CN103520774A - 一种组织工程人工骨及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种组织工程人工骨及其构建方法，该人工骨将人脐带血间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs）接种到胶原蛋白缝合线-CPC复合材料上。其中CPC由磷酸四钙（tetracalcium phosphate，TTCP）和磷酸氢钙（dicalcium phosphate anhydrous，DCPA)组成(TTCP和DCPA以摩尔比1/1混合)。然后将胶原蛋白缝合线与CPC粉末按不同的体积比混匀后再将混合物与去离子水按3-5/1的质量比混合。最后将hUCMSCs接种到胶原蛋白缝合线-CPC复合材料上。本发明制备的人工骨强度高，修复骨缺损的能力强。
Description
技术领域
本发明属于外科用品材料技术领域，具体涉及一种修复骨缺损的材料及其构建方法，特别是一种脐带血干细胞与胶原蛋白缝合线-CPC复合材料构建的组织工程人工骨及其构建方法。
背景技术
人骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能，可分化为不同的组织，如骨、软骨及肌肉等。人骨髓间充质干细胞可来源于病人的骨髓，经过体外扩增，诱导分化后接种到生物支架上修复骨缺损。因此，基于干细胞的组织工程人工骨在骨缺损和骨再生方面发挥了巨大的潜能，而且，目前需要手术治疗的骨缺损患者数量庞大，组织工程人工骨投入到临床使用后将会造福广大患者，具有积极的意义。
但获取人骨髓间充质干细胞是一种有创性的过程，而且干细胞的活力及增殖随着年龄的增加而逐渐降低。最近，人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs)受到关注，并可分化为骨、软骨、神经元及内皮细胞等。hUCMSCs具有以下优点：1）低成本获取；2）来源广阔；3）获取对机体损伤小，甚至无损伤；4）无免疫原性及致瘤性，用其来替代人骨髓间充质干细胞应该是将来的趋势。
用于制备生物支架的生物活性材料钙磷陶瓷与人骨的无机成分相似，可促进细胞的粘附、增殖及成骨分化，所以羟基磷灰石hydroxyapatite（HA）及其他钙磷支架对于骨缺损的治疗已受到广泛关注。尽管如此，对烧结而成的生物陶瓷，在使用过程中需用外科手术修剪成适当的形状才能植入移植部位，这不仅造成人工骨的浪费，而且也消耗手术时间。相比之下，磷酸钙骨水泥（calcium phosphate cement，CPC）可在体外塑型然后填充到骨缺损部位，能够与自体骨紧密结合。目前常用的CPC由磷酸四钙tetracalcium phosphate，TTCP）和磷酸氢钙（dicalcium phosphate anhydrous，DCPA)组成。CPC可自固形成骨移植物，而且由于其具有良好的生物相容性，移植后能被新骨取代等优点，1996年被美国FDA批准用于临床。但传统的CPC易碎，力学强度较低，所以只能用于非承重区的骨组织，因此需要改进其力学性能。
纯天然胶原蛋白缝合线，具有良好的生物相容性，生物可降解性及较强的抗拉力，作为可吸收缝线已在临床广泛应用。本发明将hUCMSCs种植到胶原蛋白缝合线增强的CPC上构建了一种新型的组织工程人工骨，为骨缺损患者的治疗提供了一种新的材料。
发明内容
本发明的目的提供一种构建方法简单、方便、成本较低的组织工程人工骨及其构建方法，该方法构建的组织工程人工骨具有较强的力学性能，可用于承重区骨的修复；而且构建组织工程人工骨所选用的hUCMSCs具有低成本获取、来源广阔、获取对机体损伤小，甚至无损伤、无免疫原性及致瘤性等优势。
本发明的目的是通过以下方式实现的。
一种组织工程人工骨，是在由胶原蛋白缝合线及磷酸钙骨水泥混合制成的复合材料上接种了人脐带间充质干细胞。
所述的磷酸钙骨水泥是由磷酸四钙和磷酸氢钙以摩尔比1:1混合的粉末。然后把胶原蛋白缝合线与磷酸钙骨水泥粉末按1:3-5的体积比混匀后加入去离子水，调成糊状物放置于模具定型后制成复合材料。胶原蛋白缝合线与磷酸钙骨水泥粉末的混合物与去离子水的质量比为3-5:1。
所述的组织工程人工骨的构建方法，包括以下步骤：
（1）磷酸钙骨水泥粉末的混合，
磷酸四钙和磷酸氢钙以摩尔比1:1混合；
（2）胶原蛋白缝合线与磷酸钙骨水泥粉末的混合，
把胶原蛋白缝合线与磷酸钙骨水泥粉末按1:3-5的体积比混匀；
（3）胶原蛋白缝合线-磷酸钙骨水泥复合材料的制备，
