JPS6368095A - 疎水性アミノ酸を欠く機能的組換えポリペプチド類似体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は組換えＤＮＡ技術に関し、より詳細には疎水性
メンプラン架橋領域（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｍｅｍｂ
ｒａｎｅ　ｓｐａｎｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ）の存在ゆ
えに生物学的に活性な形で容易に発現されない機能的な
組換えタンパク質およびポリペプチド（以後集合的に゛
タンパク質゛と↑る）類似体のクローニングおよび発現
に関する。

（従来の技術） 組換えＤＮＡ技術の進歩により、いったん目的タンパク
質をコードする遺伝子が単離３ｎてその核酸配列が決定
されると、比較的大量の均一なタンパク質産物Ｚ生産す
ることが可能になった。一般方法では、目的タンパク質
の細胞株または他の供給源から全ＲＮＡ’＆抽出し、全
ＲＮＡからポリＡ”ｍＲＮＡ　　ｆ単離し、ポリＡ＋ｍ
ＲＮＡの逆転写によりｃＤＮＡライブラリーを作製し、
そのライブラリーから目的タンパク質産物Ｚコードする
遺伝子ン単離する。そのｃＤＮＡＹ適当な発現ベクター
内に挿入し、そのベクターを使用して目的タンパク質産
物の予期された発現のための宿主を形質転換する。この
ような宿主には代表的には大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ　ｃｏｌｉ）のような細菌、酵母または他の単細胞
微生物が含−！れる。数種の組換えタンパク質は宿主微
生物から発現されないかあるいはきわめて低レベルで発
現され、捷た発現さ几１でタンパク質産物は生物学的活
性７示さないことが知られている。そｎには多くの理由
が存在するが、例えば効果的でないプロモーター、タン
パク質の分解（例えば宿主細胞によってコード３　Ｑる
プロテアーゼによる分解）、または前駆体タンパク質産
物の不適当なもしくは不完全な翻訳後グロセツシングな
どが含まれる。また、クンバク質の正しい６次構造が例
えば必要とされる分子間“土たは分子内ジスルフィド結
合の不在ゆえに、もしくは望マシくないジスルフィド結
合の存在ゆえに得られない場合、その発現タンパク質は
生物学的に不活性でありうる。

さらに１本発明者らは、タンパク質のカルボキシ末端の
近傍に高度に疎水性のアミノ酵領域（トランスメンブラ
ン領域）欠もつタンパク質産物はある種の宿主から生物
学的活性形で発現されないか又は不十分なＶベルで発現
さ几るにすぎないことを見出した。高度に疎水性の領域
が特にタンパク質のカルボキシ末端またはその近傍に存
在すると１発現されたタンパク質は分泌されないでむし
ろ宿主細胞のメンプラン内に保持される。このような疎
水性領域が多数の分子中に存在する場合。

かなり複雑な集合体が生じる。従って、このようなトラ
ンスメンブラン領域をコードする核酸が目的タンパク質
に対応するｃＤＮＡから除かｎるならば、恐らくタンパ
ク質の発現は制限χ受げないであろう。しかしながら、
その結果、生物学的活性に必要とされるアミノ酸の欠失
という問題が生じるかも知汎ない。

本発明は通常メンプラン架橋領域乞もつタンパク質に関
連して使用される。このようなタンパク質にはヒトマク
ロファージ特異的コロニー刺激因子のようなある種のリ
ンフオカイン類、およびインターロイキン１、インター
ロイキン２および顆粒球−マクロファージコロニー刺激
因子に対する受容体のようなリンフオカイン受容体を含
めたあらゆるホルモン受容体が含まれるであろう。

その最も好適な面において１本発明はＣ３Ｆ−１タンパ
ク質分子のカルボキシ末端領域中の高度に疎水性のアミ
ノ酊乞コードするヌクレオチドン排除すべくｃＤＮＡを
改変するか、またはこのカルボキシ末端領域をコードす
るｃＤＮＡの３′領域に存在するヌクレオチドを欠いた
ＤＮＡフラグメントを合成することにより、生物学的に
活性なＣ３Ｆ−１を生産することに関する。Ｃ３Ｆ−１
は造血幹細胞を誘発して多数の前駆細胞へ増殖させ、次
いで前駆細胞ン成熟リンパ球、成熟好中球および好酸球
。

成熟マクロファージ、成熟巨核球および単球へ分ＩｔＳ
？Ｊせるコロニー刺激因子（Ｃ８Ｆ）として知られるリ
ンフオカイン類の一員である。

Ｃ８Ｆ−１（ｍＣ８Ｆ　　とも呼ばれる）は成熟マクロ
ファージへの前駆細胞の分１じ乞刺激するＣ、ＳＦであ
る。マクロファージは本来造血性である血液由来の単球
から発生する比較的大きい（１０〜２０μｍ）、活発に
運動する食細胞である。活性１じさｎたとき。

それらは異物や老細胞乞破壊しまた腫瘍に対する抵抗性
あるいはその根絶欠もたらす。

Ｃ３Ｆ−１の生物学的および生１ヒ学的研究ならびに感
染症や腫瘍の治療におけるその利用可能性は。

Ｃ３Ｆ−１の十分な研究乞可能にする均一なＣ３Ｆ−１
が多量に利用し得ないために、少なくとも幾分か妨げら
ｆした。組換え法によりＣ３Ｆ７−１乞生産する努力は
不十分な成功ンおさめたにすぎない。これまで、細菌ま
たは酵母の発現系において生物学的に活性なヒトＣＳＦ
−１’ａ？発現することは成功していない。組換えＣ３
Ｆ−１は真核細胞（サルＣ０８−７細胞）によって発現
されたが、この発現は本来一時的なものであって、細胞
の２回またｔ／′１６回の分裂後に遺伝子発現が失われ
る。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明は、ｃＤＮＡの６′末端部分の高度に疎水性のア
ミノ際ヲコードする核酸の不在ゆえに天然りンパク質の
ｃＤＮＡと異なる突然変異構造遺伝子によってコードさ
れる、組換えＣ３Ｆ−１類似体のような生物学的に活性
なタンパク質類似体を提供する。活性Ｃ３Ｆ−１類似体
をコードする突然変異遺伝子は１じ生合成法、該タンパ
ク質のｃＤＮＡの突然変異または他の適当な方法によっ
て作られる。

゛突然変異遺伝子”なる用語は１つまたはそれ以上の核
酸もしくはコドンの不在、欠失または置換によって天然
タンパク質のｃＤＮＡとは異なる遺伝子ン意味する。こ
の遺伝子は１ヒ学的に合成されるか、ｃＤＮＡからクロ
ーニングしてゲノムＤＮＡから突然変異ケ起こさせるか
、又は他の方法により作られる。”タンパク質類似体パ
なる用語は対応する天然タンパク質と本質的に同じ生理
活性を示でか、天然ｃＤＮＡによってコードされるタン
パク質産物とはアミノ酸の組成において異なるタンパク
質ン意味する。”突然変異Ｃ３Ｆ−１遺伝子°゛は天然
Ｃ３Ｆ−１と本質的に同じ活性２示すが、天然Ｃ３Ｆ−
１ｃＤＮＡによってコードされるＣ３Ｆ−１とは組成に
おいて異なるＣ３Ｆ−１のタンパク質類似体（Ｃ３Ｆ−
１類似体）をコードする突然変異構伝子欠意味する。

本発明はまた天然ｃＤＮＡの６′末端と、トランスメン
ブラン領域の高度に疎水性のアミノＭＹコードするヌク
レオチドと、の間に存在するヌクレオチドの欠失によっ
て特徴づけられる末端切断された突然変異Ｃ３Ｆ−１構
造遺伝子を提供する。

本発明は、その側面において、前記の突然変異遺伝子乞
食むクローニングベクターおよび発現ベクター欠包含し
、また宿主細胞を形質転換して生物学的に活性なＣ３Ｆ
−１類似体１発現させるためのこの種のベクターの使用
Ｚ包含する。

本発明は、他の面において、感染症および腫瘍性疾患の
治療に有効である。生物学的に活性な組換えＣ３Ｆ−１
類似体の治療用組成物に関する。これに関連した面にお
いて、本発明は上記の治療用組成物乞使用する治療方法
に関する。

本発明は、さらに別の面において１機能的なＣ３Ｆ−１
の存在について試験するための迅速なバイオアッセイに
関する。このアッセイで１ｄ３Ｈで標識したチミジンの
存在下にネズミ単核食細胞の増殖を誘発するＣ３Ｆ−１
の能力が試験される。

（問題点を解決するための手段） 本発明に、クンバク質のカルボキシ末端領域に存在し且
つ発現タンパク質の生理活性に必須ではないｃＤＮＡに
よりコードさｎる高度に疎水性のアミノ酸を欠失させる
ことを伴う組換えＤＮＡ技術によって、Ｃ３Ｆ−１のよ
うな機能的タンパク質類似体を高レベルで発現させるこ
とに関する。このようなアミノ酸の存在は、翻訳後のタ
ンパク質産物が宿主から分泌３ｎないでむしろ宿主細胞
のメンプランに結合するために、あるいは疎水性相互作
用がタンパク質分子の複雑な会合へと導き１個々の分子
のコンホメーションン変えて生理活性を失わせるために
、単細胞宿主による機能的成熟タンパク質の発現Ｚ妨げ
る。しかしながら、カルボキシ末端領域からの疎水性ア
ミノ酸の欠失はタンパク質の生理活性に影響を及ぼし、
さらに例えばタンパク質の３次構造を変えることによっ
てそれｌ不活性化するかも知れない。従って、どの特定
アミノ酸ヲ欠失すべきかを決定することは必ずしも容易
なことではない。

ひとたびＣ３Ｆ−１類似体または他の類似体の意図する
組成が決定されると、その類似体Ｚコードｆる突然変異
遺伝子が作られる。この類似体に対応するｃＤＮＡは適
当なりローニング系にクローニングサしたｃＤＮＡライ
ブラリーから単離さｎ、その後既知方法によりその核酸
配列が決定サレる。

次いで、ｃＤＮＡは望ましくない疎水性アミノ酸をコー
ドでる所定の核酸を欠失すべく改変される。

別の方法では、突然変異構造遺伝子が阻生的に合成され
、こうして望ましくないカルボキシ末端の疎水性アミン
酸をコードでる核酩乞含まないＤＮＡフラグメントが形
成さｎる。

