CN101751696B - 一种构建人体实质脏器仿生三维血管网络的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种构建人体实质脏器仿生三维血管网络的方法，其特征在于，具体步骤为：采集正常人肝脏心脏或者肾脏血管网络图像，将三维血管模型转换成二维血管断层图；将P(CL-EC)置于纤维蛋白胶中间，压制成膜片；利用计算机激光高精度打孔机对可降解膜片进行打孔；将可降解膜片与野生型C57BL/6J小鼠的骨髓间充质干细胞共培养，其中中间编号的可降解膜片与转染SDF-1/VEGF的野生型C57BL/6J小鼠骨髓间充质干细胞共培养，待细胞基本覆盖膜片后，将材料按编号进行堆垒，在血管预制孔中注入转EGFP基因C57BL/6J小鼠的内皮祖细胞。本发明的优点是能够仿生构建人体各实质脏器血管网络且不受尺寸限制。
Description
技术领域
本发明涉及一种构建人体实质脏器仿生三维血管网络的方法，属于仿生脏器制作技术领域。
背景技术
现在每年由于机械创伤、衰老以及各种疾病，大量患者需要进行组织和器官移植。仅以我国为例，每年大约有150万人因末期器官功能衰竭需要器官移植，但每年能够使用的器官数量不到1万，供求比例达到1∶150。因此，目前采用不同的途径和方法去解决移植用脏器数量严重短缺的问题显得十分迫切。
目前临床常用的器官移植供体及缺点：①异种组织器官移植，主要问题在于移植物与受体相容性差。②同种异体组织器官移植，主要问题在于免疫排斥和供体有限。③自体组织器官移植，主要问题在于供体有限和功能紊乱。④人工合成组织代用品移植，主要问题在于异物反应和感染。⑤组织工程器官，具有良好的组织相容性，可以大量制备，不需要免疫抑制治疗；主要问题在于构建组织工程脏器的技术尚不成熟，离大规模临床运用还有一定距离。
20世纪80年代以来，组织工程学得到了长足的进步。在组织工程产生地美国，对人体的皮肤、软骨、骨、韧带、肌肉、心脏瓣膜、肝、血管都进行了体外培养分化工作，并取得一定成果。根据组织工程构建组织的结构和功能不同，组织脏器构建分为两个领域：①结构性组织和脏器的构建：此类组织脏器结构较为简单，如骨、软骨、肌腱等。目前国内外都已有临床应用报告，并取得了良好社会效益和经济效益。②相对于结构性组织脏器的构建，具有代谢功能的组织和脏器的构建(如心、肝、肾等的构建)是组织工程的终极目标，但是目前需要攻克的难点较多。组织工程脏器的构建有四个主要问题需要解决：(1)生物支架材料的选择和支架微观宏观结构的构建；(2)脏器血管网络的构建；(3)种子细胞的选择和培养；(4)细胞生长微环境。
构建能够运送氧气、营养和代谢产物的血管网络系统是构建大尺寸三维组织工程脏器需要攻克的主要难点之一。为了能够构建出满足大尺寸三维组织工程脏器的血管网络，有研究者通过体外构建支架系统然后将支架系统移植入动物体内，借助于动物的血管生成形成毛细血管网络。但是这种血管网络的构建方法存在诸多缺点：(1)需要手术实现体内植入；(2)周期长；(3)支架系统厚度不能过大；(4)血管网络内血流量小，不能满足组织工程心脏、肾脏、肝脏要求。近年来，已有国外研究者利用立体打印机技术构建空间组织工程支架，并在其中预设微血管的生长空间，但是这种技术的精度仍不能在微米级别达到构建血管网络的要求，同时也不能使微血管完全按其预设通道进行生长。随着纳米技术的发展，现在已有研究者能够通过在薄膜上利用激光预设通道精确导引细胞生长方向，另有研究者利用可降解纳米纤维上引导细胞生长。此外，以上构建的血管网络是规则的血管走行而非仿生血管网络，规则的血管走行较之仿生血管网络血细胞在其管腔内流动时会产生较多的微型湍流，从而引起血栓形成几率增高。因此，仿生血管网络的构建将是今后组织工程脏器构建的发展方向。
发明内容
本发明的目的是提供一种构建人体实质脏器仿生三维血管网络的方法。
为了达到上述目的，本发明的技术方案是提供一种构建人体实质脏器仿生三维血管网络的方法，其特征在于，具体步骤为：
第一步：利用CT采集正常人肝脏心脏或者肾脏血管网络图像，对血管网络进行三维重建，将三维血管模型缩小，利用计算机将三维血管模型转换成二维血管断层图，并引入平面坐标，对各个血管断面进行二维平面坐标精确定位和血管直径φ测定；
第二步：将可降解材料P(CL-EC)制备的膜片浸于纤维蛋白胶溶液中后阴干，制成可降解膜片，并精确切割成与二维血管断层图相同面积，将膜片从上向下编号，膜片个数与二维血管断层图的个数相同，膜片的总厚度与三维血管模型的厚度相同；
