CN107513498A - 一种骨生物功能分析多孔细胞培养板 - Google Patents

一种骨生物功能分析多孔细胞培养板 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种骨生物功能分析多孔细胞培养板，旨在于提供一种磷酸钙复合物桥连均匀，表面结构完整，保持有理想的骨仿生合成表面结构的细胞培养板；其技术方案通过下述步骤制备：1400～1600℃高温煅烧无水磷酸氢钙和碳酸钙混合生成TTCP，研磨搅拌过筛获得直径1～80μm的TTCP颗粒；研磨搅拌过筛获得直径0.4～3.0μm的DCPA颗粒；按摩尔质量比1～3:3～1混合TTCP和DCPA制备CPC粉末，以双蒸水作为液相制得液相CPC；再加入双蒸水，超声搅拌得到CPC原液溶度1mg～5mg/ml的CPC混悬液。

Description

一种骨生物功能分析多孔细胞培养板
技术领域
本发明公开了一种细胞培养板，具体地说，是一种骨生物功能分析多孔细胞培养板。
背景技术
骨生物功能分析多孔细胞培养板用于评估对药物治疗反应的细胞功能活性，主要用于成骨细胞生物学相关的细胞分化和功能研究，是骨细胞生物和分子机制研究的重要工具。目前国内尚无商业化产品提供，只能依赖进口美国Sigma公司的的相关产品价格极其昂贵，很大程度上限制了成骨细胞生物学相关的细胞分化和功能研究在临床的应用。
发明内容
针对上述不足，本发明的目的是提供一种基于磷酸钙复合的骨生物功能分析多孔细胞培养板，该骨生物功能细胞培养板，磷酸钙复合物桥连均匀，表面结构完整，保持有理想的骨仿生合成表面结构，同时CPC属于无机非生物物质，兼顾成骨细胞和破骨细胞分化与功能研究。
为此，本发明提供的技术方案是这样的：
一种骨生物功能分析多孔细胞培养板，所述的骨生物功能分析多孔细胞培养板依次通过下述步骤制得的：
1)CPC固相和液相制备
1400～1600℃高温煅烧重量比为136.06：100.09的无水磷酸氢钙和碳酸钙的生成TTCP，研磨搅拌过筛获得直径1～80μm的TTCP颗粒；TTCP颗粒研磨搅拌过筛获得直径0.4～3.0μm的DCPA颗粒；所述的TTCP和DCPA 按摩尔质量比1～3:3～1混合制备CPC粉末，以ddH2O双蒸水作为液相制液相CPC；
2)制备CPC混悬液
将步骤1)制备的液相CPC加入ddH2O双蒸水液相，超声搅拌得到CPC 原液溶度1mg～10mg/ml的CPC混悬液；
3)构建骨生物功能分析多孔细胞培养板
备常规96孔细胞培养板，每孔加入步骤2)中的CPC混悬液50～300ul 至细胞培养板底部，37℃水浴12-24小时待该悬浮液干结，用γ射线灭菌后备用。
作为本发明的进一步优选，上述的一种骨生物功能分析多孔细胞培养板，所述的ddH2O占CPC粉末的重量比体积为1-30％。
作为本发明的进一步优选，上述的一种骨生物功能分析多孔细胞培养板，其特征在于：TTCP/DCPA分别按摩尔质量比1/3或1/2.5或1/2或1/1.5或 1/1或2/1或3/1混合制备CPC粉末。
作为本发明的进一步优选，上述的一种骨生物功能分析多孔细胞培养板，所述的CPC悬浮液的最终溶解液浓度为1mg/ml或者1.5mg/ml或2.0mg/ml， 2.5mg/ml或3.0mg/ml或.5mg/ml或4.0mg/ml。
作为本发明的进一步优选，上述的一种骨生物功能分析多孔细胞培养板，所述的超声搅拌时的时间为10-30秒，震动幅度为30-60％。
作为本发明的进一步优选，上述的一种骨生物功能分析多孔细胞培养板，所述的CPC粉末粒径为50-250μm。
本发明的后一个技术方案是提供上述骨生物功能分析多孔细胞培养板作为骨细胞生物学相关的细胞分化和功能研究应用。
与现有技术相比，本发明提供的提供的技术方案具有如下优点：
1、本发明可完全替代同类型进口产品，填补国内空白。
2、本发明采用的原材料为安全无毒的磷酸钙复合物，是一种可降解的功能无机化合物，磷酸四钙、无水磷酸氢钙源于天然矿物，均为安全无毒的的天然成分。在美国已通过FDA认证，被广泛应用于制药、医用工程材料和现代化工业领域。
