JPWO2008013260A1 - 生体標本及びその作製方法 - Google Patents
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Abstract
Description
-(CHR')p-X-(CHR")q- (I)
式中、Xは直接結合又は、-NHCOO-、-CONH-、-COO-、-SO2NH-、-HN-C(=NH)-NH-、-O-、-S-、-NR-、-CH=CH-、-C≡C-、-Ar-及び-CO-Ar-NR-からなる群から選択され少なくとも1種の官能基を表し、R'とR"はそれぞれ独立に、水素原子、あるいは芳香環を含んでも良いアルキル基又はアルケニル基等の脂肪族炭化水素基、あるいは芳香族炭化水素基であって、必要によりスルホニル基、ヒドロキシル基、4級アミン基及びカルボキシル基からなる群から選択されたいずれか1種の荷電基により置換されたものを表し、Arはアリール基を表し、pとqはそれぞれ独立に0から20の整数を表し、p+q≧1である。
すなわち、複数の蛍光色素により標識された組織又は細胞が支持基材上に固定されている生体標本に励起光を照射し、生体標本からの蛍光を観察する生体標本の観察方法であって、上記蛍光色素に、少なくとも有機EL色素から成る発色部を有し、該有機EL色素が、共役系を有し、1種以上のヘテロ原子、セレン原子又はボロン原子を含むアゾール誘導体又はイミダゾール誘導体である蛍光色素を用い、該蛍光色素に1種の励起光を照射して同時励起させ、発生した蛍光を、該励起光を吸収する1種のフィルターのみを透過させて生体標本からの複数の蛍光を観察することを特徴とする。
本発明は、蛍光色素により標識された組織又は細胞が支持基材上に固定されている生体標本であって、上記蛍光色素が、少なくとも有機EL色素から成る発色部を有し、上記有機EL色素が、共役系を有し、1種以上のヘテロ原子、セレン原子又はボロン原子を含むアゾール誘導体又はイミダゾール誘導体であることを特徴とする。
生体分子との間に共有結合を形成する場合、反応性基は、標的分子のアミノ基、イミノ基、チオール基又はヒドロキシル基と反応可能な官能基が好ましい。有機EL色素と標的分子との間の共有結合としては、アミド結合、イミド結合、ウレタン結合、エステル結合、又はグアニジン結合を形成させることが好ましい。その官能基には、例えば、イソチオシアネート基、イソシアネート基、エポキシ基、ハロゲン化スルホニル基、塩化アシル基、ハロゲン化アルキル基、グリオキザル基、アルデヒド基、トリアジン基、カルボジイミド基、マレイミド基そして活性エステル化したカルボニル基等を用いることができる。好ましくは、イソチオシアネート基、イソシアネート基、エポキシ基、ハロゲン化アルキル基、トリアジン基、カルボジイミド基そして活性エステル化したカルボニル基から選択されたいずれか1種を用いることが好ましい。より好ましくは、イソチオシアネート基、イソシアネート基、エポキシ基、ハロゲン化アルキル基、トリアジン基、カルボジイミド基そして活性エステル化したカルボニル基から選択されたいずれか1種を用いることが好ましい。標的分子のアミノ基とアミド結合を形成することができ、また標的分子内のイミノ基に直接結合する事ができるからである。さらに好ましくはトリアジン基、カルボジイミド基又は活性エステル化したカルボニル基である。また、これらの有機EL色素がカルボン酸基を有する場合、カルボジイミド誘導体、トリアジン誘導体の存在下で、標的分子中に存在するアミノ基およびイミノ基を直接修飾する事も可能である。さらに、置換基を有しても良いトリアジン基、置換基を有しても良いカルボジイミド基を有する有機EL色素は、DNA塩基中のグアニン、チミンのイミノ基と直接反応するため、PCR法による色素の導入を行う必要が無く、ミスマッチ検出(二本鎖を形成していない塩基の検出)が可能であり、SNP(1塩基多型)解析の試薬として用いることが可能である。
また、標的分子との間にイオン結合を形成する反応性基には、アニオン性基、例えばスルホニル基やカルボキシル基を用いることができる。これらのアニオン性基は、生体分子のカチオン性基、例えばアミノ基とイオン結合する。
なお、標的分子がDNAの場合にはオリゴDNA末端に修飾されたアミノ残基と、タンパク質の場合にはアミノ残基と、ペプチド類の場合にはポリペプチドのアミノ基と、例えばポリリシン誘導体のアミノ残基と、そして糖類の場合には多糖類誘導体骨格内のアミノ基と反応性基を結合させることができる。
(1)2種の官能基で構成する場合
-CONH-COO-、-CH2-O-、-CH2-NR- 等が好ましい。
(2)3種以上の官能基で構成する場合
(i)以下の一般式(I)で表されるものを用いることができる。
-(CHR')p-X-(CHR")q- (I)
式中、Xは直接結合又は、-NHCOO-、-CONH-、-COO-、-SO2NH-、-HN-C(=NH)-NH-、-O-、-S-、-NR-、-CH=CH-、-C≡C-、-Ar-及び-CO-Ar-NR-からなる群から選択された少なくとも1種の官能基を用いることができ、好ましくは-COO-、-CONH-、-O-、-CH=CH-、-C≡C-又は-Ar-、より好ましくは-COO-、-CONH-、-O-又は-Ar-を用いることができる。また、R'とR"はそれぞれ独立に、水素原子、あるいは芳香環を含んでも良いアルキル基又はアルケニル基等の脂肪族炭化水素基、あるいは芳香族炭化水素基であって、必要によりスルホニル基、ヒドロキシル基、4級アミン基及びカルボキシル基からなる群から選択されたいずれか1種の荷電基により置換されたものを用いることができる。また、Arはアリール基、好ましくは、フェニレン基又はナフチレンで基あり、必要に応じてスルホニル基で置換されたものを用いることができる。pとqはそれぞれ独立に0から20の整数、好ましくは0から10の整数、より好ましくは0から5の整数であり、p+q≧1である。