本発明はリンフオカインＣ３Ｆ−１に関して以下で詳し
く説明するが１本発明は生物学的に活性な形のタンパク
質の発現乞妨害まｆｃハ制限する高度に疎水性のアミノ
酸のセグメント（％にタンパク質のカルボキシ末端部分
に存在するもの）Ｚ有するあらゆるタンパク質に適用３
ｆｉる。本発明に関（］１） 連して使用されるタンパク質の例には、ＣＳ　Ｆ　−１
ノホかに１種々のリンフオカイン類およびホルモン受容
体（例えばインターロイキン１．インターロイキン２お
よび顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子に対する
受容体のようなリンフオカイン受容体を含む）が含まれ
る。本発明はまたｍｙｃ。

ｒａｓ、　ｆｏｓ、　ｆｅｓ、　ｆｍｓ、　５ａｒｃ、
ｅｒｂ、　ａｂＩ　　などの腫瘍遺伝子と共に使用３ｎ
る。

突然変異構造遺伝子の合成 意図する組成のＣ３Ｆ−１類似体をコードするＤＮＡ（
望ましくない疎水性アミンＦＩ！ｉをコードする配列が
欠失されている）は、ホスホジエステル法またはトリエ
ステル法のような公知方法により阻生的に合成すること
ができる。トリエステル合成法の詳細はソード（Ｓｏｏ
ｄ）らのＮｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、４：２５５７
（１９７７）：およびヒロセＱ（ｉｒｏｓｃ）らのＴｅ
ｔ、　Ｌｅｔｔ、’ｌ旦：２４４９（１９７８）に開示
されている。突然変異Ｃ３Ｆ−１遺伝子乞合成する利点
は、所定宿主内でのＣ３Ｆ−１類似体の高レベル発現を
増強するリーダー配列またはプロモーター配列をもつ遺
伝子を作ることができるということである。捷た。Ｃ３
Ｆ−１遺伝子は所定のベクターへのＣ３Ｆ−１遺伝子の
挿入を容易にするための、接着末端をもつように考案し
うる。さらに、野生ＷＣ８Ｆ−１ｉ伝子のヌクレオチド
ン改変して、その結果生じるコドンによってコードされ
るアミン際７変えることなしに、。唯一の制限酵素切断
部位７つくることができる。このような制限酵素切断部
位は以下で論じるクローニング過程において遺′伝子乞
選択する際に役立つであろう。さらに、突然変異Ｃ３Ｆ
−１遺伝子乞合成することにより、ゲノムＤＮＡ中に存
在するイントロンおよびタンノ々り質屋物の生理活性に
必須でないアミノ酸残基Ｚコードｆるコドンが排除し得
る。突然変異Ｃ３Ｆ−１遺伝子’ａ？（ヒ学的に合成す
ることの他の利点は。

宿主細胞の遺伝子によってコードされる酵素およびプロ
テアーゼにより切断されるアミノ酸配列乞除くことであ
る。例えば、欧州特許出願第０２１２９１４号において
１本発明者および共同研究者は多数の塩基性アミノ酸ヲ
排除してサツ力ロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ　ｃｃｒｅｖｉｓｉａｃ）酵母のＫＥＸ−
２遺伝子によってコードされろプロテアーゼによるタン
パク質の翻訳後切断を防ぐことを論じている。

ヒトＣＳＦ−１をコードするｃＤＮＡの核酸配列は第１
図に示す。カワサキ（Ｋａｗａｓａｋｉ）らの５ｃｉｅ
ｎｃｅ　２３０：２９１（１９８５）Ｙ参照されたい。

第１図のｃＤＮＡクローンは膵臓のヒト細胞株ＭＩＡ　
−ＰａＣＡ　−２から誘導されるポリＡ＋ｍＲＮＡの逆
転写によって作製されたｃＤＮＡライブラリーから単離
される。Ｃ３Ｆ−１ｃＤＮＡの推定上のアミノ酸配列は
対応するコドンの下に示す。第１図から明らかなように
、コード１ヒタンパク質のカルボキシ末端セグメントは
主に疎水性のアミノ酸（例えばアミノ酸残基１６６〜１
８８）から構成されている。

これまで、第１図のｃＤＮＡにエリコードされる生理活
性Ｃ３Ｆ−ＩＵサルＣＯ８細胞中で発現すしたにすぎな
い。このタンパク質ン細菌や酵母細胞中で発現する試み
は成功していない。ＣＯ８発現系はそ几が一時的なもの
であるという点で実際的な（］４） 価値をもたず、遺伝子の発現はＣＯ８細胞の２回または
６回の分裂後に消失する。

本発明によれば、カルボキシ末端の疎水性アミノ酸欠コ
ードするヌクレオチドを含捷ない突然変異Ｃ３Ｆ−１遺
伝子が阻生的に合成される。この目的のために、少なく
とも第１図のアミノ酸１６６〜１８８Ｙコードｆる核酸
（核ｒＭＡ４９６〜５６４）が欠失した突然変異遺伝子
を合成することが好ましい。その突然変異Ｃ３Ｆ−１遺
伝子は好適には、疎水性アミノｆｌＹコードする欠失ヌ
クレオチドの３′側に存在するヌクレオチドをも欠失す
ることによって、第１図のＣ３Ｆ−１ｃＤＮＡの末端切
断形として合成ｇｎる。理想的には、高度に疎水性のア
ミノ酸ヲコードするヌクレオチド部分の５′末端に隣接
して存在する１個まｙｃはそれ以上の核酸がさらに欠失
した突然変異Ｃ３Ｆ−１遺伝子が合成される。

ＣｎＦｉＣ８Ｆ−１のトランスメンブラン部分の非コー
ド］じン確実にし、且つタンパク質産物を短縮すること
によりタンパク質の活性乞有意に変えることなくその発
現２高めるのに役立つという２重の目的をもっている。

Ｃつして、突然変異Ｃ３Ｆ−１遺伝子はその６′末端が
核酸／Ｖ）、　４７４　（第１図のアミノ［１５８）で
終止するように切断さｎる。このような組成の突然変異
Ｃ３Ｆ−１遺伝子は第２図に示す。

２２　図のＣ３Ｆ−１遺伝子は一連のオリゴヌクレオチ
ドＺ比学的に合成し、次いでそれら７２本鎖形に組み合
わせることにより作ら几る。それらの適切な酵素的連結
を助けるために、”接着末端”乞もつオリゴヌクレオチ
ドが合成される。捷た、オリゴヌクレオチドの連結を可
能にするために。

それらの５′末端ＵＴ４ポリヌクレオチドギナーゼの存
在下にデオキシリボヌクレオチド三すン酸ｄＡＴＰン用
いてリン酸Ｉｔｓされる。その後、オリゴヌクレオチド
ｔＴ４　リガーゼとｄＡＴＰの存在下で連結する。第３
図に示すような、意図する組成をもつＤＮＡフラグメン
トが形成され、これらは電気泳動により連結反応混合物
から選択される。選択した突然変異Ｃ３Ｆ−１遺伝子の
配列は、標準的な制限酵素分析または以下の実施例Ａに
記載の手（］６） 法を用いるＤＮＡ塩基配列決定により確認する。

突然変異Ｃ３Ｆ−１遺伝子は第３図に示す１４のオリゴ
ヌクレオチドから形成サレる。突然変異Ｃ３Ｆ−１遺伝
子に沿ったこれらのオリゴヌクレオチドの相対位置２第
２図に示す。それらを適切な順序および方向で容易に連
結しつるように、そ几ぞれ８塩基対（ｂｐ）の長さの接
着末端をもっ１４の相補オリゴヌクレオチドが合成され
る。これらの接着末端は既知の制限酵素のいずれの切断
部位とも一致しない。また、いくつかのヌクレオチドは
第１図に示すＣ３Ｆ−１遺伝子の野生型配列から改変さ
れる。これらの改変ヌクレオチドは第２図および第６図
において小文字で示す。この方法によると、突然変異Ｃ
３Ｆ−１遺伝子はその５′末端および６′末端にそれぞ
−１１，ＫｐｎＩ部位およびＸｂａＩ部位乞含む２４の
唯一の制限酵素切断部位をもつように構築される。第２
図に示すように、オリゴヌクレオチドＣ３Ｆ−Ａおよび
Ｃ３Ｆ−Ｂば、Ｃ３Ｆ−１類似体のアミノ末端にある次
の組成：Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａ
ｒｇの６個のアミノ酸乞コードする核酸乞もつように合
成される。これらの６個のアミノ酸は、以下で述べるよ
うに、酵母系においてＣ３Ｆ−１類似体の高レベル発現
乞うながす酵母プレプロαリーダー配列のカルボキシ末
端部分乞構成する。

ひとたび目的の突然変異遺伝子が阻生合成３ｎると　、
そ−ｎはその突然変異遺伝子の複製およびその遺伝子に
よってコード３ｎる活性タンパク質産物の発現のための
ベクター内に挿入され、このベクターを使用して適合性
の原核′！ｌ：たは真核宿主細胞を形質転換する。本発
明では種々のクローニングベクターが利用される。遺伝
子の複製および／まｆｃＵその遺伝子によってコードさ
れるタンパク質の高レベル発現に特に適した多数のプラ
スミドは広く市販されている。選ばれた特定プラスミド
に、大腸菌のような細菌、酵母捷たは他の単細胞微生物
であろうと、所定の形質転換宿主と適合しつるべきであ
る。プラスミドは使用すべき特定宿主細胞のための適当
な複製起点を含むべきである。また、プラスミドは形質
転換した宿主細胞を形質転換しなかった細胞から容易に
同定・分離しつるように表現型特性Ｚもつべきである。

このような表現型特性には生長阻止物質（例えば抗生物
質）に対する耐性遺伝子が含まれる。テトラサイクリン
、ストレプトマイシン、サンファ剤、ペニシリンおよび
アンピシリンを含めた各種の抗生物質に対する耐性遺伝
子ンコードするプラスミドが市販されている。

プラスミドクローニング／発現ベクターのための形質転
換用宿主は適当な原核または真核細胞のいずれであって
もよいが、好ましくはそｆ′Ｌハ大腸菌のような十分に
明確にさｔｌ、た細菌、まｆｃハ酵母菌株である。この
種の宿主は容易に受容能カンもつようになり、そして培
養下で速やかに増殖することができる。

形質転換法では、一般に限らｎた部分の宿主細胞が実際
に形質転換される。形質転換した細胞は、その細胞培養
物を適当な増殖培地および表現型同定剤（例えば抗生物
質）を含む寒天平板上で培養することにより同定しつる
。適当な耐性遺伝子（］９） （例えば抗生物質耐性遺伝子）乞もつ細胞のみが生き残
るであろう。このようにして同定された宿主は、目的タ
ンパク質産物の生産のために、一般には大規模で培養さ
れる。

