JPWO2007088849A1 - 播種性血管内凝固症候群の病態把握方法 - Google Patents

播種性血管内凝固症候群の病態把握方法 Download PDF

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Abstract

播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）患者において、フォンヴィルブランド因子（ｖＷＦ）切断酵素（ＡＤＡＭＴＳ１３）の量及び／又は酵素活性（好ましくは、更にｖＷＦの量）を分析する、ＤＩＣの病態の把握方法、並びに、ＡＤＡＭＴＳ１３に特異的に結合する抗体又はその断片を含む、ＤＩＣの病態の把握用キットを開示する。本発明によれば、臨床所見や従来のマーカーだけからでは差別化できなかったＤＩＣ患者から、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）患者の鑑別診断を行うことができる。

Description

本発明は、播種性血管内凝固症候群（Disseminated Intravascular Coagulation；以下、ＤＩＣと称する）の病態把握方法に関する。
播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）では、重篤な基礎疾患の存在下に、全身の細小血管内に微小血栓が形成される。そのため、微小循環が障害され、臓器の機能不全や出血傾向が見られる。ＤＩＣでは、以下の３つの障害や反応が起こる。
（１）微小血栓形成による微小循環障害がおこり、虚血の為に多数の臓器が機能不全に陥る。
（２）微小血栓形成による消費性凝固障害、すなわち、組織因子が細胞表面に多く発現し、外因系血液凝固が促進される。また、血液凝固因子や血小板が消費され、出血傾向が現われる。
（３）過剰線溶、すなわち、凝固の促進に応じて線溶系も活性化され、フィブリンを分解するプラスミンが生成される。プラスミンを阻害するα２プラスミンインヒビター（α２ＰＩ）が消費され、正常の６０％未満に減少すると、プラスミンによってフィブリンが過剰に分解され、出血傾向が現われる。
ＤＩＣの本態は血液凝固系の病的かつ持続的な活性化による微小血栓の形成にあるが、それに伴って線溶系も活性化される。しかし、両者のバランスは基礎疾患あるいは症例ごとに差異があり、凝固活性化は著しいが線溶系は抑制される場合や、凝固・線溶両者の活性化が著しいケースなどが見られる。前者を凝固優位型、後者を線溶優位型と分類する。凝固優位型ＤＩＣは感染症、特に敗血症に合併することが多く、臨床症状として臓器症状が見られやすい。一方、線溶優位型のＤＩＣでは線溶のマーカーであるＦＤＰ（Fibrin degradation product）やＰＩＣ（Plasmin/plasmin inhibitor complex）が著明に増加し、出血症状が見られやすい。基礎疾患としては急性前骨髄性白血病である。
ＤＩＣは治療が遅れると死に直結するため、早期診断及び早期治療が望まれる緊急性の高い病態である。現在、ＤＩＣは厚生省のＤＩＣ診断基準に従い診断されている。この診断基準では、１）臓器障害の有無、２）血小板数、３）ＦＤＰ、４）フィブリノゲン、５）ＰＴ比（プロトロンビン時間比）の値をスコア化してＤＩＣを判定している。この診断基準はＤＩＣの確定診断には優れているが、ＤＩＣの早期診断には難点があり、臨床的にこの診断基準に従い治療を行うと既にＤＩＣの病態が進みすぎていて手遅れになるケースも多い。また、臨床の場においても、特に血小板数の低下がＤＩＣによるものかどうか鑑別しがたいことが少なくない。具体的には、骨髄抑制を伴う病態（薬物、ウイルス感染症、各種造血障害をきたす血液疾患など）、肝硬変、肝不全、血栓性血小板減少性紫斑病（thrombotic thrombocytopenic purpura；ＴＴＰ）／溶血性尿毒症症候群（hemolytic uremic