スペーサー部の具体例を挙げると、-(CH2)p-CONH-(CH2)q-、-(CH2)p-COO-(CH2)q-、
-(CH2)p-CH(-R'-SO3H)-(CH2)q-、-(CH2)p-CH(-R'-N+H3)-(CH2)q-、-(CH2)p-CH(-R'-COOH)-(CH2)q-、-(CH2)p-CH(-R'-OH)-(CH2)q-、-(CH2)p-(O-CH-)n-(CH2)q-、-(CH2)p-CONH(-R'-SO3H)-(CH2)q-、-(CH2)p-CONH(-R'-SO3H)-(CH2)q-、-(CH2)p-CONH(-R'-N+H3)-(CH2)q-、-(CH2)p-CONH(-R'-OH)-(CH2)q-、-(CH2)p-CONH(-R'-COOH)-(CH2)q-、-(CH2)p-COO-R'(-SO3H)-(CH2)q-、-(CH2)p-COO-R'(-OH)-(CH2)q-、-(CH2)p-COO-R'(-N+H3)-(CH2)q-、-(CH2)p-COO-R'(-COOH)-(CH2)q-、-(CH2)p-Ar-(CH2)q-、-(CH2)p-(Ar-COO)-(CH2)q-、-(CH2)p-(Ar-SO3H)-(CH2)q-、-(CH2)p-(Ar-N+H3)-(CH2)q-、-(CH2)p-(Ar-OH)-(CH2)q-、-(CH2)p-(Ar-COOH)-(CH2)q-、-(CH2)p-C≡C-(CH2)q-、-(CH2)p-C=C-(CH2)q-、-(CH2)p-NR-(CH2)q-、-(CH2)p-O-(CH2)q-、-(CH2)p-S-(CH2)q-、-(CH2)p-HN-C(=NH)-NH- (CH2)q-、-(CH2)p-CO-Ar-NR-(CH2)q-等を挙げることができる。より好ましくは、-(CH2)p-CONH-(CH2)q-、-(CH2)p-COO-(CH2)q-、
である。
(ii)また、以下の一般式(II)で表されるものを用いることもできる。
-Y-(CHR3)r-Z- (II)
ここで、Y及びZは、それぞれ独立に、-NHCOO-、-CONH-、-COO-、-SO2NH-、-HN-C(=NH)-NH-、-O-、-S-、-NR-、-CH=CH-、-C≡C-、-Ar-及び-CO-Ar-NR-からなる群から選択された1種の官能基であり、好ましくは、-CONH-と-COO-、-COO-と-COO-、-COO-と-NR- 等の組み合わせである。また、R3は、水素原子、あるいは芳香環を含んでも良いアルキル基又はアルケニル基等の脂肪族炭化水素基、あるいは芳香族炭化水素基であって、必要によりスルホニル基、ヒドロキシル基、4級アミン基及びカルボキシル基からなる群から選択されたいずれか1種の荷電基により置換されたものを用いることができる。また、Arはアリール基、好ましくは、フェニレン基又はナフチレンで基あり、必要に応じてスルホニル基で置換されたものを用いることができる。rは0から20の整数、好ましくは0から10の整数、より好ましくは0から5の整数である。このスペーサー部の具体例を挙げると、-CONH-(CH2)r-COO-、-CONH-CH(-R3-OH)-COO-、-CONH-CH(-R3-COOH)-COO-、-CONH-CH(R3-SO3H)-COO-、-COO-(CH2)r-COO- 等を挙げることができる。
また、反応式(II)は、活性エステル化したカルボニル基にトリアジン誘導体を用い、反応性基と結合するスペーサー部の官能基に-COO-を用いた例を示している。
また、反応式(III)は、反応性基にカルボジイミド基を用い、反応性基と結合するスペーサー部の官能基に-COO-を用いた例を示している。カルボジイミド基には、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)や1-シクロヘキシル-3-(2-モルホリノエチル)カルボジイミド等のカルボジイミド試薬を用いることができる。カルボジイミド体を経由してアミド結合により有機EL色素と標的分子を結合させることができる。
また、反応式(IV)は、スペーサー部に予めカルボジイミド基、トリアジン基を導入した例、すなわち、反応性基と結合するスペーサー部の官能基が反応性基を兼ねる例を示している。これにより、蛍光色素に別途、反応性基を導入しなくても、標的分子内のアミノ基、イミノ基に対して蛍光色素を直接結合させる事ができる。
以下に、縮合多環化合物の具体例について説明する。
また、R'は芳香環を含んでも良いアルキル基又はアルケニル基等の脂肪族炭化水素基あるいは芳香族炭化水素基を示す。ここで、アルキル基、アルケニル基芳香族炭化水素基には、上記と同様のものを用いることができる。
また、An-は、Cl-、Br-、I-等のハロゲン化物イオン、CF3SO3 -、BF4 -又はPF6 -を示す。なお、以下の一般式においても、特に断らない限り同様である。