第三步：根据不同层面的二维血管断层的平面坐标图，利用计算机激光高精度打孔机对可降解膜片进行打孔得到血管预制孔；
第四步：分离、培养转EGFP基因C57BL/6J小鼠的内皮祖细胞和野生型C57BL/6J小鼠的骨髓间充质干细胞，利用脂质体将SDF-1基因和VEGF基因转染部分野生型C57BL/6J小鼠的骨髓间充质干细胞；
第五步：将可降解膜片与野生型C57BL/6J小鼠的骨髓间充质干细胞共培养，其中中间编号的部分可降解膜片与转染SDF-1基因和VEGF基因的野生型C57BL/6J小鼠骨髓间充质干细胞共培养，待细胞基本覆盖膜片后，将材料按编号进行堆垒，放入细胞培养器，1天后，在血管预制孔中注入转EGFP基因C57BL/6J小鼠的内皮祖细胞，培养得到人体实质脏器仿生三维血管网络。
本发明的优点如下：
1.经文献查新，本发明采用空间转换定位技术来构建组织工程肝脏三维血管网络、具有良好的创新性。经过查询专利数据库，我们发现西安交通大学利用可降解膜卷曲折叠进行构建的肝脏组织工程构架(专利号CN 100369590-C)并不能完全对肝脏血管网络进行仿生，且只能构建较小尺度的组织工程肝脏。本发明涉及的方法能够仿生构建人体各实质脏器血管网络且不受尺寸限制。仿生血管网络血细胞在其管腔内流动时不会产生明显的湍流，从而降低血栓形成几率，保证脏器的氧气和营养供给。
2.本发明采用多排高速螺旋CT采集的高精度正常人实质脏器血管网络图形，并进行二维转换，平面血管坐标定位，这将保证脏器血管的精确仿生定位。激光打孔技术的引入，将保证膜片材料的精确打孔和三维血管网络的复原。高精度的定位技术将为今后组织工程脏器的构建提供了形态学上的保证。
具体实施方式
下面结合实施例来具体说明本发明。
实施例
1.采集血管图像，建立平面坐标图：复旦大学附属中山医院影像科已有64排CT增强扫描采集的不同造影剂时相的人体肝脏血管CT断层图像。利用计算机对这些平面断层图像进行三维重建。按一定比例将肝血管模型缩小入50cm×50cm×50cm的区域内。利用相应软件对图像中各血管进行空间定位，并转换成50cm×50cm平面血管断层图。对平面血管断层图引入平面坐标(X，Y)，对各个血管断面进行二维平面坐标精确定位和血管管径精确测定。按12.5∶1的比例缩小平面，形成4cm×4cm的平面血管断层图，此时高4cm的三维模型，按层高0.05cm/层，将有80层平面血管断层图，对其从上向下进行编号：1，2，3……80。
2.可降解三维支架断层膜片的制备：将可降解材料P(CL-EC)(聚己内酯-碳酸亚乙酯)和纤维蛋白胶压制成厚0.05cm可降解膜片，并精确切割成4.0cm×4.0cm×0.05cm大小。将膜片从上向下编1-80号。
3.膜片精确激光打孔：将编好号码的可降解膜片固定在特制的固定架上，置于计算机激光打孔机操作平台，往计算机输入不同层面的血管断层的平面坐标图及管径，利用计算机激光打孔机对可降解膜片进行程序设定打孔。打孔完成后送扫描电镜检测，对孔径、位置不合要求编号的可降解膜片进行重新制备。
4.血管内皮祖细胞分离、体外扩增、纯化：
(1)5只6-8周龄增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)转基因C57BL/6J小鼠，处死取骨髓，用GIBCO公司生产的D-Hanks液20ml稀释。将稀释之血液按1∶2的体积比置于淋巴细胞分离液的上方。水平离心机以2000rpm去闸离心20分钟。小心吸出单核细胞层，用5倍体积的M199培养液洗涤2次，培养液为：80vol％GIBCO公司生产的M199培养液+20vol％胎牛血清(FBS)，再加入终浓度为20ng/mL的VEGF(血管内皮细胞生长因子)以及终浓度为2ng/mL的bFGF(成纤维细胞生长因子)，并分别离心，2000rpm和1500rpm各8分钟，弃上清，重悬。
(2)细胞沉淀与培养液混悬后计数，调整细胞浓度为1×106/L，移至25cm2CELLBIND培养瓶，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。培养第3天换液，用D-Hanks液洗掉未贴壁的细胞，加入新培养液继续培养。以后每3天换一次液。用倒置显微镜观察细胞形态。
