JPS6398379A - 乳酸菌増殖促進剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は乳酸菌の増殖促進剤に関し、詳ＩＪ（はキトサ
ンオリゴ着からなる乳酸菌増殖促進剤に関する。

本発明の乳酸菌増殖促進剤は、その添加により、乳酸菌
の増殖を促進することができ、乳酸菌の増殖に利用する
ことができ、さらにチーズ、バター、ヨーグルト、乳酸
菌飲料などの乳製品、漬物、ザイレージまたは乳酸の製
心などの乳酸菌の利用における乳酸菌の増殖に利用する
ことができる。

〔技術の背景および従来技術の説明〕

乳酸菌は糖類を発酵して多量の乳酸をつくる細菌であっ
て、ラクトバチルス属、ス１−レプトコヘソカス属、ロ
イコノストック属、ペディオコッカス属およびその他の
属に属する微生物に多くのものが知られており　（桜井
芳人繻「総会食品事典」「乳酸菌」）、乳酸菌はチーズ
、バター、ヨーグルトまたは乳酸菌飲料などの乳製品、
漬物、ザイレージまたは乳酸の製造などの多くの分野に
利用されている。

これまでに乳酸菌の増殖を促進する物質として、酵母エ
キス、缶白質の加水分解生成物、果物や野菜の抽出物な
どが知られているが、その本体は、主としてアミノ酸、
ペプチド、核酸または該酸関連物質として同定されてい
る（官本ら：日本農芸化学会昭和６１年度大会講演要旨
集第５７６頁）。

本発明におけるキトサンオリゴ糖は、キトサンの分解生
成物であるが、キトサンの構成単位の単項類のＤ−グル
コサミンにまで分解されていないものであって、キトサ
ンにおけるＤ−Ｐグルコサミンの重合度を小さくしたＤ
−グルコサミンを構成単位とする生別類である。