なお、以下の一般式においても、特に断らない限り同様である。また、nは1以上の整数、好ましくは1〜5であり、以下の一般式中でも同様である。
また、チオフェン誘導体の場合、非縮合系の化合物であり、以下の一般式で示される2,3,4,5-テトラフェニルチオフェン誘導体を用いることもできる。
また、以下の一般式で示される2,3,4,5-テトラフェニルチオフェン誘導体を用いることもできる。
(1)2種の官能基で構成する場合
-CONH-COO-、-CH2-O-又は-CH2-NR- が好ましい。
(2)3種以上の官能基で構成する場合
(i)以下の一般式(I)で表されるものを用いることができる。
-(CHR')p-X-(CHR")q- (I)
式中、Xは直接結合又は、-NHCOO-、-CONH-、-COO-、-SO2NH-、-HN-C(=NH)-NH-、-O-、-S-、-NR-、-Ar-及び-CO-Ar-NR-からなる群から選択された少なくとも1種の官能基を用いることができ、好ましくは-COO-、-CONH-、-O-又は-Ar-、より好ましくは-COO-、-CONH-、-O-又は-Ar-を用いることができる。また、R'とR"はそれぞれ独立に、水素原子、あるいは芳香環を含んでも良いアルキル基から成る脂肪族炭化水素基あるいは芳香族炭化水素基であって、必要によりスルホニル基、ヒドロキシル基、4級アミノ基及びカルボキシル基からなる群から選択されたいずれか1種の荷電基により置換されたものを用いることができる。また、Arはアリール基、好ましくは、フェニレン基又はナフチレンで基あり、必要に応じてスルホニル基で置換されたものを用いることができる。pとqはそれぞれ独立に0から20の整数、好ましくは0から10の整数、より好ましくは0から5の整数であり、p+q≧1である。
リンカーの具体例を挙げると、-(CH2)p-CONH-(CH2)q-、-(CH2)p-COO-(CH2)q-、
-(CH2)p-CH(-R'-SO3H)-(CH2)q-、-(CH2)p-CH(-R'-N+H3)-(CH2)q-、-(CH2)p-CH(-R'-COOH)-(CH2)q-、-(CH2)p-CH(-R'-OH)-(CH2)q-、-(CH2)p-(O-CH-)n-(CH2)q-、-(CH2)p-CONH(-R'-SO3H)-(CH2)q-、-(CH2)p-CONH(-R'-SO3H)-(CH2)q-、-(CH2)p-CONH(-R'-N+H3)-(CH2)q-、-(CH2)p-CONH(-R'-OH)-(CH2)q-、-(CH2)p-CONH(-R'-COOH)-(CH2)q-、-(CH2)p-COO-R'(-SO3H)-(CH2)q-、-(CH2)p-COO-R'(-OH)-(CH2)q-、-(CH2)p-COO-R'(-N+H3)-(CH2)q-、-(CH2)p-COO-R'(-COOH)-(CH2)q-、-(CH2)p-Ar-(CH2)q-、-(CH2)p-(Ar-COO)-(CH2)q-、-(CH2)p-(Ar-SO3H)-(CH2)q-、-(CH2)p-(Ar-N+H3)-(CH2)q-、-(CH2)p-(Ar-OH)-(CH2)q-、-(CH2)p-(Ar-COOH)-(CH2)q-、-(CH2)p-NR-(CH2)q-、-(CH2)p-O-(CH2)q-、-(CH2)p-S-(CH2)q-、-(CH2)p-HN-C(=NH)-NH- (CH2)q-、-(CH2)p-CO-Ar-NR-(CH2)q-等を挙げることができる。より好ましくは、-(CH2)p-CONH-(CH2)q-又は-(CH2)p-COO-(CH2)q-である。
(ii)また、以下の一般式(II)で表されるものを用いることもできる。
-Y-(CHR3)r-Z- (II)
ここで、Y及びZは、それぞれ独立に、-NHCOO-、-CONH-、-COO-、-SO2NH-、-HN-C(=NH)-NH-、-O-、-S-、-NR-、-Ar-及び-CO-Ar-NR-からなる群から選択された1種の官能基であり、好ましくは、YとZがそれぞれ、-CONH-と-COO-、-COO-と-COO-、-COO-と-NR- の組み合わせ、より好ましくは-COO-と-COO-、-COO-と-NR- の組み合わせである。また、R3は、水素原子、あるいは芳香環を含んでも良いアルキル基から成る脂肪族炭化水素基あるいは芳香族炭化水素基であって、必要によりスルホニル基、ヒドロキシル基、2級アミノ基、3級アミノ基、4級アミノ基及びカルボキシル基からなる群から選択されたいずれか1種の荷電基により置換されたものを用いることができる。また、Arはアリール基、好ましくは、フェニレン基又はナフチレン基であり、必要に応じてスルホニル基で置換されたものを用いることができる。rは0から20の整数、好ましくは0から10の整数、より好ましくは0から5の整数である。このスペーサー部の具体例を挙げると、-CONH-(CH2)r-COO-、-CONH-CH(-R3-OH)-COO-、-CONH-CH(-R3-COOH)-COO-、-CONH-CH(R3-SO3H)-COO-、-COO-(CH2)r-COO- 等を挙げることができる。
