KR101367658B1

KR101367658B1 - 파종성 혈관내 응고증후군의 병태를 파악하는 방법

Info

Publication number: KR101367658B1
Application number: KR1020087018908A
Authority: KR
Inventors: 토모꼬 오노; 신이치로 와타나베; 후미오 후루사키; 코 이가미
Original assignee: 쥬리디컬 파운데이션 더 케모-세로-쎄라퓨틱 리서치 인스티튜트; 미쓰비시 가가쿠 메디엔스 가부시키가이샤
Priority date: 2006-01-31
Filing date: 2007-01-30
Publication date: 2014-02-25
Also published as: JPWO2007088849A1; EP1988174A4; CN101374956A; JP5060966B2; AU2007210643A1; US20110143369A1; EP1988174B1; AU2007210643B2; KR20080091185A; US20090004673A1; CN101374956B; CA2641189A1; ES2373989T3; EP1988174A1; WO2007088849A1; US8759018B2

Abstract

파종성 혈관내 응고증후군(DIC) 환자에서, 본 윌브랜드 인자(vWF) 절단효소(ADAMTS13)의 양 및/또는 효소활성(바람직하게는, 추가로 vWF의 양)을 분석하는, DIC의 병태의 파악방법, 및 ADAMTS13에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 절편을 함유하는 DIC의 병태 파악용 키트를 개시한다.

본 발명에 의하면, 임상소견이나 종래의 마커만으로 선별할 수 있었던 DIC 환자로부터 혈전성 혈소판감소성 자반증(TTP) 환자를 감별하고 진단할 수 있다.

파종성 혈관내 응고증후군, 본 윌브랜드 인자 절단효소, 본 윌브랜드 인자

Description

파종성 혈관내 응고증후군의 병태를 파악하는 방법{Method for Determination of Condition of Disseminated Intravascular Coagulation Syndrome}

본 발명은 파종성 혈관내 응고증후군(Disseminated Intravascular Coagulation; 이하, DIC라함)의 병태를 파악하는 방법에 관한 것이다.

파종성 혈관내 응고증후군(DIC)은 중증의 기초질환이 존재할 때, 전신의 세소(細小)혈관 내에 미세혈전이 생성된다. 이 때문에, 미소순환에 장애가 오고, 장기의 기능부전이나 출혈경향이 나타난다. DIC에서는 이하의 3개의 장애와 반응이 일어난다.

(1) 미세혈전 형성에 따른 미소순환장애가 일어나, 허혈에 의하여 다수의 장기가 기능부전에 이른다.

(2) 미세혈전 형성에 따른 소비성 응고장애, 즉, 조직인자가 세포표면에 많이 발현하여, 외부원인에 의한 혈액응고가 촉진된다. 또한, 혈액응고인자나 혈소판이 소비되어 출혈경향이 나타난다.

(3) 과잉 선용(線溶:혈전을 녹임), 즉, 응고가 촉진됨에 따라, 선용도 활성화되어, 피브린을 분해하는 플라스민이 생성된다. 플라스민을 저해하는 α₂플라스민저해제(α₂PI)가 소비되어, 정상의 60% 미만으로 감소하면, 플라스민에 의하여 피브린이 과도하게 분해되어, 출혈경향이 나타난다.

DIC는 본래 혈액응고의 병적이고 지속적인 활성화에 의하여 미세혈전이 형성되는 것이나, 이에 수반하여 선용성도 활성화된다. 그러나, 양자의 균형은 기초질환 혹은 증례에 따라 차이가 있으며, 응고활성화가 심하지만 선용이 억제되는 경우와, 응고·선용 양자의 활성화가 심한 경우 등이 나타난다. 전자를 응고우위형, 후자를 선용우위형으로 분류한다. 응고우위형 DIC는 감염증, 특히, 패혈증이 합병증으로 많으며, 임상증상으로서 장기증상(臟器症狀)이 나타나기 쉽다. 한편, 선용우위형의 DIC에서는 선용의 마커인 FDP(Fibrin degradation product)와 PIC(plasmin/plasmin inhibitor complex)가 현저하게 증가하며, 출혈증상이 나타나기 쉽다. 기초질환으로서 급성전골수성 백혈병이 있다.

DIC는 치료가 늦어지면 사망에 직결되기 때문에, 조기진단 및 조기치료가 요구되는 매우 긴급한 병증이다. 현재, DIC는 후생성의 DIC 진단기준에 따라 진단되고 있다. 이 진단기준에서는 1) 장기장해의 유무, 2) 혈소판수, 3) FDP, 4) 피브리노겐, 5) PT비(프로트롬빈 시간비)의 값을 점수로 매겨 DIC를 판정하고 있다. 이 진단 기준은 DIC의 확정진단으로는 우수하지만, DIC의 조기진단으로는 어려운 점이 있어, 임상적으로 상기 진단기준에 따라 치료를 수행하면, 이미 DIC의 병태가 너무 진행되어 손을 쓰기에는 늦어버리는 케이스도 많다. 또한, 임상현장에서도, 특히, 혈소판수의 저하가 DIC에 의한 것인지 아닌지 감별하기가 어려운 경우가 적지 않다. 구체적으로, 골수억제를 동반하는 병태(약물, 바이러스감염증, 각종 조혈장해를 일으키는 혈액질환 등), 간경변, 간부전, 혈전성 혈소판감소성 자반병(thrombotic thrombocytopenic purpura;TTP)/용혈성 요독증 증후군(hemolytic uremic syndrome;HUS), 대량흉수·복수 등을 들 수 있다. 이들 병태에는 혈소판 수의 저하뿐만 아니라 FDP와 D 다이머의 상승을 동반하는 경우도 있어, DIC의 감별이 더욱 곤란하게 된다.

DIC의 치료법으로는 혈관 내의 혈전 다발(多發)을 억제하고, 동시에 소비성 응고장해의 진행을 저지하기 위하여, 저분자 헤파린과 안티트롬빈III 제제를 투여한다. 선용우위형 DIC에서는 항 트롬빈 작용 및 항선용작용이 있는 메실산 가벡세이트(Gabexate mesilate)를 투여한다. 혈소판 생산성이 저하되는 혈액질환과 합병된 DIC에 대하여는 농후 혈소판에 의한 혈소판 보충이 불가결하다. 혈중 피브리노겐이 저하되는 DIC에는 신선동결혈장(FFP)을 주입한다.

한편, TTP는 DIC나 HUS등과 같이 세혈관(細血管)장해성 용혈성빈혈(microangiopathic hemoyltic anemia;MAHA)로 불리는 병태를 나타낸다. 몇가지 원인으로 혈관 내에 병적 미세혈전이 다수 형성되면, 미세혈관 내에 좁아진 부위가 많이 발생하고, 이곳을 무리하게 통과한 적혈구는 기계적으로 파쇄되어 용혈이 일어난다. 이것이 MAHA의 발생기작이라고 생각되고 있다. 혈관 내의 직경을 작게 만드는 미세혈전의 주성분이 피브린으로 구성된 경우가 DIC이고, 혈소판으로 구성된 경우가 TTP 또는 HUS이다.

TTP는 1924년에 미국의 Moschcowitz에 의하여 처음 보고된 미세동맥에 혈소판의 응집괴(혈소판혈전)가 쌓이고, 다음과 같은 5가지 증상이 나타나는 전신성 중증질환이다. 증상은 1) 혈소판 감소증(피부에 자반이 생김), 2) 용혈성 빈혈(적혈구의 붕괴에 의함), 3) 위기능 장해, 4) 발열, 5) 동요성 정신신경증상이다.

TTP의 병인으로 지혈인자인 혈장 중의 vWF의 특이적 절단효소(VWF-cleaving protease, VWF-CP), 별칭으로 ADAMTS13이 동정된다. ADAMTS13의 양이 정상인에 비하여, TTP에서 유의하게 저하되는 것이 공지되어 있다(예를 들면, 비특허문헌 1, 비특허문헌 2 또는 특허문헌 1). ADAMTS13이 결손 또는 저하되면, 혈관내피세포로부터 방출된 UL-vWFM(unusally large vWF multimer)가 분해되지 않고, 미세혈관 등에서 생기는 높은 응력에 의하여 과잉된 혈소판응집을 일으켜 혈전으로 혈관을 폐색시킨다.

예를 들면, 특허문헌 2에는 ADAMTS13을 정량하는 것을 특징으로 하는 혈전형성경향의 정도 또는 혈전증의 검출방법이 개시되어 있고, 상기 혈전증으로는 급성 또는 만성 골수성백혈병, 급성전골수구성백혈병, 전신성 홍반성 루프스, 폐색전, 뇌경색, 간중심정맥폐색증, 급성 림프구성백혈병, 혈전성미세혈관장해, 혈전성 혈소판감소성 자반병, 용혈성 요독증증후군 또는 심부정맥혈전증을 들고 있다. 또한, 특허문헌 3에는 ADAMTS13 및/또는 그 분해인자(예를 들면, 엘라스타아제, 플라스민 또는 트롬빈)을 분석하는, DIC 또는 전신성 염증반응증후군(systmic inflammatory response syndrome;SIRS) 환자에서의 혈소판 혈전증 또는 장기장해의 검출방법이 개시되어 있다.

또한, ADAMTS13 활성이 가벼운 정도로 저하되거나 정상의 비정형 TTP도 존재한다. 이 경우의 병인도 다채로우며, 선천성과 후천성 요인이 있고, 전자에 대하여는 보체조절작용을 가지는 혈장인자 factor-H와 혈관내피세포막 관통형 단백질 CD46 등의 유전자이상에 의한 것이 보고되어 있다.

TTP는 매우 드문 질환으로, 후천적으로 일어나는 것이 일반적이지만, 후술하는 바와 같이 드물게 선천성 원인에 기인하여 일어나는 것도 있다.

TTP의 임상증상으로는 허혈성 장염에 의한 설사, 복통, 혈변, 신경증상으로서, 경련과 시력장해, 추가적으로 위장해 등이 나타난다. 검사소견으로는 혈전형성에 의한 말초혈의 파쇄적혈구, 빈혈, 혈소판감소, 혈청 LDH(젖산탈수소효소), 간접 빌리루빈의 상승, 햅토글로빈의 저하 등 용혈에 수반되는 변화가 보인다. 위장해에 의하여 혈청 크레아티닌의 상승도 나타난다.

선천성 TTP의 치료법으로는 현시점에서는 신선동결혈장(FFP)을 2~3주마다 주입하여 ADAMTS13을 보충하고, 혈소판 수를 유지하여, 증상이 생기는 것을 예방하는 치료가 수행되는 경우가 많다. 혈소판 수혈은 금지된다. 후천성 TTP의 치료법으로는 전체의 약 1/3의 병례에서 ADAMTS13 활성이 현저하게 감소하고, 이들은 거의 전체 예의 ADAMTS13에 대하여 자기항체양성이다. 이 때문에, FFP 단독투여로는 불충분하고, 후천성·특발성 TTP의 치료는 혈장교환(plasma exchange:PE) 치료요법이 최선이다. 이때, 스테로이드 또는 스테로이드 펄스 치료가 병용되는 일이 많다. 당연히 PE 실시 전의 혈소판 수혈은 금지된다. PE의 효과는 1) ADAMTS13의 보충, 2) 동일 저해제의 제거, 3)UL-vWFM의 제거, 4) 지혈에 필요한 정상 vWFM의 보충의 4가지로 집약된다. 난치·반복례에 대하여는 빈크리스틴(vincristine) 또는 엔독산(endoxan) 등의 면역억제제의 사용, 비장 적출(비적, 脾摘) 등도 고려해야 한다. PE 또는 FFP 주입 치료가 도입되기 이전의 사망율은 80%로 높았고, 예후도 매우 불량하였다. 그러나, 이들의 도입과 항혈소판 치료의 병용에 의하여 예후가 현저하게 개선되었고, 현재, 생존율은 거의 90% 이상이 되고 있다. 그러나 치료저항례 또는 재발례가 많은 것으로 알려져, 이후 해결해야할 문제로 생각되고 있다. 또한, TTP는 병태가 진행되어버리면 치료가 곤란하고 그 예후가 극히 불량하기 때문에, 조기진단과 조기치료가 필요하다.

비특허문헌 1: Zheng X 등, [Journal of biological chemistry, 276;41059-41063, 2001, USA],

비특허문헌 2: Furlan M 등, [Blood, 89;3097-3103, 1997, USA]

특허문헌 1:국제공개 제00/50904호 팜플렛

특허문헌 2: 국제공개 제2005/062054호 팜플렛

특허문헌 3: 국제공개 제2006/049300호 팜플렛

발명의 개시

발명이 해결하려는 과제

상기와 같이 현시점에서 기존 마커 측정치를 사용한 진단기준 및 임상소견으로 DIC로 진단된 환자 중에는 DIC에 대한 치료를 실시하여 좀처럼 개선을 보이지 않는 예도 많이 보고되고 있다. 이 중에서 특히, 혈소판 감소가 인정되는 환자에서는 본래는 TTP로 진단되어, 혈장교환 등의 적절한 치료가 실시된다면, 예후개선의 가능성이 높다고 생각되어 진다. DIC에서는 혈소판 주입이 치료법으로 선택되어지지만, TTP의 경우, 혈소판이 현저하게 감소하여도, 상기와 같이 혈소판 주입에 의하여 더욱 병태를 악화시켜버리기 때문에, 혈소판 주입은 금지되고 있다. 따라서, 혈소판 감소가 공통의 소견이지만, 양 질환군의 차이점을 명확하게 차별화하는 것에 의하여, 적절한 진단을 내리고, 적절한 치료법을 실시하는 것이 의료 현장에서 절실히 요구되고 있다.

본 발명자는 연구를 거듭한 결과, DIC 환자에서 ADAMTS13의 양(농도)과 ADAMTS13 효소활성의 한쪽 또는 이들의 조합에 의한 DIC 환자군의 분류, 추가로 ADAMTS13 양(농도) 및/또는 ADAMTS13 효소활성과 vWF 양(농도)와의 조합을 이용하여, DIC로 진단된 환자군 중에, 후천적인 TTP 환자의 가능성이 있는 검사군을 찾아내었다. 이는 임상소견이나 종래의 마커만으로는 차별화할 수 없었던 [TTP로 진단되어야 하는 DIC]와 [TTP와는 무관한 DIC]의 감별을 수행하여, 각 질환에 특이적인 치료법을 수행하여, 예후를 개선하는 수단이 되는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

즉, 본 발명의 과제는 임상소견이나 종래의 마커만으로는 차별화할 수 없었던 DIC 환자로부터 TTP 환자를 감별진단하는 방법 및 키트를 제공하는데 있다.

과제를 해결하기 위한 수단

상기 과제는, 본 발명에 의한 파종성 혈관내 응고증후군(DIC) 환자에서, 본 윌브랜드 인자(vWF) 절단효소(ADAMTS13)의 양(농도) 및/또는 효소활성을 분석하는 것을 특징으로 하는, 파종성 혈관내 응고증후군의 병태의 파악방법에 의하여 해결할 수 있다.

본 발명의 병태 파악방법의 바람직한 양태에 의하면, 추가로 본 윌브랜드 인자(vWF)의 양(농도)를 분석한다.

본 발명의 병태파악방법의 다른 바람직한 양태에 의하면, 본 윌브랜드 인자 절단효소의 분석을 면역학적방법에 의하여 실시한다.

또한, 본 발명은 본 윌브랜드 인자 절단효소에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편을 함유하는 파종성 혈관내응집증후군의 병태 파악용 키트에 관한 것이다.

본 명세서에 있어서, 용어 [분석]은 분석대상물질(예를 들면, ADAMTS13 또는 vWF)의 존재 유무를 판정하는 [검출]과 분석대상물질의 양(농도) 또는 활성을 정량적 또는 반정량적으로 결정하는 [측정]이 포함된다.

발명의 효과

DIC와 TTP는 병태의 유사성 때문에 명확하게 진단하기가 어렵다. 또한, 어떤 환자의 경우도, 조기진단에 의한 적절한 치료를 조기에 실시하지 않으면, 사망에 이르기 때문에, [TTP로 진단되어야할 DIC]와 [TTP와 무관한 DIC]의 감별은 매우 중요하다. 본 발명에 의하면, 현 진단기준에서 DIC로 진단되고 있는 환자에서, [TTP로 진단되어야할 DIC]와 [TTP와 무관한 DIC]의 감별이 가능하게 되어, 적절한 치료가 실시되어, 구명률의 상승 또는 치사율의 저하로 이어질 수 있다.

도면의 간단한 설명

도 1은 ADAMTS13 항원량(Aag)에 대한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 2는 ADAMTS13 효소활성(Aact)에 대한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 3은 vWF 항원량(Vag)에 대한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 4는 Vag/Aag에 대한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 5는 Vag/Aact에 대한 결과를 나타낸 그래프이다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

[1] 본 발명의 파악방법

본 발명의 방법에서는 DIC 환자의 ADAMTS13의 양(농도) 및/ 또는 효소활성의 적어도 한쪽(바람직하게는 양쪽 모두)을 분석하는 것에 의하여, 또는 ADAMTS13의 양(농도) 및/또는 효소활성의 적어도 한쪽(바람직하게는 양쪽 모두)과 vWF의 양(농도)와의 조합을 이용하는 것에 의하여 DIC의 병태를 파악할 수 있다.

본 명세서에서 [DIC의 병태 파악]에는, 적절한 치료방침 또는 치료법의 결정에 유용한 정보가 되는 DIC 환자의 각종병태의 파악이 포함되고, 예를 들면, DIC로 진단된 환자 중, 본래는 TTP로 진단되어 치료법을 바꿔야할 환자의 차별화, 즉, [TTP로 진단되어야할 DIC]와 [TTP와 무관한 DIC]와의 감별을 들 수 있다. 또한, [DIC의 병태파악]에는 상기 병태파악에 기초한 각종 판단 및 예측, 예를 들면, 적절한 치료방침 또는 치료법의 결정, 예후의 예측, 모니터링 등도 포함된다.

본 발명의 방법에서는 예를 들면, DIC 환자의 ADAMTS13의 양(농도) 및/또는 효소활성의 차이를 지표로 하여 [TTP로 의심되는 DIC]와 [TTP와 무관한 DIC]의 감별진단을 수행할 수 있고, 추가로, DIC 환자군에서도 진단이 어려운 환자에 있어서, ADAMTS13의 양(농도) 및/또는 효소활성과 vWF의 양(농도)와의 조합, 예를 들면, ADAMTS13의 양(농도) 및/또는 그의 활성에 대한 vWF 양의 비율의 상이를 지표로 하여, DIC 환자군을 예를 들면, 3개의 군으로 카테고리화하여 [TTP로 진단되어야할 DIC]와 [TTP와 무관한 DIC]로 감별하고, 환자특이적인 치료법을 제안할 수 있다. 카테고리화의 지표로서 ADAMTS13의 양(농도) 및 ADAMTS13 활성의 역치를 설정할 수 있다.

본 명세서에서 [본 윌브랜드 인자 절단효소(vWF 절단효소)]는 본 윌브랜드의 A2 도메인에 존재하는 티로신(842)과 메티오닌(843)을 특이적으로 절단하고 ADAMTS13이라 칭하는 메탈로프로테아제이다.

ADAMTS13의 양이 정상인에 비교하여, TTP에서 유의하게 저하하는 것은 공지되어 있다[예를 들면, zheng X등 [J. Biol. Chem., 276;41059-41063, 2001, USA]; Furlan M 등 [Blood, 89;3097-3103, 1997, USA; WO00/50904]. 또한, T. ono 등, 혈전지혈학회, 2004년(10/1에 초록발행)]에 의하여 정상인에 비하여 기초질환은 다양하지만 DIC 점수에 조합하여 진단된 DIC 환자군에서 ADAMTS13의 량이 유의하게 저하하는 것과 함께, TTP 환자군으로 진단된 군의 ADAMTS13의 양이 5~45%, 한편 DIC 환자군의 ADAMTS13의 양은 10~95%로 광범위한 것도 보고되었다.

또한, 최근, 여러 종류의 질환에서 ADAMTS13에 대한 검사결과가 보고되어, 이전에는 상술한 바와 같이 TTP 환자에서는 ADAMTS13 활성이 현저하게 감소하고 있다고 생각되어졌던 것이, 사실은 TTP 환자의 60%에서 ADAMTS13 활성이 현저하게 감소하지 않는 것이 보고되었다(宋本雅則, 혈관의학, 6;65-72, 2005).

그러나, DIC로 진단된 환자에서 [TTP로 진단되어야할 DIC]와 [TTP와 무관한 DIC]의 감별이 ADAMTS13 단독으로 가능하다는 보고는 없었다.

본 발명의 방법을 적용할 수 있는 대상(피험자)은 DIC 환자이다. 피험시료로는 예를 들면, 혈장 또는 혈청형태의 혈액이 바람직하나, 이들 이외에도, 예를 들면, 세포조직액, 림프액, 흉선수, 복수, 양수, 이액, 뇨, 췌장액, 골수액 또는 수액 등의 각종 체액을 사용할 수 있다. 또한, 상기 혈장은 구연산 혈장 또는 헤파린 혈장인 것이 바람직하다.

본 발명의 방법에서, DIC 및 TTP 환자로부터 각각 검체를 채취하고, 각각의 ADAMTS13 농도, ADAMTS13 활성 및/또는 vWF 농도를 측정한 후, 측정치를 비교하여 DIC의 병태의 파악, 추가로, 이의 적절한 치료방법을 결정할 수 있다. TTP가 의심되는 DIC 환자를 차별화하기 위하여, TTP 환자로부터 채취한 검체를 사용하여, 각종 판정용 역치, 예를 들면, ADAMTS13 농도 및 ADAMTS13 활성의 판정용 역치 및 ADAMTS13 농도 또는 그 활성과 vWF의 비율 판정용 역치를 미리 결정하여 두는 것이 바람직하다.

이하, 실시예에 나타난 바와 같이, 예를 들면, 다음의 분류가 가능하다. 하기 3 항목:

1) ADAMTS13 양(이하, Aag라 함)이 , 예를 들면 30% 이하

2)ADAMTS13 활성(이하, Aact라 함)이 예를 들면, 15% 이하

3)ADAMTS13 활성에 대한 ADAMTS13 양의 비(Aact/Aag)가 예를 들면, 2.0 이상

중에서, 2 항목 또는 3 항목에 해당하는 환자군을 먼저 [TTP가 의심되는 DIC 환자군(A군)으로, 그 이외의 환자군을 [TTP가 의심되지 않는 DIC 환자군](B군)으로 분류한다. 이들 환자군(A군 및 B군)에 대하여, 추가로 ADAMTS13 양(Aag)에 대한 vWF 양(이하, Vag라 함)의 비(Vag/Aag) 및 ADAMTS13 활성(Aact)에 대한 vWF 양의 비(Vag/Aact)에 관하여,

제1군: Vag/Aag가 예를 들면, 8 이상, 동시에, Vag/Aact가 예를 들면, 16 이상

제2군: Vag/Aag가 예를 들면, 8 이하, 동시에, Vag/Aact가 예를 들면, 16이상

제3군: 제1군 및 제2군에 해당하지 않는 군(즉, Vag/Aact가, 예를 들면, 16미만)

으로 분류될 수 있다. 하기 실시예에 나타낸 바와 같이, TTP로 진단된 환자 2명은 제1군으로 분류되었다. 또한, 하기 실시예에서 나타낸 바와 같이, 제1군~제3군 중, 제1군 및 제2군은 [TTP로 진단되어야할 DIC 환자군]이고, 제3군은 [TTP와 무관한 DIC 환자군]이다.

또한, 상기 Aag, Aact, Vag는 각각 정상치에 대한 상대치이고, 상기 각 비(Aact/Aag, Vag/Aag, Vag/Aact)는 상기 상대치에 기초한 비율이다.

판정용 역치가 미리 결정되어 있는 경우에는, 예측대상인 피험자에 대하여 Aag 및/또는 Aact의 분석, 또는 Aag 및/또는 Aact 및 Vag의 분석(예를 들면, Vag/Aag 및/또는 Vag/Aact의 분석)을 수행하여, 상기 피험자의 상기 판정 및/또는 예측을 실시할 수 있다. 판정용 역치는 여러가지 조건, 예를 들면, 기초질환, 성별, 연령 등에 의하여 변화할 것으로 예상되나, 당업자라면, 피험자에 대응하는 적당한 모집단을 적절히 선택하여, 그 집단으로부터 얻어진 데이타를 통계학적으로 처리하여, 정상치 범위 또는 판정용 역치를 결정할 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, ADAMTS13 농도를 분석하는 방법으로는, ADAMTS13 양을 정량적 또는 반정량적으로 결정할 수 있다. 또는 ADAMTS13의 존재 유무를 판정할 수 있는 한 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면, 항ADAMTS13 항체 또는 그 단편을 사용한 면역학적 수단(예를 들면, 효소면역측정법, 면역침강법, 면역조직염색 또는 웨스턴블럿 등), 생화학적 수단(예를 들면, 효소학적 측정법) 또는 mRNA양을 측정하는 분자생물학적 수법 등을 들 수 있다.

ADAMTS13의 분석방법으로서 면역학적 수법을 사용하는 경우에는, 항ADAMTS13 항체는 공지의 방법, 예를 들면, 국제공개 제2004/029242호 팜플렛에 기재된 방법에 따라 조제할 수 있고, 상기 면역학적 측정도, 예를 들면, 국제공개 제2004/029242호 팜플렛에 기재된 방법에 따라 실시할 수 있다.

ADAMTS13 농도를 측정하는 방법으로는, 감도 및 간편성에 따라 면역학적 방법이 바람직하다. 여기서 면역학적방법이란, ADAMTS13에 대한 항체를 이용하여 ADAMTS13을 예를 들면, ELISA법, 라텍스법 또는 이뮤노크로마토그래피 법으로 분석하는 방법이다. 면역학적 방법으로는 예를 들면, ADAMTS13을 표지하는 경합법, 항체를 표지하는 샌드위치법, 항체를 코팅한 비드의 응집을 관찰하는 라텍스법 또는 금 콜로이드 등의 착색입자에 결합한 항체를 이용하는 방법 등, 여러가지 방법이 있으나, ADAMTS13에 대한 항체를 이용하는 방법이라면, 본 발명의 바람직한 양태에 포함된다. 항체는 모노클로날 항체라도 폴리클로날항체라도 좋다. 항체단편, 예를 들면, Fab, Fab', F(ab') 또는 Fv를 사용할 수 있다.

ADAMTS13의 효소활성은 예를 들면, SDS-아가로스 전기용동법을 사용한 방법[Furlan M 등, Blood, 89;3097-3103, 1997, USA], vWF의 기질인 vWF의 A2 도메인의 재조합 항원을 사용한 ELISA법[Whitelock JL 등, Journal of Trombosis and hemostasis, 2;485-491, 2004, UK] 혹은, vWF 절단효소의 기질인 vWF의 A2 도메인 중 Asp1596-Arg1668의 73잔기에 해당하는 합성 펩티드에 형광기[2-(N-methylamino)benzoyl, Nma]과 소광기(2,4-dinitrophenyl, Dnp)를 도입한 소광성 형광기질 FRETS-VWF73을 사용하는 방법[Kokame K 등, British journal of hematology, 129;93-100, 2005, UK]에 의하여 측정할 수 있다. 또한, 일본특허출원 2005-148793호 명세서에 기재된 방법, 구체적으로는 (1) ADAMTS13을 함유할 가능성이 있는 피검시료와 vWF 또는 그 단편을 불용성 담체에 결합시킨 고정화 기질을 액 중에서 접촉시키는 공정, (2) 상기 액과 불용성 담체를 분리하는 공정, 및 (3) 불용성 담체에 잔존하는 vWF 또는 그 단편, 및/또는 불용성 담체로 부터 유리된 혈중의 vWF 단편을 분리하는 공정을 포함하는 분석방법에 의한 측정이 가능하다.

또한, vWF 농도의 측정법에 대하여는, 예를 들면, 사람 혈소판과 리스토세틴 코펙터의 응집활성에 따른 활성측정방법[Allain JP 등, Journal of laboratory and clinical medicine, 85;318-328, 1975, USA] 혹은 항 vWF 항체를 사용한 면역측정법[Brown JE 등 [Thrombosis Research, 43:303-311, 1986, USA]등을 들 수 있으며, 감도 및 간편성에 의해 면역학적 방법이 바람직하다.

[2] 본 발명의 파악용 키트

본 발명의 키트는 항ADAMTS13 항체 또는 적어도 그 단편을 함유하고, 서로 다른 2종류 이상의 항ADAMTS13 항체를 함유하는 것이 바람직하다. 상기 항ADAMTS13 항체는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날항체 중 어느 것이라도 된다. 또한, 서로 다른 2 종류 이상의 항ADAMTS13 항체를 함유하는 경우에는, 어느 한쪽(제2항체)을 표지항체로 하는 것도 가능하며, 또는 표지화 대신에, 제2항체에 대한 항체에 표지를 결합시킨 표지항체를 키트에 추가하는 것도 가능하다.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 구체적으로 설명하나, 이것이 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

<<실시예 1: DIC 환자 또는 TTP 환자의 응고선용 마커 값의 측정>>

DIC 환자 23명 및 TTP 환자 2명으로 부터, 3.8% 구연산 첨가 혈장을 채취하 였다. 혈소판 수를 제외한 각 측정 마커는 시판 키트(LPIA 시리즈, 미츠비시 화학 이아트론)을 사용하여, LPIA-NV7(미츠비시 화학 이아트론)으로 측정하였다. 혈소판 수는 3.2% 구연산첨가 혈장을 채취하여, KX-21(시스멕구스사)를 사용하여 측정하였다.

각 측정결과를 표 1에 나타내었다. 표 1에서 PAI-1은 플라스미노겐 활성화 인자억제인자-1을 의미하고, D-D는 D 다이머를 의미하며, Fbg는 피브리노겐을 의미하고, FDP-P는 혈장 FDP를 의미하고, PLT는 혈소판을 의마하며, TAT는 트롬빈/안티트롬빈III 복합체를 의미한다. DIC로 진단된 환자 중에 혈소판 수가 현저히 감소한 환자가 보이나, 종래의 응고선용 마커의 값만으로는 TTP 환자로 차별화할 수 없었다.

<<실시예 2: DIC 환자 및 TTP 환자의 ADAMTS13 항원량 및 그의 효소활성과 vWF 황원량의 분석>>

정상인 12명, DIC가 발병한 환자 23명, TTP가 발병한 환자 2명으로 부터 3.8% 구연산 첨가 혈장을 채취하였다. 그리고, DIC는 상기 DIC 진단기준에 의하여 DIC로 진단된 환자, TTP는 임상소견에 의하여 TTP로 진단된 환자를 나타낸다. ADAMTS13 항원량(Aag)은 시판 키트(ADAMTS13 ELISA kit; 미츠비시 화학 이아트론)을 사용하여 측정하였다. ADAMTS13 효소활성(Aact)은 SDS-아가로즈겔 전기영동법[Furlan M 등, Blood, 89;3097-3103, 1997, USA]에 의하여 측정하였다. vWF 항원량(Vag)은 시판 키트(STA LIA 테스트:로쉬 다이아그노틱스)를 사용하여 측정하였다. 측정결과를 표 2에 나타내었다. 그리고, Aag 또는 Aac는 정상인 12명의 평균치를 100%로 한 경우의 백분율을 나타내고, Vag는 키트에 포함된 STD(정상인)에 대한 백분율을 나타낸다.

TTP 환자의 측정치를 기초로, DIC 환자의 측정치를 다음의 지표에 따라 분류하였다. 먼저 다음 3 항목:

1)ADAMTS13 항원량(Aag)이 30% 이하

2)ADAMTS13 활성(Aact)이 15% 이하

3)ADAMTS13 활성에 대한 ADAMTS13 양의 비(Aact/Aag)가 2.0 이상

중에서, 2 항목 또는 3 항목에 해당하는 환자군을 먼저 [TTP가 의심되는 DIC 환자군(A군)으로, 그 이외의 환자군을 [TTP가 의심되지 않는 DIC 환자군](B군)으로 분류하였다. 이들 환자군(A군 및 B군)에 대하여, 추가로

제1군: Vag/Aag가 8 이상, 동시에, Vag/Aact가 16 이상

제2군: Vag/Aag가 8 이하, 동시에, Vag/Aact가 16 이상

제3군: 제1군 및 제2군에 해당하지 않는 군(즉, Vag/Aact가 16 미만)

으로 분류하였다.

각 군과 정상인을 비교하여 도 1~도 3의 결과를 얻었다. ADAMTS13 항원량(Aag), ADAMTS13 효소활성(Aact), vWF 항원량(Vag)의 결과로부터, 어떠한 마커에서도 TTP와 정상인군은 명확하게 차이를 나타내었다. 또한, ADAMTS13 항원량 및 ADAMTS13 효소활성에서는 TTP와 제3군에서 차이가 나타났으며, 양자의 판별이 가능하였다. 추가로, 제2군에 대하여는 ADAMTS13 항원량에서 TTP와의 차이가 확인되었고, ADAMTS13 효소활성에서는 TTP와의 차이가 확인되지 않았다. 한편, vWF 항원량에서는 TTP와 DIC 군(제1군~제3군)의 차가 확인되지 않았다.

여기서, Vag/Aag 또는 Vag/Aact에서 TTP와 3군으로 카테고리화한 DIC군을 비교한 경우, 도 4~ 도 5의 결과를 얻었다.

vWF 항원량과 ADAMTS13 항원량의 비(Vag/Aag) 및 vWF 항원량과 ADAMTS13 활성의 비(Vag/Aact)를 사용한 경우, 제1군 및 제2군의 각 수치의 중앙치는 TTP의 것과 비교하여 2배 이내의 값을 나타내고 있으나, 제3군의 중앙치는 TTP의 것과 비교하여 2배 이상의 차이를 나타내고 있어, 제3군은 명백하게 TTP와는 다른 병태인 것으로 나타났다.

본 발명은 DIC의 적절한 치료 용도에 적용할 수 있다.

이상, 본 발명을 특정 양태에 따라 설명하였으나, 당업자에게 명백한 변형이나 개선은 본 발명의 범위에 포함된다.

Claims

파종성 혈관내 응고증후군으로 진단된 환자에서, 혈전성 혈소판 감소성 자반병으로 진단되어야할 환자를 선택하기 위해 필요한 정보를 제공하기 위하여, 파종성혈관내 응고증후군으로 진단된 환자의 시료로부터 본 윌브랜드 인자(vWF) 절단효소의 양 및/또는 효소활성에 대하여 본 윌브랜드 인자의 양의 비율을 분석하는 방법.
삭제
제1항에 있어서, 본 윌브랜드 인자 절단효소의 분석을 면역학적 방법으로 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
본 윌브랜드 인자 절단효소에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편을 함유하는, 파종성 혈관내 응고증후군으로 진단된 환자에서, 혈전성 혈소판 감소성 자반병으로 진단되어야할 환자를 선택하기 위해 필요한 정보 제공용 키트.