JPWO2009028654A1 - TERT遺伝子のcDNAの製造、それを用いた核酸増幅法、検出方法、それらに用いるプライマー、及び、それらを用いた腫瘍の診断キット - Google Patents
TERT遺伝子のcDNAの製造、それを用いた核酸増幅法、検出方法、それらに用いるプライマー、及び、それらを用いた腫瘍の診断キット Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2009028654A1 JPWO2009028654A1 JP2009530199A JP2009530199A JPWO2009028654A1 JP WO2009028654 A1 JPWO2009028654 A1 JP WO2009028654A1 JP 2009530199 A JP2009530199 A JP 2009530199A JP 2009530199 A JP2009530199 A JP 2009530199A JP WO2009028654 A1 JPWO2009028654 A1 JP WO2009028654A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- primer
- seq
- mrna
- pcr
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
1)最初の腫瘍の発生位置から周囲組織への腫瘍の拡張。
2)体腔及び血管中への腫瘍細胞の浸透。
3)循環系による腫瘍細胞の離れた部位への輸送・放出。
4)滞留部位における腫瘍細胞の組織への侵入。
5)新たな部位における腫瘍細胞の生存と、腫瘍増殖をするための血管形成の新たな環境への適応。
また、血液中における腫瘍細胞の検出の感度が高いほど、初期段階の腫瘍の検出が可能となるため、より一層の検出感度の向上が望まれていた。
本発明は、斯かる状況に鑑みてなされたものであり、腫瘍特異的な遺伝子であるTERT遺伝子のmRNAを高感度に検出すること、及び、それを用いて腫瘍の診断を行うことを目的とする。
本発明者らは、癌特異的な遺伝子であるTERTを高感度に検出すること、及び、それを用いて癌の診断を行うことを目的として鋭意研究を行った結果、特定の逆転写条件、及び/又は、特定のプライマーを用いてTERT遺伝子のmRNAを逆転写することにより、より正確かつ安定した逆転写反応を行うことができ、その後の核酸増幅や検出を感度良く行うことができることを見出し、本発明を完成するに至った。
本実施形態における「TERT(遺伝子)」とは、約90%の悪性腫瘍において発現する悪性腫瘍(癌)特異的抗原(酵素)であるテロメレースの活性中心に位置するサブユニットの一つであり、特にヒトのTERTをhTERTと称する。本実施形態では、TERTとして、TERTポリペプチドの遺伝子多型体やスプライシングバリアントなどを用いることもできる。テロメレースは、その活性が1994年に発見されて以来、遺伝子の発見及び機能解析が行われてきたが、その臨床応用に関しては、腫瘍形成、転移後の切除組織中からの検出に留まり、血液中から簡易に検出することができなかった。2000年には、乳癌患者の血液からhTERTの定性的検出に関する報告がなされたが(Chen XQ, Clin. Cancer Res., 6: 3823-3826 (2000))、その感度は60%以下であり、臨床応用にはほど遠かった。
以下、本発明の実施形態について、説明する。
従来法では、逆転写反応(RT)とPCR反応を連続しないステップで行うため操作に時間を要し、試料のクロスオーバーやコンタミネーションの危険性があった。これに対し、One−Step RT−PCRでは、RTでのインキュベーションからPCRでのサイクリングまで、チューブの開閉や試薬の添加を行うことなく、ワンステップで迅速かつ簡便にRT−PCRを行うことができる。このOne−Step RT−PCRは、複数の試料で比較実験を行う場合に極めて有効であるため、例えば、本発明を用いた複数の試料からの腫瘍の検出などにおいて、極めて有効となる。
氷冷やサーマルサイクラー等により、加熱後のmRNAを急速に冷却することで、加熱により高次構造等が破壊されたmRNAが再びアニーリング等の高次構造形成をすることなく、次の逆転写反応を行うことができ、これにより逆転写反応の正確性や安定性がさらに高まる。急冷処理は、例えば、逆転写反応に適した温度付近(例えば、37℃、42℃、50℃、55℃もしくは60℃)まで急冷することができるが、0℃以上で、4℃以下あるいは10℃以下に急令することで、より効果的に高次構造形成を防ぐこともできる。
逆転写反応は、一般的に40℃から60℃の温度範囲(50℃前後が多い)で行われることが多いが、熱安定性の逆転写酵素を用いる、もしくは適切な温度を選択するなどして、高温(例えば60℃以上)で逆転写反応を行うことにより、逆転写反応の鋳型となるmRNAの高次構造形成を防ぎ、より正確で安定した逆転写反応を行うことができる。さらに、条件に応じて、変性処理の後に、逆転写酵素を再度添加することなく逆転写工程を行ってもよく、その場合は、cDNAの合成(製造)の全体を自動化することもできる。
さらに、これらのプライマーは、本実施形態に示す逆転写反応前のmRNAの加熱処理と併用することで、逆転写(増幅、検出)反応における正確性、安定性及び感度をさらに増すことができる。
この診断キットにおいては、TERT遺伝子のmRNAの発現量が高い場合は腫瘍の疑いが高いと診断され、その基準等は、当分野の医師などによる症例の比較などを通じて適宜設定することができる。
1)採血管にEDTAが混入していない場合
患者から採取した血液(約1〜2mL)について、700〜800xgで10分間、4℃で遠心分離し、上清を他のRNase freeのチューブに移し、それを1500xgで10分間、4℃で遠心分離し、上清を別のRNase freeのチューブに移し、最後に、1600〜3000xgで10分間、4℃で遠心分離し、RNAを含む原試料として、直ぐに用いるか、使用まで−80℃に貯蔵した。