一方、キトサンは、エビやカニなどの甲殻類の殻に含ま
れるキチンを脱アセチル化して得られる多糖類であって
、Ｄ−グルコサミンがβ−１，４結合によって直鎖状に
結合した多糖類であり、キトサンを分解して得られる低
重合度のキトサンも知られている。キトサンを分解する
方法には、塩酸による加水分解法、亜硝酸による酸化分
解法および塩素による酸化分解法などの化学的な方法、
および酵素（キトサナーゼ）による方法がある。キトサ
ナーゼを生産する微生物として、バチルス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ　Ｓｐ、　）　　Ｒ−４Ｃｈミナガ他：ビオヒミ
力・工・ビオフイジ力・アクタ　（Ｙ、　Ｔｏｍｉｎａ
ｇａｅｔ　ａｌ　：　Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｒ
ｌｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ　）第４１０巻第１４５
−１５５頁（１９５７年）〕、ペニシリウム・イスラン
デイクム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｉｓｌａｎｄｉｃｕ
ｍ　）　　Ｃディー・エム・フェントン他：ジャーナル
・オブ・ジェネラル・ミクロバイオロジー（Ｄ、Ｍ、Ｆ
ｅｎｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅ
ｎｅｒａｌＭｉｃｒＯｂｉＱＩＯｇｙ　）第１２６巻ｇ
　１５＋　−１’６５頁（１９８１年）〕、バチルス（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、　）　　９９−５　（堀内：
Ｈ本農芸化学会、昭和５９年度大会講演要旨集第５５０
頁）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　
）　Ｎｏ、　６　（ジェイ・ニス・プライス他：ジャー
ナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ、Ｓ、　Ｐｒ１ｃｅ
　ｅｔ　ａｌ　：　Ｊｏｕｎａｌ　ｏｆＢａｃｔｅｒｉ
ｏｌｏｇｙ　）第１２４巻第１５７４−１５８４頁（１
９７５年）〕、ストレプトミセス・グリセウス（Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ　）　　（オオタ
カラ他：キチン・キトサン・アンド・リレイテッド・エ
ンザイムス（Ａ、０ｈｔａｋａｒａ　ｅｔ　ａｌ　：　
Ｃｈｉｔｉｎ＋　Ｃｈｉｔｏｓａｎａｎｄ　Ｒｅ１ａｔ
ｅｄ　Ｅｎｚｙｍｅｓ　）第１４７−１６０　ｉ（１９
８５年）アカデミツク・プレス〕およびバチルス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ　５ｐ、　）　）Ｊｏ、　７−　Ｍ　　（
特願昭６０−１２０６７３号）があり、キトサンが植物
病原性のカビの生育に影響を及ぼすこと〔ビー・ニス・
ストエラセル他：フイトバソロギツシエ・ツアイトシュ
リフト（Ｐ、　５ｔｏｅｓｓｅｌ　ｅｔ　ａｌ　：Ｐｈ
ｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｓｃｈｅ　Ｚｅｉｔｓｃｈｒ
ｉｆｔ　）第１ＩＩ巻第８２−８９頁（１９８４年）、
シー・アール・アラン他：エクスペリメンタル・マイコ
ロジー（Ｃ，Ｒ，Ａｌ１ａｎ　　ｅｔ　ａｌ　：　Ｅｘ
ｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＭｙｃｏｌｏｇｙ　）第３巻第２
８５−２８７　Ｄｌｒ　（１９７９年）〕およびキトサ
ンの分解物かえん豆のカビの生育の抑制に影響を及ぼす
こと〔ディー・エフ・ケンドラ他：エクスペリメンタル
・マイコロジー（Ｄ、Ｆ、　Ｋｅｎｄｒａ　ｅｔ　ａｌ
　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｙｃｏｌｏｇｙ）第８
巻第２７６−２８＋頁（１９８４年）〕が知られ、さら
にキトサンおよびキトサンの軽度分解物が細菌の生育を
抑制すること（特願昭６０−２２３７４９号）およびキ
トサンならびにキトサンの分解産物によって植物病害を
防除すること（特願昭６１−４０４００号）が提案され
ている。

またバチルス属に属する微生物により生産され、ｐＨ５
〜１１の領域において安定なキトサナーゼによってキト
サンを分解して、Ｄ−グルコサミンのｍｓを含むことな
く、主として２〜８の重合度のキトサンオリゴ糖を製造
する方法が提案されている（特願昭６０−１６７４２７
号）。

本発明者らは、キトサンについて永年研究を続けている
が、その研究において、キトサンオリゴ糖が乳酸菌の増
殖促進に効果があることを見出し、その知見に基づいて
本発明に到達した。

〔発明の目的および発明の要約〕

本発明の目的は、乳酸菌増殖促進剤を提供することにあ
り、詳しくは、人体に対して有害でなく、安全に使用す
ることができる乳酸菌増殖促進剤を提供することにある
。

本発明は、キトサンオリゴ糖を有効成分とする乳酸菌増
殖促進剤である。

本発明の乳酸菌増殖促進剤のキトサンオリゴ蔚は、Ｄ−
グルコサミンの重合度が２〜８のキトサンオリゴ糖であ
ることが好ましく、本発明におけるキトサンオリゴ糖は
、キトサンをバチルス属に属する微生物によって生産さ
れ、ｐＨ５〜１１の領域において安定なキトサナーゼに
より分解することが好ましいが、このようなキトサナー
ゼは、バチルスＮｏ、７−Ｍ（微工研菌寄第８１３９号
）により生産することができる。

〔発明の詳細な説明〕

本発明の乳酸菌増殖促進剤の有効成分のキトサンオリゴ
糖は、その脱アセチル化度がいかなるものであっても、
これを使用することができるが、５０〜１００％の脱ア
セチル化度のものを使用するのが好ましい。

