JP2796278B2 - オリゴヌクレオチドプローブ及びそれを用いて原核生物の存在を決定するための方法 - Google Patents
オリゴヌクレオチドプローブ及びそれを用いて原核生物の存在を決定するための方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、一般に生物学の分
野に関し、特に生物医学、生化学及び分子生物学に関す
る。 【０００２】 【従来の技術】マイコプラズマ（mycoplasma）は、形が
小さく細胞壁を持たないことを特徴とするモリカテス
（Mollicutes）網の一群の病原性の微生物である。これ
らの微生物は独立して生存できる最小の既知の微生物の
一つであり、ヒト、植物及び動物における重要な病原体
である。例えば、非定形の肺炎及び非淋菌性の尿道炎
は、ヒトにおける一般的なマイコプラズマ感染である。
マイコプラズマはまた、リウマチ様の関節炎、自然流
産、不妊症及び他の生殖器（genital tract ）の疾病、
及びある種の自己免疫疾病状態にも関係する。さらにマ
イコプラズマは、細胞培養での一般的な夾雑物である。
生物学的研究では、組織培養のマイコプラズマ汚染は深
刻な問題で、不断のモニタ監視を必要とする。 【０００３】これらの生物は極端に培養条件が面倒で、
現在のところマイコプラズマに感染していることを診断
する費用に見合う特定の方法がないことは驚くべきこと
ではない。臨床試料中のマイコプラズマを検出する最も
普通に使用される方法は、血清学的なものと培養的なも
のとがある。血清学的方法は、誤って陽と判断し易く、
培養的方法は、高価で時間がかかり退屈である。細胞培
養中の微生物の汚染を検出するために現在使用されてい
る生化学的技術の多くは、マイコプラズマを特異的に検
出するのではなく、原核生物又は酵母や菌類等の単純な
真核生物の存在を示し、ビールスを検出するものさえあ
る。そのような試験は、微生物の存在を知ることのみに
関心がある場合には有利であるが、動物又はヒトの疾病
の疑わしい病因の物質を捜す場合においては、この物質
を可能な限り分類することが必要であるので、必ずしも
十分とは言えない。 【０００４】さらに、上記方法は、特殊な問題により制
約される。例えば、明らかに、通常の培養法で検出され
ない「培養できない（non-cultivable）」マイコプラズ
マがある。加えて、免疫蛍光試験の場合には、９種の異
なるマイコプラズマの種が共通の組織培養夾雑物である
ため、１以上の抗体が特定の生物の同定に必要となるこ
とが考えられる。また、ＤＮＡ染色は必ずしもマイコプ
ラズマに特異的とは限らない。 【０００５】 【発明が解決しようとする課題】そこで、簡単で、高感
度で、特異的で、費用に見合い、かつ迅速なマイコプラ
ズマ検出系が、診断医学及び生物学的研究の分野で切実
に望まれてきた。 【０００６】ヌクレオチド塩基配列相同性及び核酸ハイ
ブリダイゼーション動力学の使用は、細胞及び細胞培養
中の種々の生物を検出するために広く使用される技術と
なった。しかし、本発明以前にはマイコプラズマ検出の
ための信頼できる特異的なＤＮＡプローブ（probe）は
利用可能でなかった。 【０００７】 【課題を解決するための手段】前記課題を解決すための
手段は、以下の通りである。 （１） マイコプラズマｒＲＮＡをコードする遺伝子よ
りも短く、３’ＧＣＴＴＡＧＴＣＧＡＴＡＣＡＧＣ
５’、５’ＣＧＡＡＵＣＡＧＣＵＡＵＧＵＣＧ３’及び
これらに相補的な核酸配列から選択されるオリゴヌクレ
オチドプローブである。 （２） 原核生物には存在するが真核生物には存在しな
いヌクレオチド塩基配列を含む原核生物の存在を決定す
るための方法であって、試料を、前記ヌクレオチド塩基
配列に特異的にハイブリダイゼーションし得るオリゴヌ
クレオチドプローブと接触させ、前記オリゴヌクレオチ
ドプローブを、前記試料中に存在する核酸とハイブリダ
イゼーションさせ、前記オリゴヌクレオチドプローブと
ハイブリダイゼーションした核酸により、前記ヌクレオ
チド塩基配列を含む原核生物の存在を検出することを含
み、前記オリゴヌクレオチドプローブが、マイコプラズ
マｒＲＮＡをコードする遺伝子よりも短く、３’ＧＣＴ
ＴＡＧＴＣＧＡＴＡＣＡＧＣ５’、５’ＣＧＡＡＵＣＡ
ＧＣＵＡＵＧＵＣＧ３’及びこれらに相補的な核酸配列
から選択されるオリゴヌクレオチドプローブであること
を特徴とする方法。 （３） 前記原核生物がモリカテス綱の種（species of
the Class Mollicutes）であり、前記ヌクレオチド塩
基配列がモリカテス綱の種に由来する原核生物の核酸に
のみ存在する（２）に記載の方法である。 （４） 前記モリカテス綱の種がマイコプラズマ属の種
（species ofthe genusMycoplasma）であり、前記ヌク
レオチド塩基配列がマイコプラズマ属の種に由来する原
核生物の核酸にのみ存在する（３）に記載の方法であ
る。 （５） 前記マイコプラズマ属の種がマイコプラズマ
カプリコラン（Mycoplasma capricolun ）であり、前記
ヌクレオチド塩基配列がマイコプラズマ カプリコラン
に由来する原核生物の核酸にのみ存在する（４）に記載
の方法である。 （６） 前記マイコプラズマ属の種がマイコプラズマ
スピーシーズ ＰＧ５０（Mycoplasma species PG50 ）
であり、前記ヌクレオチド塩基配列がマイコプラズマ
スピーシーズ ＰＧ５０に由来する原核生物の核酸にの
み存在する（４）に記載の方法である。 （７） 前記マイコプラズマ属の種が肺炎マイコプラズ
マ（Mycoplasma pneumoniae ）であり、前記ヌクレオ
チド塩基配列が肺炎マイコプラズマに由来する原核生物
の核酸にのみ存在する（４）に記載の方法である。 （８） 前記モリカテス綱の種がウレアプラズマの種で
あり、前記ヌクレオチド塩基配列がウレアプラズマの種
に由来する原核生物の核酸にのみ存在する（３）に記載
の方法である。 （９） 前記モリカテス綱の種がスピロプラズマの種で
あり、前記ヌクレオチド塩基配列がスピロプラズマの種
に由来する原核生物の核酸にのみ存在する（３）に記載
の方法である。 （１０） 前記モリカテス綱の種がアコレプラズマの種
であり、前記ヌクレオチド塩基配列がアコレプラズマの
種に由来する原核生物の核酸にのみ存在する（３）に記
載の方法である。 【０００８】 【発明の実施の形態】本発明は、放射線同位元素標識、
ビオチン標識、ＰＥＩ−ペルオキシダーゼ接合又は蛍光
抗体標識ＥＬＩＳＡ法等の多様な技術で標識された（la