syndrome；ＨＵＳ）、大量胸水・腹水などがあげられる。これらの病態においては、血小板数の低下のみならずＦＤＰやＤダイマーの上昇を伴うこともあり、更にＤＩＣの鑑別は困難となる。
ＤＩＣの治療法としては、血管内の血栓多発を抑制し、同時に消費性凝固障害の進行を阻止するために、低分子ヘパリンやアンチトロンビンIII製剤を投与する。線溶優位型ＤＩＣでは、抗トロンビン作用及び抗線溶作用のあるメシル酸ガベキサートを投与する。血小板数産生の低下している血液疾患に合併したＤＩＣに対しては、濃厚血小板による血小板補充が不可欠である。血中フィブリノゲンが低下しているＤＩＣには、新鮮凍結血漿（ＦＦＰ）輸注が施行される。
一方、ＴＴＰは、ＤＩＣやＨＵＳなどと同様、細血管障害性溶血性貧血（microangiopathic hemolytic anemia；ＭＡＨＡ）と呼ばれる病態を示す。何らかの原因で血管内に病的微小血栓が多数形成されると細小血管内に狭くなった部位が多数生じ、ここを無理に通過した赤血球は機械的に破砕されるため溶血が起こる。これがＭＡＨＡの発症機序と考えられている。血管内径を小さくしてしまう微小血栓の主成分がフィブリンからなる場合がＤＩＣであり、血小板からなる場合がＴＴＰ又はＨＵＳである。
ＴＴＰは、１９２４年に米国のMoschcowitzによって始めて報告された細小動脈に血小板の凝集塊（血小板血栓）が詰まり、以下のような５つの症状がみられる全身性重篤疾患である。症状は、１）血小板減少症（皮膚に紫斑ができる）、２）溶血性貧血（赤血球の崩壊による）、３）腎機能障害、４）発熱、５）動揺性精神神経症状である。
ＴＴＰの病因として、止血因子である血漿中のｖＷＦの特異的切断酵素(VWF-cleaving protease；ＶＷＦ−ＣＰ)、別名ＡＤＡＭＴＳ１３が同定された。ＡＤＡＭＴＳ１３量が、健常人に比べ、ＴＴＰで有意に低下することは公知である（例えば、非特許文献１、非特許文献２、又は特許文献１）。ＡＤＡＭＴＳ１３が欠損または低下すると、血管内皮細胞から放出されたＵＬ−ｖＷＦＭ（unusually
large vWF multimer）は分解されずに、微小血管などで生じる高ずり応力によって過剰な血小板凝集を起こし、血栓にて血管を閉塞する。
例えば、特許文献２には、ＡＤＡＭＴＳ１３を定量することを特徴とする、血栓形成傾向の程度又は血栓症の検出方法が開示されており、前記血栓症として、急性若しくは慢性骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病、全身性エリトマトーデス、肺塞栓、脳硬塞、肝中心静脈閉塞症、急性リンパ球性白血病、血栓性微小血管障害、血栓性血小板減少性紫斑病、溶血性尿毒症症候群、又は深部静脈血栓症が挙げられている。また、特許文献３には、ＡＤＡＭＴＳ１３及び／又はその分解因子（例えば、エラスターゼ、プラスミン、又はトロンビン）を分析する、ＤＩＣ又は全身性炎症反応症候群（systemic inflammatory response syndrome；ＳＩＲＳ）患者における血小板血栓症又は臓器障害の検出方法が開示されている。
また、ＡＤＡＭＴＳ１３活性が軽度低下ないし正常の非定型ＴＴＰも存在する。この場合の病因も多彩で、先天性と後天性要因があり、前者については補体調節作用を持つ血漿因子ファクターＨ（Factor H）や血管内皮細胞膜貫通型タンパク質ＣＤ４６などの遺伝子異常によるものが報告されている。
ＴＴＰは極めて稀な疾患で、後天性に生ずるものが一般的であるが、後述のように稀に先天性素因に基づいて起こるものがある。
