合物である，
    請求項８に記載のカルシウムイオン溶出制御人工骨材料。
12. 前記表面処理剤は，トレハロースである，
    請求項８に記載のカルシウムイオン溶出制御人工骨材料。
13. 前記表面処理剤は，カップリング剤であり，
    前記カップリング剤は，アルミネート系カップリング剤，チタノール系カップリング剤，又はシラノール系カップリング剤である，
    請求項８に記載のカルシウムイオン溶出制御人工骨材料。
14. さらに，薬剤を含む，
    請求項８に記載のカルシウムイオン溶出制御人工骨材料。
15. 前記カルシウムイオン溶出制御人工骨材料は，さらに薬剤を含み，
    前記薬剤は，細胞膜保護剤，又は抗炎症剤のいずれか又は両方である，
    請求項８に記載のカルシウムイオン溶出制御人工骨材料。

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