beled or tagged）特異的なマイコプラズマのリボゾー
ムＲＮＡ遺伝子断片を、ＤＮＡ又はＲＮＡハイブリダイ
ゼーションにより臨床試料、細胞又は細胞培養中のマイ
コプラズマを特異的にかつ高感度に検出するために、使
用することにより行われる。 【０００９】一つの観点では、本発明は、マイコプラズ
マの１６Ｓ ＲＮＡ遺伝子に相補的なヌクレオチド塩基
配列を提供するものであり、このヌクレオチド塩基配列
は、マイコプラズマのリボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）に
対するコードであって、ＡＡＣＡＣＧＴＡＴＣ、ＣＧＡ
ＡＴＣＡＧＣＴＡＴＧＴＣＧ、ＧＡＧＧＴＴ−ＡＡＣ、
ＡＴＣＣＧＧＡＴＴＴＡＴＴ、ＴＣＴＣＡＧＴＴＣＧＧ
ＡＴＴＧＡ、ＡＧＧＴＧＧＴＧＣＡＴＧＧＴＴＧ、ＴＣ
ＣＴＧＧＣＴＣＡＧＧＡＴ、ＡＴＡＣＡＴＡＧＧＴ、Ａ
ＡＣＴＡＴＧＴＧＣ、ＡＡＴＴＴＴＴＣＡＣＡＡＴＧ及
びＴＣＴＣＧＧＧＴＣＴからなる一群から選択されたヌ
クレオチド塩基配列を含む。 【００１０】なお、このヌクレオチド塩基配列では、Ｔ
がチミン、Ｇがグアニン、Ａがアデニン、Ｃがシトシ
ン、−が大腸菌( E .coli ) 内の対照となるヌクレオチ
ド塩基配列に比較した場合のヌクレオチドの欠損を表
す。これらの断片は、大腸菌の１６Ｓ ＲＮＡ遺伝子と
有意で異なり、上記のものに対して相補的な標識したヌ
クレオチド塩基配列で構成されるマイコプラズマに特異
的なプローブの基本部分を構成する。 【００１１】他の観点では、本発明は、原核生物のｒＲ
ＮＡに対するコードであって、ＡＣＧＧＧＴＧＡＧＴ、
ＴＡＡＴＡＣＣＧＣＡＴ、ＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣ
ＡＧＴ、ＧＴＧＧＧＧＡＧＣＡＡＡ、ＡＧＧＡＴＴＡＧ
ＡＴＡＣＣＣＴ、ＣＣＧＴＡＡＡＣＧＡＴ、ＧＡＡＴＴ
ＧＡＣＧＧＧＧ、ＣＣＣＧＣＡＣＡＡＧ、ＧＧＴＧＧＡ
ＧＣＡＴＧＴ、ＴＧＴＴＧＧＧＴＴＡＡＧＴＣＣＣＧＣ
ＡＡＣＧＡ、ＧＧＧＡＴＧＡＣＧＴ、ＡＣＧＴＧＣＴＡ
ＣＡＡＴＧ、ＣＴＡＧＴＡＡＴＣＧ、ＴＧＴＡＣＡＣＡ
ＣＣＧＣＣＣＧＴＣＡ、ＡＡＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡＧＧ
ＴＡ及びＴＧＧＡＴＣＡＣＣＴＣＣＴＴからなる−群か
ら選ばれたヌクレオチド塩基配列を含む１６Ｓ ＲＮＡ
遺伝子の同定されたＤＮＡ塩素配列を提供する。 【００１２】これらの断片は、大腸菌及び試験した全て
のマイコプラズマに対して共通の１６Ｓ ＲＮＡ遺伝子
中の領域を表わす。全ての原核生物に対して普遍的なプ
ローブは、これらの断片に対して相補的な標識したヌク
レオチド塩基配列で構成される。 【００１３】一般に本発明は、原核生物由来の核酸に存
在し真核生物由来の核酸には存在しない特定のヌクレオ
チド塩基配列を含む核酸を含有する原核生物の存在を決
定するための方法であって、この方法が、この原核生物
由来でありこの特定のヌクレオチド塩基配列を含む核酸
又は核酸断片を含有するかもしれない媒質を、この特定
のヌクレオチド塩基配列に対して相補的なヌクレオチド
塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと接触させ、それに
より、このオリゴヌクレオチドを、この媒質中に存在す
るかもしれないこの特定のヌクレオチド塩基配列を含む
この原核生物由来の核酸又は核酸断片とハイブリダイゼ
ーションさせ、このオリゴヌクレオチドとハイブリダイ
ゼーションした核酸又は核酸断片の存在を検出すること
で行われる方法を包含する。 【００１４】他の観点では、本発明は、一般にマイコプ
ラズマ又は原核生物の検出に使用される特異的な生物学
的プローブに関与し、これは上記の方法及びそのような
プローブの同定と生産によっている。 【００１５】 【実施例】先ず本発明の生物学的プローブの生産及び使
用を含む特定の工程を詳述し、それから本発明で有効な
特定のヌクレオチド塩基配列がどのようにして決定され
るかを記述することにより、本発明を説明する。 −デオキシオリゴヌクレオチドの合成− 上に掲げた１６Ｓ マイコプラズマ ＲＮＡ遺伝子塩基
配列の一つに対して相補的である１６ｂｐデオキシオリ
ゴヌクレオチド、３’ＧＣＴＴＡＧＴＣＧＡＴＡＣＡＧ
Ｃ５’は、ここに参照として挿入する文献（M.H.Caruth
ers et al.,Gonetic Engineering,Vol.4,p.1-17,Plenum
Publishing Co.(1982) ）に記述されたリン酸三エステ
ル固相法で合成された。これまでに記述した他のデオキ
シオリゴヌクレオチド又は他の望ましいオリゴヌクレオ
チドも同様に合成される。例えば、ＤＮＡプローブの代
わりに、５’ＣＧＡＡＵＣＡＧＣＵＡＵＧＵＣＧ３’の
塩基配列を含む組換体ＳＰ６ベクタ転写体等のＲＮＡプ
ローブを合成することも望ましいだろう。 【００１６】リボゾームＲＮＡ分子に対するＤＮＡ−Ｒ
ＮＡ又はＲＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションは、オ
リゴヌクレオチドプローブをゲノム（genome）のＤＮＡ
塩基配列に対して用いるＤＮＡ−ＤＮＡ又はＲＮＡ−Ｄ
ＮＡハイブリダイゼーションより、検出の感度を数百倍
高める。これは、そのようなオリゴヌクレオチドプロー
ブを使用すると、マイコプラズマ又はユーバクテリウム
の（eubacterial）細胞当たりのリボゾームＲＮＡの多
数の複製が検出されるからである。 −デオキシオリゴヌクレオチドの試験− 上記のデオキシオリゴヌクレオチドは、ここに参照とし
て挿入される文献（C.C.Richardson,Procedure in Nucl
eic Acid Research (Cantoni,G.L.and Davies,D.R.,ed
s.),Vol.2,pp.815-828,Harper and Row,New York(197
1)）の方法を用いて５’末端を3 2 Ｐ標識された。生成
の標識したデオキシオリゴヌクレオチドは、その後マイ
コプラズマに特異的なオリゴヌクレオチドプローブとし
て使用された。 【００１７】マイコプラズマに対する特異性は、ここに
参照として挿入される文献（M.Cunningham,Anal.Bioche
m.128:415-421(1983) ）に記述されるスロット・ブロッ
ト（slot blot）ハイブリダイゼーションによって証明