ＴＴＰの臨床症状としては、虚血性腸炎による下痢、腹痛、血便、神経症状として、痙攣や視力障害、更に腎障害等がみられる。検査所見としては、血栓形成による末梢血の破砕赤血球、貧血、血小板減少、血清ＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）、間接ビリルビンの上昇、ハプトグロビンの低下等溶血に伴う変化がみられる。腎障害により、血清クレアチニンの上昇もみられる。
先天性ＴＴＰの治療法としては、現時点では新鮮凍結血漿（ＦＦＰ）を２〜３週毎に輸注してＡＤＡＭＴＳ１３補充を行い、血小板数を維持し、発症予防治療が行われている場合が多い。血小板輸血は禁忌である。後天性ＴＴＰの治療法としては、全体の約１／３の症例でＡＤＡＭＴＳ１３活性は著減し、これらはほぼ全例ＡＤＡＭＴＳ１３に対する自己抗体陽性である。それ故、ＦＦＰ単独投与では不充分で、後天性・特発性ＴＴＰの治療は血漿交換（plasma exchange；ＰＥ）療法が第一選択である。この際ステロイド又はステロイドパルス療法が併用される事が多い。当然、ＰＥ実施前の血小板輸血は禁忌である。ＰＥの効果は、１）ＡＤＡＭＴＳ１３の補充、２）同インヒビターの除去、３）ＵＬ−ｖＷＦＭの除去、４）止血に必要な正常ｖＷＦの補充の４点に集約される。難治・反復例に対してはビンクリスチン又はエンドキサンなどの免疫抑制剤の使用、脾摘なども考慮されるべきである。ＰＥ又はＦＦＰ輸注療法が導入される以前の死亡率は８０％強と、非常に予後不良であった。しかし、これらの導入や抗血小板療法の併用により予後の改善は顕著で、現在、生存率はほぼ９０％以上となっている。しかしながら、治療抵抗例あるいは再発例が多いことが知られ、今後解決されるべき問題と考えられる。また、ＴＴＰは病態が進行してしまえば、治療は困難であり、その予後は極めて不良であるので、早期診断と早期治療が必要である。
ゼン・エックス(Zheng X)ら、「ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（J Biol Chem）」、（米国）、２００１年、第２７６巻、４１０５９−４１０６３ エム・フルラン（Furlan M）ら、「ブラッド（Blood）」、（米国）、１９９７年、第８９巻、３０９７−３１０３ 国際公開第００／５０９０４号パンフレット 国際公開第２００５／０６２０５４号パンフレット 国際公開第２００６／０４９３００号パンフレット
前記のように、現在のところ、既存マーカー測定値を使用した診断基準及び臨床所見からＤＩＣと診断されている患者の中には、ＤＩＣに対する治療を実施して、なかなか改善をみない例がたくさん報告されている。この中で特に血小板減少が認められる患者では、本来はＴＴＰと診断されて、血漿交換などの適切な治療が実施されれば、予後改善の可能性が高いということが考えられる。ＤＩＣでは血小板輸注が治療法として選択されるが、ＴＴＰの場合、血小板が著減していても、前述したように血小板輸注により更に病態を悪化させてしまうため、血小板輸注は禁忌である。よって、血小板減少は共通の所見ではあるが、両疾患群の相違を明確に差別化することで、適切な診断を下し、適切な治療法を行うことは医療の現場では非常に望まれている。
本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、ＤＩＣ患者においてＡＤＡＭＴＳ１３量（濃度）とＡＤＡＭＴＳ１３酵素活性の一方又はそれらの組み合わせによるＤＩＣ患者群の分類、更に、ＡＤＡＭＴＳ１３量（濃度）及び／又はＡＤＡＭＴＳ１３酵素活性とｖＷＦ量（濃度）との組み合わせを用いることにより、ＤＩＣと診断された患者群中に、後天的なＴＴＰ患者の可能性がある検体群を見出した。このことは、臨床所見や従来のマーカーだけからでは差別化できなかった「ＴＴＰと診断されるべきＤＩＣ」と「ＴＴＰとは無関係なＤＩＣ」との鑑別を行い、各疾患に特異的な治療法を行い、予後の改善を行う手段となることを見出し、ここに本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明の課題は、臨床所見や従来のマーカーだけからでは差別化できなかったＤＩＣ患者からＴＴＰ患者の鑑別診断を行うことのできる方法及びキットを提供することにある。
