JPS637800A - Ｄｎａハイブリダイゼ−シヨンによるマイコプラズマの検出方法 - Google Patents
Ｄｎａハイブリダイゼ−シヨンによるマイコプラズマの検出方法Info
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- JPS637800A JPS637800A JP15184986A JP15184986A JPS637800A JP S637800 A JPS637800 A JP S637800A JP 15184986 A JP15184986 A JP 15184986A JP 15184986 A JP15184986 A JP 15184986A JP S637800 A JPS637800 A JP S637800A
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Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は一般に生物学の分野に関し、特に生物医学、生
化学および分子生物学に関する。
化学および分子生物学に関する。
［発明の背景および概要］
マイコプラズ？ （ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）は、形が小
さくｍｍｖを持たないことを特徴とするモリカテス（Ｍ
」日ユニ立史りじ−）綱の一部の病原性の微生物である
。これらの微生物は独立して生存できる最小の既知の微
生物の一つであり、ヒト、植物および動物における重要
な病原体である。例えば非定形の肺炎および非淋菌性の
尿道炎はヒトにおける一般的なマイコプラズマ感染であ
る。マイコプラズマはまたリウマチ様の関節炎、自然流
産、不妊症および他の生殖路（ｇｅｎｉｔａｌ ｔｒ
ａｃｔ ）の疾病、およびある種の自己免疫疾病状態に
も関係する。さらにマイコプラズマは細胞培養での一般
的な夾雑物である。生物学的研究では、組織培養のマイ
コプラズマ汚染は深刻な問題で、不断のモニタ監視を必
要とする。
さくｍｍｖを持たないことを特徴とするモリカテス（Ｍ
」日ユニ立史りじ−）綱の一部の病原性の微生物である
。これらの微生物は独立して生存できる最小の既知の微
生物の一つであり、ヒト、植物および動物における重要
な病原体である。例えば非定形の肺炎および非淋菌性の
尿道炎はヒトにおける一般的なマイコプラズマ感染であ
る。マイコプラズマはまたリウマチ様の関節炎、自然流
産、不妊症および他の生殖路（ｇｅｎｉｔａｌ ｔｒ
ａｃｔ ）の疾病、およびある種の自己免疫疾病状態に
も関係する。さらにマイコプラズマは細胞培養での一般
的な夾雑物である。生物学的研究では、組織培養のマイ
コプラズマ汚染は深刻な問題で、不断のモニタ監視を必
要とする。
これらの生物は極端に培養条件が面倒で、現在のところ
マイコプラズマに感染していることを診断する費用に見
合う特定の方法がないことは驚くべきことではない、臨
床試料中のマイコプラズマを検出する最も普通に使用さ
れる方法は、血清学的なものと培養的なものである。血
清学的方法は誤って陽と判断し易く、また培養的方法は
高価で時間がかかり退屈である。細胞培養中の微生物の
汚染を検出するために現在使用されている生化学的技術
の多くはマイコプラズマを特異的に検出するのではなく
、原核生物または酵母や菌類等の単純な真核生物の存在
を示し、ビールスを検出するものさえある。そのような
試験は微生物の存在を知ることのみに関心がある場合に
は有利であるが、動物またはヒトの疾病の疑わしい病因
の物質を捜す場合は、この物質を可能な限り分類するこ
とが必要である。
マイコプラズマに感染していることを診断する費用に見
合う特定の方法がないことは驚くべきことではない、臨
床試料中のマイコプラズマを検出する最も普通に使用さ
れる方法は、血清学的なものと培養的なものである。血
清学的方法は誤って陽と判断し易く、また培養的方法は
高価で時間がかかり退屈である。細胞培養中の微生物の
汚染を検出するために現在使用されている生化学的技術
の多くはマイコプラズマを特異的に検出するのではなく
、原核生物または酵母や菌類等の単純な真核生物の存在
を示し、ビールスを検出するものさえある。そのような
試験は微生物の存在を知ることのみに関心がある場合に
は有利であるが、動物またはヒトの疾病の疑わしい病因
の物質を捜す場合は、この物質を可能な限り分類するこ
とが必要である。
更に、上記の方法は特殊な問題により制約される。例え
ば、明らかに、通常の培養法で検出されない「培養でき
ない（ｎｏｎ −ｃｕｌｔｉｖａｂｌｅ） Ｊ マイコ
プラズマがある。加えて、免疫蛍光試験の場合には、９
種の興なるマイコプラズマの種が共通の組織培養夾雑物
であるため、１以上の抗体が特定の生物の同定に必要と
なることが考えられる。またＤＮＡ染色は必ずしもマイ
コプラズマに特異的とは限らない。
ば、明らかに、通常の培養法で検出されない「培養でき
ない（ｎｏｎ −ｃｕｌｔｉｖａｂｌｅ） Ｊ マイコ
プラズマがある。加えて、免疫蛍光試験の場合には、９
種の興なるマイコプラズマの種が共通の組織培養夾雑物
であるため、１以上の抗体が特定の生物の同定に必要と
なることが考えられる。またＤＮＡ染色は必ずしもマイ
コプラズマに特異的とは限らない。
それで簡単、高感度、特異的、費用に見合って、かつ、
迅速なマイコプラズマ検出系が診断医学および生物学的
研究の分野で切実に望まれてきた。
迅速なマイコプラズマ検出系が診断医学および生物学的
研究の分野で切実に望まれてきた。
ヌクレオチド塩基配列相同性および核酸ハイブリダイゼ
ーション動力学の使用は、細胞および細胞培養中の種々
の生物を検出するために広く使用される技術となった。
ーション動力学の使用は、細胞および細胞培養中の種々
の生物を検出するために広く使用される技術となった。
しかし、本発明以前にはマイコプラズマ検出のための信
頼できる特異的なりＮＡ試験手段（ｐｒｏｂｅ ）は利
用可能でなかった。
頼できる特異的なりＮＡ試験手段（ｐｒｏｂｅ ）は利
用可能でなかった。
本発明は、放射性同位元素標識、ビオチン標識。
ＰＥｌ−ペルオキシダーゼ接合または蛍光抗体標１ｉＥ
ＬＩｓＡ法等の多様な技術で標識された（ １ａｂｅｌ
ｅｄ ｏｒ ｔａｇｇｅｄ）特異的なマイコプラズ
マのリボゾームＲＮＡ遺伝子断片を、ＤＮＡまたはＲＮ
Ａハイブリダイゼーションにより臨床試料、ｍｒｒａま