キトサンオリゴ糖は、単体または塩などのいかなる形態
のものであっても、乳酸菌の増殖を促進するものであれ
ば、これを使用することができるが、水に溶解しうる酸
の塩、たとえば塩酸、硝酸、ギ酸、酢酸、乳酸、グルタ
ミン酸、アジピン酸またはアスコルビン酸の塩を使用す
るのが好ましい。

またキトサンオリゴ塘におけるＤ−グルコサミンの重合
度は、２０以下（特に好ましくは２〜８の範囲）のもの
を使用するのが好ましい。

キトサンオリゴ糖は、乳酸菌の増殖を促進する範囲の量
であれば、いかなる量においても、これを使用すること
ができるが、０．１〜０．４％の培地における濃度の量
において使用するのが好ましい。

またキトサンオリゴ着は、単体の形、または固体、粉体
または液体の不活性担体との組成物の形において使用す
ることができる。

本発明の乳酸菌増殖促進剤に使用されるキトサンオリゴ
糖は、キトサンを公知の手段によって分解し、所望の特
性を有するキトサンオリゴ塘を分別取得することによっ
て得られるが、キトサンを単糖にまで分解することのな
い手段によるのが好ましく、そのためにキトサンを単糖
にまで分解することのないキトサナーゼによって、キト
サンを分解するのが好ましい。このようなキトサナーゼ
としては、バチルス属に属する微生物により生産され、
５〜１ＪのｐＨの領域において安定なキトサナーゼを使
用するのが好ましく、またバチルス陽７−Ｍ　（微工研
菌寄第８１３９号）により生産されたキトサナーゼを使
用するのがさらに好ましい。

バチルスＮｏ、　７−　Ｍは、長崎県南高来郡小浜町雲
仙の原生沼の土壌よりキチンまたはキトサンを唯一の炭
素源とする培地に生育しうる細菌として分離されたバチ
ルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、）　Ｎｏ、　７株を親
株として、この親株をＮ−メチル−Ｗ−ニトロソ−Ｎ−
ニトロソグアニジン（ＮＴＧ　）で処理して突然変異を
誘発させ、得られたストレプトマイシン耐性の変異株の
中から、高活性のキトサナーゼを生産しうるものとして
分離された変異株であって、微工研菌寄第８１３９号（
ＰＥＲＭ　Ｐ　−８１３９）として通商産業省微生物工
業技術研究所に寄託されている。

バチルスＮｏ、　７−　Ｈの菌学的性質は以下に示され
る。

Ａ・細胞の形態 （１）細胞の形および大きさ：短桿菌、（肉汁および肉
汁寒天斜面培養、３７°Ｃ１２４〜７２時間の培養） （２）細胞の多形性の有焦：無し、 （３）運動性の有無：有り、 （肉汁寒天半流動高層穿刺培養） （４）胞子の有無：有り、内生胞子および裸の胞子、球
状、 〔トーナー（Ｄｏｒｎｅｒ　）の染色法およびウイツツ
（ＷｉｔＺ）変法〕 （５）ダラム染色性：陽性、 〔肉汁寒天斜面培養、３７℃、１８時間、ヒュツカ−（
Ｈｕｃｋｅｒ　）の変法により染色〕Ｂ、各培地におけ
る生育駄態 （］）肉汁寒天平板培養（３７’Ｃ，２４〜１６８時間
）：糸状の周縁を有する円形で、隆起した乳白色のコロ
ニーを形成する。コロニーの表面は凹凸でやや光沢があ
り、半透明である。時間の経過とともに盛上ってくる。

０累は生産しない。

（２）肉汁寒天斜面培養（３７℃、２４〜１６８時間）
：拡布跋に盛上った乳白色のコロニーを形成する。

コロニーは凸円形の隆起があり、光沢がある。生育は良
好で、時間とともに拡がってくる。色素は生産しない。

（３）肉汁液体培養（３７°Ｃ１２４〜１６８時間）二
表面に膜を形成しない。時間とともに全体的に濁ってく
る。底部に紫状（顆粒状）の沈デンが形成され、徐々に
多くなってくる。

（４）肉汁ゼラチン穿刺培養（２５°Ｃ１２４〜１６８
時間）： 穿刺線に沿って生育し、液化する。表面および内部は漏
斗駄に生育し、液化する。液化部分は白濁する。

（５）リドマスミルク（３７°Ｃ１２４〜１６８時間）
：２日後から上部が少しずつ液化し、４日目には色は完
全に変色し、酸性となった。凝固はしない。

時間の経過とともに、液化は進み、半透明になった。

Ｃ０生理学的性質 （１）硝酸塩の還元ニー （硝酸塩肉汁培地、３７°Ｃ１２４〜１２０時間）（２
）脱窒反応ニー （駒形らの方法、発酵管を使用、３７°０１２４〜１２
０時間） （３）ＭＲテスト二十 （３７℃、２４〜１６８時間） （４）ｖｐテスト（アセチルメチルカルビノール生成試
験二十 （３７°Ｃ１２４〜１６８時間） （５）インドールの生成ニー （３７°０１２４〜１６８時間） （６）硫化水素の生成ニー （ＴＳＩ寒天法、３７°０１２４〜１６８時間）（７）
デン粉の加水分解二十 （３７°０１２４〜１６８時間） （８）クエン酸の利用 （コーザーの培地、３７６０１２４〜１６８時間）（ク
リステンセンの培地、３７°Ｃ１２４〜１６８時間）：
十 （９）無機窒素源の利用（３７°Ｃ１２４〜１６８時間
） 硝酸塩：未定、 アンモニウム塩：未定、 （１０）色素の生成 （マンニット・酵母エキス寒天斜面培地）：〔キング（
Ｋｉｎｇ）　　Ａ寒天斜面培地コニ−（１１）蛍光の有
無：無し く１２）ウレアーゼ：十 （クリステンセンーウレア寒天培地、３７°０１２４〜
１６８時間） （１３）オキシダーゼ：＋ （肉汁寒天培地、３７°Ｃ１２４〜４８時間）（１４）
カタラーゼ：十 （肉汁寒天培地、３７°０１２４〜４８時間）（Ｉ５）
生育の範囲：　（肉汁寒天培地）温度：未定、 ｐＨ：　５〜１０、 添加食塩濃度：未定、 （１６）酸素に対する態度：好気性 （１％グルコース肉汁高層寒天培地、３７６０１２４〜
７２時間） （１７）　　Ｏ−Ｆテスト〔ヒュー−ライフソン（Ｈｕ
ｇｈ　−Ｌｅｉｆｓｏｎ　）法、３７°Ｃ，Ｄ−グルコ
ース〕　：発酵的に酸を生成する。

（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｖｅ　） （１８）糖類からの酸およびガスの生成の有無（３７６
０１２４〜１６８時間）： 塘　類　　　　　酸　　　ガス Ｄ−グルコース　　十　　　　− Ｄ−マンノース　　−− Ｄ−ガラクトース　−− Ｄ−フラクトース　十　　　　− Ｌ−アラビノース　−− Ｄ−キシロース　　−− Ｄ−ソルビット　　−　　　　− Ｄ−マンニット　　−− イノジット　　　　−− マルトース　　　　十　　　　− サッカロース　　　＋　　　　− ラクトース　　　　−− デン粉　　　　　　十　　　− セルロース　　　　−− グリセリン　　　−− 以上の菌学的性質について、パージエイス・マニュアル
・オブ・デターミネイティブーバクテリオロジー（Ｂｅ
ｒｇｅデｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａ
ｔｉｖｅＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇＹ　）の第８版（１９
７４年）を検索したところ、Ｎｏ、７−Ｍ株はバチルス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　）属に属するのが相当であること
がわかった。

バチルスＮｏ、　７−　Ｈにより生産されたキトサナー
ゼの酵素化学的性質は以下に示すとおりである。

（１）作　用： キトサンに作用し、分子の内部鎖から任意にβ−１，４
結合を分解して、主としてキトサンオリゴＭ　（ＧＩｅ
Ｎ）　　（ｎ＝２−８）（２量体〜８量体）を生成する
。キトサンオリゴ糖は高速液体クロマトグラフィーを用
いてキトサン分解液から分離することができる。この分
解液におけるキトサンの分解度は約４５％である。カル
ボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）にも作用し、ある程
度はこれを分解するが、キチンには全く作用しない。

（２）作用温度範囲および最適作用温度：可溶性キトサ
ンを基質とした場合、８０°Ｃまで作用し、最適作用温
度は５０°Ｃである。

ｐＨ６，０において１０分間反応させた場合の温度と比
活性の関係を第１図に示す。

（３）作用ｐＨ範囲および最適ｐＨ： ｐＨ３〜９の範囲において作用し、最適ｐＨはｐＨ６で
ある。

１％可溶性キトサン１ｍ１ｔに各ｐＨの緩衝液２ｍ１ｄ
および酵素液ｌ　ｉｇを加えた反応液を３７℃において
１０分間反応させた場合のｐＨと酵素の比活性の関係を
第２図に示す。

（４）熱安定性： ５０’Ｃにおける１５分間の保温まで、はぼ安定で、６
０°Ｃにおける１５分間の加熱により、酵素の約４０％
が失活し、７０°Ｃにおける１５分間の加熱により、完
全に失活した。

温度と比活性の関係を第３図に示す。

（５）ｐＨ安定性： ０．１Ｍ緩衝液中で３０６Ｃにおいて２時間装置した後
、残存する酵素活性を測定したが、ｐＨ５〜１１の範囲
において安定であった。ｐＨ１０〜１１において安定で
あることは、バチルスＮｏ、　７−　Ｍにより生産され
たキトサナーゼの大きな特徴の一つである。ｐＨと比活
性の関係を第４図に示す。

（６）■害剤： パチルスＮｏ、　７−　Ｍにより生産されたキトサナ−
ＰｂＣ１、ＡｇＮ０　　、オよびＰＣＭＢ　（７）存在
によりはば１００％が阻害された。

（７）基質特異性： 種々の基質を使用し、基質の終濃度を０・２５％とした
時に、酵素反応液４　ｍ１３当り酵素蛋白質１ｒｎ９に
よって１時間後に遊離する全還元糖とへキソサミンの量
＜７ｎ９／ｒｒＬｇｍ白質／時）を測定した。

その結果が第１表に示される。

第１表　基質特異性 基　質　　　　　　　分解産物 ＣＴＬ９／ｍ９蛋白質／６０分） （０・２５％）　　　　　全還元糖　へキソサミン粉末
キトサン　　　　　　００ コロイダルキトサン　　１０５９　　　　１９０可溶性
キトサン　　　　７７９　　　　１８９グリコールキト
サン　　６８０　　　　　９２粉末キチン　　　　　　
　０　　　　０　※コロイダルキチン　　　　０　　　
　０　※グリコールキチン　　　　０　　　　０　※セ
ルロース　　　　　　　Ｏ− ＣＭＣＩ４７　　　　　− メチルセルロース　　　　０　　　　−注）　※：ライ
シツヒ（Ｒｅ１５５１ｇ　）法による。

バチルスＮｏ、　７−　Ｍにより生産されたキトサナー
ゼは、コロイダルキトサン、可溶性キトサンおよびグラ
イコールキトサンをよく分解し、カルボキシメチルセル
ロース（ＣＭＣ）も若干分解したが、粉末キトサンには
作用しなかった。またコロイダルキチン、グライコール
キチン、粉末キチンおよびメチルセルロースは全く分解
しなかった。