された。この目的のためにｐＵＣ８中にクローニングさ
れた肺炎マイコプラズマ（Mycoplasma pneumoniae ）の
１６００ｂｐＤＮＡ断片が使用された。１６００ｂｐ断
面は、上記の１６塩基のデオキシオリゴヌクレオチドを
含む。代表的な原核生物のユーバクテリウム（eubacter
ium ）である大腸菌のゲノム消化物は、酵素Ｈｉｎｄ I
IIを用いる消化により生産された。消化された大腸菌Ｄ
ＮＡ及び１６００ｂｐ肺炎マイコプラズマＤＮＡ断片
は、ここに参照として挿入される文献（J.J.Leary et a
l.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:4045-4049(1983)）の
方法によりニトロセルロースフィルタ上に移された。Ｄ
ＮＡ断片を含有するニトロセルロースフィルタは、減圧
下８０℃で２時間熱され、3 2 Ｐ標識したデオキシオリ
ゴヌクレオチドに対してハイブリダイゼーションされ
た。図面に示すように生成のスロット ブロットを展開
して、０．０００３４ｎｇ、０．００３４ｎｇ、０．０
３４ｎｇ、０．３４ｎｇ、３．４ｎｇ（１６ｂｐに対し
て計算）の肺炎マイコプラズマＤＮＡ断片に対して高い
強度のブロットがあり、０．０００１５μｇ、０．００
１５μｇ、０．０１５μｇ、０．１５μｇ、１．５μｇ
の大腸菌ＤＮＡ断片に対してはブロットがないことが明
らかになり、デオキシオリゴヌクレオチドプローブのマ
イコプラズマに対する特異性が示された。 【００１８】３’ＧＣＴＴＡＧＴＣＧＡＴＡＣＡＧＣ
５’の塩基配列を有するデオキシオリゴヌクレオチド
は、このようにマイコプラズマのＤＮＡとハイブリダイ
ゼーションし、他の原核生物のＤＮＡとはハイブリダイ
ゼーションしないマイコプラズマに特異的なオリゴヌク
レオチドプローブとして有効である。 【００１９】他方、例えば、原核生物のコードである遺
伝子塩基配列の一つに対して相補的であるＴＧＣＣＣＡ
ＣＴＣＡの塩基配列を有するデオキシオリゴヌクレオチ
ドは、原核生物とハイブリダイゼーションし真核生物と
はハイブリダイゼーションしない原核生物に特異的なオ
リゴヌクレオチドプローブとして有効である。 【００２０】感染した細胞中のマイコプラズマの検出に
対しては、次の方法が有効であることが見出された。細
胞は１−２Ｔ７５組織培養フラスコを使用し、トリプシ
ンＥＤＴＡ（ＰＢＳ中０．０５％トリプシン、０．０４
％ＥＤＴＡ）を用いて３７℃で２分間トリプシン処理さ
れた。トリプシン処理した細胞は１−２mlの成長媒質中
に再懸濁され、ミニフォルド II （Minifold II）スロ
ットブロット ハイブリダイゼーション装置（Schleich
er and Schuell,inc.,Keene,N.H.）を使用して１０×Ｓ
ＳＣで（１×ＳＳＣは１５ｍＭクエン酸Ｎａ、１５０ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で湿らせたニトロセルロー
ス膜上に５０−１００μｌ（１×１０5−１×１０6 の
細胞）の量をスポットされた。スロット・ブロットに適
用されたＤＮＡ試料はアルカリ（０．５Ｍ ＮａＯＨ、
１．５Ｍ ＮａＣｌ）を用いて室温で５−１０分間変成
され、０．５Ｍトリス、ｐＨ７．２及び３．０Ｍ Ｎａ
Ｃｌを用いて室温で５−１０分間中和された。フィルタ
は、その後室温で２×ＳＳＣで５分間洗浄され、真空炉
（vacuum oven）中８０℃で２時間熱された。フィルタ
は、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭトリス、ｐＨ７．
５、５×デンハーズ（Denhardt）及び１００μｇ／ｍｌ
の熱変成した疎精子ＤＮＡからなる前ハイブリダイゼー
ション緩衝液を使用して６５℃で２時間、前ハイブリダ
イゼーションされた。１０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１
ｍＭ ＥＤＴＡ、０．７５Ｍ ＮａＣｌ、１×デンハー
ズ、０．５％ＳＤＳ、１０％硫酸デキストラン及び１０
０μｇ／ｍｌの熱変成した疎精子ＤＮＡからなるハイブ
リダイゼーション緩衝液中、3 2Ｐ標識したデオキシオ
リゴヌクレオチドの１〜２×１０6 cpm、比活性１０8 c
pm／μｇ以上、として測定される濃度の本発明の試験手
段を使用して、ハイブリダイゼーションが６５℃で１６
時間行われた。 【００２１】ハイブリダイゼーションの後、フィルタ
は、２×ＳＥＴ、０．２％ＳＤＳ（１×ＳＥＴは３０ｍ
Ｍトリス、ｐｈ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）を用い
て６５℃で２〜４時間、及び４ｍＭトリス塩基を用いて
室温で１〜２時間洗浄された。フィルタはその後乾燥さ
れ、１個又は２個のデュポンクロネックス（Dupont Cro
nex）強化スクリーンを用いてＸ線膜上にさらされた。 −特定のヌクレオチド塩基配列の決定− 特定のヌクレオチド塩基配列がどのようにして製造さ
れ、かつ、使用されるかを前述したが、次に、本発明の
広い範囲を理解するため、マイコプラズマに特異的なオ
リゴヌクレオチドプローブ、一般の原核生物に特異的な
オリゴヌクレオチドプローブ、マイコプラズマ、ウレア
プラズマ（ureaplasma）アコレプラズマ（acholeplasm
a）及びスピロプラズマ（spiroplasma ）の個々の種に
特異的なオリゴヌクレオチドプローブ、又は、ユーバク
テリウムの個々の種に特異的なプローブとして有効な、
特定のヌクレオチド塩基配列を決定するために使用され
る技術の試験について説明する。 【００２２】そのような決定は、次の工程で行われる。 １． マイコプラズマの特定の種のリボゾームＲＮＡの
完全なゲノムをバクテリオファージ又はプラスミドのベ
クタ中にクローニングする工程、 ２． 生成のリボゾームＲＮＡ遺伝子断片を、マイコプ
ラズマでない原核生物のリボゾームＲＮＡオペロンを用
いて試験する工程、 ３． このマイコプラズマでない原核生物のリボゾーム
ＲＮＡオペロンとハイブリダイゼーションする断片を特
性づける工程、 ４． ここに参照として挿入する文献（Gobel,U.and St
anbridge ,E.J.,Science,Vol.226,pp.1211-1213(1984)
）に記述される差をつけた（differential）ハイブリ
ダイゼーションによりマイコプラズマに特異的な断片を
同定する工程、 ５． マイコプラズマに特異的な断片を、塩基配列しつ