検体からの採取は、固定液の滲透を良くするために、薄くかつ小さく、例えば、厚さ1mm、大きさ1mm3程度に細切りして行う。固定は、組織や細胞を生体に近い状態に保存するために行うもので、ホルムアルデヒドやグルタールアルデヒド等の還元剤を用いて行う。次に、組織中の水分を除くために脱水剤にエタノールやアセトン等を用いて脱水する。次に、パラフィンで包埋するに先立って、パラフィンと脱水剤との親和性を有する置換剤、例えばキシレンを用い、組織内を置換する。次に、パラフィンを組織内に滲透させて固めてパラフィン包埋体を作製する。そのパラフィン包埋体をミクロトームにより薄切りして厚さ2〜10μm程度の切片とする。その切片をスライドガラス上に載せ、温水に浸け切片のしわをとって支持基材上に固定する。次に、脱パラフィン処理を行って、切片からパラフィンを除去する。次に、蛍光色素を用いて切片を標識する。さらに、マイアーヘマトキシリン液等を用い対比染色を行う。その後、脱水剤による脱水、キシレン等による透徹を行い、非水溶性封入剤を滴下しカバーガラスを載せて封入し、顕微鏡観察に供する。これにより、生体標本の一の態様として、蛍光色素により標識された組織又は細胞からなる薄切片がスライドガラスからなる支持基材上に固定された状態で、封入剤とともに封入部材であるカバーガラスにより封入された生体標本を作製することができる。この生体標本は、顕微鏡観察後は、凍結保存する。
合成例1.
有機EL色素として、1, 2, 5,-オキサジアゾロ-[3, 4-c]ピリジン誘導体を用いた。
合成例1は、スペーサー部を有しない蛍光色素の例を示し、合成例2から6はスペーサー部を導入した蛍光色素の例を示す。以下に、スペーサー部を導入したオキサジアゾロ-[3, 4-c]ピリジンの活性エステル体の反応例(スキーム2と3)を示す。
(合成手順)
(1)ジケトン誘導体(2)の合成
500mL三口フラスコに4-メトキシアセトフェノン(1)37.5 g (0.25 mol)、亜硝酸ナトリウム0.15 gを酢酸100 mLに溶解した。水浴中、HNO3 100 mLを酢酸100 mLに溶解したものを2時間かけて滴下した。その後、室温で2日間撹拌した。反応混合物を500mLの水にゆっくりと入れ、沈殿を生成させた。沈殿物は濾過し、クロロホルムに溶解した。クロロホルム相を飽和重曹水で洗浄し、10% NaCl 水溶液で2回洗浄した。MgSO4で脱水した後、減圧下、クロロホルムを留去し、オキサジアゾール-N-オキサイド(2)を34.5 g (収率78%)で得た。
500mL三口フラスコにオキサジアゾール-N-オキサイド(2)17.7 g (0.05 mol)をアセトニトリル400 mLに溶解した。それにZn 12.0 g、AcOH 7 mL、Ac2O 20mLを添加した。水浴中で反応温度が30℃を超えないように冷却した。12時間撹拌して反応終点とした。反応混合物を濾過し、不溶分を除去した。アセトニトリルを減圧下留去して残渣を得た。残渣をクロロホルムで再結晶し、オキサジアゾール-N-オキサイド(3)を10.2 g (収率60%)で得た。
500mL三口フラスコでオキサジアゾール-N-オキサイド(3)15.6 g (0.046 mol)をブタノール300 mLに溶解した。そこへグリシンエチルエステル塩酸塩 32.0 g (0.23 mol)を添加した。24時間加熱還流を行った。ブタノールを減圧下留去し、残渣を得た。残渣を200mLのクロロホルムに溶解し、10% HCl、飽和NaHCO3、10%NaClで洗浄した。MgSO4で乾燥し、溶媒を留去した。得られた残渣をクロロホルムで再結晶し、オキサジアゾロピリジンエチルエステル(4)を13.0 g (収率 70%)で得た。
500mL三口フラスコでオキサジアゾロピリジンエチルエステル(4)3.0 g (0.007 mol)を200 mLのエタノールに溶解した。そこへKOH 0.62 g (0.01 mol)を添加した。5時間加熱環流を行った後、反応混合物を200 mLの水へ添加した。この水溶液に濃塩酸を滴下してpH 1に調整したところ沈殿が生じた。沈殿物を濾過し、クロロホルムに溶解した。クロロホルム相を10% NaHCO3水溶液、水で洗浄した。クロロホルムを留去して残渣を得た。残渣を水-エタノール (1:1)で再結晶し、2.1 g (収率 81%)のオキサジアゾロピリジンカルボン酸(5)を得た。
50 mL 三口フラスコでオキサジアゾロピリジンカルボン酸(5)1.0 g (0.0026 mol)とN-ヒドロキシスクシンイミド0.30 g (0.0026 mol)をDMF 20mLに溶解した。これにN, N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド 0.54 g (0.0026 mol)を30分かけて滴下した。滴下後、室温で30時間撹拌した。減圧下、DMFを留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム)で単離精製し、オキサジアゾロピリジン活性エステル体(6)を0.76 g (収率62%)得た。
スペーサー部にアラニンを用いた例を示す。以下に、合成例1と異なる部分のみの合成手順を示す。
(1)カルボン酸体(7)の合成
50 mL 三口フラスコでオキサジアゾロピリジン活性エステル体(6) 100 mg (0.21 mmol)とアラニン18.8 mg (0.21 mmol)をDMF 20mLに溶解した。その後、室温で12時間撹拌した。反応終了後、減圧下、DMFを留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム−メタノール=7:3)で単離精製し、カルボン酸体(7)を83 mg (収率88%)得た。