Ｉｔｓ学合成したオリゴヌクレオチドの大フラグメント
は往々にして首尾よくクローニングすることができない
。その理由は完全には理解されていないが、オリゴヌク
レオチドの１し学合成中に”誤り”が生じて、不適当な
核酸が合成されるためと思われる。これが有意な程度に
起こると、転写や翻訳が行われない。第２図に示す特定
組成の突然変異Ｃ３Ｆ−１遺伝子に関して、本発明者ら
は、この全遺伝子を第３図に示す１４のオリゴヌクレオ
チドから単一の連結反応で直接構成して、その後約５（
１０ｂｐのフラグメントをクローニングプラスミドに挿
入する場合、このプラスミドによる大腸菌の形質転換は
成功しないことを見出した。大フラグメントとしての合
成りＮＡは大腸菌内で効率よく複製されなかった。その
結果、別のクローニング方法を使用し、こうしてまず初
めに合成りＮＡの比較的小さいフラグメント乞サブクロ
ーニングし１次いでサブクローニングしたセグメン）Ｙ
組み合わせて完全な突然変異遺伝子とした。

別のクローニング方法では、第６図のオリゴヌクレオチ
１フ組み合わせて、それぞれ２８０ｂｐ　ｙ含む２つの
２重鎖予備フラグメン）Ｙ作った。フラグメント■と名
づけた第１のフラグメントにヌクレオチドＣ３Ｆ−Ａか
らＣ３Ｆ−Ｈまでを含み、フラグメント■と名づけた第
２のフラグメントはヌクレオチドＣ３Ｆ−ＧからＣ３Ｆ
−Ｎ−！でを含む。先に述べたように、オリゴヌクレオ
チドの５′末端はｄＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチド
キナーゼの存在下でリン１１ｉ１ｔｓして、オリゴヌク
レオチド同士ン連結できるようにする。しかしながら、
Ｃ３Ｆ−ＡおよびＣ３Ｆ−Ｎオリゴヌクレオチドはリン
酸１ヒせず、それにより”頭部対頭部″捷たば“尾部対
尾部”のそれらの連結を防ぐ。フラグメン）Ｉおよびｌ
Ｉ’＆形成するためのオリゴヌクレオチドの連結反応は
、とりわけＴ４１ＪガーゼおよびｄＡＴＰ’＆含む反応
混合物中で実施される。２つの予備ＤＮＡフラグメント
は電気泳動により連結反応混合物から分離される。予備
フラグメントの予測された位置に泳動するバンド乞電気
泳動ゲルから切り取つ　・で、エタノール沈殿および／
またはイオン交換クロマトグラフィーのような標準核酸
精製法により精製する。

その後、フラグメン）Ｉおよび■は制限酵素で消（’Ｆ
Ｓ　Ｌで、３つの別個の゛最終”フラグメント（各フラ
グメン）Ｈその後それらを組み合わせて完全な突然変異
遺伝子とするための特異な接着末端Ｚもつ）を形成する
。これに関して、予備フラグメン）ＩＨ制限酵素Ｈｉｎ
ｄｌｌＪおよび５ｓｔＴで消１じして、このフラグメン
ト乞２つの別個の最終フラグメントに切断し、Ｆ−１と
名づけた第１のフラグメントは第２図のヌクレオチド／
１６１から１７４まで伸長し、そしてＦ−２と名づけた
第２のフラグメントはヌクレオチド滝１７５から２６９
まで伸長する。

予備フラグメント■は制限酵素５ｓｔ）で消］シシて単
一のフラグメン）Ｙ形成し、Ｆ−６と名づけたそのフラ
グメントは第２図のヌクレオチドＪ６２７０から５（１
０捷で伸長する。その後、６つの個々のフラグメント乞
クローニングベクターに挿入して、プラスミド複製用の
宿主乞形質転換する。形質転換宿主は表現型マーカーに
より選択し１次いでアルカリ溶菌法のような公知方法の
いずれかを用いて形質転換体から複製プラスミドを抽出
する。３つのサブクローンの核酸配列は、例えばサンガ
ー（Ｓａｎｇｅｒ）らのＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ
、Ｓｃｉ、ＵＳＡＪ旦：　５４６３（１９７７）　に開
示され、以下の実施例Ａで詳述３ｔｒる標準チェインタ
ーミネーション法のようなりＮＡ塩基配列決定法で確認
する。

ｃＤＮＡからの突然変異構造遺伝子の作製全ヒ）ＲＮＡ
は比較的高レベルのＣ８Ｆ　−１を産生ずると考えられ
る細胞株または他の源（例えばヒト肺細胞または先に述
べたようなヒト膵臓細胞株ＭＩＡ−ＰａＣａ−２）から
抽出する。ダス（］）２ｓ）らの　Ｂｌｏｏｄ　５旦＝
６６０（１９８１）；ウー（Ｗｕ　）　　らのＢｉｏｌ
、Ｃｈｅｍ、２５４：６２２６（１９７９）；　おＬび
カワサキらの上記文献を参照さｎたい。全ＲＮＡ抽出物
からポ！ＪＡ＋ｍＲＮＡを単離し、その後逆転写酵素に
よるポリＡ＋ｍＲＮＡの逆転写にエリｃＤＮＡライブラ
リーを作製する。そのＤＮＡｙａ：ＤＮＡポリメラーゼ
■で２本鎖となし、適当なりローニングベクターに挿入
する。その後、組換えクローニングベクターを用いて適
当な宿主乞形質転換する。

上記方法の詳細はマニアチスらの上記文献（ｐ。

１８７）に開示されている。

形質転換宿主を同定して、プールごとに分ける。

これらのプールから調製さｎたプラスミドＤＮＡは、ヒ
トＣＳＦ−１遺伝子に対して相同性火水す放射性標識プ
ローブとハイブリダイゼーションさせる。例えば、オリ
ゴヌクレオチドグローブはカワサキらの上記文献によっ
て部分的に性状決定されたヒトＣＳＦ−１ゲノムクロー
ンの一部に対応するように牝牛的に合成しつる。

グローブに対して陽性信号乞示すクローンのプール乞同
定し、その推定上のプールヲサらに分割してハイバリダ
イゼーション選別乞繰り返す。最後に、ヒトＣＳＦ−１
遺伝子を含む単一の形質転換細胞を同定する。この形質
転換細胞からプラスタドＤＮＡ’に調製し１例えばサン
ガーらの上記文献記載のテエインクーミネーション法を
用いル塩基配列決定により同定する。

次罠、Ｃ３Ｆ−１ｃＤＮＡのカルボキシ末端部分にまた
はその近傍に存在する疎水性アミノ酪ヲコードするヌク
レオチドが除かれる。突然変異Ｃ３Ｆ−１遺伝子の九学
合成法に関して上述したように。

疎水性アミノ酸乞コードするヌクレオチドの６′側に存
在でる核酸もまた除かれる。さらに、疎水性アミノ酸欠
コードするヌクレオチド部分の５′末端に隣接して存在
する核酸も、生物学的活性が失われない限り除か扛る。

ｃＤＮＡからのこれらの標的核酸の除去は、例えば所望
の位置でｃＤＮＡン切断しつる制限酵素を用いてプラス
ミドｃＤＮＡＹ消１１Ｚするような、標準ｉｎ　ｖｉｔ
ｒｏ突然変異誘発法により達成しつる。別法として、プ
ラスミドｃＤＮＡのｉｎ　ｖｉｔｒｏ突然変異は、その
プラスミドを制限酵素で消１ヒして線状比し、次いで所
望の核酸がそのフラグメントの６′末端部分から除かれ
るまで、得らｔ″したＤＮＡフラグメントの測鎖’１Ｂ
ａ１３１エキソヌクレアーゼで同時に減成することによ
り実施しうる。この方法はｃＤＮＡの末端が切断−ｇｎ
だ形の突然変異遺伝子を作る際にとりわけ有用である。

さらに別の方法として、いろいろな突然変異誘発法（特
定部位−突然変異誘発法を含む）がｃ　ＤＮＡの中間位
置に存在するヌクレオチドを除くために使用される。特
定部位−突然変異誘発法の詳細はクレイク（Ｋｒａｉｋ
）　　の　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、　１９８５年
１月、１２−１９に開示さ几ている。ひとたび意図する
組成のｃ　ＤＮＡ突然変異遺伝子が作らｎると。

そ几はプラスミドの複製および以下に述べるような生理
活性Ｃ３Ｆ−１類似体の発現のために適でる宿主を形質
転換する際に使用するクローニングベクター中に挿入さ
れる。

酵母宿主によるＣ３Ｆ−１類似体の発現本発明者らは、
第２図に示す突然変異遺伝子が酵母宿主中で生理活性Ｃ
３Ｆ−１類似体を高レベルで発現しつることを見出した
。本発明は酵母によるＣ３Ｆ−１類似体の発現に特に限
定されず、他のタイプの発現系も含まれる。

酵母発現系では、第２図に示す突然変異Ｃ３Ｆ−１遺伝
子（第４図のような組み合わされたフラグメン）　Ｆ−
１，Ｆ−２およびＦ−３から成る）が細菌および酵母宿
主内での遺伝子の複製およびその後のＣ３Ｆ−１類似体
の発現のために考案されたシャトルベクター中に挿入す
几る。第４図に示すように、ｐαＦＣ８Ｆ−１と名づけ
られたシャトルベクターは好ましくは大腸菌の複製起点
および選択マーカーとしてのアンピシリン耐性遺伝子（
Ａｍｐｒ）Ｙ含むｐＢＲ３２２由来の配列（太線部分）
を含む。理想的には、その発現ベクターはまた酵母由来
の配列、例えば選択マーカーとしてのトリプトファン−
１遺伝子（Ｔｒｐ−１）および２μ酵母複製起点（第４
図の細線部分）を含む。また理想的には、そのシャトル
ベクターは酵母宿主におけるＣ３Ｆ−１類似体の高レベ
ル合成および分泌を導くα因子プロモーターおよびリー
ダー配列（第４図の点描ボックス部分）乞さらに含み、
こ几らに続いて突然変異Ｃ３Ｆ−１遺伝子（中空ボック
ス部分）を含む。α因子遺伝子の構造はカージャン（Ｋ
ｕｒｊａｎ）およびハースコビッッ（Ｈｅｒｓｋｏｗｉ
ｔｚ）ノｃｅｌｌ　３０：９３３（１９８２）　　に論
じられている。

初めに、突然変異Ｃ３Ｆ−１遺伝子を構成する６つのＤ
ＮＡフラグメント（第４図参照）および消比したシャト
ルベクターがら成る連結混合物を用いて大腸菌乞形質転
換する。形質転換された大腸菌宿主を選択し１次いで目
的の構築物欠含む組換えプラスミドを標準制限酵素分析
により同定する。