3、本发明制备的磷酸钙复合物微球，使骨生物功能分析多孔细胞培养板构建成为可能，新型合成技术制备磷酸钙复合物微球可减少微球表面变性发生，形成的类似于骨的空间结构有利于营养物质和废物的扩散，模拟天然骨组织的细胞外基质成分，可为骨细胞提供最佳的培养环境。
4、本发明制备的骨生物功能分析多孔细胞培养板不仅保留了良好生物相容性，而且还显著提高了骨诱导作用和携带细胞能力，具有优异的生物相容性，可促进更多的细胞贴壁，用于成骨细胞和破骨细胞分化与功能研究的应用。
5、本发明制备工艺易于控制，操作简便，采用本发明方法制备骨生物功能分析多孔细胞培养板可显著促进成骨细胞和破骨细胞分化与功能研究应用，同时明显降低研究消耗费用，在骨免疫研究领域具有一定的先进性和创新性，可为骨免疫研究工具提供新思路和新方法，该细胞培养板能够实现产业化生产，相关产品具有较大的市场竞争力，可以很好地应用到各类骨免疫研究，具有广阔的临床应用和市场前景。
6、本发明提供的新型骨生物功能分析多孔细胞培养板，该骨生物功能细胞培养板，磷酸钙复合物桥连均匀，表面结构完整，保持有理想的骨仿生合成表面结构，同时CPC属于无机非生物物质，兼顾成骨细胞和破骨细胞分化与功能研究。
附图说明
图1是破骨细胞前体在骨生物功能分析多孔细胞培养板中培养5天拍照图；
图2是破骨细胞前体在骨生物功能分析多孔细胞培养板中培养5天后培养板底部吸收面积的定量图。
具体实施方式
以下实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以下实施例。所述技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的内容和各参数所取范围，均可实现本发明的目的。
实施例1
1500℃高温煅烧重量比为136.06：100.09的无水磷酸氢钙和碳酸钙的生成TTCP，研磨搅拌过筛获得直径1～80μm的TTCP颗粒。研磨搅拌过筛获得直径0.4～3.0μm的DCPA颗粒。TTCP(MW＝366.254g/mol)/DCPA (MW＝136.057g/mol)按摩尔质量比1/3混合制备CPC粉末。以ddH2O (2.5％W/V)双蒸水作为液相。250mgCPC加入100mLddH2O(2.5％W/V) 双蒸水得到2.5mg/mLCPC原液，超声搅拌(50％震动幅度，20秒)，形成均匀的CPC混悬液，测量微球直径和内部结构、形态备用。常规96孔细胞培养板，每孔加入50ulCPC混悬液然至细胞培养板底部，37℃水浴待该悬浮液干结，用γ射线灭菌后备用。
实施例2
1400℃高温煅烧重量比为136.06：100.09的无水磷酸氢钙和碳酸钙的生成TTCP，研磨搅拌过筛获得直径1～80μm的TTCP颗粒。研磨搅拌过筛获得直径0.4～3.0μm的DCPA颗粒。TTCP(MW＝366.254g/mol)/DCPA (MW＝136.057g/mol)按摩尔质量比1/2.5混合制备CPC粉末。以ddH2O (2.5％W/V)双蒸水作为液相。250mgCPC加入100mLddH2O(2.5％W/V) 双蒸水得到2.5mg/mLCPC原液，超声搅拌(50％震动幅度，20秒)，形成均匀的CPC混悬液，测量微球直径和内部结构、形态备用。常规96孔细胞培养板，每孔加入100ulCPC混悬液然至细胞培养板底部，37℃水浴待该悬浮液干结，用γ射线灭菌后备用。
实施例3
1500℃高温煅烧重量比为136.06：100.09的无水磷酸氢钙和碳酸钙的生成 TTCP，研磨搅拌过筛获得直径1～80μm的TTCP颗粒。研磨搅拌过筛获得直径0.4～3.0μm的DCPA颗粒。TTCP(MW＝366.254g/mol)/DCPA (MW＝136.057g/mol)按摩尔质量比1/2混合制备CPC粉末。以ddH2O (2.5％W/V)双蒸水作为液相。250mgCPC加入100mLddH2O(2.5％W/V)双蒸水得到2.5mg/mLCPC原液，超声搅拌(50％震动幅度，20秒)，形成均匀的CPC混悬液，测量微球直径和内部结构、形态备用。常规96孔细胞培养板，每孔加入150ulCPC混悬液然至细胞培养板底部，37℃水浴待该悬浮液干结，用γ射线灭菌后备用。