つあるプラスミド中にサブクローニングする工程、 ６． 生成のサブクローニングしたマイコプラズマに特
異的な断片を塩基配列させる工程、 ７． マイコプラズマの他の種及びマイコプラズマでな
い原核生物に対して、１〜６の工程を繰り返す工程、並
びに、 ８． ６及び７の工程で得た塩基配列を比較する工程。
これにより、マイコプラズマの全ての種に共通でありマ
イコプラズマでない原核生物の対応する塩基配列とは異
なる塩基配列は、マイコプラズマに特異的なオリゴヌク
レオチドプローブとして有効であり、マイコプラズマの
全ての種並びにマイコプラズマでない原核生物に共通で
ある塩基配列は、一般の原核生物に特異的なオリゴヌク
レオチドプローブとして有効であり、かつ、マイコプラ
ズマ、アコレプラズマ、ウレアプラズマ又はスピロプラ
ズマの特性の種のいずれかに特異的な塩基配列、及び任
意の与えられたユーバクテリウムの種に特異的な塩基配
列は、マイコプラズマ、アコレプラズマ、ウレアプラズ
マ又はスピロプラズマの個々の種に対してそれぞれ特異
的なオリゴヌクレオチドプローブとして有効である。 【００２３】肺炎マイコプラズマのリボゾームＲＮＡゲ
ノムのクローニングは、肺炎マイコプラズマの全ＤＮＡ
のＨｉｎｄ III消化、及び、このＨｉｎｄ III断片のＨ
ｉｎｄ IIIで消化したベクタｐＵＣ８へ連結により達成
された。生成のリボゾームＲＮＡの遺伝子の断片は、こ
こに参照として挿入される文献（Gobel et al., Scienc
e,226:1211-1213(1984) ）の方法により、ｐＫＫ３５３
５プラスミド中の大腸菌のリボゾームＲＮＡオペロンを
用いて試験され、リボゾーム塩基配列を含むクローニン
グした断片を同定された。 【００２４】厳密なハイブリダイゼーション条件下でマ
イコプラズマの種に対してハイブリダイゼーションし、
大腸菌又は哺乳類のＤＮＡに対してはハイブリダイゼー
ションしないことを基礎として、１６００ｂｐ断片が選
ばれた。この１６００ｂｐ断面はＨｉｎｄ III消化によ
りｐＵＣ８ペクタから除かれ、ここに参照として挿入す
る文献（Sanger et al.,Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.
A.,74:5463-5467(1977)）に記述されるサンガージデオ
キシ法を用いて、塩基配列させるためにＭ１３Ｍｐ８Ｄ
ＮＡ細菌ウィルスへ連結された。 【００２５】肺炎マイコプラズマ、マイコプラズマ カ
プリコラン（M.capricolum）及びマイコプラズマ種ＰＧ
５０（Mycoplasma species ＰＧ５０）と大腸菌との塩
基配列を比較することにより、ある塩基配列がマイコプ
ラズマのこれらの総ての種に対して共通であって大腸菌
に対しては異なることが示された。これらの塩基配列は
合成され、標識されてマイコプラズマに対して特異的な
オリゴヌクレオチドプローブとして使用される。例え
ば、３’ＧＣＴＴＡＧＴＣＧＡＴＡＣＡＧＣ５’は、マ
イコプラズマに特異的なオリゴヌクレオチドプローブを
構成した。他の塩基配列は、マイコプラズマのこれらの
種並びに大腸菌に対して共通であった。これらの後者の
塩基配列は合成され、標識されて全ての原核生物に対し
て特異的なオリゴヌクレオチドプローブとして使用され
る。更に、他の塩基配列は一つのマイコプラズマ種に特
有であって、合成され、標識されてマイコプラズマの種
に対して特異的なオリゴヌクレオチドプローブとして使
用される。 【００２６】本発明はこのように、汚染された細胞培養
又は他の生物学的環境中のマイコプラズマを検出する特
異的で高感度の迅速な方法を提供する。また、本発明
は、全ての原核生物に保持されている領域から誘導され
たリボゾームＤＮＡプローブを提供することができる。
このようなプローブは、ヒト又は動物の菌血症又は敗血
症の迅速で高感度の診断において非常に有効であろう。 【００２７】本発明は、マイコプラズマ、アコレプラズ
マ、ウレアプラズマ、スピロプラズマ及びユーバクテリ
ウムの個々の種に対してそれぞれに特異的なリボゾーム
ＤＮＡプローブを提供することもできる。これらのプロ
ーブは、遺伝子構成がほとんど又は全く知られていない
これらの生物に対して特に有効であろう。 【００２８】ある特定のデオキシオリゴヌクレオチド及
びマイコプラズマの種を例として本発明を詳細に説明し
たが、多くの変形が可能であることは当業者には明らか
である。本発明の範囲はそのような変形を含み、また、
本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ制限され
る。
野に関し、特に生物医学、生化学及び分子生物学に関す
る。 【０００２】 【従来の技術】マイコプラズマ（mycoplasma）は、形が
小さく細胞壁を持たないことを特徴とするモリカテス
（Mollicutes）網の一群の病原性の微生物である。これ
らの微生物は独立して生存できる最小の既知の微生物の
一つであり、ヒト、植物及び動物における重要な病原体
である。例えば、非定形の肺炎及び非淋菌性の尿道炎
は、ヒトにおける一般的なマイコプラズマ感染である。
マイコプラズマはまた、リウマチ様の関節炎、自然流
産、不妊症及び他の生殖器（genital tract ）の疾病、
及びある種の自己免疫疾病状態にも関係する。さらにマ
イコプラズマは、細胞培養での一般的な夾雑物である。
生物学的研究では、組織培養のマイコプラズマ汚染は深
刻な問題で、不断のモニタ監視を必要とする。 【０００３】これらの生物は極端に培養条件が面倒で、
現在のところマイコプラズマに感染していることを診断
する費用に見合う特定の方法がないことは驚くべきこと
ではない。臨床試料中のマイコプラズマを検出する最も
普通に使用される方法は、血清学的なものと培養的なも
のとがある。血清学的方法は、誤って陽と判断し易く、
培養的方法は、高価で時間がかかり退屈である。細胞培
養中の微生物の汚染を検出するために現在使用されてい
る生化学的技術の多くは、マイコプラズマを特異的に検
出するのではなく、原核生物又は酵母や菌類等の単純な
真核生物の存在を示し、ビールスを検出するものさえあ
る。そのような試験は、微生物の存在を知ることのみに
関心がある場合には有利であるが、動物又はヒトの疾病
の疑わしい病因の物質を捜す場合においては、この物質
を可能な限り分類することが必要であるので、必ずしも
十分とは言えない。 【０００４】さらに、上記方法は、特殊な問題により制
約される。例えば、明らかに、通常の培養法で検出され