６つの合成りＮＡフラグメントＦ−１，Ｆ−２およびＦ
−３に組込まｔ″した唯一の制限酵素切断部位はこの方
法に役立つ。

次に、３つのＤＮＡフラグメン）Ｙ適切な順序で含むシ
ャトルベクター？用いてＳ、セ１／ビシェの適当な菌株
乞形質転換する。好適な菌株には酵母菌株７９．Ｘ２１
８１−ＩＢ、ＤＢＹ７４６．ＹＮＮ２８２゜２０Ｂ−１
２が含まれるが、これらに限定されない。

これらの菌株はすべてα因子プロモーターとの適合性の
ために、およびＴｒｐ十形質転換体の選択のためにα、
Ｔｒｐ−１　　である。これらの菌株はすべて広く入手
可能であり、例えば菌株７９はイースト・ジエネテイツ
ク・ストック・センター（ＹｅａｓｔＧｅｎｅｔｉｃ　
５ｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ　；　ＣＡ９４７０２．　　
バークレー、カリフォルニア大学　生物物理・医療物理
部）から入手しつる。

突然変異Ｃ３Ｆ−１遺伝子欠含む組換えシャトルベクタ
ーによる酵母宿主の形質転換は公知方法（プラスミドの
取込みに先立ってスフェロプラストを作り、その後洗浄
でる）に従って行われる。

この方法のための標準プロトコルはすでに確立されてい
る。ベッグス（Ｂｅｇｇｓ）　　の　Ｎａｔｕｒｅ（Ｌ
ｏｎｄｏｎ）　２７５：　１０４（１９７８）　；　　
お工びヒネン（Ｈｉｎｎｅｎ）らのＰｒｏｃ、　Ｎａｔ
ｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

以仄７５：１９２９（１９７８）　　を参照されたい。

生物学的活性についての検定 酵母細胞の培養上清は標準コロニー形成検定（以下の実
施例Ｂ）および比較的迅速なチミジン増殖検定（以下の
実施例Ｃ）で生物学的活性について検定した。コロニー
形成検定はネズミ源から得らｔ’ｔた骨髄細胞の増殖お
よび分比乞誘発するＣ３Ｆ−１の能力を調べる。この検
定では、形成さく２９） れたコロニーケ採取＋、、次にコロニー中に存在ｆる細
胞の型（例えば顆粒球、マクロファージ、好中球、好酸
球など）乞視覚＋ｔ、Ｖるために染色する。

コロニー形成検定の１つの欠点は、その完了１でに要す
る時間が比較的長い（ｆなわち７〜１４日間）ことであ
る。慣例的なコロニー形成検定に代わるものとして１本
発明に２４時間以内に完了する増殖検定を提供する。こ
の検定にヒトＣＳＦ−１がネズミ単核食細胞に対して生
物学的に活性であるが、ヒ）ＧＭ−Ｃ３Ｆはネズミ系に
おいてこの生物学的活性Ｚ示さないという観察に基づい
ている。

この検定はネズミ単核食細胞の増殖を誘発でる試料（ヒ
トＣＳＦ−１’Ｙ含むと推定される）の能力を調べるこ
とによりＣ３Ｆ−１活性の存在について試験する。この
検定の詳細は実施例Ｃにおいて後述する。

コロニー形成検定およびチミジン増殖検定に基づくと、
酵母発酵液は比較的高レベルのＣ３Ｆ−１活性を含むこ
とがわかった。測定されたレベルは約４５（１００　Ｃ
３Ｆ−１コロニ一形成単位／ミリリットル（ＣＦＵ／ｒ
ｒＬｌ）、または発酵液１ｄ当たり約１μＩの組換えＣ
３Ｆ−１類似体であった。

治療用途 本発明のＣ３Ｆ−１類似体は天然Ｃ３Ｆ−１の生物学的
活性ン示す。こうして、それは天然Ｃ３Ｆ−１と同じよ
うに治療１診断または検索用途において利用され１例え
ば感染症や腫瘍性疾患の診断および治療のために、細胞
により媒介サレる細胞毒性欠増大させるために、リンフ
オカイン活性比キラー細胞活性を刺激するために、病気
の状態におけるＣ３Ｆ−１’＆監視する診断検定法の開
発のために、ならびに白血球増加症および／ｌａＵ単球
増加症のｉｎ　ｖｉｖｏ　　誘発のために利用できる。

本発明のＣ３Ｆ−１類似体はそｎ自体で、または他の免
疫学的に有効なりまたｆｌＴ細胞細胞リンフイカイン類
くに他の治療剤と組合せて使用される。有用な治療剤の
例にはマクロファージ活性１し因子（ＭＡＦ）およびい
ろいろな型のインターフェロンが含まれる。

治療または診断用途のために、Ｃ３Ｆ−１類似体（３Ｊ
） は適当な無毒性の、非アレルゲン性の、生理学的に適合
性のキャリアー、例えば蒸留水９食塩水。

ヒト血清アルブミンと混合した食塩水、リンゲル液、バ
ンク液などに配合す几る。Ｃ３Ｆ−１は経口的に、ある
いは腹腔内、筋肉内または皮下に注射することにより適
切な方法で投与される。治療用途のためのＣ３Ｆ−１の
用量は１回につきＣ１，０１〜１０．（１００μ〃の範
囲でありうる。

実施例Ａ Ｄ　’Ｎ　Ａフラグメントの核酸配列決定突然変異Ｃ３
Ｆ−１遺伝子を作るためのザブクローン１しフラグメン
トＦ−１，Ｆ−２およびＦ−３を含め−ｒｃ　Ｄ　Ｎ　
Ａフラグメントハサンガーらの上記文献に初めて開示さ
れ、米国特許第４３２２４９９号に記載され、そしてＭ
１３クローニングおよび塩基配列決定と題するアマ−ジ
ャム・ハンドブック（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｈａｎｄｂｏ
ｏｋ）、ブレンハイム・クレセント、ロンドン（１９８
３）　　（以後°゛了ママ−ジャムハンドブック°°と
呼ぶ）に詳述サレる標準チェインターミネーション法に
より核酸配列を決定１−た。さらに、メツシンク（Ｍｅ
ｓｓｉｎｇ）のＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ　Ｔｅ
ｃｈｎｉｃａｌ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ、ＮＩＨ発行番号７
９−９９山４３−４８（１９７９）　；　　ノランダー
（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ）　　らのＧｅｎｅ　２６　：　
１０１（１９８３）　：セレツチ（Ｃｅｒｒｅｔｔｉ）
らのＮｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ、　Ｒｅｓ。

１１：２５９９（１９８３）；およびビギン（Ｂｉｇｇ
ｉｎ）らのＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ
、ＵＳＡ　８１１：３９６３（１９８３）を参照さｎた
い。

この核酸配列決定法でに、Ｍ１３線維状ファージが対象
のＤＮＡ配列のクローニングベクターとして使用サレる
。これらのファージベクターはチェインターミネーショ
ン法によって容易に核酸配列決定しつる１重鎖ＤＮＡテ
ンプレートヲもたらす。この方法は１本鎖テンプレート
分子に遊離６′ヒドロキシル基をもつ短鎖プライマービ
アニーリングし１次いでＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｌｅｎ
ｏｗ　フラグメント）および４種類すべてのデオキシリ
ボヌクレオチド三リン酸すなわちｄＡＴＰ　、　ｄ　Ｃ
ＴＰ　、　ｄＧＴＰ　。

ｄＴＴＰ（集合的に”ｄＮＴＰ’“　と称τ；　ｄＮＴ
Ｐのうち１種は放射性標識される）２使用する鎖伸長反
応によりテンプレート鎖ンコピーすることを包含する。

この合成反応でハ、６′ヒドロキシル末端を欠くヌクレ
オヂド特異的チェインターミネータ−１例えｉｄ’　２
’、　３’−ジデオキシヌクレオチド三すン酔（ｄｄＮ
ＴＰ）が使用され、それにより一連の鎖長の異なるＤＮ
Ａ分子が合成される。ターミネータ−は伸長しつつある
ＤＮＡ鎖罠取り込まれるように通常の５′末端ンもつが
、６′ヒドロキシル末端欠欠く。いったんターミネータ
−がＤＮＩＮに組み込マレると、もはやデオキシヌクレ
オチド三リン酸に付加されず、ＤＮＡ鎖の伸長が停止す
る。４種類のヌクレオチドｄＮＴＰ（すなわちｄＡＴＰ
、ｄＣＴＰ。

ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）のうちの１種のｄｄＮＴＰを
含む４つの別個の合成反応が行われる。ｄＮＴＰｏｌつ
は放射性標識されるので１合成鉛はポリアクリルアミド
ゲルで太き３により分画比し１ζ後オートラジオグラフ
イーにかけることができる。４つの反応からの合成りＮ
Ａ釦を別々のゲルレーンに並置してゲル電気泳動を行う
と、オートラジオグラフィーからのＤＮＡフラグメント
のパターンはクローン比ＤＮＡの核酸配列に一致する。

本発明のＤＮＡフラグメントは、以下で説明する変法を
伴うアマ−ジャム・ハンドブックに記載の方法に従って
、その核酸配列が決定された。フラグメン）ＨＰｓｔＩ
および／またＵＲｓａＩで消１ヒし、次いでＭ２Ｓ　１
本鎖線維状ファージベクターのｍｐ１８およびｍｐ１９
株（イリノイ州アーリントンハイツ、アマ−ジャム社）
にサブクローニングした。ｍｐ１８およびｍｐ１９ファ
ージベクターは、ノランダーらゐ上記文献に示されるよ
うに１次の唯一のクローニング部位：　Ｈｉｎｄ　ｍ；
　Ｓｐｈ　Ｔ：Ｐｓｔ　Ｉ；　Ｓａｌ　Ｉ：　Ａｃｃ　
Ｉ；　Ｈ＋ｎｃ　ＩＩｙ　ＸｂａＩ：ＢａｍＨＩ；　Ｘ
ｍａ　Ｉ；　Ｓｍａ　Ｉ；　Ｋｐｎ　Ｉ；　Ｓｓｔ　Ｉ
；および　Ｅｃｏ　ＲＩ　Ｙ含む。ｍｐ　ｉ　ｓおよび
ｍｐ１９ベクターの組成は同じ組成であるが、ｃＤＮＡ
挿入物の測鎖を２つのベクターで都合よく塩基配列決定
し得るように、上記の制限部位の順序がｍｐ１９ベクタ
ーでは逆になっている。対応するｃＤＮＡ挿入物乞含む
乞含１８およびｍｐ１９ベクター乞用いて大腸菌株に１
２のＪＭ１０７（メリーランド州ベセスダ。

ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ）ヲ形質転換し、
それによりセンス釧とアンチセンス鎖の１本鎖挿入物を
含む多数の１本鎖ＤＮＡテンプレートを生産した。

共通ノ合成７’　ラ（マー　：　５’−ＣＣＣＡＧＴＣ
ＡＣＧＡＣＧＴＴ−３’（ライスコンシン州ミルウォー
キー、Ｐ−Ｌバイオケミカルズ社）を１本１ｍ　Ｄ　Ｎ
　Ａテンプレートにアニーリングして上記のようにＤＮ
Ａ合成を開始させた。その後、伸長フラグメン）Ｙゲル
電気泳動により大きさに基づいて分離し、オートラジオ
グラフィーにかげ、そしてその泳動パターンからフラグ
メントのヌクレオチド配列Ｙ　推定Ｌ　ｒｃ。

このジデオキシ塩基配列決定反応では、放射性標識とし
てデオキシアデノシン５′（α−Ｃ３５Ｓ’３−ｙ−オ
）三リン酸（以後ｄＡＴＰ［α−３５Ｓ〕　と記す）を
使用した。また、アマ−ジャム・ハンドブック５６頁に
記載されるゲルを使用することなく、７Ｍ尿素、１（１
０ｍＭ）リス−ホウ酸（ｐＨ８，１）　　および２南エ
チレンジアミン四酢ＥＩＩＰ（ＥＤＴＡ）　Ｙ含む厚さ
０．４龍の６％ポリアクリルアミドゲルを使用した。

実施例Ｂ ネズミ骨髄コロニー検定 この検定では、骨髄幹細胞の半固体培養物中での分１ヒ
したマクロファージコロニーの形成ヲ刺激する本発明Ｃ
３Ｆ−１類似体の能力を調べた。形成すしたコロニーか
らの細胞は、オルセインで染色してコロニー１ヒ細胞を
視覚１ヒした。

この検定では栄養培地原液および寒天組成物７使用した
。寒天は滅菌蒸留水中の１．４バクトー寒天（ミシガン
州デトロイト、ジフコ社）から成っていた。栄養培地原
液（４℃で２週間まで貯蔵可能）は次の組成のものであ
った。

１、　２８．５％ウマ血清 ２、　０．７ｘ１０’Ｍ　　２−メルカプトエタノール
３、　０．１２ｍｇ／ｍｌ　アｙ、パラキン４、　０．
７ｍｇ／ｍｌグルタミン ５、　１５０Ｕ／ｗＬｌペニシリンＧ ６、　１５０Ｕ／ｍｌストＶブトマイシン７、　１．Ｉ
Ｘα−最少必須培地（αＭＥＭ）、および８．２．２Ｘ
　　ビタミン類（オハイオ州チャグリンフォールス、ギ
ブコラボラトリーズ；カタログ　≠３２０−１１２０　
） この検定法でに、５０μｌの試料Ｙｌｏｇ−２希釈系列
で適当なウェルに加えた。上記のバクトー寒天溶液用の
寒天は、その寒天懸濁液乞含む管を沸騰水浴中に約１０
分量大れることにより調製した。

いったん寒天が溶解したら、そニア′１−’Ｙ４０℃の
浴に移した。

栄養培地は３７℃に温め、培地７部とバクト一寒天溶液
３部を混合しく以後インキュベーション培地と称−ｒ）
、そして６７℃に保持した。その後。

パーコール処理した骨髄細胞７６７°Ｃに温め、すぐに
約５Ｘ１０’細胞／　ｍｌの最終濃度でインキュベーシ
ョン培地に加えた。骨髄細胞混合物欠３７℃に保ちなが
ら、試験すべき試料７含むプレートの各ウェルに２５０
μｇ了りコートを分配した。次いで、プレート２穏やか
に攪拌して、寒天が固１ヒするまで室温に置いた。その
後、ウェルが乾燥するのン防ぐために蒸留水を含むプラ
スチック製の箱の中にプレートン配置した。

５０個以上の細胞を含むコロニーを４日目、５日目およ
び７日目に計数した。比較的早い時期は顆粒球の計数に
適しており、そして遅い時期はマクロファージや混合コ
ロニーの計数に適していた。

それぞれの検定においてバックグラウンドのコロニー合
計数７得るために、数個のウェルにはＣ３Ｆ−１試料Ｙ
加えなかった。ブランクのウエルニ形成されたコロニー
の平均数は、試料を含む各ウェルにおいて見出されたコ
ロニー数から差し引いた。

被験試料中のＣ３Ｆ−１類似体の活性（ＣＦＵＳ）ｉｄ
、コロニー数がＩ　Ｘ　１０５　骨髄細胞によって形成
された最大コロニーの２分の１となる試料の希釈度に。

その場合（最大コロニーの２分の１）に観察されたコロ
ニー数２乗じた値に等しいとして求めた。

例えば、試料が１：１（１００の求釈度で最大コロニー
の半分（すなわち６５個）のコロニー乞生じたとすると
、その試料は３５Ｘ１（１００．すなわち３５（１０［
］ＣＦＵ／ｍＡ　を含むとされた。

コロニー中の細胞の型ハ、コロニーヲ採取して個々の細
胞ヲ０．６％オルセインおよび６０％酢酸から成る染料
で染色することにより決定した。この染色法では、等容
量の５０％メタノール（ＭｅＯＨ）を各培養物に加え、
次にその培養物乞室温で２０分間インキュベーションし
た。その後、５０％Ｍｅ０１■Ｚ吸引して除き、各培養
物に等容量の１（１０％ＭｅＯＨン加えて室温で２０分
間またに４℃で一晩インキユベーションした。次に、１
（１０％ＭｅＯＴ−Ｉ　火吸引除去し、培養物を乾かし
′ｒｃ。

この細胞培養物にオルセイン染料混合物乞、培養物のも
との容量の５０％に等しい量で加えた。

約２０分径細胞の核が肉眼で見えるようになった。

その後、培養物に多量の蒸留水を注入し、吸引して（沈
殿していた）オルセイン乞除いた。次に。

培養物のもとの容量に等しい容量の蒸留水を加えて染料
の色彩を増強し、かつコロニーの細胞組成を評価しやす
くした。

実施例Ｃ チミジン増殖検定 先に述べたように、Ｃの検定では非付着性骨髄細胞から
誘導’ｙｎるネズミ単核食細胞の増殖を誘発する本発明
Ｃ３Ｆ−１類似体の能力を調べた。ツシンスキー（Ｔｕ
ｓｈｉｎｓｋｉ）　　らの旦−ユ２８ニア１（１９８２
）；　　ツシンスキーおよびスタンレー（Ｓｔａｎｌｅ
ｙ）のＪ、　Ｃｅ１ｌ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　１１６：
６７（１９８３）；　　ならびにツシンスキーおよびス
タンレーのＪ、　Ｃｅ１１．Ｐｈｙｓｉｏｌ、１２λ：
２２１（１９８５）を参照されたい。この検定では、５
０μｌのαＭＥＭ乞９６−ウェル平底マイクロタイター
プレートの各ウェルにピペットで加えた。Ｃ３Ｆ−１に
ついて検定すべき試料５０μ７’Ｙ各列の第１ウエルに
分配した。次のウェルに移す前に各ウェルを混和しく約
８回のピペッティング）、その後５０μｌ容量分ン各列
の後方のウェルに移し、そｆ″１．により２倍希釈系列
をつくった。その後、各ウェルに５０μｌの細胞懸濁液
（５Ｘ１０３〜１０Ｘ１０３個の凍結したまたげ新鮮な
非付着性ネズミ骨髄細胞から成る）を加えた。この培養
物を空気中１０％ＣＯ２乞含む湿潤雰囲気中にて３７℃
インキュベーションＬ、７Ｃ０５〜７時間後、トリチウ
ム比チミジン（３ＨＴｄｒ）（マサチューセッツ州ボス
トン、ニューインクランド・ヌクレアー社）（比活性８
０Ｃｉ／ｍＭ）’ｆｇ含むαＭＥＭ＋（８０μＣｉ／ｍ
Ｊ）　２５μｌ乞各ウエルに添加した。その後、骨髄細
胞をウェルにまいてから２４時間が経過するまでその培
養物乞インキュベーションした。生物学的に活性なＣ３
Ｆ−１の存在下に培養した骨髄細胞のみが用量に依存し
て３Ｔ−ＩＴｄｒを取り込んだ。活性Ｃ３Ｆ−１の不在
下に培養した骨髄細胞はバックグラウンドレベルの３Ｉ
−ＩＴｄｒのみを取り込んだ。

培養の２４時間後、検定物ケオリつぶすことにより収穫
した。この目的のために、５％ＮＰ４０界面活性剤１２
．５μｌ乞各ウェルに分与し、培養物を１分間撮動装置
上にのせた。振動は細胞溶ＷＩヲもたらすが、核に無傷
のまま残（−だ。その後、アンチフオームＡエマルジョ
ン（ミズーリ州セントルイス、シグマ・ケミカル・カン
パニー）の１％溶液１２．５μＡＮＹ各ウエルに加え、
マイクロタイタープレート欠約１０秒間振動させた。そ
の後、マツシャー装置中のガラス繊維フィルター」二に
核を集めた。次いでフィルター２乾かし、それらの放射
能乞液体シソチレーションカウンターで計測した。

活性単位は最大３ＨＴｄｒ取込みの５０％ｌ誘発するＣ
３Ｆ−１類似体の量として計算した。従って、５０μｌ
の試料が１＝５の希釈度で最大３ＨＴｄｒ取込みの２分
の１の取込み７示したとすると、１単位は５０μｌの５
分の１、すなわち１０μｌ中に含まれるとされた。それ
故に、この試料は１（１００を１０で割った値、すなわ
ち１（１０Ｕ／μｌの活性火含むであろう。

実施例１ 突然変異Ｃ３Ｆ−１遺伝子の合成 第６図においてＣ３Ｆ−ＡないしＣ３Ｆ−Ｎと名づげら
れた１４のオリゴヌクレオチドは、アプライド・バイオ
システムダ３８０Ａ型ＤＮＡ合成機で製造者の説明書に
従って別々に合成した。第２図および第６図に示すよう
に、ヌクレオチドの組成は互いに相補的な末端乞形成す
るように選ばｎた（これらの末端はオリゴヌクレオチド
を組合せて大きい２重鎖ＤＮＡフラグメント乞作るのに
役立つ）。この目的のために、オリゴヌクレオチドＣ８
Ｆ−ＡおよびＣ３Ｆ−Ｂのそれぞれ５′末端と５′末端
、ならびにオリゴヌクレオチドＣ３Ｆ−ＭおよびＣ３Ｆ
−Ｎのそれぞれ６′末端と５′末端乞除いて、すべての
オリゴヌクレオチドは８ｂｐ　　の釦長の接着末端を協
同的に形成するように構築された。