採血管にEDTAが混入している場合は、上記のようにして得た体液を1500〜1600xgで10分間、4℃で遠心分離し、上清を他のRNase freeのチューブに移し、15,000xg以上で、10分間、4℃で遠心分離し、その上清を0.22μmのフィルターで濾過して、RNAを含む原試料として、直ぐに用いるか、使用まで−80℃に貯蔵した。
1)逆転写前に、試料を様々な温度にて加熱した。
2)逆転写反応を、61℃で20−30分で行った。
3)反応活性化段階(RNase失活など)として、95℃で15分加熱した。
4)一般的な3ステップのPCR反応を55サイクル程度(アニーリング温度はプライマーに応じて変化させた)行った。
より具体的には、逆転写前の加熱条件を変化させた際の、RT―PCRによる核酸増幅産物の量(インターカレーター性色素の蛍光の変化量)をRT−PCRのサイクル数の関数としてグラフで示したものが図1−12のaである。また、逆転写前の加熱条件を変化させた際の、RT−PCR後の核酸増幅産物の融解曲線の負の一次微分曲線(−dF/dT)を示したものが図1−12のb(Newのプライマー:配列番号:1および2を使用)およびc(Oldのプライマー:配列番号:5および6を使用)である。また、逆転写前の加熱条件を変化させた際の、RT−PCRによる増幅結果(核酸増幅産物)を通常の核酸電気泳動により確認したものが図13−15である。
これに対し、逆転写前に高温加熱処理を施した、図2−12に示すRT−PCRでは、加熱しなかった際に複数観察されたピークが減少しており、また、目的物のピークと考えられる最も大きなピークは、高く細くシャープとなっており、PCRの特異性がさらに高まっていることが確認された。特に、Newのプライマーを用いた際には、逆転写前の高温加熱処理による特異性の上昇が顕著であることが明らかとなった。
Claims (15)
- TERT遺伝子のmRNAを75℃以上の温度に加熱する工程と、
前記工程で得られたRNAを鋳型として、アンチセンスプライマーを用いた逆転写反応を行い、cDNAを合成する工程と
を含む、cDNAの製造方法。 - TERT遺伝子のmRNAの少なくとも一部に対応するcDNAを増幅するための方法であって、
前記mRNAを75℃以上の温度に加熱する工程と、
前記工程で得られたRNAを鋳型として、アンチセンスプライマーを用いた逆転写反応を行い、cDNAを合成する工程と、
前記cDNAを鋳型として、プライマーセットを用いて、前記cDNAの少なくとも一部を核酸増幅する工程と
を含む、方法。 - One−Step RT−PCRである、請求項2に記載の方法。
- mRNAを加熱する工程の後に、加熱後のmRNAを急冷する工程を更に含む、請求項2に記載の方法。
- 前記逆転写反応が60℃以上で行われる、請求項2に記載の方法。
- TERT遺伝子のmRNAを標的として核酸増幅するためのプライマーセットであって、
配列番号:1で示される塩基配列と80%の同一性を有する核酸を含むセンスプライマーと、
配列番号:2で示される塩基配列と80%の同一性を有する核酸を含むアンチセンスプライマーとを含んでなるプライマーセット。 - 前記センスプライマーが配列番号:1で示される塩基配列からなる核酸を含み、かつ、前記アンチセンスプライマーが配列番号:2で示される塩基配列からなる核酸を含む、請求項6に記載のプライマーセット。
- TERT遺伝子のmRNAを標的として核酸増幅するためのプライマーセットであって、
配列番号:3で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸を含むセンスプライマーと、
配列番号:4で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸を含むアンチセンスプライマーとを含んでなるプライマーセット。 - 前記センスプライマーが配列番号:1で示される塩基配列からなる核酸を含み、かつ、前記アンチセンスプライマーが配列番号:2で示される塩基配列からなる核酸を含む、請求項8に記載のプライマーセット。
- 請求項6または8に記載のプライマーセットを含む、腫瘍の診断キット。
- 前記アンチセンスプライマーが請求項6または8に記載のアンチセンスプライマーであり、かつ、前記プライマーセットが請求項6または8に記載のプライマーセットである、請求項2に記載の方法。
- 前記アンチセンスプライマーが配列番号:6で示される塩基配列と80%の相同性を有する核酸を含むアンチセンスプライマーであり、
前記プライマーセットが、
配列番号:5で示される塩基配列と80%の相同性を有する核酸を含むセンスプライマーと、
配列番号:6で示される塩基配列と80%の相同性を有する核酸を含むアンチセンスプライマーと
を含んでなるプライマーセットである、請求項2に記載の方法。 - 前記アンチセンスプライマーが配列番号:8で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸を含むアンチセンスプライマーであり、
前記プライマーセットが、
配列番号:7で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸を含むセンスプライマーと、
配列番号:8で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸を含むアンチセンスプライマーと
を含んでなるプライマーセットである、請求項2に記載の方法。 - 前記アンチセンスプライマーが配列番号:6で示される塩基配列からなる核酸を含むアンチセンスプライマーであり、
前記プライマーセットが、
配列番号:5で示される塩基配列からなる核酸を含むセンスプライマーと、
配列番号:6で示される塩基配列からなる核酸を含むアンチセンスプライマーと
を含んでなる、請求項2に記載の方法。 - TERT遺伝子のmRNAの検出方法であって、
前記mRNAを75℃以上の温度に加熱する工程と、
前記工程で得られたRNAを鋳型として、アンチセンスプライマーを用いた逆転写反応を行い、cDNAを合成する工程と、
前記cDNAを鋳型として、プライマーセットを用いた核酸増幅法により、前記mRNAの少なくとも一部を含む核酸の増幅産物を得る工程と、