前記課題は、本発明による、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）患者において、フォンヴィルブランド因子切断酵素（ＡＤＡＭＴＳ１３）の量（濃度）及び／又は酵素活性を分析することを特徴とする、播種性血管内凝固症候群の病態の把握方法により解決することができる。
本発明の病態把握方法の好ましい態様によれば、更にフォンヴィルブランド因子（ｖＷＦ）の量（濃度）を分析する。
本発明の病態把握方法の別の好ましい態様によれば、フォンヴィルブランド因子切断酵素の分析を免疫学的方法により実施する。
また、本発明は、フォンヴィルブランド因子切断酵素に特異的に結合する抗体又はその断片を含む、播種性血管内凝固症候群の病態の把握用キットに関する。
本明細書における用語「分析」には、分析対象物質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３又はｖＷＦ）の存在の有無を判定する「検出」と、分析対象物質の量（濃度）又は活性を定量的又は半定量的に決定する「測定」とが含まれる。
ＤＩＣとＴＴＰはその病態の類似性のために明確に診断することが難しい。また、いずれの疾患の場合も、早期診断による適切な治療を早期に実施しないと致死に至るため、「ＴＴＰと診断されるべきＤＩＣ」と「ＴＴＰとは無関係なＤＩＣ」の鑑別は非常に重要である。本発明によれば、現診断基準でＤＩＣと診断されている患者において、「ＴＴＰと診断されるべきＤＩＣ」と「ＴＴＰとは無関係なＤＩＣ」の鑑別が可能となり、適切な治療が実施されることになり、救命率の上昇又は致死率の低下につながる。
ＡＤＡＭＴＳ１３抗原量（Ａag）に関する結果を示すグラフである。 ＤＡＭＴＳ１３酵素活性（Ａact）に関する結果を示すグラフである。 ｖＷＦ抗原量（Ｖag）に関する結果を示すグラフである。 Ｖag/Ａagに関する結果を示すグラフである。 Ｖag/Ａactに関する結果を示すグラフである。
［１］本発明の把握方法
本発明方法では、ＤＩＣ患者における、ＡＤＡＭＴＳ１３の量（濃度）及び／又は酵素活性の少なくとも一方（好ましくは両方）を分析することにより、あるいは、ＡＤＡＭＴＳ１３の量（濃度）及び／又は酵素活性の少なくとも一方（好ましくは両方）とｖＷＦの量（濃度）との組み合わせを用いることにより、ＤＩＣの病態の把握を行うことができる。
本明細書における「ＤＩＣの病態把握」には、適切な治療方針又は治療法の決定に有用な情報となるＤＩＣ患者における各種病態の把握が含まれ、例えば、ＤＩＣと診断されている患者の中から、本来はＴＴＰと診断されて治療法が変わるべき患者の差別化、すなわち、「ＴＴＰと診断されるべきＤＩＣ」と「ＴＴＰとは無関係なＤＩＣ」との鑑別を挙げることができる。また、「ＤＩＣの病態把握」には、前記病態把握に基づく各種判断及び予測、例えば、適切な治療方針又は治療法の決定、予後の予測、モニタリング等も含まれる。
本発明方法では、例えば、ＤＩＣ患者におけるＡＤＡＭＴＳ１３量（濃度）及び／又は酵素活性の違いを指標にして、「ＴＴＰの疑いがあるＤＩＣ」と「ＴＴＰとは無関係なＤＩＣ」との鑑別診断を行うことができ、更には、ＤＩＣ患者群でも診断に苦慮する患者において、ＡＤＡＭＴＳ１３量（濃度）及び／又は酵素活性とｖＷＦ量（濃度）との組合せ、例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３量（濃度）及び／又はその活性に対するｖＷＦ量の比率の相違を指標として、ＤＩＣ患者群を、例えば、更に３つの群にカテゴライズして「ＴＴＰと診断されるべきＤＩＣ」と「ＴＴＰとは無関係なＤＩＣ」とに鑑別し、患者特異的な治療法を提案することができる。カテゴライズの指標として、ＡＤＡＭＴＳ１３量（濃度）及びＡＤＡＭＴＳ１３活性の閾値を設定することが可能である。