さらに第２図に示すように、合成オリゴ中の数個のヌク
レオチドは第１図に示すｃＤＮＡ配列と異なっており、
それにより突然変異Ｃ３Ｆ−１遺伝子の５′末端からこ
の遺伝子の６′末端までの間に２４の唯一の制限酵素切
断部位がもたらされた。次の唯一の制限酵素切断部位が
含まれる：ＫｐｎＩ：Ｓｃａ　Ｉ；　Ｂｓｔ　Ｘ　Ｔ；
　Ｐｓｔ　Ｉ；　Ａｈａ　ＩＩ；　Ａａｔ　ＩＩ；Ｓａ
ｌ　Ｉ；　Ａｃｃ　Ｉ；　Ｈｉｎｃ　［；　Ａｆｌ　Ｉ
Ｉ；　Ｉ−ｒｉｎｄ　ｍ；Ｂａｎ　ＩＩ；Ｂｓｐ　１２
８６；　Ｈｇ１Ａ　Ｉ；　Ｎｓｐ　Ｕ；Ｓｓｔ　Ｔ：Ｓ
ｔｕ　Ｉ；　Ａｖａ　Ｉ；　Ｘｈｏ　Ｉ；　Ｓｓｐ　Ｉ
；　Ａｓｕ　ＩＩ；Ｂｓｍ　Ｉ　；　ＢａｍＨＩ　；　
および　ＸｂａＩ。

オリゴヌクレオチドＣ３Ｆ−ＡおよびＣ３Ｆ−Ｂは、次
の６個のアミノ酸：　Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ
−Ｌｙｓ−ＡｒｇＹコードするヌクレオチドを突然変異
Ｃ３Ｆ−１遺伝子の５′側に直接音むように考案された
。こルらの６個のアミノ酸は酵母宿主内でのＣ３Ｆ−１
の高ンベル発現のための酵母プレプロαリーダー配列の
カルボキシ末端部分からのものであり、以下の実施例６
で説明する。

第２図および第３図に示すように、オリゴヌクレオチド
Ｃ３Ｆ−ＡないしＣ３Ｆ−Ｎは、それらが２重鎖形に構
築されたとき、大体第１図に示すＣ３Ｆ−１遺伝子のｃ
ＤＮＡに一致するが、そのｃＤＮＡの３′セクシヨンの
有意な部分を除かｆ′した。この実施例で示す本発明の
特定の実施態様では、突然変異Ｃ３Ｆ−１遺伝子は第１
図の核酸Ａ４７４（アミノ酸残基Ａ　１５８　）で終止
していた。これは第２図の核酸Ａ　４９２　（アミノ酸
残基／１６．１６４）に相当する。

第３図に示す１４の１ヒ学合成されたオリゴヌクレオチ
ドは、それぞれ２８０ｂｐの鎖長の２つの予備２亜鉛フ
ラグメントに構築された。第１の予備フラグメント（フ
ラグメントＩ）ＨオリゴヌクレオチドＣ３Ｆ−Ａないし
Ｃ３Ｆ−Ｈから成り、第２の予備フラグメント（フラグ
メント■）ばＣ３Ｆ−ＧないしＣ３Ｆ−Ｎから成ってい
た。これらのフラグメントは標準酵素的連結反応により
構築された。

しかしながら、連結反応７行う前にオリゴヌクレオチド
の５′末端乞リン酸ｆじＩ−て、フラグメント乞連結で
きるようにした。しかし、オリゴヌクレオチドＣ３Ｆ−
ＡおよびＣ３Ｆ−Ｎの５′末端はリン酪１ζせず、それ
によりフラグメン）Ｉおよび■の末端対末端または尾部
対尾部の連結を防いだ。リン酸１６は次の成分：第６図
に示″′ｒ１４のオリゴヌクレオチド（それぞれ１０　
ｔｔｇ／ｌ１ｌ）　；　１　ｍＭ　ｄＡＴＰ　；　Ｔ、
ポリヌクレオチドキナーゼ（ＩＯＵ／μｙＤＮＡ）；７
０ｍＭ　）リス−ＨＣＩ（ｐＨ７，６）：１０ｍＭＭｇ
Ｃｌ□；および５ｒｒＭ　　ジチオトレイトールを含む
反応混合物中３７℃で１時間実施した。１時間後、６０
℃で１０分間加熱することにより反応を停止させた。

リンｍ１ｔ１．が完了した後１合成オリゴヌクレオチド
を一緒に連結して２重釧予備フラグメント■および■乞
形成した。連結反応は次の成分：オリゴヌクレオチド（
それぞｔ’Ｌ３．３μＦ値）；Ｔ４ＤＮＡ　　リガーゼ
（１Ｕ／ｆｉ９　ＤＮＡ）：５０ｍＭ　　）リスートＩ
ＣＩ（ｐＨ７，４）：１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２：１０ｍＭ
ジチオトレイ）　−７＋／　；　１　ｍＭ　スペルミジ
ン；および１　ｍＭ　ｄＡＴＰ乞含む乞含混合物中室温
で５分間実施した。連結反応後、形成されたＤＮＡフラ
グメントば８９ｍＭトリス−ホ’ｙ　ｍ　（ｐＩ（８，
０）および２ｍＭＥＤＴＡ　’ｒ：含む低メルトアガロ
ースゲル（ジ−プラーク：５ｅａ−Ｐｌａｑｕｅ　、メ
イン州ロックランド、ＦＭＣ＝１−ポレーション）上で
の電気泳動により分離した。

予測’ｇ′ｉ″Ｌ′１？ｃ大きさの予備フラグメント■
および■の位置洗泳動した核酸バンドをゲルから切り出
し、その後エルチップ−ｄ　（Ｅｌｕｔｉｐ−ｄ）イオ
ン交換クロマトクラフィーカラムにューハンプシャー州
キーノ、シャイチャー＆シュエル）ヲ用いて製造者の説
明書に従って精製した。

予備フラグメントＩおよび■ばその後制限酵素で消比し
て、サブクローニング用の３つの最終ＤＮＡフラグメン
トＦ−１，Ｆ−２およびＦ−３を形成した。フラグメン
）Ｉは例えばマニアチスらの上記文献（ｐ−１０４）に
詳述される標準方法により制限酵素Ｈｉｎｄ１ｍおよび
５ｓｔＩで消［じした。この消Ｉｔ、方法によると、フ
ラグメントＩｆｌ第１の１７５ｂｐＫｐｎＩ　−Ｈｌｎ
ｄｌｌＤＮＡ　７７グメント（Ｆ−１と命名）、および
第２の９５ｂｐ　Ｈｉｎｄｍ　−５ｓｔＩフラグメント
（Ｆ−２と命名）に分割３ｆｉだ。予備フラグメン）Ｉ
ＩＪｊ：５ｓｔＩで消比して、２３０ｂｐのＳｓ　ｔ　
Ｉ　−Ｘｂａ　Ｉフラグメント（Ｆ−６と命名）を形成
した。

３）の最終フラグメントＦ−１，Ｆ−２およびＦ−６は
標準方法を使ってサブクローニングした。この目的のた
めに、マニアチスらの上記文献（ｐ、２２９）に記載さ
れるような標準方法な用いて、Ｆ−１およびＦ−２フラ
グメントを制限酵素Ｋｐｎ　■−Ｉ−Ｉｉ　ｎｄ■また
はＨｉｎｄｕ／　Ｓｓｔ　Ｉで予め処理したプラスミド
ｐＵｃ１９に連結した。ｐＵｃ１９プラスミドは市販さ
ｎている。Ｆ−３７ラグメントハ制限酵素５ｓｔ）およ
びＸｂａｉで予め消比したプラスミドｐＧｅｍ４　　（
ウィスコンシン州マジソン、プロメガ・バイオチク社）
Ｋ連結した。

その後、ハナハン（Ｈａｎａｈａｎ）のＪ、　Ｍｏ１．
Ｂｉｏｌ。

工ωＳ：５５７（１９８３）に記載の方法により、受容
能力をもつようにした大腸菌株ＭＭ２９４ｖ上記の組換
えプラスミドで形質転換した。この方法において、ＭＭ
２９４のコロニーは凍結細胞源からの新しいストリーク
（画線培養物）から採取しく１０〜１５ｒｒＬｌ！当た
り直径２．５　ｍｍのコロニー１個）、適度のポルテッ
クス攪拌によりＳＯＢ培地１ｒｒＬｌ中に分散した。Ｓ
ＯＢ培地は２％（ｗ／ｖ）バタトトリプトン、０．５％
（ｗ／ｖ　）酵母エキス、１０ｍＭ　ＮａＣｌ。

２．５ｍＭ　ＫＣＩ、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１０ｍＭ
　Ｍｇ５Ｏ。

から成る。この培地をオートクレーブ滅菌し、Ｍｇ２＋
源（ＩＭ　ＭｇＣｌ２・６Ｈ２０＋ＩＭ　ＭｇＳＯ４・
７Ｈ２０、滅菌沢過したもの）を加えて培地中のＭｇ　
２”ｊｔ　２０ｍＭとした。その後、この混合物を予め
洗浄した２２μｍフィルター装置に通して滅菌ｆ過した
。混合物の最終ｐＨｆ１６．８〜ＺＯであった。

ＳＯＢ中に分散した細胞ン用いて、予め洗浄したフラス
コ中のＳＯＢ培地（３（１０ｒｆＬｌフラスコ中１０〜
６０属）に接種した。

その後、培養物は細胞密度が４Ｘ１０７〜７Ｘ１０７／
ｍｌになるまで（５５０ｎｍでの吸光度＝ＤＨ１に対し
て０．４５〜０．５５：約２〜２．５時間）３７℃、２
７５μｌｍでインキュベーションした。細胞乞５０　ｍ
ｌ　ホＩ７７’ロビレン管に集めて水中に１０〜１５分
間置き１次に４℃、２５０ｒｐＩ’　で１２分間沈殿さ
せた。細胞をｚ容量の形質転換緩衝液（ＴＦＢ）中に穏
やかなポルテックス攪拌により再懸濁し、水中に１０〜
１５分間置き、再度４℃、２５（１０Ｏｒｐｍで１０分
間沈殿させた。

ＴＦＢは１０ｍＭ　Ｋ−ＭＥＳ　（１）Ｈ６，２）　、
　１（１０ｍＭＲｂＣｌ　、４５ｍＭ　ＭｎＣｌ２−４
Ｈ，，０，１０ｍＭ　ＣａＣｌ２−２Ｈ２０，３ｍＭ　
ＨＣｏＣ＋３　から成ってイｆ（−０Ｍ−ＭＥＳはＫＯ
Ｈを用いてｐＨ６，３に調整し、滅菌ｆ過して一２０℃
で貯蔵した。すべての塩類は固体として加えた。この溶
液は予め洗浄し７’ｖ０．２２μｍフィルター装置に通
して滅菌ｆ過し、１年以上の間４℃で貯蔵した。