ない「培養できない（non-cultivable）」マイコプラズ
マがある。加えて、免疫蛍光試験の場合には、９種の異
なるマイコプラズマの種が共通の組織培養夾雑物である
ため、１以上の抗体が特定の生物の同定に必要となるこ
とが考えられる。また、ＤＮＡ染色は必ずしもマイコプ
ラズマに特異的とは限らない。 【０００５】 【発明が解決しようとする課題】そこで、簡単で、高感
度で、特異的で、費用に見合い、かつ迅速なマイコプラ
ズマ検出系が、診断医学及び生物学的研究の分野で切実
に望まれてきた。 【０００６】ヌクレオチド塩基配列相同性及び核酸ハイ
ブリダイゼーション動力学の使用は、細胞及び細胞培養
中の種々の生物を検出するために広く使用される技術と
なった。しかし、本発明以前にはマイコプラズマ検出の
ための信頼できる特異的なＤＮＡプローブ（probe）は
利用可能でなかった。 【０００７】 【課題を解決するための手段】前記課題を解決すための
手段は、以下の通りである。 （１） マイコプラズマｒＲＮＡをコードする遺伝子よ
りも短く、３’ＧＣＴＴＡＧＴＣＧＡＴＡＣＡＧＣ
５’、５’ＣＧＡＡＵＣＡＧＣＵＡＵＧＵＣＧ３’及び
これらに相補的な核酸配列から選択されるオリゴヌクレ
オチドプローブである。 （２） 原核生物には存在するが真核生物には存在しな
いヌクレオチド塩基配列を含む原核生物の存在を決定す
るための方法であって、試料を、前記ヌクレオチド塩基
配列に特異的にハイブリダイゼーションし得るオリゴヌ
クレオチドプローブと接触させ、前記オリゴヌクレオチ
ドプローブを、前記試料中に存在する核酸とハイブリダ
イゼーションさせ、前記オリゴヌクレオチドプローブと
ハイブリダイゼーションした核酸により、前記ヌクレオ
チド塩基配列を含む原核生物の存在を検出することを含
み、前記オリゴヌクレオチドプローブが、マイコプラズ
マｒＲＮＡをコードする遺伝子よりも短く、３’ＧＣＴ
ＴＡＧＴＣＧＡＴＡＣＡＧＣ５’、５’ＣＧＡＡＵＣＡ
ＧＣＵＡＵＧＵＣＧ３’及びこれらに相補的な核酸配列
から選択されるオリゴヌクレオチドプローブであること
を特徴とする方法。 （３） 前記原核生物がモリカテス綱の種（species of
the Class Mollicutes）であり、前記ヌクレオチド塩
基配列がモリカテス綱の種に由来する原核生物の核酸に
のみ存在する（２）に記載の方法である。 （４） 前記モリカテス綱の種がマイコプラズマ属の種
（species ofthe genusMycoplasma）であり、前記ヌク
レオチド塩基配列がマイコプラズマ属の種に由来する原
核生物の核酸にのみ存在する（３）に記載の方法であ
る。 （５） 前記マイコプラズマ属の種がマイコプラズマ
カプリコラン（Mycoplasma capricolun ）であり、前記
ヌクレオチド塩基配列がマイコプラズマ カプリコラン
に由来する原核生物の核酸にのみ存在する（４）に記載
の方法である。 （６） 前記マイコプラズマ属の種がマイコプラズマ
スピーシーズ ＰＧ５０（Mycoplasma species PG50 ）
であり、前記ヌクレオチド塩基配列がマイコプラズマ
スピーシーズ ＰＧ５０に由来する原核生物の核酸にの
み存在する（４）に記載の方法である。 （７） 前記マイコプラズマ属の種が肺炎マイコプラズ
マ（Mycoplasma pneumoniae ）であり、前記ヌクレオ
チド塩基配列が肺炎マイコプラズマに由来する原核生物
の核酸にのみ存在する（４）に記載の方法である。 （８） 前記モリカテス綱の種がウレアプラズマの種で
あり、前記ヌクレオチド塩基配列がウレアプラズマの種
に由来する原核生物の核酸にのみ存在する（３）に記載
の方法である。 （９） 前記モリカテス綱の種がスピロプラズマの種で
あり、前記ヌクレオチド塩基配列がスピロプラズマの種
に由来する原核生物の核酸にのみ存在する（３）に記載
の方法である。 （１０） 前記モリカテス綱の種がアコレプラズマの種
であり、前記ヌクレオチド塩基配列がアコレプラズマの
種に由来する原核生物の核酸にのみ存在する（３）に記
載の方法である。 【０００８】 【発明の実施の形態】本発明は、放射線同位元素標識、
ビオチン標識、ＰＥＩ−ペルオキシダーゼ接合又は蛍光
抗体標識ＥＬＩＳＡ法等の多様な技術で標識された（la
beled or tagged）特異的なマイコプラズマのリボゾー
ムＲＮＡ遺伝子断片を、ＤＮＡ又はＲＮＡハイブリダイ
ゼーションにより臨床試料、細胞又は細胞培養中のマイ
コプラズマを特異的にかつ高感度に検出するために、使
用することにより行われる。 【０００９】一つの観点では、本発明は、マイコプラズ
マの１６Ｓ ＲＮＡ遺伝子に相補的なヌクレオチド塩基
配列を提供するものであり、このヌクレオチド塩基配列
は、マイコプラズマのリボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）に
対するコードであって、ＡＡＣＡＣＧＴＡＴＣ、ＣＧＡ
ＡＴＣＡＧＣＴＡＴＧＴＣＧ、ＧＡＧＧＴＴ−ＡＡＣ、
ＡＴＣＣＧＧＡＴＴＴＡＴＴ、ＴＣＴＣＡＧＴＴＣＧＧ
ＡＴＴＧＡ、ＡＧＧＴＧＧＴＧＣＡＴＧＧＴＴＧ、ＴＣ
ＣＴＧＧＣＴＣＡＧＧＡＴ、ＡＴＡＣＡＴＡＧＧＴ、Ａ
ＡＣＴＡＴＧＴＧＣ、ＡＡＴＴＴＴＴＣＡＣＡＡＴＧ及
びＴＣＴＣＧＧＧＴＣＴからなる一群から選択されたヌ
クレオチド塩基配列を含む。 【００１０】なお、このヌクレオチド塩基配列では、Ｔ
がチミン、Ｇがグアニン、Ａがアデニン、Ｃがシトシ
ン、−が大腸菌( E .coli ) 内の対照となるヌクレオチ
ド塩基配列に比較した場合のヌクレオチドの欠損を表
す。これらの断片は、大腸菌の１６Ｓ ＲＮＡ遺伝子と
有意で異なり、上記のものに対して相補的な標識したヌ
クレオチド塩基配列で構成されるマイコプラズマに特異
的なプローブの基本部分を構成する。 【００１１】他の観点では、本発明は、原核生物のｒＲ
ＮＡに対するコードであって、ＡＣＧＧＧＴＧＡＧＴ、
ＴＡＡＴＡＣＣＧＣＡＴ、ＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣ
ＡＧＴ、ＧＴＧＧＧＧＡＧＣＡＡＡ、ＡＧＧＡＴＴＡＧ
ＡＴＡＣＣＣＴ、ＣＣＧＴＡＡＡＣＧＡＴ、ＧＡＡＴＴ
ＧＡＣＧＧＧＧ、ＣＣＣＧＣＡＣＡＡＧ、ＧＧＴＧＧＡ
ＧＣＡＴＧＴ、ＴＧＴＴＧＧＧＴＴＡＡＧＴＣＣＣＧＣ
ＡＡＣＧＡ、ＧＧＧＡＴＧＡＣＧＴ、ＡＣＧＴＧＣＴＡ
ＣＡＡＴＧ、ＣＴＡＧＴＡＡＴＣＧ、ＴＧＴＡＣＡＣＡ
ＣＣＧＣＣＣＧＴＣＡ、ＡＡＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡＧＧ
ＴＡ及びＴＧＧＡＴＣＡＣＣＴＣＣＴＴからなる−群か
ら選ばれたヌクレオチド塩基配列を含む１６Ｓ ＲＮＡ
遺伝子の同定されたＤＮＡ塩素配列を提供する。 【００１２】これらの断片は、大腸菌及び試験した全て
のマイコプラズマに対して共通の１６Ｓ ＲＮＡ遺伝子
中の領域を表わす。全ての原核生物に対して普遍的なプ
ローブは、これらの断片に対して相補的な標識したヌク
レオチド塩基配列で構成される。 【００１３】一般に本発明は、原核生物由来の核酸に存
在し真核生物由来の核酸には存在しない特定のヌクレオ
チド塩基配列を含む核酸を含有する原核生物の存在を決
定するための方法であって、この方法が、この原核生物
由来でありこの特定のヌクレオチド塩基配列を含む核酸
又は核酸断片を含有するかもしれない媒質を、この特定
のヌクレオチド塩基配列に対して相補的なヌクレオチド
塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと接触させ、それに
より、このオリゴヌクレオチドを、この媒質中に存在す
るかもしれないこの特定のヌクレオチド塩基配列を含む
この原核生物由来の核酸又は核酸断片とハイブリダイゼ
ーションさせ、このオリゴヌクレオチドとハイブリダイ
ゼーションした核酸又は核酸断片の存在を検出すること
で行われる方法を包含する。 【００１４】他の観点では、本発明は、一般にマイコプ
ラズマ又は原核生物の検出に使用される特異的な生物学
的プローブに関与し、これは上記の方法及びそのような
プローブの同定と生産によっている。 【００１５】 【実施例】先ず本発明の生物学的プローブの生産及び使
用を含む特定の工程を詳述し、それから本発明で有効な
特定のヌクレオチド塩基配列がどのようにして決定され
るかを記述することにより、本発明を説明する。 −デオキシオリゴヌクレオチドの合成− 上に掲げた１６Ｓ マイコプラズマ ＲＮＡ遺伝子塩基
配列の一つに対して相補的である１６ｂｐデオキシオリ
ゴヌクレオチド、３’ＧＣＴＴＡＧＴＣＧＡＴＡＣＡＧ
Ｃ５’は、ここに参照として挿入する文献（M.H.Caruth
ers et al.,Gonetic Engineering,Vol.4,p.1-17,Plenum
Publishing Co.(1982) ）に記述されたリン酸三エステ
ル固相法で合成された。これまでに記述した他のデオキ
シオリゴヌクレオチド又は他の望ましいオリゴヌクレオ
チドも同様に合成される。例えば、ＤＮＡプローブの代
わりに、５’ＣＧＡＡＵＣＡＧＣＵＡＵＧＵＣＧ３’の
塩基配列を含む組換体ＳＰ６ベクタ転写体等のＲＮＡプ
ローブを合成することも望ましいだろう。 【００１６】リボゾームＲＮＡ分子に対するＤＮＡ−Ｒ
ＮＡ又はＲＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションは、オ
リゴヌクレオチドプローブをゲノム（genome）のＤＮＡ
塩基配列に対して用いるＤＮＡ−ＤＮＡ又はＲＮＡ−Ｄ
ＮＡハイブリダイゼーションより、検出の感度を数百倍
高める。これは、そのようなオリゴヌクレオチドプロー
ブを使用すると、マイコプラズマ又はユーバクテリウム
の（eubacterial）細胞当たりのリボゾームＲＮＡの多
数の複製が検出されるからである。 −デオキシオリゴヌクレオチドの試験− 上記のデオキシオリゴヌクレオチドは、ここに参照とし
て挿入される文献（C.C.Richardson,Procedure in Nucl
eic Acid Research (Cantoni,G.L.and Davies,D.R.,ed
s.),Vol.2,pp.815-828,Harper and Row,New York(197
1)）の方法を用いて５’末端を3 2 Ｐ標識された。生成
の標識したデオキシオリゴヌクレオチドは、その後マイ
コプラズマに特異的なオリゴヌクレオチドプローブとし
て使用された。 【００１７】マイコプラズマに対する特異性は、ここに
参照として挿入される文献（M.Cunningham,Anal.Bioche
m.128:415-421(1983) ）に記述されるスロット・ブロッ
ト（slot blot）ハイブリダイゼーションによって証明
された。この目的のためにｐＵＣ８中にクローニングさ
れた肺炎マイコプラズマ（Mycoplasma pneumoniae ）の
１６００ｂｐＤＮＡ断片が使用された。１６００ｂｐ断
面は、上記の１６塩基のデオキシオリゴヌクレオチドを
含む。代表的な原核生物のユーバクテリウム（eubacter
ium ）である大腸菌のゲノム消化物は、酵素Ｈｉｎｄ I
IIを用いる消化により生産された。消化された大腸菌Ｄ
ＮＡ及び１６００ｂｐ肺炎マイコプラズマＤＮＡ断片
は、ここに参照として挿入される文献（J.J.Leary et a
l.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:4045-4049(1983)）の
方法によりニトロセルロースフィルタ上に移された。Ｄ
ＮＡ断片を含有するニトロセルロースフィルタは、減圧
下８０℃で２時間熱され、3 2 Ｐ標識したデオキシオリ
ゴヌクレオチドに対してハイブリダイゼーションされ
た。図面に示すように生成のスロット ブロットを展開
して、０．０００３４ｎｇ、０．００３４ｎｇ、０．０
３４ｎｇ、０．３４ｎｇ、３．４ｎｇ（１６ｂｐに対し
て計算）の肺炎マイコプラズマＤＮＡ断片に対して高い
強度のブロットがあり、０．０００１５μｇ、０．００
１５μｇ、０．０１５μｇ、０．１５μｇ、１．５μｇ
の大腸菌ＤＮＡ断片に対してはブロットがないことが明
らかになり、デオキシオリゴヌクレオチドプローブのマ
イコプラズマに対する特異性が示された。 【００１８】３’ＧＣＴＴＡＧＴＣＧＡＴＡＣＡＧＣ
５’の塩基配列を有するデオキシオリゴヌクレオチド
は、このようにマイコプラズマのＤＮＡとハイブリダイ
ゼーションし、他の原核生物のＤＮＡとはハイブリダイ
ゼーションしないマイコプラズマに特異的なオリゴヌク
レオチドプローブとして有効である。 【００１９】他方、例えば、原核生物のコードである遺
伝子塩基配列の一つに対して相補的であるＴＧＣＣＣＡ
ＣＴＣＡの塩基配列を有するデオキシオリゴヌクレオチ
ドは、原核生物とハイブリダイゼーションし真核生物と
はハイブリダイゼーションしない原核生物に特異的なオ
リゴヌクレオチドプローブとして有効である。 【００２０】感染した細胞中のマイコプラズマの検出に