本明細書において「フォンヴィルブランド因子切断酵素（ｖＷＦ切断酵素）」とは、フォンヴィルブランド因子（ｖＷＦ）のＡ２ドメインに存在するチロシン（８４２）とメチオニン（８４３）を特異的に切断し、ＡＤＡＭＴＳ１３とも称されるメタロプロテアーゼである。
ＡＤＡＭＴＳ１３量が、健常人に比べ、ＴＴＰで有意に低下することは公知である［例えば、ゼン・エックス(Zheng X)ら、「ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（J Biol Chem）」、（米国）、２００１年、第２７６巻、４１０５９−４１０６３；エム・フルラン（Furlan
M）ら、「ブラッド（Blood）」、（米国）、１９９７年、第８９巻、３０９７−３１０３；ＷＯ００／５０９０４］。また、小野ら［小野（T.ono）ら、血栓止血学会、２００４年（１０／１に抄録発行）］により、健常人に比べ、基礎疾患は多様であるがＤＩＣスコアに照合して診断されたＤＩＣ患者群においてＡＤＡＭＴＳ１３量が有意に低下すること、併せて、ＴＴＰ患者群と診断された群のＡＤＡＭＴＳ１３量は５〜４５％、一方、ＤＩＣ患者群のＡＤＡＭＴＳ１３量は１０〜９５％と広範囲であることも報告されている。
また、近年、多種の疾患でＡＤＡＭＴＳ１３に関する検討結果が報告されるようになり、以前は、前述のように、ＴＴＰ患者ではＡＤＡＭＴＳ１３活性は著減していると考えられていたものが、実はＴＴＰ患者の６０％でＡＤＡＭＴＳ１３活性は著減していないことが報告されている（松本雅則、血管医学、２００５年、第６巻、６５−７２）。
しかしながら、ＤＩＣと診断されている患者において、「ＴＴＰと診断されるべきＤＩＣ」と「ＴＴＰとは無関係なＤＩＣ」との鑑別が、ＡＤＡＭＴＳ１３単独で可能であるとの報告はない。
本発明方法を適用することのできる対象（被験者）は、ＤＩＣ患者である。被検試料としては、例えば、血漿または血清形態の血液が好ましいが、それ以外にも、例えば、細胞組織液、リンパ液、胸腺水、腹水、羊水、胃液、尿、膵臓液、骨髄液、又は唾液等の各種体液を用いることもできる。また、前記血漿は、クエン酸血漿又はヘパリン血漿であることが好ましい。
本発明方法では、ＤＩＣ及びＴＴＰ患者から、それぞれ検体を採取し、それぞれのＡＤＡＭＴＳ１３濃度、ＡＤＡＭＴＳ１３活性、及び／又はｖＷＦ濃度を測定した後、測定値を比較することにより、ＤＩＣの病態の把握、更には、その適切な治療方法の決定を行うことができる。ＴＴＰが疑われるＤＩＣ患者を差別化するために、ＴＴＰ患者から採取した検体を用いて、各種判定用閾値、例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３濃度及びＡＤＡＭＴＳ１３活性の判定用閾値、並びにＡＤＡＭＴＳ１３濃度又はその活性とｖＷＦの比率の判定用閾値を予め決定しておくことが好ましい。
後述の実施例に示すように、例えば、以下の分類が可能である。下記３項目：
１）ＡＤＡＭＴＳ１３量（以下、Ａagと称する）が、例えば、３０％以下
２）ＡＤＡＭＴＳ１３活性（以下、Ａactと称する）が、例えば、１５％以下
３）ＡＤＡＭＴＳ１３活性に対するＡＤＡＭＴＳ１３量の比（Ａact／Ａag）が、例えば、２．０以上
の内、２項目又は３項目に該当する患者群をまず「ＴＴＰの疑いがあるＤＩＣ患者群（Ａ群）に、それ以外の患者群を「ＴＴＰの疑いがないＤＩＣ患者群」（Ｂ群）に分類する。これらの患者群（Ａ群及びＢ群）に対して、更に、ＡＤＡＭＴＳ１３量（Ａag）に対するｖＷＦ量（以下、Ｖagと称する）の比（Ｖag／Ａag）及びＡＤＡＭＴＳ１３活性（Ａact）に対するｖＷＦ量の比（Ｖag／Ａact）に関して、