前記増幅産物を定量的に検出する工程と
を含む、検出方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2009530199A JP5721161B2 (ja) | 2007-08-31 | 2008-08-29 | TERT遺伝子のcDNAの製造、それを用いた核酸増幅法、検出方法、それらに用いるプライマー、及び、それらを用いた腫瘍の診断キット |
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2007227082 | 2007-08-31 | ||
JP2007227082 | 2007-08-31 | ||
JP2009530199A JP5721161B2 (ja) | 2007-08-31 | 2008-08-29 | TERT遺伝子のcDNAの製造、それを用いた核酸増幅法、検出方法、それらに用いるプライマー、及び、それらを用いた腫瘍の診断キット |
PCT/JP2008/065518 WO2009028654A1 (ja) | 2007-08-31 | 2008-08-29 | TERT遺伝子のcDNAの製造、それを用いた核酸増幅法、検出方法、それらに用いるプライマー、及び、それらを用いた腫瘍の診断キット |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2014164582A Division JP2014239692A (ja) | 2007-08-31 | 2014-08-12 | TERT遺伝子のcDNAの製造、それを用いた核酸増幅法、検出方法、それらに用いるプライマー、及び、それらを用いた腫瘍の診断キット |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2009028654A1 true JPWO2009028654A1 (ja) | 2010-12-02 |
JP5721161B2 JP5721161B2 (ja) | 2015-05-20 |
Family
ID=40387365
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2009530199A Expired - Fee Related JP5721161B2 (ja) | 2007-08-31 | 2008-08-29 | TERT遺伝子のcDNAの製造、それを用いた核酸増幅法、検出方法、それらに用いるプライマー、及び、それらを用いた腫瘍の診断キット |
JP2014164582A Pending JP2014239692A (ja) | 2007-08-31 | 2014-08-12 | TERT遺伝子のcDNAの製造、それを用いた核酸増幅法、検出方法、それらに用いるプライマー、及び、それらを用いた腫瘍の診断キット |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2014164582A Pending JP2014239692A (ja) | 2007-08-31 | 2014-08-12 | TERT遺伝子のcDNAの製造、それを用いた核酸増幅法、検出方法、それらに用いるプライマー、及び、それらを用いた腫瘍の診断キット |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
JP (2) | JP5721161B2 (ja) |
WO (1) | WO2009028654A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2014183839A (ja) * | 2013-02-19 | 2014-10-02 | Tottori Univ | 哺乳動物における膵癌を診断するための診断キット、それを用いた検査方法および診断マーカー |
JP2019129798A (ja) * | 2018-02-02 | 2019-08-08 | 東ソー株式会社 | 加熱サンプルを用いたより迅速で効率的な等温増幅反応 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5837442A (en) * | 1995-11-29 | 1998-11-17 | Roche Molecular Systems, Inc. | Oligonucleotide primers for amplifying HCV nucleic acid |
JP3985959B2 (ja) * | 1999-04-20 | 2007-10-03 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | 核酸の測定方法に用いる核酸プローブおよびデータを解析する方法 |
WO2005020923A2 (en) * | 2003-08-29 | 2005-03-10 | Cedars-Sinai Medical Center | Composition and method for the treatment of cancer and other physiologic conditions based on modulation of the ppar-gamma pathway and her-kinase axis |
US20070178461A1 (en) * | 2003-11-21 | 2007-08-02 | Norimasa Miura | Cancer diagnostic method |
-
2008
- 2008-08-29 JP JP2009530199A patent/JP5721161B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2008-08-29 WO PCT/JP2008/065518 patent/WO2009028654A1/ja active Application Filing
-
2014