（８）分子量： ５Ｏ５−ポリアクリルアミド電気泳動法により分子量を
測定した結果を第５図に示す。第５図において（○）は
バチルスｌＪｏ、　７−　Ｍにより生産されたキトサナ
ーゼの分子量であって、約４１　、０００である。

セファデックスＧ−１００を用いたゲル濾過法により分
子量を測定した結果を第６図に示す。第６図において（
○）はバチルスＮｏ、　７−　Ｍにより生産されたキト
サナーゼの分子量であって、約３０、０００である。

（９）酵素力価の？ｌ！ｌｌｌ： １ｇの粉末キトサン（２８メツシユ）を５０噌の帆ＩＭ
酢酸水溶液に溶解し、Ｏ，，１Ｍ酢酸ナトリウム水溶液
でｐＨ６，０に調整したｉ、０．１　Ｍ酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ：　６．０）を加えて、全容を１００ｍ７にして、基
質の１％可溶性キトサン溶液を調製する。

３７℃において５分間ブレインキュベートした基質の１
％可溶性キトサン溶液１　ｒｎｌｌに、同様にブレイン
キュベートした酵素液１ｍｌを加え、３７°Ｃにおいて
正確に１０分間酵素反応を行なわせる。その後反応液を
３分間煮沸して酵素反応を停止させ、反応液中に生成し
た還元糖を定量する。

この条件において１μモルのグルコサミンに相当する還
元糖を遊歴させる酵素量を、１単位（ｕｎｉｔ）のキト
サナーゼ活性とする。

以下において本発明を参考例および実施例に代りうる試
験例によってさらに詳しく説明する。

参考例１ （種培養の調製） ２５０ｍｌ！、容三角フラスコに、酵母エキス帆８％、
ペプトン０＋４％、肉エキス０．２％、コロイダルキト
サン０．５％を含む液体培地（ｐＨ：　７．２）　　５
０７ｒＬＩ！、を入れ、常法により殺菌した後、これに
予め液体培養したバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、
）　Ｎｏ、　７−Ｍ　　（ＦＥＲＭ　Ｐ　−８１３９）
を接種し、３００Ｇにおいて、１日間振とう培養した。

（酵素生産用培養液の調製） ５１容三角フラスコ２本に、上記と同一の組成の液体培
地をそれぞれｌｌずつ入れ、常法により殺菌した後、こ
れに上記で得られた種培養液４゜ｒｒＪを接種し、３０
℃において、４日間振とう培養した。培養液を６．００
Ｏｒ、ｐ、ｍにおいて遠心分離して、菌体を除去し、得
られた上澄液のキトサナーゼの活性を前記の酵素力価の
測定法によって測定した。上澄液１　ｍｌ：当り帆９９
単位であった。

（酵素液の精製） 上記で得られた上澄液を混合し、得られた混合液１．８
１１！、に固体硫安１，０１５ｇ（硫安８０％飽和に相
当する）を加え、濾過し、得られた沈デン物を蒸留水に
溶解し、１７７ｍ１！、とじた。この酵素液を蒸留水、
引き続いて、０．０２　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ：　６．
０）に対して透析した後、得られた酵葉液を、予め０．
０２　Ｍリン酸緩衝液で平衡化したＣＭ−セファデック
スＣ−５０を充填したカラム（２，６Ｃｉ（径）Ｘ４５
Ｃ！ｎ（長さ）〕に流してキトサナーゼを吸着させた。

はとんどの不純蛋白質は素通り区分に集まっていた。こ
のカラムを０゜０２Ｍリン酸緩衝液３５０耀で洗浄した
扱、０〜０．５Ｍの塩化ナトリウムで直線的濃度勾配に
より酵素蛋白質を溶出した。

次にキトサナーゼ活性を示した第２１８〜２４０のフラ
クションを合し、これをダイアフローメンブレンフィル
ターＰＭ−１０（アミコン社製品）を用いた限外濾過装
置で１７倍にａ縮し、この濃縮液に、セファデックスＧ
−１００を用いるゲル濾過を行なった。