たは細胞培養中のマイコプラズマを特異的でかつ高感度
に検出するために、使用することにより行われる。
ＬＩｓＡ法等の多様な技術で標識された（ １ａｂｅｌ
ｅｄ ｏｒ ｔａｇｇｅｄ）特異的なマイコプラズ
マのリボゾームＲＮＡ遺伝子断片を、ＤＮＡまたはＲＮ
Ａハイブリダイゼーションにより臨床試料、ｍｒｒａま
たは細胞培養中のマイコプラズマを特異的でかつ高感度
に検出するために、使用することにより行われる。
一つの観点では、本発明は、マイコプラズマのリボゾー
ムＲＮＡ （ｒＲＮＡ）のコードであるＡＡＣＡＣＧＴ
ＡＴＣ，ＣＧＡＡＴＣＡＧＣＴＡＴＧＴＣＧ％ＧＡＧＧ
ＴＴ−ＡＡＣ，ＡＴＣＣＧＧＡＴＴＴＡＴＴ、ＴＣＴＣ
ＡＧＴＴＣＧＧＡＴＴＧＡ、ＡＧＧＴＧＧＴＧＣＡＴＧ
ＧＴＴＧ、ＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧＧＡ下、ＡＴＡＣＡ
ＴＡＧＧＴ、ＡＡＣＴＡＴＧＴＧＣ，ＡＡ’ＴＴＴＴＴ
ＣＡＣＡＡＴＧ、および、ＴＣＴＣＧＧＧＴＣＴから成
る一部から選ばれたヌクレオチド塩基配列を含み、大腸
菌（Ｌ−二基）における類似の塩基配列からヌクレオチ
ドが欠如したマイコプラズマの１６Ｓ ＲＮＡ３ｍ！
伝子由来のＤＮＡ塩基配列を提供する。式中、王はチミ
ン、Ｇはグアニン、Ａはアデニン、Ｃはシトシンを表わ
す。これらの断片は大腸菌の１６８ ＲＮＡ遺伝子と
著しく異なり、上記のものに対して相補的な標識したヌ
クレオチド塩基配列で構成されるマイコプラズマに特異
的な試験手段の基礎となる。
ムＲＮＡ （ｒＲＮＡ）のコードであるＡＡＣＡＣＧＴ
ＡＴＣ，ＣＧＡＡＴＣＡＧＣＴＡＴＧＴＣＧ％ＧＡＧＧ
ＴＴ−ＡＡＣ，ＡＴＣＣＧＧＡＴＴＴＡＴＴ、ＴＣＴＣ
ＡＧＴＴＣＧＧＡＴＴＧＡ、ＡＧＧＴＧＧＴＧＣＡＴＧ
ＧＴＴＧ、ＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧＧＡ下、ＡＴＡＣＡ
ＴＡＧＧＴ、ＡＡＣＴＡＴＧＴＧＣ，ＡＡ’ＴＴＴＴＴ
ＣＡＣＡＡＴＧ、および、ＴＣＴＣＧＧＧＴＣＴから成
る一部から選ばれたヌクレオチド塩基配列を含み、大腸
菌（Ｌ−二基）における類似の塩基配列からヌクレオチ
ドが欠如したマイコプラズマの１６Ｓ ＲＮＡ３ｍ！
伝子由来のＤＮＡ塩基配列を提供する。式中、王はチミ
ン、Ｇはグアニン、Ａはアデニン、Ｃはシトシンを表わ
す。これらの断片は大腸菌の１６８ ＲＮＡ遺伝子と
著しく異なり、上記のものに対して相補的な標識したヌ
クレオチド塩基配列で構成されるマイコプラズマに特異
的な試験手段の基礎となる。
他の観点では、本発明は、原核生物のｒＲＮＡのコード
であるＡＣＧＧＧＴＧＡＧＴ、ＴＡＡＴＡＣＣＧＣＡＴ
、ＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴｌＧＴＧＧＧＧＡ
ＧＣＡＡＡ、ＡＧＧＡＴＴＡＧＡＴＡＣＣＣＴ、ＣＣＧ
ＴＡＡＡＣＧＡＴｌＧＡＡＴＴＧＡＣＧＧＧＧＳＣＣＣ
ＧＣＡＣＡＡＧｌ ＧＧＴＧＧＡＧＣＡＴＧＴ、ＴＧＴ
ＴＧＧＧＴＴＡＡＧＴＣＣＣＧＣＡＡＣＧＡ、ＧＧＧＡ
ＴＧＡＣＧＴＳ ＡＣＧＴＧＣＴＡＣＡＡＴＧＳ ＣＴ
ＡＧＴＡＡＴＣＧ、ＴＧＴＡＣＡＣＡＣＣＧＣＣＣＧＴ
ＣＡ、ＡＡＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡＧＧＴＡ、および、Ｔ
ＧＧＡＴＣＡＣＣＴＣＣＴＴから成る一部から選ばれた
ヌクレオチド塩基配列を含む１６３ ＲＮＡ遺伝子の
同定されたＤＮＡ塩基配列を提供する。これらの断片は
大腸菌および試験した全てのマイコプラズマに対して共
通の１６ＳＲＮＡ遺伝子中の領域を表わす。全ての原核
生物に対して普遍的な試験手段は、これらの断片に対し
て相補的な標識したヌクレオチド塩基配列で構成される
。
であるＡＣＧＧＧＴＧＡＧＴ、ＴＡＡＴＡＣＣＧＣＡＴ
、ＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴｌＧＴＧＧＧＧＡ
ＧＣＡＡＡ、ＡＧＧＡＴＴＡＧＡＴＡＣＣＣＴ、ＣＣＧ
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ＴＧＧＧＴＴＡＡＧＴＣＣＣＧＣＡＡＣＧＡ、ＧＧＧＡ
ＴＧＡＣＧＴＳ ＡＣＧＴＧＣＴＡＣＡＡＴＧＳ ＣＴ
ＡＧＴＡＡＴＣＧ、ＴＧＴＡＣＡＣＡＣＣＧＣＣＣＧＴ
ＣＡ、ＡＡＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡＧＧＴＡ、および、Ｔ
ＧＧＡＴＣＡＣＣＴＣＣＴＴから成る一部から選ばれた
ヌクレオチド塩基配列を含む１６３ ＲＮＡ遺伝子の
同定されたＤＮＡ塩基配列を提供する。これらの断片は
大腸菌および試験した全てのマイコプラズマに対して共
通の１６ＳＲＮＡ遺伝子中の領域を表わす。全ての原核
生物に対して普遍的な試験手段は、これらの断片に対し
て相補的な標識したヌクレオチド塩基配列で構成される
。
一般に本発明は、原核生物由来の核酸に存在し真核生物
由来の核酸には存在しない特定のヌクレオチド塩基配列
を含む核酸を含有する原核生物の存在を決定するための
方法であって、この方法が、この原核生物由来でありこ
の特定のヌクレオチド塩基配列を含む核酸または核酸断
片を含有するかもしれない媒質を、この特定のヌクレオ
チド塩基配列に対して相補的なヌクレオチド塩基配列を
含むオリゴヌクレオチドと接触させ、それにより、この
オリゴヌクレオチドを、この媒質中に存在するかもしれ
ないこの特定のヌクレオチド塩基配列を含むこの原核生
物由来の核酸または核酸断片とハイブリダイゼーション
させ、このオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーショ
ンした核酸または核酸断片の存在を検出することで行わ
れる方法を包含する。
由来の核酸には存在しない特定のヌクレオチド塩基配列
を含む核酸を含有する原核生物の存在を決定するための
方法であって、この方法が、この原核生物由来でありこ
の特定のヌクレオチド塩基配列を含む核酸または核酸断
片を含有するかもしれない媒質を、この特定のヌクレオ
チド塩基配列に対して相補的なヌクレオチド塩基配列を
含むオリゴヌクレオチドと接触させ、それにより、この
オリゴヌクレオチドを、この媒質中に存在するかもしれ
ないこの特定のヌクレオチド塩基配列を含むこの原核生
物由来の核酸または核酸断片とハイブリダイゼーション
させ、このオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーショ
ンした核酸または核酸断片の存在を検出することで行わ
れる方法を包含する。
他の観点では、本発明は、一般にマイコプラズマまたは
原核生物の検出に使用される特異的な生物学的試験手段
に関与し、これは上記の方法およびそのような試験手段
の同定と生産によっている。
原核生物の検出に使用される特異的な生物学的試験手段
に関与し、これは上記の方法およびそのような試験手段
の同定と生産によっている。
［好ましい具体例の説明］
先ず本発明の生物学的試験手段の生産および使用を含む
特定の工程を詳述し、それから本発明で有効な特定のヌ
クレオチド塩基配列がどのようにして決定されるかを記
述することにより、本発明を説明する。
特定の工程を詳述し、それから本発明で有効な特定のヌ
クレオチド塩基配列がどのようにして決定されるかを記
述することにより、本発明を説明する。
１ｊ」」仁ム丈亘ｌヱ臼ム、１＋上１０しく上に掲げた
１６Ｓ マイコプラズマ ＲＮＡ１伝子塩基配列の一
つに対して相補的である１６ｂｐデオキシオリゴヌクレ
オチド、ＧＣＴＴＡＧＴＣＧＡＴＡＣＡＧＣはここに参
照として挿入する文献 （Ｍ、 Ｈ，Ｃａｒｕｔｈ
ｅｒｓ ｅｔ ａｌ、 、 て１
コと１９コニｉｃ−一−１”ｎ １ｎｅｅｒｉｎ 、
Ｖｏｌ、４ 、 ｐ、 １−１７． ＰｌｅｎｕｍＰｕ
ｂｌｉｓｈｉｒ＋ｏ Ｃｏ 、 （１９８２） ）
に記述されたリン酸三エステル固相法で合成された。
１６Ｓ マイコプラズマ ＲＮＡ１伝子塩基配列の一
つに対して相補的である１６ｂｐデオキシオリゴヌクレ
オチド、ＧＣＴＴＡＧＴＣＧＡＴＡＣＡＧＣはここに参
照として挿入する文献 （Ｍ、 Ｈ，Ｃａｒｕｔｈ
ｅｒｓ ｅｔ ａｌ、 、 て１
コと１９コニｉｃ−一−１”ｎ １ｎｅｅｒｉｎ 、
Ｖｏｌ、４ 、 ｐ、 １−１７． ＰｌｅｎｕｍＰｕ
ｂｌｉｓｈｉｒ＋ｏ Ｃｏ 、 （１９８２） ）
に記述されたリン酸三エステル固相法で合成された。
これまでに記述した伯のデオキシオリゴヌクレオチドま
たは他の望ましいオリゴヌクレオチドは同様に合成され
る。例えば、ＤＮＡ試験手段の代わりに、ＣＧＡＡＵＣ
ＡＧＣＵＡＵＧＵＣＧのｊ２２基配死金含む組換体ＳＰ
６ベクタ転写体等のＲＮＡ試験手段を合成することが望
ましいだろう。
たは他の望ましいオリゴヌクレオチドは同様に合成され
る。例えば、ＤＮＡ試験手段の代わりに、ＣＧＡＡＵＣ
ＡＧＣＵＡＵＧＵＣＧのｊ２２基配死金含む組換体ＳＰ
６ベクタ転写体等のＲＮＡ試験手段を合成することが望
ましいだろう。
リボゾームＲＮＡ分子に対するＤＮＡ−ＲＮＡまたはＲ
ＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションは、試験手段をゲ
ノム（ｇｅｎｏｍｅ ）のＤＮＡ塩基配列に対して用い
るＤＮＡ−ＤＮＡまたはＲＮＡ−ＤＮＡハイブリダイピ
ージョンより、検出の感度を数百倍高める。これは、そ
のような試験手段を使用すると、マイコプラズマまたは
ユーバクテリウムの（ｅｕｂａｃｔｅｒｉａｌ ）細胞
者りのリボゾームＲＮＡの多数の複製が検出されるから
である。
ＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションは、試験手段をゲ
ノム（ｇｅｎｏｍｅ ）のＤＮＡ塩基配列に対して用い
るＤＮＡ−ＤＮＡまたはＲＮＡ−ＤＮＡハイブリダイピ
ージョンより、検出の感度を数百倍高める。これは、そ
のような試験手段を使用すると、マイコプラズマまたは
ユーバクテリウムの（ｅｕｂａｃｔｅｒｉａｌ ）細胞
者りのリボゾームＲＮＡの多数の複製が検出されるから
である。
−オキシ第１ゴヌクレオチ゛の
上記のデオキシオリゴヌクレオチドは、ここに参照とし
て挿入される文献（Ｃ，Ｃ，Ｒｉｃｈａｒｄｓ。
て挿入される文献（Ｃ，Ｃ，Ｒｉｃｈａｒｄｓ。
ｎ、 Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃ１ｄ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ （Ｃａｎｔｏｎ
ｉ、 Ｇ、 Ｌ、 ａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ 、
Ｄ。
Ａｃ１ｄ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ （Ｃａｎｔｏｎ
ｉ、 Ｇ、 Ｌ、 ａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ 、
Ｄ。
Ｒ，、ｅｄｓ、） 、 Ｖｏｌ、 ２ 、 ｏｐ、 ８
１５−８２８ 、 Ｈａｒｐｅｒ ａｎｄ Ｒｏｗ
、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９７１） ）の方法を
用いて５′末端を３２ｐ標識された。生成の標識したデ
オキシオリゴヌクレオチドは、その後マイコプラズマに
特異的な試験手段として使用された。マイコプラズマに
対する特異性は、ここに参照として挿入される文献（Ｍ
、Ｃｕｎｎ１ｎａｈａＩＩｌ。
１５−８２８ 、 Ｈａｒｐｅｒ ａｎｄ Ｒｏｗ
、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９７１） ）の方法を
用いて５′末端を３２ｐ標識された。生成の標識したデ
オキシオリゴヌクレオチドは、その後マイコプラズマに
特異的な試験手段として使用された。マイコプラズマに
対する特異性は、ここに参照として挿入される文献（Ｍ
、Ｃｕｎｎ１ｎａｈａＩＩｌ。
Ａｎａｌ 、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 １２８
：４１５ −４２１ （１９８３） ）に
記述されるスロット プロット（ｓｌｏｔ ｂｌｏｔ
）ハイブリダイゼーションによって証明された。この目
的のためにｐｕｃｓ中にクローニングされた肺炎マイコ
ブラズ？ （Ｍ ｃｏｐｌａｓｇＩａ ｐｎｅｕｍｏ
ｎｉａｅ）（７）１６００ｂｐＤＮＡｖｆＩ片が使用サ
レタ。１６００ｂｐ断片は上記の１６塩基のデオキシオ
リゴヌクレオチドを含む。代表的な原核生物のユーバク
テリウム（ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ）である大腸菌の
ゲノム消化物は′ｆｓ索ＬＬ！ｌＬｄ■を用いる消化に
より生産された。
：４１５ −４２１ （１９８３） ）に
記述されるスロット プロット（ｓｌｏｔ ｂｌｏｔ
）ハイブリダイゼーションによって証明された。この目
的のためにｐｕｃｓ中にクローニングされた肺炎マイコ
ブラズ？ （Ｍ ｃｏｐｌａｓｇＩａ ｐｎｅｕｍｏ
ｎｉａｅ）（７）１６００ｂｐＤＮＡｖｆＩ片が使用サ
レタ。１６００ｂｐ断片は上記の１６塩基のデオキシオ
リゴヌクレオチドを含む。代表的な原核生物のユーバク
テリウム（ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ）である大腸菌の
ゲノム消化物は′ｆｓ索ＬＬ！ｌＬｄ■を用いる消化に
より生産された。
消化された大腸菌ＤＮ、Ａおよび１６００ｂｐ肺炎マイ
コプラズマＤＮＡ断片は、ここに参照として挿入される
文献（Ｊ、 Ｊ、 １−ｅａｒｙ ｅｔ ａ、１．
。
コプラズマＤＮＡ断片は、ここに参照として挿入される
文献（Ｊ、 Ｊ、 １−ｅａｒｙ ｅｔ ａ、１．
。
Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、
ｕ、 ｓ、 Ａ。
ｕ、 ｓ、 Ａ。
８０ ： ４０４５−４０４９ （１９８３） ）の方
法によりニトロセルロースフィルタ上に移された。ＤＮ
Ａ断片を含有するニトロセルロースフィルタは減圧下８
０℃で２時間熱され、３２ｐ漂識したデオキシオリゴヌ
クレオチドに対してハイブリダイゼーションされた。図
面に示すように生成のスロット プロットヲ展開シテ、
Ｏ，０Ｏ０３４ｎｑ、０．００３４ｎｇ、０．０３４ｎ
ｇ、０．３４ｎｇおよび３．４ｎｇ（１６ｂｐに対して
計算）の肺炎マイコプラズマＤＮＡ断片に対して高い強
度のプロットがあり、０、 ０００１５μａ、 ０．
００１５μＱ１０．０１５μａＳＯ，１５μｑおよび
１．５μ０の大腸菌ＤＮＡ断片に対してはプロットがな
いことが明らかになり、デオキシオリゴヌクレオチド試
験手段のマイコプラズマに対する特異性が示された。Ｇ
ＣＴＴＡＧＴＣＧＡＴＡＣＡＧＣの塩基配列を有するデ
オキシオリゴヌクレオチドは、このように、マイコプラ
ズマのＤＮＡとハイブリダイゼーションし他の原核生物
のＤＮＡとはハイブリダイゼーションしないマイコプラ
ズマに特異的な試験手段として有効である。他方、例え
ば、原核生物のコードである遺伝子塩基配列の一つに対
して相補的であるＴＧＣＣＣＡＣＴＣＡの塩基配列を有
するデオキシオリゴヌクレオチドは、原核生物とハイブ
リダイゼーションし真核生物とはハイブリダイゼーショ
ンしない原核生物に特異的な試験手段として有効である
。
法によりニトロセルロースフィルタ上に移された。ＤＮ
Ａ断片を含有するニトロセルロースフィルタは減圧下８
０℃で２時間熱され、３２ｐ漂識したデオキシオリゴヌ
クレオチドに対してハイブリダイゼーションされた。図
面に示すように生成のスロット プロットヲ展開シテ、
Ｏ，０Ｏ０３４ｎｑ、０．００３４ｎｇ、０．０３４ｎ
ｇ、０．３４ｎｇおよび３．４ｎｇ（１６ｂｐに対して
計算）の肺炎マイコプラズマＤＮＡ断片に対して高い強
度のプロットがあり、０、 ０００１５μａ、 ０．
００１５μＱ１０．０１５μａＳＯ，１５μｑおよび
１．５μ０の大腸菌ＤＮＡ断片に対してはプロットがな
いことが明らかになり、デオキシオリゴヌクレオチド試
験手段のマイコプラズマに対する特異性が示された。Ｇ
ＣＴＴＡＧＴＣＧＡＴＡＣＡＧＣの塩基配列を有するデ
オキシオリゴヌクレオチドは、このように、マイコプラ
ズマのＤＮＡとハイブリダイゼーションし他の原核生物
のＤＮＡとはハイブリダイゼーションしないマイコプラ
ズマに特異的な試験手段として有効である。他方、例え
ば、原核生物のコードである遺伝子塩基配列の一つに対
して相補的であるＴＧＣＣＣＡＣＴＣＡの塩基配列を有
するデオキシオリゴヌクレオチドは、原核生物とハイブ
リダイゼーションし真核生物とはハイブリダイゼーショ
ンしない原核生物に特異的な試験手段として有効である
。
感染した細胞中のマイコプラズマの検出に対しては、次
の方法が有効であることが見出された。
の方法が有効であることが見出された。
細胞は１−２Ｔ７５組織培養フラスコを使用し、トリプ
シンＥＤＴＡ （ＰＢＳ中０．０５％トリプシン、０．
０４％ＥＤＴＡ）を用いて３７℃で２分間トリプシン処
理された。トリプシン処理した細胞は１−２１の成長媒
質中に再懸濁され、ミニフォルトｆｌ （Ｍ １ｎｉｆ
ｏｌｄ ＩＩ ）スロットプロットハイブリダイゼーシ
ョン装置（３ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄＳｃｈｕｅ
ｌｌ、 Ｉ ｎｃ、 、 Ｋｅｅｎｅ、 Ｎ、 Ｈ，
）を使用して１０ｘＳＳＣで（１ＸＳＳＣは１５ｍＭク
エン酸Ｎａ、１５０ｍＭ Ｎａ（１、ｐＨ７，４）で
湿らせたニトロセルロース膜上に５０−１００μＱ （
１ｘ１０種−１ｘ１０Ｇの細胞）の量をスポットされた
。スロット プロットに適用されたＤＮＡ試料はアルカ
リ（０，５Ｍ ＮａＯＨ１１，５Ｍ Ｎａｃ、を用
いて空温で５−１０分間変成され、０．５Ｍトリス、ｐ
Ｈ７，２および３．０Ｍ ＮａＣρを用いて空温で５
−１０分間中和された。フィルタはその模空温で２ｘＳ
ＳＣで５分間洗浄され、真空炉（ｖａｃｕｕｍ ｏｖ
ｅｎ）中８０℃で２＠間熱された。フィルタは、０．５
ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭトリス、ｐＨ７，５，５ｘデ
ンハーズ（Ｄ ｅｎｈａｒｄｔ ）および１００μＱ／
ｒｒ１２の熱変成した膝精子ＤＮＡから成る前ハイブリ
ダイゼーション緩衝液を使用して６５℃で２時間、前ハ
イブリダイゼーションされた。１０ｍＭトリス、ｐＨ７
，５，１ｍＭ ＥＤＴＡ。
シンＥＤＴＡ （ＰＢＳ中０．０５％トリプシン、０．
０４％ＥＤＴＡ）を用いて３７℃で２分間トリプシン処
理された。トリプシン処理した細胞は１−２１の成長媒
質中に再懸濁され、ミニフォルトｆｌ （Ｍ １ｎｉｆ
ｏｌｄ ＩＩ ）スロットプロットハイブリダイゼーシ
ョン装置（３ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄＳｃｈｕｅ
ｌｌ、 Ｉ ｎｃ、 、 Ｋｅｅｎｅ、 Ｎ、 Ｈ，
）を使用して１０ｘＳＳＣで（１ＸＳＳＣは１５ｍＭク
エン酸Ｎａ、１５０ｍＭ Ｎａ（１、ｐＨ７，４）で
湿らせたニトロセルロース膜上に５０−１００μＱ （
１ｘ１０種−１ｘ１０Ｇの細胞）の量をスポットされた
。スロット プロットに適用されたＤＮＡ試料はアルカ
リ（０，５Ｍ ＮａＯＨ１１，５Ｍ Ｎａｃ、を用
いて空温で５−１０分間変成され、０．５Ｍトリス、ｐ
Ｈ７，２および３．０Ｍ ＮａＣρを用いて空温で５
−１０分間中和された。フィルタはその模空温で２ｘＳ
ＳＣで５分間洗浄され、真空炉（ｖａｃｕｕｍ ｏｖ
ｅｎ）中８０℃で２＠間熱された。フィルタは、０．５
ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭトリス、ｐＨ７，５，５ｘデ
ンハーズ（Ｄ ｅｎｈａｒｄｔ ）および１００μＱ／
ｒｒ１２の熱変成した膝精子ＤＮＡから成る前ハイブリ
ダイゼーション緩衝液を使用して６５℃で２時間、前ハ
イブリダイゼーションされた。１０ｍＭトリス、ｐＨ７
，５，１ｍＭ ＥＤＴＡ。
０．７５Ｍ Ｎａ（１，１ｘデンハーズ、０．５％Ｓ
Ｏ８，１０％硫酸デキストランお７よび１．００μＱ／
ｍ℃の熱変成した諌精子ＤＮＡから成るハイブリダイゼ
ーション緩衝液中、３２ Ｐｆａｌしたデオキシオリゴ
ヌクレオチドの１−２ｘｌＯ’ ｃｐＩｌｌ。
Ｏ８，１０％硫酸デキストランお７よび１．００μＱ／
ｍ℃の熱変成した諌精子ＤＮＡから成るハイブリダイゼ
ーション緩衝液中、３２ Ｐｆａｌしたデオキシオリゴ
ヌクレオチドの１−２ｘｌＯ’ ｃｐＩｌｌ。
比活性１０” ＣｐＨ／μＱ以上、として測定される濃
度の本発明の試験手段を使用して、ハイブリダイゼーシ
ョンが６５℃で１６時間行われた。ハイブリダイゼーシ
ョンの後、フィルタは、２ｘＳＥＴ。
度の本発明の試験手段を使用して、ハイブリダイゼーシ
ョンが６５℃で１６時間行われた。ハイブリダイゼーシ
ョンの後、フィルタは、２ｘＳＥＴ。
０．２％ＳＤＳ （１ｘＳＥＴは３０ｍＭトリス、ｐＨ
８，０，１５０ｍＭ ＮａＣＪ２）を用いて６５℃で
２−４時間、および、４ｍＭトリス塩基を用いて至濡で
１−２時間洗浄された。フィルタはその後乾燥され、１
個または２個のデュポンクロネツクス（Ｄ ｕｐｏｎｔ
Ｃｒｏｎｅｘ ）強化スクリーンを用いてＸ線膜上
にさらされた。
８，０，１５０ｍＭ ＮａＣＪ２）を用いて６５℃で
２−４時間、および、４ｍＭトリス塩基を用いて至濡で
１−２時間洗浄された。フィルタはその後乾燥され、１
個または２個のデュポンクロネツクス（Ｄ ｕｐｏｎｔ
Ｃｒｏｎｅｘ ）強化スクリーンを用いてＸ線膜上
にさらされた。
の し ゛ 。
特定のヌクレオチド塩基配列がどのようにして製造され
、かつ、使用されるかを前述したが、次に、本発明の広
い範囲を理解するため、マイコプラズマに特異的な試験
手段、一般の原核生物に特異的な試験手段、マイコプラ
ズマ、ウレアプラズマ（ｕｒｅａｐｌａｓｍａ、） 、
アコレプラズマ（ａｃｈｏｌｅｌ）ＩａＳｍａ）および
スピロプラズマ（５ｐｉｒｏｐｌａｓｉａ ）の個々の
種に特異的な試験手段、または、ユーバクテリウムの個
々の種に特異的な試験手段として有効な、特定のヌクレ
オチド塩基配列を決定するために使用される技術の試験
について説明する。
、かつ、使用されるかを前述したが、次に、本発明の広
い範囲を理解するため、マイコプラズマに特異的な試験
手段、一般の原核生物に特異的な試験手段、マイコプラ
ズマ、ウレアプラズマ（ｕｒｅａｐｌａｓｍａ、） 、
アコレプラズマ（ａｃｈｏｌｅｌ）ＩａＳｍａ）および
スピロプラズマ（５ｐｉｒｏｐｌａｓｉａ ）の個々の
種に特異的な試験手段、または、ユーバクテリウムの個
々の種に特異的な試験手段として有効な、特定のヌクレ
オチド塩基配列を決定するために使用される技術の試験
について説明する。
そのような決定は次の工程で行われる。
１、 マイコプラズマの特定の種のリボゾームＲＮＡの
完全なゲノムをバタテリオファージまたはブラ、スミド
のベクタ中にクローニングする工程、２、 生成のりポ
ゾームＲＮＡ遺伝子断片を、マイコプラズマでない原核
生物のリボゾームＲＮＡオペロンを用いて試験する工程
、 ３、 このマイコプラズマでない原核生物のリボゾ本ム
ＲＮＡオペＯンとハイブリダイゼーションする断片を特
性づける工程、 ４、 ここに参照として挿入する文献（ＧＯｂｅｌ。
完全なゲノムをバタテリオファージまたはブラ、スミド
のベクタ中にクローニングする工程、２、 生成のりポ
ゾームＲＮＡ遺伝子断片を、マイコプラズマでない原核
生物のリボゾームＲＮＡオペロンを用いて試験する工程
、 ３、 このマイコプラズマでない原核生物のリボゾ本ム
ＲＮＡオペＯンとハイブリダイゼーションする断片を特
性づける工程、 ４、 ここに参照として挿入する文献（ＧＯｂｅｌ。
Ｕ、ａｎｄ ３ｔａｎｂｒｉｄｇｅ 、 Ｅ、 Ｊ、
、 比り飢坦。
、 比り飢坦。
Ｖｏｌ、 ２２６ 、 Ｉ）Ｉ）、 １２１１−１２１
３ （１９８４） ）に記述される差をつけた（ ｄ
ｉ ｆｆｅｒｅｎｔ ｉａ ｌ ）ハイブリダイゼーシ
ョンにより、マイコプラズマに°特異的な断片を同定す
る工程、 ５、 マイコプラズマに特異的な断片を、塩基配列しつ
つあるプラスミド中にサブクローニングする工程、 ６、 生成のサブクローニングしたマイコプラズマに特
異的な断片を塩基配列させる工程、７、 マイコプラズ
マの他の種およびマイコプラズマでない原核生物に対し
て、１−６の工程を繰り返す工程、および、 ８、６および７の工程で得た塩基配列を比較する工程。
３ （１９８４） ）に記述される差をつけた（ ｄ
ｉ ｆｆｅｒｅｎｔ ｉａ ｌ ）ハイブリダイゼーシ
ョンにより、マイコプラズマに°特異的な断片を同定す
る工程、 ５、 マイコプラズマに特異的な断片を、塩基配列しつ
つあるプラスミド中にサブクローニングする工程、 ６、 生成のサブクローニングしたマイコプラズマに特
異的な断片を塩基配列させる工程、７、 マイコプラズ
マの他の種およびマイコプラズマでない原核生物に対し
て、１−６の工程を繰り返す工程、および、 ８、６および７の工程で得た塩基配列を比較する工程。
これにより、マイコプラズマの全ての種に共通でありマ
イコプラズマでない原核生物の対応する塩基配列とは異
なる塩基配列は、マイコプラズマに特異的な試験手段と
して有効であり、マイコプラズマの全ての種並びにマイ
コプラズマでない原核生物に共通である塩基配列は、一
般の原核生物に特異的な試験手段として有効であり、か
つ、マイコプラズマ、アコレプラズマ、ウレアプラズマ
またはスピロプラズマの特定の種のいずれかに特異的な
塩基配列、および、任意の与えられたユーバクテリウム
の種に特異的な塩基配列は、マイコプラズマ、アコレプ
ラズマ、ウレアプラズマまたはスピロプラズマの個々の
種に対してそれぞれ特異的な試験手段として有効である
。
イコプラズマでない原核生物の対応する塩基配列とは異
なる塩基配列は、マイコプラズマに特異的な試験手段と
して有効であり、マイコプラズマの全ての種並びにマイ
コプラズマでない原核生物に共通である塩基配列は、一
般の原核生物に特異的な試験手段として有効であり、か
つ、マイコプラズマ、アコレプラズマ、ウレアプラズマ
またはスピロプラズマの特定の種のいずれかに特異的な
塩基配列、および、任意の与えられたユーバクテリウム
の種に特異的な塩基配列は、マイコプラズマ、アコレプ
ラズマ、ウレアプラズマまたはスピロプラズマの個々の
種に対してそれぞれ特異的な試験手段として有効である
。
肺炎マイコプラズマのリボゾームのＲＮＡゲノムのクロ
ーニングは、肺炎マイコプラズマの全ＤＮＡの１組ｄｌ
［［消化、および、この１組ｄ［［断片のＨｉｎｄｌ［
［で消化したベクタＤＵＣ８への連結により達成された
。生成のりポゾームＲＮＡの遺伝子の断片は、ここに参
照として挿入される文献（Ｇｏｂｅｌ ｅｔ ａｔ
、 、 ５ｃｉｅｎｃｅ、 ２２６ ：１２１１−１２
１３ （１９８４） ）の方法により、ｐＫＫ３５３５
プラスミド中の大腸菌のリボゾームＲＮＡオペロンを用
いて試験され、リボゾーム塩基配列を含むクローニング
した断片を同定された。厳密なハイブリダイゼーション
条件下でマイコプラズマの種に対してハイブリダイゼー
ションし、大腸菌または哺乳類のＤＮＡに対してはハイ
ブリダイゼーションしないことを基礎として、１６００
ｂｐ断片が選ばれた。この１６００ｂｐ断片はＬＬ！ｌ
Ｌｄ■消馬によりｐＵＣ８ベクタから除かれ、ここに参
照″として挿入する文献（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａ
ｌ、 、 Ｌ匹虹。
ーニングは、肺炎マイコプラズマの全ＤＮＡの１組ｄｌ
［［消化、および、この１組ｄ［［断片のＨｉｎｄｌ［
［で消化したベクタＤＵＣ８への連結により達成された
。生成のりポゾームＲＮＡの遺伝子の断片は、ここに参
照として挿入される文献（Ｇｏｂｅｌ ｅｔ ａｔ
、 、 ５ｃｉｅｎｃｅ、 ２２６ ：１２１１−１２
１３ （１９８４） ）の方法により、ｐＫＫ３５３５
プラスミド中の大腸菌のリボゾームＲＮＡオペロンを用
いて試験され、リボゾーム塩基配列を含むクローニング
した断片を同定された。厳密なハイブリダイゼーション
条件下でマイコプラズマの種に対してハイブリダイゼー
ションし、大腸菌または哺乳類のＤＮＡに対してはハイ
ブリダイゼーションしないことを基礎として、１６００
ｂｐ断片が選ばれた。この１６００ｂｐ断片はＬＬ！ｌ
Ｌｄ■消馬によりｐＵＣ８ベクタから除かれ、ここに参
照″として挿入する文献（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａ
ｌ、 、 Ｌ匹虹。
ａｔｌ、 ｃａｄ ｃｉ 、 、
、７４：５４６３−５４６７ （１９７７） ）
に記述されるサンガージデオキシ法を用いて、塩基配列
させるためにＭ１３ＭＩ）８ＤＮＡＩＢＩウイルスへ連
結された。
、７４：５４６３−５４６７ （１９７７） ）
に記述されるサンガージデオキシ法を用いて、塩基配列
させるためにＭ１３ＭＩ）８ＤＮＡＩＢＩウイルスへ連
結された。
肺炎マイクプラズマ、マイコプラズマ カブリコラン（
化、姐肚組吐ル）およびマイコプラズマ種ＰＧ５０ （
ｃｏ ｌａｓｍａ ｓ ｅｃｉｅｓ ）と
大腸菌との塩基配列を比較することにより、ある塩基配
列がマイコプラズマのこれらの全ての榎に対して共通で
あって大腸菌に対しては異なることが示された。これら
の塩基配列は合成され、標識されてマイコプラズマに対
して特異的な試験手段として使用される。例えば、ＧＣ
ＴＴＡＧＴＣＧＡＴＡＣＡＧＣはマイコプラズマに特異
的な試験手段を構成した。他の塩基配列はマイｉ・グラ
ス°・マのこれらの種並びに大ｉｓに対して共通であっ
た。これらの後者の塩基配列は合成され、標識されて全
ての原核生物に対して特異的な試験手段として使用され
る。更に、他の塩基配列は一つのマイコプラズマ種に特
有であって、合成され、標識されてマイコプラズマの種
に対して特異的な試験手段として使用される。
化、姐肚組吐ル）およびマイコプラズマ種ＰＧ５０ （
ｃｏ ｌａｓｍａ ｓ ｅｃｉｅｓ ）と
大腸菌との塩基配列を比較することにより、ある塩基配
列がマイコプラズマのこれらの全ての榎に対して共通で
あって大腸菌に対しては異なることが示された。これら
の塩基配列は合成され、標識されてマイコプラズマに対
して特異的な試験手段として使用される。例えば、ＧＣ
ＴＴＡＧＴＣＧＡＴＡＣＡＧＣはマイコプラズマに特異
的な試験手段を構成した。他の塩基配列はマイｉ・グラ
ス°・マのこれらの種並びに大ｉｓに対して共通であっ
た。これらの後者の塩基配列は合成され、標識されて全
ての原核生物に対して特異的な試験手段として使用され
る。更に、他の塩基配列は一つのマイコプラズマ種に特
有であって、合成され、標識されてマイコプラズマの種
に対して特異的な試験手段として使用される。
本発明はこのように、汚染された細胞培養または他の生
物学的環境中のマイコプラズマを検出する特異的で高感
度の迅速な方法を提供する。また、本発明は、全ての原
核生物に保持されている領域から誘導されたリボゾーム
ＤＮＡ試験手段を提供することができる。このような試
験手段は、ヒトまたは初物の菌内症または敗血症の迅速
で高感度の診断において非常に有効であろう。本発明は
。
物学的環境中のマイコプラズマを検出する特異的で高感
度の迅速な方法を提供する。また、本発明は、全ての原
核生物に保持されている領域から誘導されたリボゾーム
ＤＮＡ試験手段を提供することができる。このような試
験手段は、ヒトまたは初物の菌内症または敗血症の迅速
で高感度の診断において非常に有効であろう。本発明は
。
マイコプラズマ、アコレプラズマ、ウレアプラズマ、ス
ピロプラズマおよびユーバクテリウムの個々の種に対し
てそれぞれに特異的なリボゾームＤＮＡ試験手段を提供
することもできる。これらの試験手段は、遺伝子構成が
ほとんどまたは全く知られていないこれらの生物に対し
て特に有効であろう。
ピロプラズマおよびユーバクテリウムの個々の種に対し
てそれぞれに特異的なリボゾームＤＮＡ試験手段を提供
することもできる。これらの試験手段は、遺伝子構成が
ほとんどまたは全く知られていないこれらの生物に対し
て特に有効であろう。
ある特定のデオキシオリゴヌクレオチドおよびマイコプ
ラズマの種を例として本発明の詳細な説明したが、多く
の変形が可能であることは当業者には明らかでる。本発
明の範囲はそのような変形を含み、また、本発明のｌａ
囲は特許請求の範囲によってのみ制限される。
ラズマの種を例として本発明の詳細な説明したが、多く
の変形が可能であることは当業者には明らかでる。本発
明の範囲はそのような変形を含み、また、本発明のｌａ
囲は特許請求の範囲によってのみ制限される。
第１図はスロット プロット展開を示す。
Claims (19)
- （１）原核生物に由来する核酸には存在するが、真核生
物に由来する核酸には存在しない特定のヌクレオチド塩
基配列を含む核酸を含有する原核生物の存在を決定する
ための方法であつて、 該原核生物に由来し、上記の特定のヌクレオチド塩基配
列を含む核酸または核酸断片を含有するかもしれない媒
質を、上記の特定のヌクレオチド塩基配列に対して相補
的なヌクレオチド塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと
接触させ、 それにより、該オリゴヌクレオチドを、該媒質中に存在
するかもしれない上記の特定のヌクレオチド塩基配列を
含む該原核生物に由来する核酸または核酸断片とハイブ
リダイゼーションさせ、かつ、 該オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションした任
意の核酸または核酸断片の存在を検出すること を包含する方法。 - （２）該原核生物がモリカテス綱の種であり、上記の特
定のヌクレオチド塩基配列がモリカテス綱の種に由来す
る原核生物の核酸にのみ存在する特許請求の範囲第１項
記載の方法。 - （３）該原核生物がマイコプラズマ属の種であり、上記
の特定のヌクレオチド塩基配列がマイコプラズマ属の種
に由来する原核生物の核酸にのみ存在する特許請求の範
囲第１項記載の方法。 - （４）該原核生物がマイコプラズマ カプリコランであ
り、上記の特定のヌクレオチド塩基配列がマイコプラズ
マ カプリコランに由来する原核生物の核酸にのみ存在
する特許請求の範囲第１項記載の方法。 - （５）該原核生物がマイコプラズマ種ＰＧ５０であり、
上記の特定のヌクレオチド塩基配列がマイコプラズマ種
ＰＧ５０に由来する原核生物の核酸にのみ存在する特許
請求の範囲第１項記載の方法。 - （６）該原核生物が肺炎マイコプラズマであり、上記の
特定のヌクレオチド塩基配列が肺炎マイコプラズマに由
来する原核生物の核酸にのみ存在する特許請求の範囲第
１項記載の方法。 - （７）該原核生物がマイコプラズマの種であり、上記の
特定のヌクレオチド塩基配列がこのマイコプラズマの種
に由来する原核生物の核酸にのみ存在する特許請求の範
囲第１項記載の方法。 - （８）該原核生物がウレアプラズマの種であり、上記の
特定のヌクレオチド塩基配列がこのウレアプラズマの種
に由来する原核生物の核酸にのみ存在する特許請求の範
囲第１項記載の方法。 - （９）該原核生物がスピロプラズマの種であり、上記の
特定のヌクレオチド塩基配列がこのスピロプラズマの種
に由来する原核生物の核酸にのみ存在する特許請求の範
囲第１項記載の方法。 - （１０）該原核生物がアコレプラズマの種であり、上記
の特定のヌクレオチド塩基配列がこのアコレプラズマの
種に由来する原核生物の核酸にのみ存在する特許請求の
範囲第１項記載の方法。 - （１１）該原核生物が細菌性の種であり、上記の特定の
ヌクレオチド塩基配列がこの細菌性の種に由来する原核
生物の核酸にのみ存在する特許請求の範囲第１項記載の
方法。 - （１２）上記の特定のヌクレオチド塩基配列を含む上記
の核酸断片が１６ＳＲＮＡ遺伝子である特許請求の範囲
第１項記載の方法。 - （１３）上記の特定のヌクレオチド塩基配列を含む上記
の核酸断片が２３ＳＲＮＡ遺伝子である特許請求の範囲
第１項記載の方法。 - （１４）上記の特定のヌクレオチド塩基配列を含む上記
の核酸断片が５ＳＲＮＡ遺伝子である特許請求の範囲第
１項記載の方法。 - （１５）上記の特定のヌクレオチド塩基配列が、Ｔはチ
ミン、Ｇはグアニン、Ａはアデニン、ｃはシトシンを表
わすとき、ＡＡＣＡＧＧＴＡＴＣ、ＧＧＧＴＣＴ）およ
び、ＴＡＧＡＴＡＴＡＴＧから成る一部から選ばれたも
のであり、かつ、塩基配列におけるヌクレオチドの欠如
を示すモリカテス綱の任意の原核生物を検出するために
有効な特許請求の範囲第１項記載の方法。 - （１６）上記の特定のヌクレオチド塩基配列が、ＡＣＧ
ＧＧＴＧＡＧＴ、ＴＡＡＴＡＣＣＧＣＡＴ）ＴＣＧＴＡ
ＡＣＡＡＧＧＴＡ、および、ＴＧＧＡＴＣＡＣＣＴＣＣ
ＴＴから成る一部から選ばれたものである任意の原核生
物を検出するために有効な特許請求の範囲第１項記載の
方法。 - （１７）ＧＣＴＴＡＧＴＣＧＡＴＡＣＡＧＣのヌクレオ
チド塩基配列を含有するデオキシオリゴヌクレオチド。 - （１８）ＣＧＡＡＵＣＡＧＣＵＡＵＧＵＣＧのヌクレオ
チド塩基配列を含有するデオキシオリゴヌクレオチド。 - （１９）マイコプラズマに対して特異的な試験手段また
は一般の原核生物に対して特異的な試験手段として有効
な特定のヌクレオチド塩基配列の同定のための方法であ
つて、 ａ、マイコプラズマの特定の種のリボゾームＲＮＡまた
はその一部の完全なオペロンをバクテリオファージまた
はプラスミドのベクタ中にクローニングする工程、 ｂ、生成のリボゾームＲＮＡ遺伝子断片を、マイコプラ
ズマでない原核生物のリボゾームＲＮＡオペロンまたは
その断片を用いて試験する工程、ｃ、上記のマイコプラ
ズマでない原核生物のリボソームＲＮＡオペロンとハイ
ブリダイゼーションする断片を特性づける工程、 ｄ、差をつけたハイブリダイゼーションにより、マイコ
プラズマに特異的な断片を同定する工程、 ｅ、マイコプラズマに特異的な断片を、塩基配列しつつ
あるプラスミド中にサブクローニングする工程、 ｆ、生成のサブクローニングしたマイコプラズマに特異
的な断片を塩基配列させる工程、ｇ、モリカテス綱の他
のものおよびマイコプラズマでない原核生物に対して、
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅおよびｆの工程を繰り返す工程、お
よび、れ、ｆおよびｇの工程で得た塩基配列を比較する
工程 の各工程を包含し、 これにより、マイコプラズマの全ての種に共通でありマ
イコプラズマでない原核生物の対応する塩基配列とは異
なる塩基配列が、マイコプラズマに特異的な試験手段と
して有効であり、マイコプラズマの全ての種並びにマイ
コプラズマでない原核生物に共通である塩基配列が、一
般の原核生物に特異的な試験手段として有効であり、か
つ、マイコプラズマ、ウレアプラズマ、アコレプラズマ
またはスピロプラズマの与えられた種に特異的な塩基配
列、および、ユーバクテリウムの与えられた種に特異的
な塩基配列が、マイコプラズマ、ウレアプラズマ、アコ
レプラズマ、スピロプラズマまたはユーバクテリウムの
個々の種に対して特異的な試験手段として有効であるよ
うな 上記の特定なヌクレオチド塩基配列の同定の方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61151849A JP2870693B2 (ja) | 1986-06-30 | 1986-06-30 | オリゴヌクレオチドプローブ及びそれを用いて原核生物の存在を決定するための方法 |
| JP32134498A JPH11225761A (ja) | 1986-06-30 | 1998-10-26 | オリゴヌクレオチドプローブ及びそれを用いて原核生物の存在を決定するための方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61151849A JP2870693B2 (ja) | 1986-06-30 | 1986-06-30 | オリゴヌクレオチドプローブ及びそれを用いて原核生物の存在を決定するための方法 |
Related Child Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8255417A Division JP2796278B2 (ja) | 1996-09-05 | 1996-09-05 | オリゴヌクレオチドプローブ及びそれを用いて原核生物の存在を決定するための方法 |
| JP32134498A Division JPH11225761A (ja) | 1986-06-30 | 1998-10-26 | オリゴヌクレオチドプローブ及びそれを用いて原核生物の存在を決定するための方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS637800A true JPS637800A (ja) | 1988-01-13 |
| JP2870693B2 JP2870693B2 (ja) | 1999-03-17 |
Family
ID=15527613
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61151849A Expired - Lifetime JP2870693B2 (ja) | 1986-06-30 | 1986-06-30 | オリゴヌクレオチドプローブ及びそれを用いて原核生物の存在を決定するための方法 |
| JP32134498A Pending JPH11225761A (ja) | 1986-06-30 | 1998-10-26 | オリゴヌクレオチドプローブ及びそれを用いて原核生物の存在を決定するための方法 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP32134498A Pending JPH11225761A (ja) | 1986-06-30 | 1998-10-26 | オリゴヌクレオチドプローブ及びそれを用いて原核生物の存在を決定するための方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (2) | JP2870693B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03502963A (ja) * | 1987-12-11 | 1991-07-04 | イノビウス，アラン | 燃焼ガス中の窒素酸化物と硫黄酸化物の含有量を減少させる反応装置 |
| JP2000505305A (ja) * | 1996-02-28 | 2000-05-09 | アクゾ・ノベル・エヌ・ベー | マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の増幅、検出および型別のためのプライマーおよびプローブ |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60501339A (ja) * | 1983-01-10 | 1985-08-22 | ジエン−プロ−ブ インコ−ポレィテッド | 生物を検出、同定又は定量する方法およびキット |
-
1986
- 1986-06-30 JP JP61151849A patent/JP2870693B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-10-26 JP JP32134498A patent/JPH11225761A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60501339A (ja) * | 1983-01-10 | 1985-08-22 | ジエン−プロ−ブ インコ−ポレィテッド | 生物を検出、同定又は定量する方法およびキット |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03502963A (ja) * | 1987-12-11 | 1991-07-04 | イノビウス，アラン | 燃焼ガス中の窒素酸化物と硫黄酸化物の含有量を減少させる反応装置 |
| JP2000505305A (ja) * | 1996-02-28 | 2000-05-09 | アクゾ・ノベル・エヌ・ベー | マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の増幅、検出および型別のためのプライマーおよびプローブ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH11225761A (ja) | 1999-08-24 |
| JP2870693B2 (ja) | 1999-03-17 |
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