- 2014-08-12 JP JP2014164582A patent/JP2014239692A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2014239692A (ja) | 2014-12-25 |
WO2009028654A1 (ja) | 2009-03-05 |
JP5721161B2 (ja) | 2015-05-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11274351B2 (en) | Methods and compositions for detecting bacterial contamination | |
JP5674696B2 (ja) | 遠隔サンプル由来のdna断片を提供する方法 | |
ES2346589T3 (es) | Metodo para la deteccion de mutaciones en egfr en muestras de sagre. | |
US6344317B2 (en) | Diagnostic detection of nucleic acids | |
JPH05269000A (ja) | 核酸増幅による悪性腫瘍転移の検出方法 | |
US7785842B2 (en) | Comparative analysis of extracellular RNA species | |
TW201221650A (en) | Method for detection of enterovirus | |
JP2022546443A (ja) | cccDNAから転写されたHBV RNAを含む、B型肝炎ウイルスRNAの増幅および検出のための組成物および方法 | |
CA2384917C (en) | Nucleic acid primers and probes for detecting tumor cells | |
JP5721161B2 (ja) | TERT遺伝子のcDNAの製造、それを用いた核酸増幅法、検出方法、それらに用いるプライマー、及び、それらを用いた腫瘍の診断キット | |
JP5310764B2 (ja) | 微小転移の検出方法 | |
US20080003600A1 (en) | Isothermal screening of breast cancer related nucleic acid | |
EP1530644B1 (en) | Probes for detecting tumor cells | |
WO2018199136A1 (ja) | Abl1 t315i変異の発現レベルの測定方法 | |
US9062350B2 (en) | Method of mutation detection in blood cell-free DNA using primer extension (PE) and PCR | |
CN112852963B (zh) | 一种肝癌新型分子标记物tRF-Leu-AAG-007的检测试剂盒 | |
CN108866199B (zh) | 一种用于乳腺癌诊断mRNA标志物及其检测试剂盒与应用 | |
WO2003020975A2 (en) | OLIGONUCLEOTIDES FOR USE IN DETECTION OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS L1 mRNA | |
JP2017077183A (ja) | Dnajb1−prkaca遺伝子の検出方法 | |
JPH03164199A (ja) | 結核菌の迅速同定方法及び同定用試薬キット | |
JP2000069969A (ja) | プライマーDNA及びこれを用いる前立腺特異抗原をコードするmRNAの検出方法 | |
JP2008517626A (ja) | 乳房細胞を検出するための核酸プライマー及びプローブ |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20110804 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20130730 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20130927 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20131004 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20131028 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20140513 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140812 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140829 |
|
A911 | Transfer of reconsideration by examiner before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20140924 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20141118 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20141211 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20150303 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20150319 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5721161 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |