JPWO2005023853A1 - プロテアーゼ耐性ｓｅｂ改変体およびそれを含むワクチン - Google Patents

Abstract

プロテアーゼに対する耐性を有し、より毒性の低減された黄色ブドウ球菌腸管内毒素Ｂ（ＳＥＢ）改変体、および該ＳＥＢ改変体を含むワクチンを提供する。 配列番号１において９７位のリジンおよび９８位のリジンを任意のアミノ酸に置換したアミノ酸配列を有するＳＥＢ改変体またはその誘導体、および該ＳＥＢ改変体またはその誘導体を含むワクチン。

Description

本発明は、スーパー抗原の一つとして知られる黄色ブドウ球菌腸管内毒素Ｂ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ Ｂ、以下「ＳＥＢ」と呼称することもある）の改変体またはその誘導体、およびそれを有効成分として含有するワクチンおよびその利用に関する。さらに詳細には、本発明は、プロテアーゼに対して耐性を有し、その結果、毒性の低減したＳＥＢ改変体またはその誘導体、およびそれを有効成分として含有するワクチンおよびその利用に関する。

ＳＥＢは黄色ブドウ球菌によって産生されるエンテロトキシン（腸管毒；毒素型食中毒の原因毒素）の１種である。ＳＥＢは２３９個のアミノ酸残基よりなり、そのアミノ酸配列も知られている（配列番号１）。ＳＥＢ分子は２つのドメインから構成され、最初のドメインは残基１〜１２０よりなり、２番目のドメインは残基１２７〜２３９よりなる。

黄色ブドウ球菌は常在菌である一方、多くの抗生物質に耐性の黄色ブドウ球菌による感染症は、極めて重篤で予後も悪いことが知られている。食中毒に代表されるような重症のブドウ球菌感染症は、主として菌体から放出される毒素によって引き起こされている。その中で黄色ブドウ球菌腸管内毒素（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ、以下「ＳＥ」と略することがある）は、スーパー抗原の一種で多くのＴリンパ球に作用して通常では起こらないほど大量の炎症性サイトカインの産生を促す（非特許文献１）。炎症性サイトカインが大量に作用するとショック様症状を引き起こし、生体を死に至らせることもある。成人の健常人は加齢と共に黄色ブドウ球菌腸管内毒素（ＳＥ）に対する抗体を有する割合が高くなることが報告されているが（非特許文献２）、悪性腫瘍の末期状態などの免疫不全の状態では、薬剤耐性ブドウ球菌の侵入を容易に許してしまい、黄色ブドウ球菌腸管内毒素Ｂ（ＳＥＢ）による炎症も起こりやすいと考えられている。

またアトピー患者がＩｇＥ型抗ＳＥＢ抗体を有する割合が高いことが報告され、ＳＥＢと病態形成との関連が疑われている（非特許文献３）。

さらにリウマチ患者の場合もＳＥＢと発症、病態形成との関係を示唆する疫学データが報告されており、ＩｇＭ型抗ＳＥＢ抗体と病態との関係が報告されている（非特許文献４）。

疫学的にはＳＥＢに対する抗体はヒトでは加齢と共に保有率が増加し、７歳以上の殆どの成人ではほぼ１００％になることが報告されている（非特許文献５）。

しかしながら、一般的にその抗体価は高くなく、血中でＳＥＢを中和するのに充分な親和性を有しているかどうかは不明である。

一方、ＳＥＢが関与すると考えられる食中毒を始めとした種々の疾患の予防や治療を目的として、ＳＥＢを改変して毒性を低減させた改変体の報告が数多く行われてきた（非特許文献６）。本発明者らもＳＥＢの毒性を大きく低減した改変体を作出し、この改変体がＳＥＢとしての抗体産生誘導能を有していることを確認している（ＳＥＢの２３位のアスパラギン残基をチロシン残基に置き換えた変異体；特許文献１）。

しかしながら、本発明者らのものも含め、これまでの改変体は毒性を低減させたとはいえ、数１０ｎｇ／ｍｌの濃度でヒトのリンパ球を活性化する性質を有しており、ワクチン抗原の毒性として考えた場合には更なる改良が必要であった。

これまでにもＳＥＢの立体構造解析などからＭＨＣとの接触部位を改変した改変体、ＴＣＲとの接触部位を改変した改変体などが報告されている（非特許文献７）。
ＷＯ９９／４０９３５号公報 ミクサン（Ｖ．Ｖ．Ｍｉｃｕｓａｎ）およびチボドー（Ｊ．Ｔｈｉｂｏｄｅａｕ）、"セミナーズ・イン・イムノロジー（Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）"，１９９３，Ｖｏｌ５，ｐ．３−１１ クワハタ（Ｋｕｗａｈａｔａ，Ｍ．）ら、"アクタ・ペディアトリカ・ジャポニカ（Ａｃｔａ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃａ Ｊａｐｏｎｉｃａ）"，１９９６，３８，ｐ．１−７ ゾーン（Ｓｏｈｎ ＭＨ．）、キム（Ｋｉｍ ＧＨ）、キム（Ｋｉｍ ＷＫ）、ヤング（Ｊａｎｇ ＧＣ）、キム（Ｋｉｍ ＫＥ）、"アラジー・アズマ・プロシーディングス（Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｓｔｈｍａ Ｐｒｏｃ．）"，２００３，２４（１），ｐ．６７−７１ オリグチ（Ｏｒｉｇｕｃｈｉ Ｔ．）、エグチ（Ｅｇｕｃｈｉ Ｋ．）、カワベ（Ｋａｗａｂｅ Ｙ．）、ヤマシタ（Ｙａｍａｓｈｉｔａ Ｉ．）、ミゾカミ（Ｍｉｚｏｋａｍｉ Ａ．）、イダ（Ｉｄａ Ｈ．）、ナガタキ（Ｎａｇａｔａｋｉ Ｓ．）、"アニュアル・リューマトロジカル・ディジーズ（Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．）"，１９９５，５４（９），ｐ．７１３−７２０ クワハタ（Ｋｕｗａｈａｔａ，Ｍ．）、イマナカ（Ｉｍａｎａｋａ，Ｈ．）、タケイ（Ｔａｋｅｉ，Ｓ．）およびマスダ（Ｍａｓｕｄａ，Ｋ．）、"アクタ・エディアトリカ・ジャポニカ（Ａｃｔａ Ｏｅｄｉａｔｒｉｃａ Ｊａｐｏｎｉｃａ）"，１９９６，３８，ｐ．１−７ ウッディー（Ｗｏｏｄｙ ＭＡ）、クラカワー（Ｋｒａｋａｕｅｒ Ｔ）、スタイルズ（Ｓｔｉｌｅｓ ＢＧ）、"ワクチン（Ｖａｃｃｉｎｅ）"，１９９７，１５（２），ｐ．１３３−１３９ リーダー（Ｌｅｄｅｒ Ｌ，）ら、"ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディスン（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）"，１９９８，１８７（６），ｐ．８２３−８３３

しかしながら、前述のようにこれらの改変体の毒性の低減は不十分であり、単純な接触部位の変異のみでは毒性の低減に限界があると考えられた。

本発明者らは、ＳＥＢのアミノ酸変異が及ぼす活性の変化を鋭意検討した結果、プロテアーゼ切断サイトの変異と毒性発現に着目した。

野生型ＳＥＢの一次配列上には３７箇所のトリプシン認識配列があるが、通常の生体と同様の中性バッファー条件で実際に切断されるのは、９７位のリジン、９８位のリジンのＣ末端側、２３８位、２３９位のリジンのＣ末端側のみであることが実験的に確認されている。

しかしながら、これらのサイトが切断されてもＳＥＢの活性（リンパ球活性化、増殖能）には全く影響ないこと、またＳＥＢ抗体との反応性についても変化がないことを見出した。

腸管内では膵由来のトリプシンによりＳＥＢは殆どこのような切断型で存在し、活性を発現しているものと考えられる。

一方、ヒトＳＥＢ抗体中にはウエスタンブロットを用いた解析などから、複数のリニアーエピトープに対する抗体が含まれ、ＳＥＢがスーパー抗原としてのみならず、抗原として抗原提示細胞にプロセッシングされて抗原提示されていることが示唆されている。従ってプロテアーゼ切断サイトの変異は抗体誘導能を変化させる可能性が考えられる。

本発明者らは、前述の情報や解析結果から、９７位のリジン、９８位のリジンに着目した。構造上はこの２つのアミノ酸はＳＥＢのＮ末端ドメインとＣ末端ドメインを結ぶループ上に存在しており、このループの動きや切断がＳＥＢの活性発現に関わる構造変化に大きく関与している可能性が考えられる。さらにこのサイトはトリプシンのみならずカテプシンＢの切断サイトであることを本発明者らは見出した。

カテプシンＢは抗原提示細胞内で抗原プロセッシングに大きく関与していることが明らかにされている酵素である。従って、このサイトへの変異導入は生体内でのＳＥＢの動態、抗原提示、毒性発現に大きな影響を及ぼすことが予測された。

そこで、本発明者らは、遺伝子工学的手法を用い、ＳＥＢのアミノ酸配列中の２３位のアスパラギンをチロシンに置換したＳＥＢ改変体に対して９７位のリジンおよび９８位のリジンにアミノ酸変異を加えた複数の変異体を作製し、大腸菌での発現を試みたところ、９７位および９８位のリジンがともにセリンに置換された改変体（Ｎ２３ＹＫ９７ＳＫ９８Ｓ改変体）が良好な発現を示した。なお、本明細書に用いられる改変に係る表記は、アミノ酸残基位置の数字の前に改変前のアミノ酸名を、後に改変後のアミノ酸名を表記したものであり、たとえば「Ｎ２３Ｙ」の場合、Ｎ末端から２３番目（２３位）のＮ（Ａｓｎ：アスパラギン）をＹ（Ｔｙｒ：チロシン）に置換した改変体を意味する。また、２以上のアミノ酸残基が置換された改変体の場合は、各アミノ酸残基に係る表記をそのままＮ末端側から順に列記して記載してある（たとえば、「Ｎ２３ＹＫ９７ＳＫ９８Ｓ」は、Ｎ末端から２３番目（２３位）のＮ（Ａｓｎ：アスパラギン）をＹ（Ｔｙｒ：チロシン）に、９７番目（９７位）および９８番目（９８位）のＫ（Ｌｙｓ：リジン）をＳ（Ｓｅｒ：セリン）にそれぞれ置換した改変体を意味する）。Ｎ２３ＹＫ９７ＳＫ９８Ｓ改変体のアミノ酸配列を配列番号２に示す。

精製したこの改変体は予測されたとおり、トリプシンやカテプシンＢ処理に対して耐性を示す一方で、ＳＥＢ抗体との反応性は充分に有しており、ＳＥＢとしての抗原性に天然型と大きな差はないと考えられた。

このように、２３位のアスパラギンのチロシンへの変異（Ｎ２３Ｙ改変体）に加えて９７位および９８位の２つのリジンをさらに改変することにより、リンパ球増殖活性やサイトカイン産生誘導活性が大幅に低下していることが確認された。とりわけ本発明によるＮ２３ＹＫ９７ＳＫ９８Ｓ改変体は、天然型と比べリンパ球増殖活性で１００万分の１、Ｎ２３Ｙ改変体に比べても１万分の１程度にまで減少していた。

さらに、本発明のＮ２３ＹＫ９７ＳＫ９８Ｓ改変体はサイトカイン産生刺激活性についても大幅に低下しており、ＩＬ−４の誘導が天然型の４０％程度認められる以外は、炎症性サイトカインの産生誘導も認められないなど活性低減に優れた効果を示した。ＳＥＢによるいくつかの毒性はＳＥＢによって刺激された白血球が産生するモノカイン、とくに腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）に起因すると考えられる。従って、リンパ球増殖刺激活性やサイトカイン産生誘導活性の低下は、ＳＥＢによる毒性低下の指標となるものである。

本発明のＮ２３ＹＫ９７ＳＫ９８Ｓ改変体を通常の方法と同様の手法でマウス腹腔にアジュバントとともに免疫すると、Ｎ２３Ｙ改変体に比べ有意に高い抗体価を示す抗体が誘導でき、またその抗体はＮ２３Ｙ改変体を免疫した場合と同質の抗体であった。

ＳＥＢのＮ２３Ｙ改変体および本発明のＮ２３ＹＫ９７ＳＫ９８Ｓ改変体をトリプシン処理した後のフラグメントをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより調べた結果を示す。Ｔ：トリプシン処理、Ｍ：分子量標準。

ＢＡＬＢ／ｃマウスにＳＥＢの精製Ｎ２３Ｙ改変体または本発明のＮ２３ＹＫ９７ＳＫ９８Ｓ改変体を接種後、マウスにおける抗ＳＥＢ抗体価の分布を示すグラフ。

本発明のＮ２３ＹＫ９７ＳＫ９８Ｓ改変体を免疫して得られる抗血清の反応性をＮ２３Ｙ改変体を免疫して得られる抗血清の反応性と比較して示すグラフ。

本発明のＮ２３ＹＫ９７ＳＫ９８Ｓ改変体の細胞増殖刺激活性を、野生型ＳＥＢおよびＳＥＢのＮ２３Ｙ改変体と比較して示すグラフ。

本発明のＮ２３ＹＫ９７ＳＫ９８Ｓ改変体の幼若化刺激活性を、野生型ＳＥＢおよびＳＥＢのＮ２３Ｙ改変体と比較して示すグラフ。

本発明のＮ２３ＹＫ９７ＳＫ９８Ｓ改変体のサイトカイン産生刺激活性を、野生型ＳＥＢおよびＳＥＢのＮ２３Ｙ改変体と比較して示すグラフ。

本発明のＮ２３ＹＫ９７ＳＫ９８Ｓ改変体を経口投与した場合の抗ＳＥＢ抗体誘導を、ＳＥＢのＮ２３Ｙ改変体と比較して示すグラフ。

本発明によるＳＥＢ改変体の基本となる野生型ＳＥＢ（黄色ブドウ球菌に由来するＳＥＢと同じアミノ酸配列を有する遺伝子組換え技術に基づいて調製されたＳＥＢ）は、たとえば、概略以下の方法で調製することができる。

ＳＥＢの染色体ＤＮＡは公知であるので（Ｒａｎｅｌｌｉ Ｄ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，Ｖｏｌ．８２，ｐ．５８５０〜（１９８５））、ＤＮＡ合成機等を用いて５’センスプライマーおよび３’アンチセンスプライマーを合成することができる。該プライマーと市販されている黄色ブドウ球菌のＤＮＡライブラリーに存する染色体ＤＮＡによるプラークハイブリダイゼーションによりプラークを採取し、さらにセンスのプライマーを用いてＰＣＲを行ない、得られたバンドからＤＮＡを抽出する。そして、好適なクローニングベクターに抽出されたＤＮＡを挿入してクローニングする。

クローニングされたＳＥＢをコードする遺伝子をＳａｃＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、ＳａｌＩおよびＰｓｔＩ等の制限酵素で切断し、同じく制限酵素ＸｍｎＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、ＳａｌＩおよびＰｓｔＩ等で切断したベクターに組み込むことによって組換え体ＤＮＡを得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版、第９章、１９８９年、ニューヨーク、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス）。ベクターとしては、分泌発現用ベクターｐＴｒｃ９９Ａ等が好適に用いられ得る。

得られた組換え体ＤＮＡを適当な宿主、たとえば大腸菌に組み込むことにより、形質転換体を得ることができる。当該形質転換体を常法により培養した後、培養終了後に菌体を採取し、常法により菌体を破砕し懸濁液より所望の野生型ＳＥＢを得ることができる。なお、条件によっては培養上清中に好適に野生型ＳＥＢが分泌されている場合があり、この場合、培養上清が調製の出発原料となり得る。出発原料を、たとえば、抗ＳＥＢ単クローン抗体を吸着体に結合させた免疫アフィニティークロマトグラフィー等の精製手段により精製する。なお、各種試験に用いられる最終調剤の緩衝液は、トリス−塩酸緩衝液、リン酸緩衝液等を用いることが好ましい。
本発明のＳＥＢ改変体の調製は前述の野生型ＳＥＢの調製に準じて行うことができる。

調製された野生型ＳＥＢおよびＳＥＢ改変体を最大限に維持するためには、新鮮であるか、４℃で保存する場合は保存後約５日以内のものが好ましい。あるいは、本発明のＳＥＢ改変体は、ゼラチン、塩、糖、糖アルコールまたはアミノ酸等の好適な環境で保存することができる。

また、本発明では有効成分としてのＳＥＢ改変体と公知の適当な賦形剤とを組み合わせ、公知の方法で本発明のワクチン製剤とすることができる。本製剤の最終的な剤形については、皮下投与、筋肉内投与あるいは経口投与を可能にする粉末（固形）状、溶液状あるいはシロップ状のものが考慮されうる。例えば、ＳＥＢ改変体単独を或いはアルミアジュバントに代表されるようなアジュバントと共に、適当な剤形剤、たとえば炭水化物、糖、糖アルコールおよびアミノ酸等とともに凍結乾燥し固形状としたもの、またはＳＥＢ改変体を生理食塩水および許容しうる強度のイオン強度を有する適当な緩衝液中に溶解した液状製剤等は好適な態様である。また、本態となるＳＥＢ改変体を市販の飲料水に溶解し経口的に摂取することも考えられる。薬剤中の含量については、１回の投与当たり０．１μｇ〜１００ｍｇ（０．００２〜２ｍｇ／Ｋｇ体重）、好ましくは１μｇ〜５ｍｇ（０．０２μｇ〜１００μｇ／Ｋｇ体重）のＳＥＢ改変体を含有する薬剤が好ましい。

本発明のＳＥＢ改変体もしくはその誘導体を本態とするワクチン製剤の有効投与量は、たとえば投与対象者の年齢、症状および重症度などにより変動し、最終的には医師の意図により変動するものであるが、たとえばＳＥＢ改変体に換算した場合、成人１日当たり０．１μｇ〜１ｍｇであり、好ましくは１μｇ〜５ｍｇを１〜２回に分けて投与するのがよい。また、場合によりステロイド剤などの他の薬剤との併用も可能である。

また、本発明のＳＥＢ改変体の「誘導体」とは、上記少なくとも１のアミノ酸残基の置換を有するＳＥＢ改変体がさらにアミノ酸修飾を受けたものをいい、上記特定のアミノ酸以外に天然型ＳＥＢのアミノ酸配列中のいずれかのアミノ酸残基がさらに置換、欠失、挿入等されたもので、本発明のＳＥＢ改変体と同等の活性を有するものはいずれも本発明に包含される。

以下に、調製例および実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。

調製例１（組換えＳＥＢ改変体の作製と発現）
１−１ ＳＥＢ遺伝子のクローニング
ＣＬＯＮＯＴＥＣ社よりＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ Ａ＋Ｂ＋ＤのＤＮＡライブラリーを購入し、プラークハイブリダイゼーション法を行なった。プローブとして、アンチセンスの合成ＤＮＡあるいはＰＣＲ断片を用いた。プライマーは以後のクローニング操作を容易にするために両端にＳａｌＩ切断部位を付加した。

上記プライマーと結合したプラークを採取し、さらにセンスのプライマーを用いてＰＣＲを行ない、得られたバンドからＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ−ＩＩベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にクローニングした。上記ハイブリダイゼーションに用いたプライマーを表１に示す。

その後、オートシークエンサーを使用して、ＤＮＡの塩基配列を確認した。得られたＳＥＢ遺伝子はプロモーター領域（ＳＥＢ−Ｐｒｏ）を含んでいたので、プロモーター領域を含まないＳＥＢ遺伝子を得るために更に、表２に記載のプライマーを用いてＰＣＲを行ない、得られたＤＮＡ断片をＰＣＲ−ＩＩベクターにクローニングした。

得られたＳＥＢ遺伝子のＤＮＡ塩基配列は、オートシークエンサーを用いて決定したが、上記のようにして得られたＳＥＢ遺伝子には突然変異は含まれていなかった。プロモーター領域を含まないＳＥＢ遺伝子を、ＳａｌＩで切断し、同じ切断部位を持つ分泌発現用ベクターｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）にクローニングし、正常な方向に挿入されているものを使用して、ＩＰＴＧを用いた誘導を行ない、ＳＥＢが分泌発現されることを確認した。

１−２ ポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）
本実施例では、ＰＣＲはＳａｉｋｉら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ｖｏｌ．２３９，ｐ．４８７（１９８８））の報告に従い、ＴａｑポリメラーゼとＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ（Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ，ＵＳＡ）のＤＮＡサーマルサイクラーを用いて行なった。二本鎖テンプレートＤＮＡを変性解離させるための１分間の変性工程（９４℃）、プライマーとテンプレートを会合させるための２分間のアニーリング工程（５５℃）および合成のための２分間の延長工程（７２℃）を３０〜３５サイクル行なった。テンプレート濃度は１ｎＭ〜１μＭであり、オリゴヌクレオチドプライマー濃度は１ｍＭとした。

１−３ 組換えＳＥＢ改変体の作製と発現
ＳＥＢ改変体は、アミノ酸置換導入を行なったもののみ組換え発現した。表３にアミノ酸置換の導入部位について示す。

１−４ アミノ酸置換の導入
ＳＥＢ改変体の一つであるＮ２３Ｙ（ＳＥＢの２３位のアスパラギン残基をチロシン残基に置き換えた変異体；国際出願番号：ＰＣＴ／ＪＰ９９／００６３８）をｐＴｒｃ９９Ａに組み込んだプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ／Ｎ２３Ｙを鋳型にして、ＰＣＲ法にて９７位、９８位のアミノ酸が目的のアミノ酸に変換されるように塩基配列に変異を入れたＰＣＲ用プライマーを用いて、改変体を作製した。変異導入は以下のようにして行った。

５’−プライマーにはｐＴｒｃ９９Ａ／Ｎ２３ＹのＳｆｉＩ配列を付加したＳＥＢの５’端に相当する領域に対応したプライマーを、３’−プライマーにはＮｏｔＩ認識配列を付加したＳＥＢの３’端に相当する領域に対応したプライマー（アンチセンス）を合成した。さらに、９７位、９８位のアミノ酸を変換するために、Ｋ９７ＳＫ９８Ｓセンスプライマー、アンチセンスプライマーを合成した。

Ｋ９７ＳＫ９８Ｓセンスプライマー
ＣＡＡＴＧＴＴＡＴＴＴＴＴＣＴＡＧＣＡＧＣＡＣＧＡＡＴＧＡＴＡＴＴＡＡＴＴＣＧＣＡＴ（配列番号７）
Ｋ９７ＳＫ９８Ｓアンチセンスプライマー
ＡＴＧＣＧＡＡＴＴＡＡＴＡＴＣＡＴＴＣＧＴＧＣＴＧＣＴＡＧＡＡＡＡＡＴＡＡＣＡＴＴＧ（配列番号８）

ｐＴｒｃ９９Ａ／Ｎ２３Ｙを鋳型にして、５’−プライマーとＫ９７ＳＫ９８Ｓアンチセンスプライマーで変異を含んだ５’側の領域を、Ｋ９７ＳＫ９８Ｓセンスプライマーと３’−プライマーで変異を含んだ３’側の領域をＰＣＲ法にて増幅した。

得られた２本のＤＮＡ断片を使用して、アッセンブリーＰＣＲを行い、全長の変異型Ｎ２３ＹＫ９７ＳＫ９８ＳＤＮＡを作製した。この全長のＤＮＡ断片をｐＴｒｃ９９Ａにクローニングした。クローニングしたＮ２３ＹＫ９７ＳＫ９８Ｓ ＳＥＢ改変体のＤＮＡ塩基配列のシークエンシングを行い、変異の導入が正確になされているかどうか確認した。

１−５ ＳＥＢ改変体の発現および該改変体の調製
ＳＥＢ改変体の発現はｐＴｒｃ９９Ａベクターに挿入された改変体遺伝子を用いて行なった。遺伝子を組み込んだ大腸菌を４％ ＣＩＲＣＬＥＧＲＯＷ（ＢＩＯ １０１ Ｉｎｃ．，Ｖｉｓｔａ，ＣＡ，ＵＳＡ）、アンピシリン（５０ｍｇ／ｍｌ）を溶かした培地で３７℃１８時間培養し、細胞を集めた後、さらに同じ培地に、Ｏ．Ｄ．５５０ｎｍが０．３〜１．０になるように調整して浮遊し、２ｍＭイソプロピル−Ｂ−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を加えて３７℃で一晩振とうすることにより誘導を行なった。誘導後、遠心分離により宿主の大腸菌を除去し、０．４５μｍの濾過膜で濾過した。

このようにして調製した培養上清を、抗ＳＥＢ単クローン抗体ＳＡ５８−２−６ＩｇＧを固相化したＳｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂカラムに通液し、含まれるＳＥＢ改変体を吸着させた。０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で洗浄したのち、４Ｍ ＭｇＣｌ_２で溶出した。溶出画分は、２０倍容の生理食塩水に３回透析後、２０倍容のＰＢＳに２回透析した。今回調製したＳＥＢ改変体は全てこの単クローン抗体カラムで精製することが可能であった。

実施例１（マウスを用いた致死毒性試験）
Ｍｉｅｔｈｋｅ Ｔ．らが報告しているように、天然型ＳＥＢは通常はマウスに致死毒性をもたらさないが、これにＤ−ガラクトサミンを２０μｇ／ｋｇで投与し、さらに２０μｇ／マウスのＳＥＢを投与静脈内若しくは腹腔内に投与することで、死亡することが知られている（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．１７５，ｐ．９１−９８（１９９２））。本実施例では予めＤ−ガラクトサミンを投与したマウスに引き続きＳＥＢおよびＳＥＢ改変体を投与して、これらが実際に死亡率を改善するものであるかどうかを調べた。

先ず、エンドトキシンに対する感受性を調べるため、ＢＡＬＢ／ｃマウスにＤ−ガラクトサミン２０ｍｇ／マウスを投与後、大腸菌Ｂ４株由来のＬＰＳ（リポ多糖）を静脈内投与して２４時間後の死亡率を調べた。その結果、ＬＰＳ投与量が１ｎｇ／マウス以下では死亡例は０であった（表４）。

ＳＥＢ改変体標品中に含まれるエンドトキシンの量を最終投与量が１０ｎｇ／マウス以下になるように除去し、雄を使用して実験を行なった。雄では、Ｄ−ガラクトサミン投与後のＳＥＢの致死毒性は１００μｇ／マウス以上を投与したときに発現されたので、ＳＥＢ改変体の投与量は１００μｇ／マウスとした。表５に示すように、天然型ＳＥＢおよび野生型ＳＥＢではマウスの死亡率は高く、致死毒性があることが示されたが、他の改変体では致死毒性は低減されていた。なお、ここでいう天然型ＳＥＢとは黄色ブドウ球菌に由来する腸管内毒素を意味し、野生型ＳＥＢは天然型ＳＥＢとアミノ酸配列を同じくする遺伝子組換え技術に基づいて調製されたＳＥＢを意味する。

次に、雌のＢＡＬＢ／ｃマウスを用いて実験を行なった。雌ではＤ−ガラクトサミン４０ｍｇ／マウスを投与したとき、ＳＥＢ２０μｇ／マウスで高い致死毒性が認められた。天然型−ＳＥＢおよび野生型−ＳＥＢでは高い死亡率となったが、その他の改変体では死亡率は低く、致死毒性が低減されていることが示された。

実施例２（改変体のプロテアーゼ耐性）
リン酸バッファー平衡化生理食塩水（ＰＢＳ，ｐＨ７．２）に溶解した精製ＳＥＢ−Ｎ２３ＹおよびＳＥＢ−Ｎ２３ＹＫ９７ＳＫ９８Ｓ改変体１００μｇ／ｍｌ（５００μｌ）に対し、１０μｇのトリプシンを添加し、３７℃で１時間反応させた。１ｍｇのトリプシンインヒビターを添加して反応を停止後、２０μｌを取り、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、生成物の解析行った。その結果、ＳＥＢ−Ｎ２３Ｙはトリプシン処理によりＮ末（２１Ｋｄａ付近）およびＣ末（１０Ｋｄａ付近）の２つのフラグメントに分解されたのに対し、ＳＥＢ−Ｎ２３ＹＫ９７ＳＫ９８Ｓ改変体では消化前と同一の位置（３２ｋｄａ付近）と２８Ｋｄａ付近の２つのバンドが確認された。ウエスタンブロットの結果、これらのバンドがＳＥＢ抗体に反応性を有することが確認できた（図１）。またＮ末分析の結果、この２つのバンドは同一のＳＥＢのＮ末の配列を有しており、２８Ｋｄａ付近のバンドはＣ末側のリジンがトリプシンで消化された結果、塩基性が低下し、理論値（２８．３Ｋｄａ）に近い位置に泳動されたＳＥＢ−Ｎ２３ＹＫ９７ＳＫ９８Ｓ改変体であると考えられた。

従って、ＳＥＢ−Ｎ２３ＹＫ９７ＳＫ９８Ｓ改変体はその他の部位でトリプシンにより切断されることはなく、セリンプロテアーゼに対して充分に耐性を有していることが確認された。またカテプシンＢに対しても同様の挙動を示し、カテプシンＢに対しても耐性を有することが確認できた。

実施例３（改変体の免疫実験）
ＢＡＬＢ／ｃマウス３〜４週齢（メス）に２０μｇの精製ＳＥＢ−Ｎ２３ＹＫ９７ＳＫ９８Ｓ改変体もしくは精製ＳＥＢ−Ｎ２３ＹをＦＣＡとエマルジョンを形成後、腹腔内に接種した。精製改変体および精製ＳＥＢ−Ｎ２３Ｙのエンドトキシン含量は０．０５ＥＵ／ｍｇ以下であった。

２週間後採血し、血中の抗ＳＥＢ抗体価をＥＬＩＳＡにより測定した。１万倍希釈して測定したときの各マウスの抗ＳＥＢ抗体価の分布を図２に示す。改変体を免疫した群の血中抗ＳＥＢ抗体価はＳＥＢ−Ｎ２３Ｙ免疫群に比べ、有意に上昇していることが示された。

また生成した抗体の性状を野生型のＳＥＢやＳＥＢ−Ｎ２３Ｙを免疫して得られた抗血清と比較した結果、野生型ＳＥＢに対して同様の反応性を示し、質的に同一であり、充分に中和活性を持ちうることが確認された（図３）。

実施例４（改変体のリンパ球増殖ならびに幼若化誘導活性の評価）
健常人の末梢血単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ；以下「ＰＢＭＣ」と称することがある）を１×１０^５／ウエルとなるように９６ウェルプレートに播種し、ＳＥＢ、ＳＥＢ−Ｎ２３Ｙ、Ｎ２３ＹＫ９７ＳＫ９８改変体を０．０１、１、１００、１００００ｎｇ／ｍＬの濃度で３日間刺激し、ハーベスト１６時間前にトリチウムーチミジン（０．５μＣｉ）を取り込ませて増殖誘導活性を調べた。その結果、図４に示すように、ＳＥＢは０．０１ｎｇ／ｍＬ以上でＰＢＭＣに濃度依存的に強い増殖誘導活性を示した。Ｎ２３ＹはＳＥＢより増殖誘導活性はかなり弱く、１００ｎｇ／ｍＬ以上でトリチウムーチミジンの取り込みが検出されはじめ、１００００ｎｇ／ｍＬでもＳＥＢの１／１０程度のカウントであった。Ｎ２３ＹＫ９７ＳＫ９８Ｓ改変体はさらに増殖刺激活性が低下しており、１００００ｎｇ／ｍＬでもほとんどトリチウムーチミジンの取り込みは認められなかった（図４）。

また、上記ＰＢＭＣを各々同濃度のＳＥＢ改変体存在下で６日間培養し、Ｔ細胞の幼若化の程度をフローサイトメトリー（以下、「ＦＡＣＳ」と称することこともある）のＦＳＣ／ＳＳＣ解析により調べた。その結果、Ｎ２３Ｙは１ｎｇ／ｍＬ以上で４０％弱の細胞に有意な幼若化を誘導したが、Ｎ２３ＹＫ９７ＳＫ９８Ｓ改変体の誘導活性はＮ２３Ｙの約１／２程度にさらに低下していた（図５）。

これらの成績から、Ｎ２３ＹＫ９７ＳＫ９８Ｓ改変体はｉｎ ｖｉｔｒｏでヒトＰＢＭＣに対し増殖刺激活性や幼若化誘導活性が野生型ＳＥＢと比較して著しく低下していることが明らかとなった。

実施例５（Ｎ２３ＹＫ９７ＳＫ９８Ｓ改変体のサイトカイン誘導活性の評価）
健常人のＰＢＭＣを１×１０^６／ｍＬで２４ウエルプレートに播種し、ＳＥＢ、Ｎ２３ＹおよびカテプシンＢ部位改変体（Ｎ２３ＹＫ９７ＳＫ９８Ｓ改変体）の各１００ｎｇ／ｍＬで２日間刺激後、上清を回収した。この培養上清の種々のサイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＧＭ−ＣＳＦ）産生をＥＬＩＳＡキット（ＣｙｔｏＳｅｔｓ、ＣｙｔｏＦｉｘ、旭テクノグラス社）を用いて測定した。ＳＥＢ１００ｎｇ／ｍＬ刺激時のサイトカイン誘導活性を１００％としたときのＮ２３Ｙ、Ｎ２３ＹＫ９７ＳＫ９８Ｓ改変体の相対活性を図５に示す。その結果、Ｎ２３ＹＫ９７ＳＫ９８Ｓ改変体はＮ２３Ｙ、ＳＥＢと比較してサイトカイン産生能は著しく低下していた。とりわけ炎症性サイトカインＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γの産生は顕著に低減している一方で、抑制性サイトカインのＩＬ−４の産生はＮ２３Ｙと同程度に維持されていた（図６）。

実施例６（Ｎ２３ＹＫ９７ＳＫ９８Ｓ改変体の経口投与による抗体誘導）
ＳＥＢ−Ｎ２３ＹおよびＮ２３ＹＫ９７ＳＫ９８Ｓ改変体を経口投与し、抗体誘導の惹起を調べた。

１０μｇ／マウスでゾンデを使って４週間連日経口投与した。試験終了後に全採血し、血中の抗ＳＥＢ抗体価をＥＬＩＳＡ法にて測定した。その結果、Ｎ２３ＹＫ９７ＳＫ９８Ｓ改変体投与群では非投与群、コントロールの生理食塩水投与群よりも高い抗ＳＥＢ抗体価を有するマウスが多く、経口投与でも抗ＳＥＢ抗体が惹起されていることが示された（図７）。

本発明のＳＥＢ改変体はプロテアーゼ、とりわけトリプシンやカテプシンＢに対して耐性を有し、従来のＳＥＢ改変体に比べて毒性が極めて低減されている。それゆえ、本発明のＳＥＢ改変体（Ｎ２３ＹＫ９７ＳＫ９８Ｓ改変体）は、日和見感染症や抗生物質耐性の細菌によって産生される毒素が引き起こす重症疾患、および１型アレルギー性疾患を予防および治療するためのワクチンとして有効に用いることができる。

Claims (9)

1. プロテアーゼに耐性を有するようにアミノ酸置換を導入した黄色ブドウ球菌腸管内毒素Ｂ（ＳＥＢ）改変体またはその誘導体。
2. 配列番号１において９７位のリジンおよび９８位のリジンを任意のアミノ酸に置換したアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のＳＥＢ改変体またはその誘導体。
3. 配列番号１において９７位のリジンおよび９８位のリジンがそれぞれセリンに置換されている、請求項２に記載のＳＥＢ改変体またはその誘導体。
4. 配列番号１において２３位のアスパラギンがチロシンで置換されたアミノ酸配列を有する、請求項１から３のいずれかに記載のＳＥＢ改変体またはその誘導体。
5. プロテアーゼがトリプシンおよびカテプシンＢから選ばれる、請求項１から４のいずれかに記載のＳＥＢ改変体またはその誘導体。
6. 請求項１から５のいずれかに記載のＳＥＢ改変体またはその誘導体を主成分とするワクチン。
7. 日和見感染症や抗生物質耐性の細菌によって産生される毒素が引き起こす重症疾患に対するものである、請求項６に記載のワクチン。
8. １型アレルギー性疾患に対するものである、請求項６に記載のワクチン。
9. 経口投与用である請求項６から８のいずれかに記載のワクチン。

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