対しては、次の方法が有効であることが見出された。細
胞は１−２Ｔ７５組織培養フラスコを使用し、トリプシ
ンＥＤＴＡ（ＰＢＳ中０．０５％トリプシン、０．０４
％ＥＤＴＡ）を用いて３７℃で２分間トリプシン処理さ
れた。トリプシン処理した細胞は１−２mlの成長媒質中
に再懸濁され、ミニフォルド II （Minifold II）スロ
ットブロット ハイブリダイゼーション装置（Schleich
er and Schuell,inc.,Keene,N.H.）を使用して１０×Ｓ
ＳＣで（１×ＳＳＣは１５ｍＭクエン酸Ｎａ、１５０ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で湿らせたニトロセルロー
ス膜上に５０−１００μｌ（１×１０5−１×１０6 の
細胞）の量をスポットされた。スロット・ブロットに適
用されたＤＮＡ試料はアルカリ（０．５Ｍ ＮａＯＨ、
１．５Ｍ ＮａＣｌ）を用いて室温で５−１０分間変成
され、０．５Ｍトリス、ｐＨ７．２及び３．０Ｍ Ｎａ
Ｃｌを用いて室温で５−１０分間中和された。フィルタ
は、その後室温で２×ＳＳＣで５分間洗浄され、真空炉
（vacuum oven）中８０℃で２時間熱された。フィルタ
は、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭトリス、ｐＨ７．
５、５×デンハーズ（Denhardt）及び１００μｇ／ｍｌ
の熱変成した疎精子ＤＮＡからなる前ハイブリダイゼー
ション緩衝液を使用して６５℃で２時間、前ハイブリダ
イゼーションされた。１０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１
ｍＭ ＥＤＴＡ、０．７５Ｍ ＮａＣｌ、１×デンハー
ズ、０．５％ＳＤＳ、１０％硫酸デキストラン及び１０
０μｇ／ｍｌの熱変成した疎精子ＤＮＡからなるハイブ
リダイゼーション緩衝液中、3 2Ｐ標識したデオキシオ
リゴヌクレオチドの１〜２×１０6 cpm、比活性１０8 c
pm／μｇ以上、として測定される濃度の本発明の試験手
段を使用して、ハイブリダイゼーションが６５℃で１６
時間行われた。 【００２１】ハイブリダイゼーションの後、フィルタ
は、２×ＳＥＴ、０．２％ＳＤＳ（１×ＳＥＴは３０ｍ
Ｍトリス、ｐｈ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）を用い
て６５℃で２〜４時間、及び４ｍＭトリス塩基を用いて
室温で１〜２時間洗浄された。フィルタはその後乾燥さ
れ、１個又は２個のデュポンクロネックス（Dupont Cro
nex）強化スクリーンを用いてＸ線膜上にさらされた。 −特定のヌクレオチド塩基配列の決定− 特定のヌクレオチド塩基配列がどのようにして製造さ
れ、かつ、使用されるかを前述したが、次に、本発明の
広い範囲を理解するため、マイコプラズマに特異的なオ
リゴヌクレオチドプローブ、一般の原核生物に特異的な
オリゴヌクレオチドプローブ、マイコプラズマ、ウレア
プラズマ（ureaplasma）アコレプラズマ（acholeplasm
a）及びスピロプラズマ（spiroplasma ）の個々の種に
特異的なオリゴヌクレオチドプローブ、又は、ユーバク
テリウムの個々の種に特異的なプローブとして有効な、
特定のヌクレオチド塩基配列を決定するために使用され
る技術の試験について説明する。 【００２２】そのような決定は、次の工程で行われる。 １． マイコプラズマの特定の種のリボゾームＲＮＡの
完全なゲノムをバクテリオファージ又はプラスミドのベ
クタ中にクローニングする工程、 ２． 生成のリボゾームＲＮＡ遺伝子断片を、マイコプ
ラズマでない原核生物のリボゾームＲＮＡオペロンを用
いて試験する工程、 ３． このマイコプラズマでない原核生物のリボゾーム
ＲＮＡオペロンとハイブリダイゼーションする断片を特
性づける工程、 ４． ここに参照として挿入する文献（Gobel,U.and St
anbridge ,E.J.,Science,Vol.226,pp.1211-1213(1984)
）に記述される差をつけた（differential）ハイブリ
ダイゼーションによりマイコプラズマに特異的な断片を
同定する工程、 ５． マイコプラズマに特異的な断片を、塩基配列しつ
つあるプラスミド中にサブクローニングする工程、 ６． 生成のサブクローニングしたマイコプラズマに特
異的な断片を塩基配列させる工程、 ７． マイコプラズマの他の種及びマイコプラズマでな
い原核生物に対して、１〜６の工程を繰り返す工程、並
びに、 ８． ６及び７の工程で得た塩基配列を比較する工程。
これにより、マイコプラズマの全ての種に共通でありマ
イコプラズマでない原核生物の対応する塩基配列とは異
なる塩基配列は、マイコプラズマに特異的なオリゴヌク
レオチドプローブとして有効であり、マイコプラズマの
全ての種並びにマイコプラズマでない原核生物に共通で
ある塩基配列は、一般の原核生物に特異的なオリゴヌク
レオチドプローブとして有効であり、かつ、マイコプラ
ズマ、アコレプラズマ、ウレアプラズマ又はスピロプラ
ズマの特性の種のいずれかに特異的な塩基配列、及び任
意の与えられたユーバクテリウムの種に特異的な塩基配
列は、マイコプラズマ、アコレプラズマ、ウレアプラズ
マ又はスピロプラズマの個々の種に対してそれぞれ特異
的なオリゴヌクレオチドプローブとして有効である。 【００２３】肺炎マイコプラズマのリボゾームＲＮＡゲ
ノムのクローニングは、肺炎マイコプラズマの全ＤＮＡ
のＨｉｎｄ III消化、及び、このＨｉｎｄ III断片のＨ
ｉｎｄ IIIで消化したベクタｐＵＣ８へ連結により達成
された。生成のリボゾームＲＮＡの遺伝子の断片は、こ
こに参照として挿入される文献（Gobel et al., Scienc
e,226:1211-1213(1984) ）の方法により、ｐＫＫ３５３
５プラスミド中の大腸菌のリボゾームＲＮＡオペロンを
用いて試験され、リボゾーム塩基配列を含むクローニン
グした断片を同定された。 【００２４】厳密なハイブリダイゼーション条件下でマ
イコプラズマの種に対してハイブリダイゼーションし、
大腸菌又は哺乳類のＤＮＡに対してはハイブリダイゼー
ションしないことを基礎として、１６００ｂｐ断片が選
ばれた。この１６００ｂｐ断面はＨｉｎｄ III消化によ
りｐＵＣ８ペクタから除かれ、ここに参照として挿入す
る文献（Sanger et al.,Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.