第１群：Ｖag／Ａagが、例えば、８以上、且つ、Ｖag／Ａactが、例えば、１６以上
第２群：Ｖag／Ａagが、例えば、８以下、且つ、Ｖag／Ａactが、例えば、１６以上
第３群：第１群及び第２群に該当しない群（すなわち、Ｖag／Ａactが、例えば、１６未満）
と分類することができる。後述の実施例に示すとおり、ＴＴＰと診断された患者２名は第１群に分類された。また、後述の実施例に示すとおり、第１群〜第３群の内、第１群及び第２群は「ＴＴＰと診断されるべきＤＩＣ患者群」であり、第３群は「ＴＴＰとは無関係のＤＩＣ患者群」である。
なお、前記のＡag、Ａact、Ｖagは、それぞれ、正常値に対する相対値であり、前記の各比（Ａact／Ａag、Ｖag／Ａag、Ｖag／Ａact）は、前記相対値に基づく比である。
判定用閾値が予め決定されている場合には、予測対象である被験者に関して、Ａag及び／若しくはＡactの分析、又は、Ａag及び／若しくはＡact並びにＶagの分析（例えば、Ｖag／Ａag及び／又はＶag／Ａactの分析）を行うことにより、前記被験者における前記判定及び／又は予測を行うことができる。判定用閾値は、種々条件、例えば、基礎疾患、性別、年齢などにより変化することが予想されるが、当業者であれば、被験者に対応する適当な母集団を適宜選択して、その集団から得られたデータを統計学的処理を行うことにより、正常値範囲又は判定用閾値を決定することができる。
本発明方法において、ＡＤＡＭＴＳ１３濃度を分析する方法としては、ＡＤＡＭＴＳ１３量を定量的又は半定量的に決定することができるか、あるいは、ＡＤＡＭＴＳ１３の存在の有無を判定することができる限り、特に限定されるものではなく、例えば、抗ＡＤＡＭＴＳ１３抗体又はその断片を用いる免疫学的手法（例えば、酵素免疫測定法、ラテックス凝集免疫測定法、化学発光免疫測定法、蛍光抗体法、放射免疫測定法、免疫沈降法、免疫組織染色、又はウエスタンブロット等）、生化学的手法（例えば、酵素学的測定法）、又はｍＲＮＡ量を測定する分子生物学的手法などを挙げることができる。
ＡＤＡＭＴＳ１３の分析方法として免疫学的手法を用いる場合には、抗ＡＤＡＭＴＳ１３抗体は、公知の方法、例えば、国際公開第２００４／０２９２４２号パンフレットに記載の方法に遵って調製することができ、前記免疫学的測定も、例えば、国際公開第２００４／０２９２４２号パンフレットに記載の方法に従って実施することができる。
ＡＤＡＭＴＳ１３濃度を測定する方法としては、感度及び簡便性から免疫学的方法が好ましい。ここで免疫学的方法とは、ＡＤＡＭＴＳ１３に対する抗体を用いて、ＡＤＡＭＴＳ１３を、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ラテックス法、又はイムノクロマトグラフ法で分析する方法である。免疫学的方法としては、例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３を標識する競合法、抗体を標識するサンドイッチ法、抗体をコートしたビーズの凝集を観察するラテックスビーズ法、あるいは、金コロイドなどの着色粒子に結合した抗体を用いる方法等、様々な方法があるが、ＡＤＡＭＴＳ１３に対する抗体を用いた方法であれば、本発明の好ましい態様に含まれる。抗体は、モノクローナル抗体でも、ポリクローナル抗体でも良い。また、抗体断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、又はＦｖを用いることもできる。
ＡＤＡＭＴＳ１３の酵素活性は、例えば、ＳＤＳ−アガロース電気泳動法を用いた方法［エム・フルラン（M.Furlan）ら，「ブラッド（Blood）」,（米国），１９９７年，第８９巻，ｐ．３０９７−３１０３］、ｖＷＦの基質であるｖＷＦのＡ２ドメインの組み換え抗原を使用したＥＬＩＳＡ法［ホワイトロック・ジェーエル（Whitelock