(3)一周后当细胞数量达到107收集贴壁细胞予以CD34+/CD133+磁珠筛选。调节细胞浓度到107/80ul，加入20ul单抗标记磁珠，6℃放置15min。(pH7.4)PBS洗涤，500rpm离心10min，用PBS调整体积为500ul。过柱、洗涤、洗脱阴性细胞；将柱子脱离磁场，获取阳性细胞。
5.骨髓间充质干细胞的分离培养：
(1)取野生型C57BL/6J小鼠，与GIBCO公司生产的DMEM培养液(含16％胎牛血清)混合后，铺于6ml的淋巴细胞分离液(1.073g/l)之上。离心，取中层单个核细胞，置于含DMEM液的细胞培养瓶中，于37℃，含5％CO2饱和湿度的培养箱中培养。
(2)24h后首次换液，以后每5天换液一次。经不断增殖培养至细胞数达107/瓶，细胞总数108。
(3)取生长状态良好的细胞，自第3代至第6代，采用流式细胞仪对MSCs表面抗原CD29、CD44、CD45、HLA-DR的表达进行检测筛选。
(4)取第三代细胞，转染前一天将MSCs接种于六孔板中，其中一孔为空白对照，细胞密度为40-60％。稀释10μL Lipofectin2000(脂质体，Invitrogen公司生产)试剂于100μL无血清、无抗菌素的DMEM(GIBCO公司生产)培养基。混匀后室温静置5min；同时稀释1-2μg待转染质粒DNA(pcDNA3.1-VEGF/SFD-1 Invitrogen公司构建)于100μL无血清、无抗菌素的DMEM(GIBCO公司)培养基。混匀后室温静置5min；混合两种溶液，室温静置25-30min。然后再加入800μL无血清，无抗菌素的DMEM培养基(GIBCO公司)，弃掉六孔板中的旧培养基，用2mL无血清、无抗菌素的DMEM(GIBCO公司)培养基清洗细胞2次；将Lipofectin试剂-DNA混合物1mL覆盖细胞，抚育6h；吸出转染液，加入含10％血清(GIBCO公司)正常生长培养基DMEM，(GIBCO公司)37℃培养；G418(Invitrogen公司)筛选阳性细胞。Western Blot，RT-PCR检测转染前后VEGF，SDF-1蛋白和mRNA的表达。
5.三维血管网络的构建：将可降解膜片与野生型C57BL/6J小鼠的骨髓间充质干细胞共培养，(GIBCO公司DMEM培养基)，其中21-60编号的可降解膜片与转染SDF-1/VEGF的野生型C57BL/6J小鼠骨髓间充质干细胞共培养(GIBCO公司DMEM培养基)，待细胞基本覆盖膜片后，将材料按编号进行堆垒，放入细胞培养器，1天后，在血管预制孔中注入转EGFP基因C57BL/6J小鼠的内皮祖细胞，培养7天。
6.血管网络的观测：采用上海同步辐射光源实验平台，在7d，14d，30d，45d，60d利用同步辐射光衍射成像技术对新生的微血管网络进行动态观测；在观测期结束后用常规切片染色和免疫组化(CD31，VIII因子)对血管网络的形成情况进行观察。
Claims (1)
1.一种构建人体实质脏器仿生三维血管网络的方法，其特征在于，具体步骤为：
第一步：利用CT采集正常人肝脏心脏或者肾脏血管网络图像，对血管网络进行三维重建，将三维血管网络按比例缩小，利用计算机将缩小后的三维血管网络转换成二维血管断层图，并引入平面坐标，对各个血管断面进行二维平面坐标精确定位和血管直径φ测定；
第二步：将可降解材料P(CL-EC)制备的膜片浸于纤维蛋白胶溶液中后阴干，制成可降解膜片，并精确切割成与二维血管断层图相同面积，将膜片从上向下编号，膜片个数与二维血管断层图的个数相同，膜片的总厚度与缩小后的三维血管网络的厚度相同；
第三步：根据不同层面的二维血管断层的平面坐标图，利用计算机激光高精度打孔机对可降解膜片进行打孔得到血管预制孔；
第四步：分离、培养转EGFP基因C57BL/6J小鼠的内皮祖细胞和野生型C57BL/6J小鼠的骨髓间充质干细胞，利用脂质体将SDF-1基因和VEGF基因转染部分野生型C57BL/6J小鼠的骨髓间充质干细胞；
第五步：将可降解膜片与野生型C57BL/6J小鼠的骨髓间充质干细胞共培养，其中中间编号的部分可降解膜片与转染SDF-1基因和VEGF基因的野生型C57BL/6J小鼠骨髓间充质干细胞共培养，待细胞基本覆盖膜片后，将材料按编号进行堆垒，放入细胞培养器，1天后，在血管预制孔中注入转EGFP基因C57BL/6J小鼠的内皮祖细胞，培养得到人体实质脏器仿生三维血管网络。
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