このゲル濾過のキトサナーゼ活性を示した第５０〜６３
のフラクションを合し、再びＣＭ−セファデックスＣ−
５０によるカラムクロマトグラフィーを行なった。前回
と同じ条件で酵素を吸着し、０〜０．５Ｍの塩化ナトリ
ウムで直線的濃度勾配により酵素蛋白質を溶出した。

参考例２ ２５〇−容三角フラスコに、キトサン（脱アセチル化度
＝９９％）５ｇを取り、これに脱イオン水５０ｄおよび
１Ｎ乳酸３１−を加え、充分撹拌した後、脱イオン水を
加えて、全量を１００艷にした。

このキトサン乳酸溶液のｐＨは５．７４であった。この
キトサン乳酸溶液を３７６Ｃの恒温槽において１５分間
ブレインキュベートした。

これとは別に、参考例１のＣＭ−セファデックスＣ−５
０によるカラムクロマトグラフィーで得たキトサナーゼ
溶液を希釈して、１０．５　ｕｎｉｔ　／ｒｄとし、そ
の１０−を試験管に取り、前記と同様にブレインキュベ
ートし、これを前記のキトサン乳酸溶液に加え、３７°
Ｃの恒温槽において反応させた。１時間４０分後に三角
フラスコを沸とう浴に６分間入れ、反応液を加熱して反
応を停止させた。

反応液の還元糖の生成量を、Ｄ−グルコサミン塩酸塩を
標準試料として、測定し、１９．４■／−の結果を得た
。反応液を遠心分離し、さらに濾紙で濾過した後、凍結
乾燥して、６．５３９のキトサンオリゴ糖粉末を得た。

反応時間を６時間としたこと以外は、前記と同様にして
還元糖の生成量２４．３ｍｙ／−の反応液を得、さらに
６．９２９のキトサンオリゴ塘粉末を得た。

それぞれの反応液の一部を高速液体クロマトグラフィー
にかけて、キトサンオリゴ塘の重合度側の生成量を調べ
た。

その結果は第７図に示すとおりであった。

第７図において、ヨコ軸はキトサンオリゴ塘の重合度で
あり、そのタテ軸は生成したキトサンオリゴ糖における
それぞれの重合度のキトサンオリゴ塘の含有比率（％）
である。第７図におけるそれぞれの重合度のキトサンオ
リゴ糖の含有比率は棒グラフの面積比によって示される
。第７図の（ａ）は１時間４０分の反応における結果で
あり、（ｂ）は６時間の反応における結果である。

実施例 （ＭＲＴ培地の組成） グルコース　　　　　　　　　　　　　ｌ０Ｊ７酢酸ナ
トリウム　　　　　　　　　　ｌ０９ＮａＣ１１ｇ ＣａＣ］　・２ＨＯ１，５ｇ ペプトン　　　　　　　　　　　　　１０９酵母エキス
　　　　　　　　　　　　５ｇ肉エキス　　　　　　　
　　　　　　　３ｇＭｇ５０・７ＨＯ（１０ｇ／　１０
０ｍｊｌ水溶液）２−Ｍｎ５Ｏ・ｘＨＯ（１９／　１０
０ｄ水溶液）　１−ＦｅＳＯ−７ＨＯ（１００Ｍ９／　
１００−水溶液）１ｍ１水　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　１０００艷ＭＲＴ培地】０艷にラクト
バチルス・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
　ｂｕｌｇａｒｌｃｕｓ　）　（ＩＡＭ　３５３３　）
を接種し、３７℃において１８時間静置培養して、前培
養液１０−を得た。