实施例4
1500℃高温煅烧重量比为136.06：100.09的无水磷酸氢钙和碳酸钙的生成 TTCP，研磨搅拌过筛获得直径1～80μm的TTCP颗粒。研磨搅拌过筛获得直径0.4～3.0μm的DCPA颗粒。按TTCP(MW＝366.254g/mol)/DCPA (MW＝136.057g/mol)按摩尔质量比1/1.5混合制备CPC粉末。以ddH2O (2.5％W/V)双蒸水作为液相。250mgCPC加入100mLddH2O(2.5％W/V)双蒸水得到2.5mg/mLCPC原液，超声搅拌(50％震动幅度，20秒)，形成均匀的CPC混悬液，测量微球直径和内部结构、形态备用。常规96孔细胞培养板，每孔加入200ulCPC混悬液然至细胞培养板底部，37℃水浴待该悬浮液干结，用γ射线灭菌后备用。
实施例5
1600℃高温煅烧重量比为136.06：100.09的无水磷酸氢钙和碳酸钙的生成 TTCP，研磨搅拌过筛获得直径1～80μm的TTCP颗粒。研磨搅拌过筛获得直径0.4～3.0μm的DCPA颗粒。TTCP(MW＝366.254g/mol)/DCPA (MW＝136.057g/mol)按摩尔质量比1/1混合制备CPC粉末。以ddH2O (2.5％W/V)双蒸水作为液相。500mgCPC加入100mLddH2O(2.5％W/V)双蒸水得到5mg/mLCPC原液，超声搅拌(50％震动幅度，20秒)，形成均匀的 CPC混悬液，测量微球直径和内部结构、形态备用。常规96孔细胞培养板，每孔加入50ulCPC混悬液然至细胞培养板底部，37℃水浴待该悬浮液干结，用γ射线灭菌后备用。
实施例6
1500℃高温煅烧重量比为136.06：100.09的无水磷酸氢钙和碳酸钙的生成 TTCP，研磨搅拌过筛获得直径1～80μm的TTCP颗粒。研磨搅拌过筛获得直径0.4～3.0μm的DCPA颗粒。TTCP(MW＝366.254g/mol)/DCPA (MW＝136.057g/mol)按摩尔质量比3/1混合制备CPC粉末。以ddH2O (2.5％W/V)双蒸水作为液相。500mgCPC加入100mLddH2O(2.5％W/V)双蒸水得到5mg/mLCPC原液，超声搅拌(50％震动幅度，20秒)，形成均匀的 CPC混悬液，测量微球直径和内部结构、形态备用。常规96孔细胞培养板，每孔加入50ulCPC混悬液然至细胞培养板底部，37℃水浴待该悬浮液干结，用γ射线灭菌后备用。
为了更好的说明本发明提供的技术方案的优点，下面给出本发明的对比试验：
1、破骨细胞，成骨细胞培养
破骨细胞培养代表实验：
第一部分：血清分离
血清样本收集，取24ml全血，离心1000r，5min后，取2ml上清置于冻存管，置于～80℃冰冻，6h后转移至液氮中保存。剩下全血样品混匀并准备下一步实验。
第二部分：破骨细胞分选
取淋巴细胞分离液加入15ml离心管内，每管5ml(若用50ml离心管则每管20ml)；混匀后的样品缓慢加入到各管淋巴细胞分离液表面；离心3次以上，每次10min，第一次1100r，第二次1200r，第三次1300r，若3次后仍未达到分离效果，可进行第四、第五次，转速均为1300r，缓升缓降(升降速均为1)；取出白膜层，再离心，1000r，10min；洗涤3次，每次用5～6ml洗涤液，离心均为1000r，10min；洗涤后可得到PBMC，计数。
与磁珠结合(染磁)：每10^7PBMC加入6μl磁珠和80μlBuffer，混匀并在冰盒中静置15～20min；洗去多余磁珠：静置后每10^7PBMC加入 1mlBuffer，并离心1000r10min，弃去上清；湿润过滤柱：把过滤柱装到磁铁架上，并每个过滤柱加入3mlBuffer，下面用试管接滤液，湿润后弃去滤液；细胞过滤：每108PBMC加入0.5mlBuffer，混匀后加入过滤柱，待液体滤完后，再往每个过滤柱中加入3mlBuffer冲洗，冲洗4～5次；过滤柱中取出细胞：含有CD14+细胞的过滤柱从磁铁架中取出，加入5mlBuffer，并加活塞用力压出，可重复1～2次，使CD14+细胞被冲出，用新的离心管接好滤液，重悬细胞(1000r10min)后计数。