次いで、50 mL 三口フラスコでオキサジアゾロピリジンカルボン酸体(7)70 mg (0.16 mmol)とN-ヒドロキシスクシンイミド18.0 mg (0.16 mmol)をDMF 20mLに溶解した。これにDMF 5 mLに溶解したN, N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド 32.2 mg (0.16 mmol)を30分かけて滴下した。滴下後、室温で30時間撹拌した。減圧下、DMFを留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム)で単離精製し、活性エステル体(8)を75.8 mg (収率89%)得た。
有機EL色素としてイミダゾロピリジンエチルエステル誘導体を用いた。以下に、スペーサー部を導入したイミダゾロピリジンエチルエステルの活性エステル体の反応例(スキーム4と5)を示す。
500mL三口フラスコでエステル体(1)0.5 g (1.5 mmol)を50 mLのエタノールに溶解した。そこへKOH 0.12 g (2.1 mol)を添加した。5時間加熱環流を行った後、反応混合物を50 mLの水へ添加した。この水溶液に濃塩酸を滴下してpH 1に調整したところ沈殿が生じた。沈殿物を濾過し、クロロホルムに溶解した。クロロホルム相を10% NaHCO3水溶液、水で洗浄した。クロロホルムを留去して残渣を得た。残渣を水で再結晶し、0.3 g (収率 63%)のカルボン酸体(2) を得た。
50 mL 三口フラスコでカルボン酸誘導体(2)0.2 g (0.6 mmol)とN-ヒドロキシスクシンイミド0.07 g (0.6 mmol)をDMF 10mLに溶解した。これにN, N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド 0.12 g (0.6 mmol)を30分かけて滴下した。滴下後、室温で30時間撹拌した。減圧下、DMFを留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム)で単離精製し、活性エステル体(3)を0.14 g (収率55%)得た。
50 mL 三口フラスコでイミダゾロピリジン活性エステル体(3) 80 mg (0.19 mmol)とアラニン17.3 mg (0.19 mmol)をDMF 20mLに溶解した。その後、室温で10時間撹拌した。反応終了後、減圧下、DMFを留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム−メタノール=7:3)で単離精製し、カルボン酸体(4)を 58 mg (収率 78%)得た。
次いで、50 mL 三口フラスコでイミダゾロピリジンカルボン酸体(4)54 mg (0.14 mmol)とN-ヒドロキシスクシンイミド16.1 mg (0.14 mmol)をDMF 20mLに溶解した。これにDMF 5 mLに溶解したN, N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド 28.8 mg (0.14 mmol)を30分かけて滴下した。滴下後、室温で30時間撹拌した。減圧下、DMFを留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム)で単離精製し、活性エステル体(5)を62.2 mg (収率 92%)得た。
有機EL色素として合成例1で用いたオキサジアゾロピリジン誘導体を用い、スペーサー部にシステイン酸を用いた。オキサジアゾロピリジン活性エステル体(6)をシステイン酸と反応させ、スペーサー部を導入したカルボン酸体(9)を合成した。その後、カルボン酸体(9)をジオキサン中、N-ヒドロキシスクシンイミドと反応させ、スペーサー部を導入したオキサジアゾロピリジン活性エステル体(10)を合成した。以下に反応例を示す。
(1)カルボン酸体(9)の合成
50 mL 三口フラスコでオキサジアゾロピリジン活性エステル体(6) 100 mg (0.21 mmol)とシステイン酸 39 mg (0.23 mmol)をDMF 20mLに溶解した。その後、室温で12時間撹拌した。反応終了後、減圧下、DMFを留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム−メタノール=7:3)で単離精製し、カルボン酸体(9)を98 mg (収率88%)得た。
次いで、50 mL 三口フラスコでオキサジアゾロピリジンカルボン酸体(9) 80 mg (0.15 mmol)とN-ヒドロキシスクシンイミド 19 mg (0.17 mmol)をDMF 20mLに溶解した。これにDMF 5 mLに溶解したN, N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド 35 mg (0.17 mmol)を30分かけて滴下した。滴下後、室温で30時間撹拌した。減圧下、DMFを留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム:メタノール=10:1)で単離精製し、活性エステル体(10)を73 mg (収率 78%)得た。