A.,74:5463-5467(1977)）に記述されるサンガージデオ
キシ法を用いて、塩基配列させるためにＭ１３Ｍｐ８Ｄ
ＮＡ細菌ウィルスへ連結された。 【００２５】肺炎マイコプラズマ、マイコプラズマ カ
プリコラン（M.capricolum）及びマイコプラズマ種ＰＧ
５０（Mycoplasma species ＰＧ５０）と大腸菌との塩
基配列を比較することにより、ある塩基配列がマイコプ
ラズマのこれらの総ての種に対して共通であって大腸菌
に対しては異なることが示された。これらの塩基配列は
合成され、標識されてマイコプラズマに対して特異的な
オリゴヌクレオチドプローブとして使用される。例え
ば、３’ＧＣＴＴＡＧＴＣＧＡＴＡＣＡＧＣ５’は、マ
イコプラズマに特異的なオリゴヌクレオチドプローブを
構成した。他の塩基配列は、マイコプラズマのこれらの
種並びに大腸菌に対して共通であった。これらの後者の
塩基配列は合成され、標識されて全ての原核生物に対し
て特異的なオリゴヌクレオチドプローブとして使用され
る。更に、他の塩基配列は一つのマイコプラズマ種に特
有であって、合成され、標識されてマイコプラズマの種
に対して特異的なオリゴヌクレオチドプローブとして使
用される。 【００２６】本発明はこのように、汚染された細胞培養
又は他の生物学的環境中のマイコプラズマを検出する特
異的で高感度の迅速な方法を提供する。また、本発明
は、全ての原核生物に保持されている領域から誘導され
たリボゾームＤＮＡプローブを提供することができる。
このようなプローブは、ヒト又は動物の菌血症又は敗血
症の迅速で高感度の診断において非常に有効であろう。 【００２７】本発明は、マイコプラズマ、アコレプラズ
マ、ウレアプラズマ、スピロプラズマ及びユーバクテリ
ウムの個々の種に対してそれぞれに特異的なリボゾーム
ＤＮＡプローブを提供することもできる。これらのプロ
ーブは、遺伝子構成がほとんど又は全く知られていない
これらの生物に対して特に有効であろう。 【００２８】ある特定のデオキシオリゴヌクレオチド及
びマイコプラズマの種を例として本発明を詳細に説明し
たが、多くの変形が可能であることは当業者には明らか
である。本発明の範囲はそのような変形を含み、また、
本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ制限され
る。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、スロット ブロット展開を示す図であ
る。
る。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 ウルフ ゴベル
ドイツ連邦共和国 デー−7800 フライ
ベルクヘルマン ヘルダー シュトラー
セ 11
(58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名)
C12Q 1/68
C12N 15/11
ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ
ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．マイコプラズマｒＲＮＡをコードする遺伝子よりも
短く、３’ＧＣＴＴＡＧＴＣＧＡＴＡＣＡＧＣ５’、
５’ＣＧＡＡＵＣＡＧＣＵＡＵＧＵＣＧ３’及びこれら
に相補的な核酸配列から選択されるオリゴヌクレオチド
プローブ。 ２．原核生物には存在するが真核生物には存在しないヌ
クレオチド塩基配列を含む原核生物の存在を決定するた
めの方法であって、 試料を、前記ヌクレオチド塩基配列に特異的にハイブリ
ダイゼーションし得るオリゴヌクレオチドプローブと接
触させ、 前記オリゴヌクレオチドプローブを、前記試料中に存在
する核酸とハイブリダイゼーションさせ、 前記オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイゼーシ
ョンした核酸により、前記ヌクレオチド塩基配列を含む
原核生物の存在を検出することを含み、 前記オリゴヌクレオチドプローブが、マイコプラズマｒ
ＲＮＡをコードする遺伝子よりも短く、３’ＧＣＴＴＡ
ＧＴＣＧＡＴＡＣＡＧＣ５’、５’ＣＧＡＡＵＣＡＧＣ
ＵＡＵＧＵＣＧ３’及びこれらに相補的な核酸配列から
選択されるオリゴヌクレオチドプローブであることを特
徴とする方法。 ３．前記原核生物がモリカテス綱の種（species of the
Class Mollicutes ）であり、前記ヌクレオチド塩基配
列がモリカテス綱の種に由来する原核生物の核酸にのみ
存在する請求項２に記載の方法。 ４．前記モリカテス綱の種がマイコプラズマ属の種（sp
ecies ofthe genus Mycoplasma）であり、前記ヌクレオ
チド塩基配列がマイコプラズマ属の種に由来する原核生
物の核酸にのみ存在する請求項３に記載の方法。 ５．前記マイコプラズマ属の種がマイコプラズマ カプ
リコラン（Mycoplasma capricolun ）であり、前記ヌク
レオチド塩基配列がマイコプラズマ カプリコランに由
来する原核生物の核酸にのみ存在する請求項４に記載の
方法。 ６．前記マイコプラズマ属の種がマイコプラズマ スピ
ーシーズＰＧ５０（Mycoplasma species PG50 ）であ
り、前記ヌクレオチド塩基配列がマイコプラズマ スピ
ーシーズ ＰＧ５０に由来する原核生物の核酸にのみ存
在する請求項４に記載の方法。 ７．前記マイコプラズマ属の種が肺炎マイコプラズマ
（Mycoplasma pneumoniae ）であり、前記ヌクレオチ
ド塩基配列が肺炎マイコプラズマに由来する原核生物の
核酸にのみ存在する請求項４に記載の方法。 ８．前記モリカテス綱の種がウレアプラズマの種であ
り、前記ヌクレオチド塩基配列がウレアプラズマの種に
由来する原核生物の核酸にのみ存在する請求項３に記載
の方法。 ９．前記モリカテス綱の種がスピロプラズマの種であ
り、前記ヌクレオチド塩基配列がスピロプラズマの種に
由来する原核生物の核酸にのみ存在する請求項３に記載
の方法。 １０．前記モリカテス綱の種がアコレプラズマの種であ
り、前記ヌクレオチド塩基配列がアコレプラズマの種に
由来する原核生物の核酸にのみ存在する請求項３に記載
の方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| JP8255417A JP2796278B2 (ja) | 1996-09-05 | 1996-09-05 | オリゴヌクレオチドプローブ及びそれを用いて原核生物の存在を決定するための方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8255417A JP2796278B2 (ja) | 1996-09-05 | 1996-09-05 | オリゴヌクレオチドプローブ及びそれを用いて原核生物の存在を決定するための方法 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61151849A Division JP2870693B2 (ja) | 1986-06-30 | 1986-06-30 | オリゴヌクレオチドプローブ及びそれを用いて原核生物の存在を決定するための方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09234084A JPH09234084A (ja) | 1997-09-09 |
| JP2796278B2 true JP2796278B2 (ja) | 1998-09-10 |
Family
ID=17278477
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8255417A Expired - Lifetime JP2796278B2 (ja) | 1996-09-05 | 1996-09-05 | オリゴヌクレオチドプローブ及びそれを用いて原核生物の存在を決定するための方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2796278B2 (ja) |
-
1996
- 1996-09-05 JP JP8255417A patent/JP2796278B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH09234084A (ja) | 1997-09-09 |
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