JL）ら，「ジャーナル オブトロンボーシス アンド ヘモステーシス」，（英国），２００４年，第２巻，４８５−４９１］、あるいは、ｖＷＦ切断酵素の基質であるｖＷＦのＡ２ドメインの中のＡｓｐ１５９６−Ａｒｇ１６６８の７３残基に相当する合成ペプチドに蛍光基［2-(N-methylamino)benzoyl,
Nma］と消光基（2,4-dinitrophenyl, Dnp）を導入した消光性蛍光基質ＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３を使用した方法［コカメ・ケー（Kokame K）ら「ブリティッシュ ジャーナル オブ ヘマトロジー」,（英国）,２００５年，第１２９巻，９３−１００］により測定することができる。また、特願２００５−１４８７９３号明細書に記載の方法、具体的には、（１）ＡＤＡＭＴＳ１３を含有する可能性のある被検試料と、ｖＷＦ又はその断片を不溶性担体に結合させた固定化基質とを液中で接触させる工程、（２）前記液と不溶性担体とを分離する工程、並びに（３）不溶性担体に残存するｖＷＦ又はその断片、及び／又は、不溶性担体から遊離した液中のｖＷＦ断片を分析する工程を含む分析方法により測定することができる。
また、ｖＷＦ濃度の測定法に関しては、例えば、ヒト血小板とリストセチンコファクターの凝集活性による活性測定方法［アライン・ジェーピー（Allain JP）ら，「ジャーナル オブ ラボラトリー アンド クリニカル メディスン（J Lab Clin Med.）」,（米国），１９７５年，第８５巻，ｐ．３１８−３２８］、あるいは、抗ｖＷＦ抗体を使用した免疫測定法［ブラウン・ジェーイー（Brown
JE）ら，「トロンボーシス リサーチ（Thromb Res.）」,（米国），１９８６年，第４３巻，ｐ．３０３−３１１］などを挙げることができ、感度及び簡便性から免疫学的方法が好ましい。
［２］本発明の把握用キット
本発明のキットは、抗ＡＤＡＭＴＳ１３抗体又はその断片を少なくとも含み、異なる２種類以上の抗ＡＤＡＭＴＳ１３抗体を含むことが好ましい。前記抗ＡＤＡＭＴＳ１３抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体のいずれであることもできる。また、異なる２種類以上の抗ＡＤＡＭＴＳ１３抗体を含む場合には、いずれか一方（第２抗体）を標識抗体とすることもできるし、あるいは、標識化の代わりに、第２抗体に対する抗体に標識を結合させた標識抗体を更にキットに追加することもできる。
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
《実施例１：ＤＩＣ患者及びＴＴＰ患者における凝固線溶マーカー値の測定》
ＤＩＣ患者２３名及びＴＴＰ患者２名より、３．８％クエン酸加血漿を採取した。血小板数を除く各測定マーカーは、市販キット（ＬＰＩＡシリーズ；三菱化学ヤトロン）を用いて、ＬＰＩＡ−ＮＶ７(三菱化学ヤトロン)にて測定した。血小板数は３．２％クエン酸加血漿を採取し、ＫＸ−２１（シスメックス社）を用いて測定した。
各測定結果を表１に示す。表１において、ＰＡＩ−１はプラスミノーゲン活性化因子抑制因子−１を意味し、Ｄ−ＤはＤダイマーを意味し、Ｆｂｇはフィブリノゲンを意味し、ＦＤＰ−Ｐは血漿ＦＤＰを意味し、ＰＬＴは血小板を意味し、ＴＡＴはトロンビン／アンチトロンビンIII複合体を意味する。ＤＩＣと診断されている患者の中には血小板数が著減している患者がみられるが、従来の凝固線溶マーカーの値のみでは、ＴＴＰ患者と差別化することはできなかった。
Figure 2007088849
《実施例２：ＤＩＣ患者及びＴＴＰ患者におけるＡＤＡＭＴＳ１３抗原量及びその酵素活性並びにｖＷＦ抗原量の分析》