有機EL色素として合成例1で用いたオキサジアゾロピリジン誘導体を用い、スペーサー部にセリンを用いた。オキサジアゾロピリジン活性エステル体(6)をセリンと反応させ、スペーサー部を導入したカルボン酸体(11)を合成した。その後、カルボン酸体(11)をジオキサン中、N-ヒドロキシスクシンイミドと反応させ、スペーサー部を導入したオキサジアゾロピリジン活性エステル体(12)を合成した。以下に反応例を示す。
(1)カルボン酸体(11)の合成
50 mL 三口フラスコでオキサジアゾロピリジン活性エステル体(6) 100 mg (0.21 mmol)とセリン26 mg (0.25 mmol)をDMF 20mLに溶解した。その後、室温で12時間撹拌した。反応終了後、減圧下、DMFを留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム−メタノール=7:3)で単離精製し、カルボン酸体(12)を 79 mg (収率 81%)得た。
次いで、50 mL 三口フラスコでオキサジアゾロピリジンカルボン酸体(11) 70 mg (0.15mmol)とN-ヒドロキシスクシンイミド 19 mg (0.17 mmol)をDMF 20mLに溶解した。これにDMF 5 mLに溶解したN, N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド 35 mg (0.17 mmol)を30分かけて滴下した。滴下後、室温で30時間撹拌した。減圧下、DMFを留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム:メタノール=10:1)で単離精製し、活性エステル体(12)を 61 mg (収率 72%)得た。
有機EL色素として合成例1で用いたオキサジアゾロピリジン誘導体を用い、スペーサー部にペプチドリンカーとしてアラニルセリン(Ala-Ser)を用いた。オキサジアゾロピリジン活性エステル体(6)をアラニルセリンと反応させ、スペーサー部を導入したカルボン酸体(13)を合成した。その後、カルボン酸体(13)をジオキサン中、N-ヒドロキシスクシンイミドと反応させ、スペーサー部を導入したオキサジアゾロピリジン活性エステル体(14)を合成した。以下に反応例を示す。
(1)カルボン酸体(13)の合成
50 mL 三口フラスコでオキサジアゾロピリジン活性エステル体(6) 100 mg (0.21 mmol)とアラニルセリン 45 mg (0.25 mmol)をDMF 20mLに溶解した。その後、室温で10時間撹拌した。反応終了後、減圧下、DMFを留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム−メタノール=6:4)で単離精製し、カルボン酸体(13)を72 mg (収率64%)得た。
次いで、50 mL 三口フラスコでオキサジアゾロピリジンカルボン酸体(13) 60 mg (0.11 mmol)とN-ヒドロキシスクシンイミド 14 mg (0.12 mmol)をDMF 15mLに溶解した。これにDMF 5 mLに溶解したN, N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド 25 mg (0.12 mmol)を30分かけて滴下した。滴下後、室温で15時間撹拌した。減圧下、DMFを留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム:メタノール=8:2)で単離精製し、活性エステル体(14)を60 mg (収率 86%)得た。
以下に、窒素カチオン含有基として活性エステルと結合した3-エチルエステルピリジニウム基を用いた場合の反応例を示す。
オキサジアゾロピリジンエチルエステル体(4)をNaBH4存在下、還元反応を行い、ヒドロキシメチル体(15)を得、これと塩化チオニルを反応させチアジアゾロピリジンクロロメチル体(16)を得、これに3-エチルエステルピリジン活性エステル体(17)を反応させて窒素カチオン体(18)を合成した。
(1)クロロメチル体(16)の合成
50 mL 三口フラスコでピリジンヒドロキシメチル体(15) 100 mg (0.35 mmol)をSOCl2 20 mLに溶解した。その後、60℃で10時間撹拌した。反応終了後、減圧下、SOCl2を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム−ヘキサン=8:2)で単離精製し、クロロメチル体(16)を72 mg (収率62%)得た。
チアジアゾロピリジンクロロメチル体(16) (100 mg、0.3 mmol)と3-エチルエステルピリジン活性エステル体(17) (0.9 mmol, 206 mg)とをToluene 5mlに溶解させ、一晩加熱還流を行った。反応終了後、吸引濾過を行い、濾物を真空乾燥させ、窒素カチオン体(18)を得た。反応は定量的である。
1H-NMR (CDCl3): 9.33 (s, 1H), 9.07 (d, 1H), 8.35-8.51 (m, 4H), 7.50-7.67 (m, 8H), 6.46 (s, 2H), 3.32 (t, 2H), 3.10 (t, 2H), 2.80 (s, 4H).