胶原蛋白缝合线与磷酸钙骨水泥粉末的混合物与去离子水按照质量比为3-5:1混合调制成糊状物，将糊状物放置于模具定型得到胶原蛋白缝合线-磷酸钙骨水泥复合材料，消毒备用；
（4）将hUCMSCs种植于胶原蛋白缝合线-磷酸钙骨水泥复合材料。
hUCMSCs用成骨诱导培养液(DMEM低糖培养液中含100ml/L磷酸盐缓冲液（Phosphatebuffer solution，PBS），100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素，10nmol/L地塞米松、200μm/L L-抗坏血酸-2-磷酸盐及10mmol/L B-甘油磷酸钠)稀释，将细胞悬液滴加到胶原蛋白缝合线-CPC支架上，然后将细胞与材料复合物放置在37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中进行孵育。胶原蛋白缝合线-CPC支架在接种干细胞前先用钴60消毒后再用成骨诱导培养液浸泡24h。
可将本发明种植了人脐带血间充质干细胞的胶原蛋白缝合线-CPC支架作为骨填充物直接放置于骨缺损部位。与现有技术相比，本发明的优点在于：一方面，本发明的胶原蛋白缝合线-CPC复合材料强度高，可用于承重区骨的修复；另一方面，本发明使用hUCMSCs作为干细胞来源，避免了传统使用骨髓干细胞造成新的创伤的缺点，而且具有低成本获取、来源广阔、无免疫原性及致瘤性等优势。此外，本发明的脐带血干细胞与可降解胶原蛋白缝合线-CPC复合材料复合构建组织工程人工骨的方法相对简单，操作方便，成本较低，能够广泛应用于临床骨缺损的修复。而使用本发明制备的组织工程人工骨进行骨缺损的修复方法也非常容易操作，便于在修复手术中进行推广和应用。
附图说明
图1为hUCMSCs分别在CPC与胶原蛋白缝合线-CPC复合材料上粘附生长情况图。
具体实施方式
以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
实施例1
本发明的胶原蛋白缝合线-CPC复合材料，由胶原蛋白缝合线、TTCP和DCPA组成。通过调整胶原蛋白缝合线的比例可改变CPC的强度，最后将干细胞接种到胶原蛋白缝合线-CPC复合材料上，构建组织工程人工骨。
本实施例的组织工程人工骨的构建步骤如下：
（1）胶原蛋白缝合线-CPC复合材料的制备
TTCP和DCPA购自北京恩赛科技股份有限责任公司，其中TTCP粉末的平均尺寸为20μm，DCPA颗粒的平均长度为2μm。TTCP和DCPA混合形成CPC粉末，TTCP和DCPA以摩尔比1/1混合。胶原蛋白缝合线购自武汉众鑫医疗器械有限责任公司（缝线型号为2#，可提供力学支撑约50天），将胶原蛋白缝合线剪成长为6mm备用。胶原蛋白缝合线与CPC的体积比为1/3。胶原蛋白缝合线-CPC混匀后再将混合物与去离子水混合，混合的质量比为3/1。将糊状物至于4×3×25cm的模具（力学测定）及厚度为2mm，直径12mm的圆形（生物学测试）模具定型4小时，干燥后用于下面相关测试。
（2）样品的力学性能
三点弯曲试验用于测定样品的抗弯强度，跨距为20mm，加载速度为0.5mm/min。抗弯强度S=3F L/(2bd2),式中F是最大载荷,L是跨度,b是样品宽度，d是厚度。弹性模量E=[3L(P1-P2)/2bh2(S2-S1)]×10-3，式中P1，P2分别为材料在线性范围内加载的初载荷和末载荷，L是跨度,b是样品宽度，h是厚度,S1、S2分别为与P1与P2对应的试样跨中的应变。（3）hUCMSCs种植于CPC支架
在24孔培养板中加入胶原蛋白缝合线-CPC材料作为试验组，普通培养板作为空白对照。hUCMSCs用2ml成骨诱导培养液(DMEM低糖培养液中含100ml/L磷酸盐缓冲液（Phosphatebuffer solution，PBS），100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素，10nmol/L地塞米松、200μm/L L-抗坏血酸-2-磷酸盐及10mmol/L B-甘油磷酸钠)稀释；将细胞悬液滴加到胶原蛋白缝合线-CPC支架上，每孔20000个细胞左右，细胞与材料复合物放置在37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中进行孵育，每2天换液一次，共培养14天。胶原蛋白缝合线-CPC支架在接种干细胞前先用钴60消毒后再用成骨诱导培养液浸泡24h。