上記の組成のＭＲＴ培地に、参考例２の１時間４０分の
反応で得たキトサンオリゴ塘粉末１ｇ、３ｇおよび５ｇ
を加えて、試験培地を調製した。

対照として、キトサンオリゴ糖粉末を加えないＭＲＴ培
地を使用した。

前記の前培養液を１／１０に希釈し、その０．１ｍｌを
取り、上記の試験培地（０，１％、０．３％および０．
５％キトサンオリゴ糖を含むＭＲＴ培地）１０ｍ！およ
び対照培地（ＭＲＴ培地）ｌＯ耐にそれぞれ接種し、３
７°Ｃにおいて静置培養し、第８図に示す時間の経過後
に、６６０　ｎｍの吸光度を測定して、菌の増殖を調べ
た。

その結果を第８図に示す。

第８図において、（−〇−１実線）は０．１％のキトサ
ンオリゴ糖を含む試験培地の結果を、（−△−１実線）
は０．３％のキトサンオリゴ糖を含む試験培地の結果を
、また（−×−１実線）は０．５％のキトサンオリゴ糖
を含む試験培地の結果を示し、さらに（−０−１鎖線）
はキトサンオリゴ糖を含まない対照培地の結果を示す。

第８図によると、４時間までの培養では、キトサンオリ
ゴ糖を含む試験培地は、いずれも対照培地よりも菌の増
殖速度が大きいが、８時間以上の培養では、０．１％お
よび０．３％のキトサンオリゴ糖を含む試験培地だけが
対照培地よりも菌の増殖速度が大きいのに対して、０．
５％のキトサンオリゴ恒を含む試験培地は対照培地より
も菌の増殖速度が／ｌＸさい。

このことから、キトサンオリゴ糖がラクトバチルス・ブ
ルガリクスの菌の増殖に対して促進効果を有することが
わかる。

〔発明の効果〕

キトサンオリゴ塘は乳酸菌の増殖を促進する。

【図面の簡単な説明】

第１図は、バチルスＮｏ、　７−　Ｍにより生産された
キトサナーゼの作用温度範囲および最適作用温度範囲を
示す図表、第２図は、バチルスＮｏ、　７−　Ｍにより
生産されたキトサナーゼの作用ｐＨ範囲および最適ｐＨ
を示す図表、第３図は、バチルスＮｏ、７−Ｍにより生
産されたキトサナーゼの温度と比活性の関係（熱安定性
）を示す図表、第４図は、バチルスｌＪｏ、　７−　Ｍ
により生産されたキトサナーゼのｐＨと比活性の関係（
ｐＨ安定性）を示す図表、第５図は、バチルスＮｏ、　
７−　Ｍにより生産されたキトサナーゼの５ＤＳ−ポリ
アクリルアミドＳ気泳動法による分子量を示す図表、第
６図は、バチルスＮｃ７−Ｍにより生産されたキトサナ
ーゼのゲル濾過法による分子量を示す図表、そして第７
図は、参考例２で得たキトサンオリゴ糖の重合度分布を
示す図表、さらに第８図は実施例におけるラクトバチル
ス・ブルガリクスの菌の増殖を示す図表である。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）キトサンオリゴ糖を有効成分とすることを特徴と
   する乳酸菌増殖促進剤。
2. （２）キトサンオリゴ糖が、Ｄ−グルコサミンの重合度
   が２〜８のキトサンオリゴ糖であることを特徴とする特
   許請求の範囲第１項に記載の乳酸菌増殖促進剤。
3. （３）キトサンオリゴ糖が、バチルス属に属する微生物
   により生産され、ｐＨ５〜１１の領域において安定なキ
   トサナーゼにより分解して得られたものであることを特
   徴とする特許請求の範囲第１項または第２項に記載の乳
   酸菌増殖促進剤。
4. （４）バチルス属に属する微生物が、バチルスＮｏ．７
   −Ｍ（微工研菌寄第８１３９号）であることを特徴とす
   る特許請求の範囲第３項に記載の乳酸菌増殖促進剤。