(蛍光実体顕微鏡による観察)
(1)生体標本の作製
マウスから摘出した肝臓に、蛍光色素として合成例1で合成した活性エステル体(6)の粉末を振りまき、スライドガラス上に固定して生体標本とした。
作製した生体標本に紫外線の励起光を照射し、蛍光実体顕微鏡下(ニコン製)で観察した。さらに、この生体標本を2週間冷蔵保存した後、再度蛍光実体顕微鏡下で観察した。図1に標本作製直後と2週間経過後の観察像を示す。GFPが発現している肝臓の場合、2週間経過後蛍光を確認できなかった。一方、本発明の生体標本では、蛍光が全く褪色せず観察が可能であった。
(蛍光顕微鏡による薄切片の観察)
(1)生体標本の作製
マウスに蛍光色素として活性エステル体(6)を溶解したDMSO溶液0.5 mLを筋肉注射し、3日間放置後、灌流固定前にそのDMSO溶液0.9 mLを血管より注入した。その後、摘出したリンパ節をグルタール+パラフォルム灌流固定し、エトキシプロパノールで脱水し、減圧乾燥し、テクノビット包埋し、ミクロトームにより薄切りして切片を得た。その切片をスライドガラスに固定後、封入剤を用いカバーガラスで封入して生体標本を得た。なお、脱水、乾燥後に切片の収縮は認められなかった。
作製した生体標本に紫外線の励起光を照射し、蛍光顕微鏡下(オリンパス製)で観察した。さらに、この生体標本を1週間冷蔵保存した後、再度蛍光実体顕微鏡下で観察した。
図1に標本作製直後の観察像を示す。図中の矢印で示した箇所では、蛍光色素による高輝度のオレンジの蛍光が認められた。蛍光色素を取り込んだマクロファージが集積されたものと考えられる。1週間冷蔵保存した後も、蛍光色素による高輝度のオレンジの蛍光が認められた。また、比較として脱水剤にアセトンを用いて切片を作製したが、脱水、乾燥により切片が収縮した。
(包埋樹脂の自家蛍光の影響)
(1)試料の作製方法
スライドグラス上に蛍光色素として合成例1で合成した活性エステル体(6)の粉末を置き、その蛍光色素をエポン包埋して試料とした。比較のため、テキサスレッドとエポン樹脂を用いた試料も作製した。
試料に所定波長域の可視光を照射し、蛍光実体顕微鏡で観察した。図3の上段は、(従来の蛍光色素)を用いた例を示し、下段は活性エステル体(6)を用いた例を示す。図3の下段の右端に示すように、340-380nmの紫外光を照射し、425nmのフィルターを用いて蛍光を観察した場合、エポンの自家蛍光に阻害されることなく、蛍光色素が有するオレンジ色の色調を確認することができた。
(多重標識標本観察の検討)
(1)試料
蛍光色素に、活性エステル体(6)(オレンジ)と、その誘導体2種(グリーン及びイエロー)を用い、それぞれDMSO溶液を調製した。これら3種の蛍光色素には、励起波長/フィルター波長が、515-560nm/580nm、490-577nm/528-633nm、340-380nm/425nmの条件で蛍光を観察した。
ここで、用いた3種の蛍光色素は、グリーンは励起波長が383nmで蛍光波長が520nm、イエローは励起波長が415nmで蛍光波長が535nm、オレンジは励起波長が460nmで蛍光波長が594nmである。
図4はその結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図中、上段がオレンジ、中段がグリーン、そして下段がイエローの蛍光色素である。これにより、1種の励起波長を用い、かつ検出側に1種のフィルターを用いることにより、3種の蛍光を同時観察することができた。これにより、標本を多重標識した場合であっても、1種の励起波長を用い、かつ検出側に1種のフィルターを用いることにより、3種の蛍光を同時観察することができると可能と考えられる。
1.0 mgのストレプトアビジンを0.2 M Sodium bicarbonate buffer (pH8.3) 400 μlで溶解し、ストレプトアビジン溶液を調製した。調製したストレプトアビジン溶液に窒素カチオン体(18)のDMSO溶液 200 μlを加え、室温で1時間攪拌した。その後、反応相をSephadex series G-25で濾過し、標識されたストレプトアビジンを得た。
結果を図5に示す。ビオチン標識抗マウス抗体と窒素カチオン体標識ストレプトアビジンを反応させたラット脊髄の組織片では青色蛍光が検出された。また、2週間経過後でも、蛍光が全く褪色せず観察が可能であった。また、7ヶ月経過後の結果を図6に示す。7ヶ月経過後でも、蛍光が全く褪色せず観察が可能であった。