次に、沈殿物娑細胞のもとの容量の”／１２．５のＴＦ
Ｂ中に再懸濁した（２．５１ｄの培養物が２（１０μｌ
の別個の形質転換緩衝液中に濃縮されｆｃ）。

新しいＤＭＳＯを６．５％（７μ、６／２（１０ＷＬｌ
）　　ｔで加え。

攪拌し、水中に５分間量いた。その後ジチオ１・レイト
ールＹ７５ｍＭまで加え、攪拌し、水中に１０分間放置
した。さらに等割合のＤＭＳＯ’Ｙ加え、次いで細胞を
水中で５分間インキュベーションした。

その後試料（２１０μＡ）ｖ冷却した１　７ｍｍ×１（
１０ｍｍポリプロピレン管（フアシヨン４２０５９）の
中ニ入ｎた。ＤＮＡ乞加え（１０μｌ以下）、この混合
物’ＩＩ　攪拌し、水中で６０分間インキュベーション
した。次いでこの混合物を攪拌せずに４７℃で９０秒間
加熱し、その後水中に１〜２分間置装た。

ＳＯＣ培地（約２０℃）８（１０μｌを加え、この管Ｙ
３７°Ｇ、２２５ｒｆ’で１時間インキュベーションし
た。

ＳＯＣ培地は２０ｍＭグルコース乞含乞含ＯＢ培地から
成る。

培養物の適当な分画は、ベント式（Ｌ字形）パスツール
ビペラ）Ｙ使って適当な抗生物質を含有するＬ培地平板
上のＳＯＢ培地（１（１０〜２（１０μｌ）のプール中
た取り出し、穏やかにかつ最小限度に広ケた。次いで、
その平板を６７℃でインキュベーションしてコロニーを
形成させた。形質転換細胞は培地中に存在する表現型同
定剤（アンピシリン、７５μｇ〜）を用いて選択した。

６つのサブクローンについて形質転換宿主を同定した後
、それぞｎのサブクローンの核酸配列を実施例Ａで」二
連したＤＮＡ塩基配列決定法により確かめた。

目的のＤＮＡフラグメントＦ−１，Ｆ−２およびＦ−３
を含む形質転換宿主は標準方法によりそれらの核酸配列
を決定した。その後、ＤＮＡ’ａ’上記のように分離精
製した。

実施例２ 合成りＮＡクローンからの機能的Ｃ３Ｆ−１類似体の発
現 第２図に示す合成突然変異Ｃ３Ｆ−１遺伝子が機能的な
Ｃ３Ｆ−１タンパク質をコードすることを確かめるため
に、３つのサブクローンｆ’ｂ　Ｄ　Ｎ　Ａフラグメン
トＦ−１，Ｆ−２およびＦ−３’Ｙプラスミドｐα３に
連結させ、それにより酵母宿主細胞内でのＣ３Ｆ−１類
似体の高ンベル発現を導く組換えシャトルベクター（ｐ
αＦＣ８Ｆ−１と命名）を形成した。

出発プラスミドのｐα６はメリーランド州２０８５２゜
ロックビル、バークローンドライブ１２３０１　　、ア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣ
Ｃ）に寄託番号５３２２０として寄託されている。第４
図に示すように、ｐα６プラスミドはプラスミドｐＢＲ
３２２由来の複製起点およびＡｍ　ｐγ耐性遺伝子を含
む（太線部分）。また、ｐα６プラスミドに２μサ一ク
ル複製起点および形質転換酵母宿主（Ｔｒｐ−栄養要求
株）乞選択するためのＴｒｐＩ遺伝子を含んでいる（第
４図の細線部分）。

Ｃ３Ｆ−１配列（第４図の中空ボックス部分）Ｕα因子
配列の下流（３リ　末端に融合された。ｐα３プラスミ
ドはまた実施例１で製造した合成Ｃ８Ｆ　−１フラグメ
ント（フラグメントＦ−１，Ｆ−２およびＦ−６）へ有
利に連結させるために、接着ＫｐｎＩ部位および接着Ｘ
ｂａＩ部位と適合するＳｐｅ　Ｉ部位を有するリンキン
グオリゴヌクレオチド（中実ボックス部分）を含む。

ｐα３ベクター乞制限酵素ＫｐｎＩおよび５ｐｅＩで消
比した。酵素５ｐｅＩばＸｂａＩにより形成される接着
末端と適合しつる接着末端Ｚ生成する。

ｐαＦＣ８Ｆ−１シヤトルベクタ一乞作製するために。

マニアチスらの上記文献に記載されるような標準方法に
より、４通りの連結反応をＫｐｎ　Ｉ　−Ｓｐｅ　７消
比ベクター；　Ｆ−１（ＫｐｎＩ−Ｈｉｎｄｍ）１７５
ｂｐ　　合成りＮＡ７ラグメント：　Ｆ−２（Ｈｉｎｄ
ｌｒＩ−８ｓｔＩ　）９５ｂｐ合成りＮＡフラグメント
；およびＦ−ろ（ＳｓｔＩ−ＸｂａＩ）２３０ｂｐ合成
りＮＡ７ラグメントＺ使用して実施した。この連結方法
では、約５０ｎｇのベクターフラグメントラそれぞれ約
１Ｏｒ＋ｇの６つの合成りＮＡフラグメントと一緒に連
結させた。次に１例えばポリバー（１３ｏ１１ｖａｒ）
　　らのＧｅｎｅ　２：９５（１９７７）およびビーフ
ｙり（Ｐｅａｃｏｃｋ）らのＢｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏ
　ｈ　ｓ、　Ａｃｔａ、　６５：２４３（１９８１）に
記載されるような標準形質転換法により、この連結混合
物ン用いて大腸菌株ＲＲ，１乞形質転換した。大腸菌の
この菌株は広く商業的に入手可能である。宿主細胞は培
養下に増殖させ。

培地から取り出し、その後溶菌した。形質転換さｔｌ、
た宿主細胞からのプラスミドは１例えばマニアチスらの
上記文献（ｐ、３７４）ならびにスミス（Ｓｍｉｔｈ）
　　およびバーンスチー／ｌ／　（Ｂｉ　ｒｎｓ　ｔ　
ｉｅ　Ｉ　）の・Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ、Ｒｅｓ、　３
：２３８７（１９７６）　　に記載の技法を用いて、標
準制限酵素分析によりプラスミド内での突然変異Ｃ３Ｆ
−１遺伝子フラグメントノ正しい方向性について調べた
。

６つのＤＮＡフラグメントが適切な相対位置に連結され
たこと乞確かめた後、標準方法による’ｌ’ｒｐ＋形質
転換細胞の選択のためのＳ、セレビシェの酵母菌株７９
（α、Ｔｒｐ１−１．Ｌｅｕ２−１）　　を組換えＤＮ
ＡシャトルベクターｐαＦＣ８Ｆ−１で形質転換した。

形質転換に先立って、菌株７９はＹＥＰＤ培地〔１％（
Ｗ／Ｖ）酵母エキス、２％（ｗ／ｖ）ペプトン、２％（
Ｗ／Ｖ）　　グルコース〕中で２Ｘ１０７細胞／　ｍｌ
の密度へ培養増殖させた。細胞ヲ２２℃。

１ｏｏｏｘ、ｙで５分遠心することにより収穫し、その
後沈殿物乞滅菌蒸留水で洗った。

次いで、酵母細胞はＸ。容量のＳＥＤ〔１Ｍソルビトー
ル、　２５ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）および５０ｍ
Ｍジチオトレイトール〕中に再懸濁し、６０℃で１０分
間インキュベーションするＣとにより濃縮した。その後
、細胞−緩衝液混合物Ｙ３（１０Ｘ、ｆで５分間遠心し
、沈殿物を４゜容量の１Ｍソルピト一ルで１回洗い、そ
の細胞ｔ】／、。容量のＳＣＥ［１Ｍソルビトール、　
０．１　Ｍクエン酪ナトリウム（ｐＨ５，８）　、　０
．０１ＭＥＤＴＡ〕　中に再懸濁した。

この液に細胞壁乞破壊する１０−３容量のグルスラーゼ
を添加し１時々穏やかに攪拌しながら６０℃で３０　分
間インキュベーションした。スフェロプラストの存在は
、顕微鏡スライドガラス上の５％（Ｗ／Ｖ）ドデシル硫
酸ナトリウム（ＳＤＳ）１滴中に酵母細胞１０μｌｌ’
を希釈して、４（１０Ｘ位相差で゛ゴースト”を観察す
ることにより検定した。その後細胞混合物を３（１０Ｘ
、？で６分間遠心（−た。得らｆｌ、た沈殿物を’／１
０容量の１Ｍソルビトールで２回洗い、次にＣａＳ（Ｉ
Ｍ　　ツルピトー＃、１０ｍＭＣａＣｌ２）で１回洗っ
た。

ソノ後、　酵ｆｆｌスフエロプラス）ｆｌベンゲスの上
記文献記載の方法の変法を用いて先に作製した発現ベク
ターで形質転換した。スフェロプラスト沈殿物”　’／
２（１０容量のＣａＳに懸濁Ｌ　、　　１．５　ｍｌ　
ｘ　７　ヘンドルフ管に１（１０μｌアリコートずつ分
けた。次いで１〜１０μｌ　のプラスミドＤＮＡＹ各ア
リコートに加えた（０．５〜５μｇ）。この混合物ン室
温で１５分間インキュベーションし、’ｉｍｌのポリエ
チレングリコール（ＰＥＧ）（２０％ＰＥＧ４（１００
，１０ｍＭＣａＣ！２．１０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７４））Ｙ各アリコートに加えてＤＮＡの取込みを高
めた。

室温で１５分後、この混合物ｗ３５０ｘｇで５分間遠心
した。得られた沈殿物を１５０μｌのＳＯ８（２Ｍツル
ピトー＃　１０　ｒｔｔｌ　、　ＹＥＰＤ培地６．７　
ｍｌ　、　ＩＭ　ＣａＣｌ２０．１３ｄ、１％トリプト
フ了ノン２フμｌよび水ろ、７ｒｎｌ）中に再懸濁し、
この混合物を３０℃で２０分間インキュベーションした
。その後細胞ｗ平板培養した。