第三部分：破骨细胞诱导及染色鉴定
完全培养液：450mlα～MEN基础培养液+50mlFBS+10ml双抗+6ml左旋谷酰胺。
用完全培养基重悬细胞，使细胞在悬夜中浓度为2.5×105/ml，并加入 hM～CSF并使其最终浓度为20ng/ml，种入96孔板中培养2天。2天后依次把hM～CSF按照20ng/ml和RANKL按照100ng/ml溶入96孔板培养液中，培养3天。3天后更换培养液(含同样浓度的hM～CSF和RANKL)。2天后固定细胞，进行TRAP染色并拍照。(一共8天)
以下为本实施例构建的骨生物功能分析多孔细胞培养板的应用试验：
破骨细胞钙吸收观察代表实验：
使用经消毒灭菌处理骨生物功能分析多孔细胞培养板，细胞培养条件与第四部分一致，完全培养液450mlα～MEN基础培养液+50mlFBS+10ml双抗 +6ml左旋谷酰胺用完全培养基重悬细胞，使细胞在悬夜中浓度为 2.5×105/ml，并加入hM～CSF并使其最终浓度为20ng/ml，种入96孔板中培养2天。2天后依次把hM～CSF按照20ng/ml和RANKL按照100ng/ml溶入96孔板培养液中，培养3天。3天后更换培养液(含同样浓度的hM～CSF 和RANKL)。在第5天时观察CPC中钙吸收的情况并拍照定量，参阅图1 和图2，其中黑色：CPC涂层。白色：吸收区域。A图：空白对照。B图： RANKL(80ng/ml)破骨细胞产生的吸收图像；结果参阅图2 RANKL(80ng/ml)诱导培养破骨细胞钙吸收的情况相对于每孔表面积百分比的定量分析。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种骨生物功能分析多孔细胞培养板，其特征在于，所述的骨生物功能分析多孔细胞培养板依次通过下述步骤制得的：
1)CPC固相和液相制备
1400～1600℃高温煅烧重量比为136.06：100.09的无水磷酸氢钙和碳酸钙的生成TTCP，研磨搅拌过筛获得直径1～80μm的TTCP颗粒；TTCP颗粒研磨搅拌过筛获得直径0.4～3.0μm的DCPA颗粒；所述的TTCP和DCPA按摩尔质量比1～3:3～1混合制备CPC粉末，以ddH2O双蒸水作为液相制液相CPC；
2)制备CPC混悬液
将步骤1)制备的液相CPC加入ddH2O双蒸水液相，超声搅拌得到CPC原液溶度1mg～10mg/ml的CPC混悬液；
3)构建骨生物功能分析多孔细胞培养板
备常规96孔细胞培养板，每孔加入步骤2)中的CPC混悬液50～300ul至细胞培养板底部，37℃水浴12-24小时待该悬浮液干结，用γ射线灭菌后备用。
2.根据权利要求1所述的一种骨生物功能分析多孔细胞培养板，其特征在于，所述的ddH2O占CPC粉末的重量比体积为1-30％。
3.根据权利要求1所述的一种骨生物功能分析多孔细胞培养板，其特征在于：TTCP/DCPA分别按摩尔质量比1/3或1/2.5或1/2或1/1.5或1/1或2/1或3/1混合制备CPC粉末。
4.根据权利要求1所述的一种骨生物功能分析多孔细胞培养板，其特征在于，所述的CPC悬浮液的最终溶解液浓度为1mg/ml或者1.5mg/ml或
2.0mg/ml，2.5mg/ml或3.0mg/ml或.5mg/ml或4.0mg/ml。
5.根据权利要求1所述的一种骨生物功能分析多孔细胞培养板，其特征在于，所述的超声搅拌时的时间为10-30秒，震动幅度为30-60％。
6.根据权利要求1所述的一种骨生物功能分析多孔细胞培养板，其特征在于，所述的CPC粉末粒径为50-250μm。
7.权利要求1所述的一种骨生物功能分析多孔细胞培养板作为骨细胞生物学相关的细胞分化和功能研究应用。
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