健常人１２名、ＤＩＣを発症した患者２３名、ＴＴＰを発症した患者２名より、３．８％クエン酸加血漿を採取した。なお、ＤＩＣは前述のＤＩＣ診断基準によりＤＩＣと診断された患者、ＴＴＰは臨床所見よりＴＴＰと診断された患者を示す。ＡＤＡＭＴＳ１３抗原量（Ａag）は、市販キット（ADAMTS-13 ELISA kit；三菱化学ヤトロン）を使用して測定した。ＡＤＡＭＴＳ１３酵素活性（Ａact）は、ＳＤＳ−アガロースゲル電気泳動法［エム・フルラン（M.Furlan）ら，「ブラッド（Blood）」,（米国），１９９７年，第８９巻，ｐ．３０９７−３１０３］により測定した。ｖＷＦ抗原量（Ｖag）は、市販キット（STA
LIAtest：ロッシュダイアグノスティックス）を使用して測定した。測定結果を表２に示す。なお、Ａag又はＡacは、健常人１２名の平均値を１００％とした場合の百分率で示し、Ｖagは、キットに含まれるＳＴＤ（正常人）に対する百分率で示す。
Figure 2007088849
ＴＴＰ患者の測定値をもとに、ＤＩＣ患者の測定値を下記の指標に従って分類を行った。まず、下記３項目：
１）ＡＤＡＭＴＳ１３抗原量（Ａag）が３０％以下
２）ＡＤＡＭＴＳ１３酵素活性（Ａact）が１５％以下
３）ＡＤＡＭＴＳ１３活性に対するＡＤＡＭＴＳ１３量の比（Ａact／Ａag）が２．０以上
の内、２項目又は３項目に該当する患者群をまず「ＴＴＰの疑いがあるＤＩＣ患者群（Ａ群）に、それ以外の患者群を「ＴＴＰの疑いがないＤＩＣ患者群」（Ｂ群）に分類した。これらの患者群（Ａ群及びＢ群）に対して、更に、
第１群：Ｖag／Ａagが８以上、且つ、Ｖag／Ａactが１６以上
第２群：Ｖag／Ａagが８以下、且つ、Ｖag／Ａactが１６以上
第３群：第１群及び第２群に該当しない群（すなわち、「Ｖag／Ａactが１６未満」）
に分類した。
各群と健常者を比較したところ、図１〜図３の結果を得た。ＡＤＡＭＴＳ１３抗原量（Ａag）、ＡＤＡＭＴＳ１３酵素活性（Ａact）、ｖＷＦ抗原量（Ｖag）の結果から、いずれのマーカーでもＴＴＰと健常人群は明らかに差を認めた。また、ＡＤＡＭＴＳ１３抗原量及びＡＤＡＭＴＳ１３酵素活性ではＴＴＰと第３群の差を認め、両者の判別が可能であった。更に、第２群に関してはＡＤＡＭＴＳ１３抗原量ではＴＴＰとの差をみとめ、ＡＤＡＭＴＳ１３酵素活性では ＴＴＰとの差は認められなかった。一方、ｖＷＦ抗原量ではＴＴＰとＤＩＣ群（第１群〜第３群）の差は認められなかった。
そこで、Ｖag／Ａag又はＶag／ＡactでＴＴＰと３群にカテゴライズしたＤＩＣ群とを比較したところ、図４〜図５の結果を得た。
ｖＷＦ抗原量とＡＤＡＭＴＳ１３抗原量の比（Ｖag／Ａag）及びｖＷＦ抗原量とＡＤＡＭＴＳ１３活性の比（Ｖag／Ａact）を使用した場合、第１群及び第２群の各値の中央値はＴＴＰのそれに比べ２倍以内の値を示しているが、第３群の中央値はＴＴＰのそれに比べ、２倍以上の差を示しており、第３群は明らかにＴＴＰとは異なる病態であることが示された。
本発明は、ＤＩＣの適切な治療の用途に適用することができる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。

Claims (4)

  1. 播種性血管内凝固症候群患者において、フォンヴィルブランド因子切断酵素の量及び／又は酵素活性を分析することを特徴とする、播種性血管内凝固症候群の病態の把握方法。
  2. 更にフォンヴィルブランド因子の量を分析する、請求項１に記載の方法。
  3. フォンヴィルブランド因子切断酵素の分析を免疫学的方法により実施する、請求項１又は２に記載の方法。
  4. フォンヴィルブランド因子切断酵素に特異的に結合する抗体又はその断片を含む、播種性血管内凝固症候群の病態の把握用キット。
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