Claims (16)
- 蛍光色素により標識された組織又は細胞が支持基材上に固定されている生体標本であって、
上記蛍光色素が、少なくとも有機EL色素から成る発色部を有し、該有機EL色素が、共役系を有し、1種以上のヘテロ原子、セレン原子又はボロン原子を含むアゾール誘導体又はイミダゾール誘導体である生体標本。 - 上記アゾール誘導体が、以下の一般式(1)、(2)又は(3)のいずれか1種である請求項1記載の生体標本。
- 上記イミダゾール誘導体が、以下の一般式(4)、(5)、(6)、(7)又は(8)で示される請求項1記載の生体標本。
- 上記蛍光色素が生体分子を結合する結合部を有し、該結合部が、カルボン酸基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、エポキシ基、ハロゲン化アルキル基、トリアジン基、カルボジイミド基そして活性エステル化したカルボニル基から選択されたいずれか1種の反応性基を有する請求項1記載の生体標本。
- 上記蛍光色素が、発色部と結合部とを連結するスペーサー部を有する請求項5記載の生体標本。
- 上記スペーサー部が、-CH2-、-NHCOO-、-CONH-、-COO-、-SO2NH-、-HN-C(=NH)-NH-、-O-、-S-、-NR-(Rはアルキル基)、-(CH2-CH2-O)n-(nは1〜10の整数)、-CH=CH-、-C≡C-、-Ar-及び-CO-Ar-NR-からなる群から選択される官能基を少なくとも1種含む請求項6記載の生体標本。
- 上記スペーサー部が、以下の一般式(I)で表される請求項7記載の生体標本。
-(CHR')p-X-(CHR")q- (I)
(式中、Xは直接結合又は、-NHCOO-、-CONH-、-COO-、-SO2NH-、-HN-C(=NH)-NH-、-O-、-S-、-NR-、-CH=CH-、-C≡C-、-Ar-及び-CO-Ar-NR-からなる群から選択された少なくとも1種の官能基を表し、R'とR"はそれぞれ独立に、水素原子、あるいは芳香環を含んでも良いアルキル基又はアルケニル基等の脂肪族炭化水素基、あるいは芳香族炭化水素基であって、必要によりスルホニル基、ヒドロキシル基、4級アミン基及びカルボキシル基からなる群から選択されたいずれか1種の荷電基により置換されたものを表し、Arはアリール基を表し、pとqはそれぞれ独立に0から20の整数を表し、p+q≧1である。) - 上記アゾール誘導体が、以下の一般式(9)、(10)又は(11)のいずれか1種で示される請求項1記載の生体標本。
- 上記のリンカーLが、-(CH2)n-(nは1〜4の整数)である請求項9記載の生体標本。
- 上記イミダゾール誘導体が、以下の一般式(12)、(13)、(14)、(15)又は(16)のいずれか1種で示される請求項1記載の生体標本。
- 上記のリンカーLが、-(CH2)n-(nは1〜4の整数)である請求項11記載の生体標本。
- 蛍光色素により標識された組織又は細胞が支持基材上に固定されている生体標本の作製方法であって、
検体から採取した組織又は細胞を包埋剤により包埋して包埋体となし、
該包埋体を薄切りして切片となし、
該切片を支持基材上に固定し、
該切片を、少なくとも有機EL色素から成る発色部を有し、該有機EL色素が、共役系を有し、1種以上のヘテロ原子、セレン原子又はボロン原子を含むアゾール誘導体又はイミダゾール誘導体である上記蛍光色素で標識する、生体標本の作製方法。 - 上記切片を上記蛍光色素で標識するに先立って、上記包埋剤を除去する請求項13記載の作製方法。
- 上記包埋体を作製するに際し、脱水溶剤にエーテルアルコール類又はグルシジルエーテル類を用いる請求項13記載の作製方法。
- 複数の蛍光色素により標識された組織又は細胞が支持基材上に固定されている生体標本に励起光を照射し、生体標本からの蛍光を観察する生体標本の観察方法であって、上記蛍光色素に、少なくとも有機EL色素から成る発色部を有し、該有機EL色素が、共役系を有し、1種以上のヘテロ原子、セレン原子又はボロン原子を含むアゾール誘導体又はイミダゾール誘導体である蛍光色素を用い、該蛍光色素に1種の励起光を照射して同時励起させ、発生した蛍光を、該励起光を吸収する1種のフィルターのみを透過させて生体標本からの複数の蛍光を観察する生体標本の観察方法。
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