プロトプラス）／ＤＮＡ混合物を平板培養する前に、　
選択平板’Ｙ　３７℃でプＶインキュベーションした。

その後、形質転換細胞の各アリコートにソルビトール１
８．２７ｄ；寒天２ｇ；ジフコ酵母窒素塩基（アミノ酸
不含）０．６ｇ；グルコース２ｇ；１％アゾ＝：１０．
１１ｎＩ！；１％ウラシルＱ、　４　ｍｌ　；および必
要に応じてアミノ酪ヲ含む溶融した上層寒天（４５℃）
３ｍｌｖ加え、この混合物を選択平板上に注いだ。平板
”２５０℃で２〜４日間インキュベーションした。Ｔｒ
ｐマイナス培地で発生したコロニーはＴｒｐ　１遺伝子
をもつプラスミド（すなわち形質転換用プラスミド）を
含んでいた。

バイオアッセイに先立って、形質転換細胞はＹＥＰＤ２
０〜５０ｒｌＬｌ　　中６０℃で定常期ｔｆｊＨｉ３せ
た。収穫時に、プロテアーゼ阻害剤のフェニルメチルス
ルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）およびヘフスタチン
ＡＹそれぞｔ’Ｌ　１　ｍＭおよび１０μＭの最終濃度
で加えた。その後細胞１４（１０Ｘ、！９で遠心するこ
とにより分離し、培地は０．４５ミクロンのセルロース
アセテートフィルターにューヨーク州コーニング、コー
ニング・グラス°ワークス社）７通して沢過した。滅菌
上清を４℃で貯蔵した。

得られた上清は、コロニー形成検定おｊ：びチミジン増
殖検定で調べたとき、約４５（１００　Ｃ３Ｆ−ＩＣＦ
則官または酵母発酵液１１当たり組換えＣ３Ｆ−１１μ
ｇ乞含んでいた。

本発明の突然変異Ｃ３Ｆ−１遺伝子が機能的なタンパク
質乞コードでるという本発明者らの発見は、Ｃ３Ｆ−１
分子の活性部位が第２図に示すＣ３Ｆ−１のアミノ酸配
列中に含まれるという結論に導く。

また、十分に理解さ几でいない理由のために、核［Ａ４
７４の３′側に位置するＣ３Ｆ−１ｃＤＮＡ　　の部分
は生物学的に活性な全長Ｃ３Ｆ−１の発現を抑制する原
因でありうることがわかった。Ｃの発見により、今や活
性Ｃ３Ｆ−１は商業的に１例えば大規模酵母発酵で量産
することができる。今まで、こｎ、ｌｌ−を不可能であ
った。

実施例６ Ｃ３Ｆ−１ｃＤＮＡ　　のｉｎ　ｖｉｔｒｏ　　突然変
異遺伝子に述べたように、ヒトＣＳＦ−１のｃＤＮＡ核
際配核酸第１図に示さ几る。ヒトＣ３Ｆ−１のｃＤＮＡ
はカワサキらの上記文献記載の方法により岡山−バーブ
発現ベクター（Ｍｏｌ、　Ｃｅ１ｌ、　Ｂｉｏｌ、　２
：１６１（１９８２）を参照）ヲ使用して作製した。

Ｃ３Ｆ−１の突然変異遺伝子ばＣ３Ｆ−１ｃＤＮＡのｉ
ｎ　ｖｉｔｒｏ突然変異誘発によりつくった。これはＣ
３Ｆ−１ｃＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡを制限酵素５
ｃａＩおよびＢａｍＨＩ　　で消雷して、第１図の核酸
／ｒ６１７から核酸、％、４６９まで伸長する線状ｃＤ
ＮＡフラグメントをつくることにより実施した。

その後、得らｎたＤＮＡフラグメン）　ｙｔ　Ｔ、ＤＮ
Ａポリメラーゼで処理して、　ｌＢａ＋ｎＨＩ　　末端
の５′突出部分を除いた。単離したｃＤＮＡの６′末端
に１例えばマニアチスらの上記文献に記載３ｎる標準方
法によりＮｃｏＪリンカ−乞付加し、それによりｃＤＮ
Ａフラグメント７％ｐα３シャトルベクターのＮｃ０１
部位へ連結できるようにした。次の組成：ＧＧＧＴＡＡ
ＣＣＡＴＧＧＣＣＣ（ｎ　Ｎｃｏ　Ｉリンカ−は停止コ
ドンＴＡＡを含む。ＮｃｏＩ　リンカ−ＹＮｃｏ■制限
酵素で消１ヒして接着３′末端を形成した。得られた５
ｃａＩ−ＮｃｏＩ　　ｃＤＮＡフラグメントはアガロー
スゲルによる電気泳動で精製した。

プラスミドＤＮＡの制限酵素５ｃａＩによる消ＩＹ：Ｊ
によってｃＤＮＡフラグメントの５′末端から除かｎた
ヌクレオチドを付加するために、オリゴヌクレオチド乞
製造した。このオリゴヌクレオチドはまた酵母系での高
レベルＣ３Ｆ−１発現のためのプロモーター配列、およ
びオリゴヌクレオチドをクロ一ニングベクターに連結す
るための５′接着末端乞含んでいた。以下の表１に示す
オリゴヌクレオチドの組成ばＫｐｎＩ接着５′末端、続
いて酵母プレプロαリーダー配列のカルボキシ末端部分
および次のアミノ酸：　Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−３ｅ
ｒ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ　ｑコードする核酸を含む。

表　　　１ ５’　ＣＴ　ＴＴＧＧＡＴＡＡＡＡＧＡＧＡＧＧＡＧＧ
ＴＧＴＣＧ弘ＧＴ３’３’ＣＡＴ　ＧＧＡＡＡＣＣＴＡ
ＴＴＴ　ＴＣＴ　ＣＴＣＣＴＣＣＡＣＡＧＣＣＴＣＡ５
’得られた突然変異Ｃ３Ｆ−１遺伝子は第１図の核ｗ／
Ｉ６ｉから核Ｗ／ｉＡ　４６９まで伸長する。Ｃの遺伝
子によってコードされるＣ３Ｆ−１類似体は、実施例１
で上述したｐα６シヤトルベクター乞使用することによ
り、酵母宿主細胞内で発現３ｆ’Ｌ′ｒｃ０ｐαＦｍｕ
ｔ　　Ｃ３Ｆ−１と名づけだシャトルベクター’＆作る
ために、　ＫｐｎＩ−ＮｃｏＩ消比ｐ消雷プラスミド。

Ｋｐｎ　Ｉ−Ｓｅａ　Ｉリンキングオリゴヌクレオチド
（表１参照）、および５ｃａＩ　−ＮｃｏＩ　　Ｃ３Ｆ
−１ｃＤＮＡフラグメントを用いて３通りの連結を行っ
た。得られだシャトルベクターを用いて実施例１に詳述
した方法により大腸菌株ＭＭ２９４”ｋ形質転換した。

形質転換された大腸菌宿主ン選択し、その中に含ｔ−れ
るプラスミドＤＮＡ’＆制限酵素分析で分析してオリゴ
ヌクレオチド、突然変異Ｃ３Ｆ−１遺伝子およびｐα３
プラスミドが適切な相対位置で連結されたことを確かめ
た。その後、実施例２に記載の方法乞用いてシャトルベ
クターで酵母菌株７９乞形質転換した。実施例２のよう
に、酵母上清は実施例ＢおよびＣに詳述したコロニー形
成検定ならびにチミジン増殖検定で調べた。

【図面の簡単な説明】

第１図はヒトＣＳＦ−１ｃＤＮＡの核酸配列および推定
上のアミノ酸配列を示す； 第２図は本発明のヒトＣＳＦ−１遺伝子の核酸配列およ
び対応するアミノ酪配列欠示し、成熟タンパク質のＮ末
端は矢印が付けられており、制限酵素切断部位が示さｎ
、また第１図に示すｃＤＮＡからのヌクレオチド変１ヒ
が小文字で示されている；第３図は第２図に示す突然変
異Ｃ３Ｆ−１遺伝子を形成するために使用される１ヒ学
合成されたオリゴヌクレオチドの組成を示す； 第４図は第２図に示すＣ３Ｆ−１突然変異遺伝子を組込
んだｐαＦＣ３Ｆ−１プラスミドの構築方法を示ｆ模式
図である（このプラスミドはその複製のために大腸菌細
胞を形質転換しかつ生物学的に活゛　性なＣ３Ｆ−１類
似体の発現のために酵母宿主細胞を形質転換でる際に使
用サレる）；そして第５図は第１図に示すＣ３Ｆ−１ｃ
ＤＮＡの１ｎｖｉｔｒｏ　　突然変異誘発により誘導’
ｇｎた突然変異Ｃ３Ｆ−１遺伝子１組込んだシャトルベ
クターの構築方法７示す模式図である（このベクターも
プラスミドの複製および活性Ｃ３Ｆ−１の発現のために
それぞれ大腸菌細胞および酵母宿主細胞ケ形質転換する
際に使用される）。 手続補正書（方式） 昭和６２年　９月７８日

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）アミノ酸の組成が天然タンパク質と一致するが、
   トランスメンブラン領域に特徴的な疎水性アミノ酸の欠
   失または置換により天然タンパク質と異なる、生物学的
   に活性な組換え突然変異ポリペプチド類似体。
2. （２）天然ポリペプチドはリンフオカインまたはリンフ
   オカイン受容体である、特許請求の範囲第１項記載のポ
   リペプチド類似体。
3. （３）天然ポリペプチドはヒトＣＳＦ−１である、特許
   請求の範囲第２項記載のポリペプチド類似体。
4. （４）第１図のアミノ酸１−１６６に一致するアミノ酸
   配列から成る、特許請求の範囲第３項記載のポリペプチ
   ド類似体。
5. （５）第１図のアミノ酸１−１５８に一致するアミノ酸
   配列から成る、特許請求の範囲第３項記載のポリペプチ
   ド類似体。
6. （６）特許請求の範囲第１〜５項のいずれか１項に記載
   のポリペプチド類似体をコードする突然変異ＤＮＡ配列
   。
7. （７）第２図のヌクレオチド配列に一致するヌクレオチ
   ド配列をもつ突然変異ＤＮＡ配列。
8. （８）特許請求の範囲第６項または第７項に記載のＤＮ
   Ａ配列を含む、原核または真核単細胞生物内での組換え
   タンパク質の発現に適するプラスミドベクター。
9. （９）特許請求の範囲第６項または第７項に記載のＤＮ
   Ａ配列を含む、酵母内での組換えタンパク質の発現に適
   するプラスミドベクター。
10. （１０）特許請求の範囲第６項または第７項に記載のプ
    ラスミドベクターを含む宿主生物を培養し、発現された
    ポリペプチドを発酵培地から回収することから成る、ア
    ミノ酸の組成が天然タンパク質と一致するが、トランス
    メンブラン領域に特徴的な疎水性アミノ酸の欠失または
    置換により天然タンパク質と異なる、生物学的に活性な
    組換え突然変異ポリペプチド類似体の発現方法。