（4）扫描电镜（Scaning electron microscopy,SEM）观察hUCMSCs在CPC与胶原蛋白缝合线-CPC材料上粘附生长情况
hUCMSCs与胶原蛋白缝合线-CPC支架共培养7天，使用PBS洗涤，2.5%戊二醛固定，酒精梯度脱水，饿酸浸泡，干燥并喷金后SEM观察hUCMSCs在材料上的粘附生长情况。
（5）MTT法检测材料对hUCMSCs生长及增殖的影响
共培养14天，细胞与材料复合物移入一新的24孔板，加入PBS洗涤2次，再加入1ml的PBS和100μlMTT溶液（5mg/ml）继续37℃孵育4小时，然后吸弃培养液，加入DMSO1ml，震荡使甲瓒完全溶解，取200μlDMSO溶解液加入到一新的96孔板。酶联免疫检测仪在490nm处测定每孔光吸收值。
（6）酶联法检测hUCMSCs在材料上的碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）活性
ALP活性在干细胞的成骨分化中起着重要的作用，是评价hUCMSCs成骨分化的重要指标。各组细胞分别培养14天，吸弃各孔培养液，PBS洗涤2次，将胶原蛋白缝合线-CPC支架移入一新的24孔板，加入0.2ml去离子水，反复冻融3次（-80℃和室温，每次30分钟），收集样品至1.5ml的离心管，3000转/分离心20分钟，仔细收集上清。取上清按兔碱性磷酸酶酶联免疫分析试剂盒（武汉华美）提供的步骤进行操作，酶联仪450nm波长处测定各孔吸光度值，通过标准曲线计算样品中碱性磷酸酶浓度，以普通培养基在细胞培养板培养的间充质干细胞作为对照组。
试验结果如下：
（1）力学结果
胶原蛋白缝合线-CPC的弯曲强度为24MPa，明显高于CPC样品的10MPa。胶原蛋白缝合线-CPC的弹性模量为5.1GPa，明显高于CPC样品的2.3GPa。
（2）SEM结果
如图1所示,hUCMSCs（用箭头表示）分别粘附于CPC（图1A）与胶原蛋白缝合线-CPC(图1B)支架上，细胞在两种材料上粘附生长并大量增殖，已基本覆盖材料的表面。这些数据显示，胶原蛋白缝合线可增强CPC的力学性能，但不会影响hUCMSCs在材料上的粘附生长。
（3）hUCMSCs在不同材料上的增殖
第14天，CPC组和胶原蛋白缝合线-CPC组的吸光度值分别为1.02和1.05，两组无统计学意义。这些数据显示，胶原蛋白缝合线可增强CPC的力学性能，但不会影响hUCMSCs在材料上的增殖。
（4）ALP活性
胶原蛋白缝合线-CPC组ALP活性为4.12U/L，BCP组4.10U/L，两组间无统计学意义。两者都明显高于对照组ALP活性(1.58U/L)。这些数据显示，胶原蛋白缝合线可增强CPC的力学性能，但不会影响hUCMSCs在材料上的成骨分化。
使用本实施例制备得到的组织工程人工骨修复骨缺损，具体的修复方法为：将组织工程人工骨直接放置于骨缺损部位。使用本发明制备的组织工程人工骨修复骨缺损，既能使人工骨的修复强度明显提高，而且由于加入了干细胞可加速骨的愈合。
Claims (5)
1.一种组织工程人工骨，其特征在于，是在由胶原蛋白缝合线及磷酸钙骨水泥混合制成的复合材料上接种了人脐带血间充质干细胞。
2.根据权利要求1所述的组织工程人工骨，其特征在于，所述的磷酸钙骨水泥是由磷酸四钙和磷酸氢钙以摩尔比1:1混合的粉末。
3.根据权利要求1所述的组织工程人工骨，其特征在于，把胶原蛋白缝合线与磷酸钙骨水泥粉末按1:3-5的体积比混匀后加入去离子水，调成糊状物放置于模具定型后制成复合材料。
4.根据权利要求3所述的组织工程人工骨，其特征在于，胶原蛋白缝合线与磷酸钙骨水泥粉末的混合物与去离子水的质量比为3-5:1。
5.权利要求1-4任一项所述的组织工程人工骨的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）磷酸钙骨水泥粉末的混合，
磷酸四钙和磷酸氢钙以摩尔比1:1混合；
（2）胶原蛋白缝合线与磷酸钙骨水泥粉末的混合，
把胶原蛋白缝合线与磷酸钙骨水泥粉末按1:3-5的体积比混匀；
（3）胶原蛋白缝合线-磷酸钙骨水泥复合材料的制备，
胶原蛋白缝合线与磷酸钙骨水泥粉末的混合物与去离子水按照质量比为3-5:1混合调制成糊状物，将糊状物放置于模具定型得到胶原蛋白缝合线-磷酸钙骨水泥复合材料，消毒备用；
（4）将人脐带间充质干细胞种植于胶原蛋白缝合线-磷酸钙骨水泥复合材料。
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