JPS6350997B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は微生物を利用してアリルベンジルエー
テルから相当する光学活性エポキシドである光学
活性フエニルメトキシメチルオキシランを製造す
る方法に関する。 光学活性フエニルメトキシメチルオキシラン
は、アミン類によるオキシラン環の開環反応や還
元反応により種々の光学活性誘導体を合成し得る
ので合成中間体として医薬や濃薬などの製造上重
要なものである。 従来技術 従来、オレフインから相当するエポキシドを製
造する方法としては、過酸化水素や有機過酸など
の過酸化物を酸化剤として用いて酸化する化学的
方法並びに微生物を用いて酸素酸化する生化学的
方法が知られている。このうち、微生物を用いる
方法ではノカルデイア属、シユードモナス属、ブ
レビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、マ
イコバクテリウム属、アルスロバクター属、アシ
ネトバクター属、アルカリゲネス属、メチロバク
テリウム属、メチロコツカス属、メチロシナス属
などに属する微生物を直鎖状オレフインあるいは
スチレンやアリルベンゼンなどのアルケニルベン
ゼン類に作用させて相当するエポキシドを生産す
ることが知られている。 微生物によるエポキシ化では、用いる微生物の
種類により、エポキシ化できるオレフインが限ら
れており、例えば、シユードモナス・オレオボラ
ンスでは、炭素数６から12までのα−オレフイン
〔B.J.Abbott and C.T.Hou、Appl.Microbiol.
26、86−91（1973）〕、α、ω−ジエン〔S.W.
May、R.D.Schwartz、B.J.Abbott and O.S.
Zaborsky、Biochim.Biophys.Acta、403、245−
255（1975）〕、およびアリルベンゼン〔Ｍ−Ｊ
de Smet、J.kingma、H.Wynberg and B.
Witholt、Enzyme Microb.Technol.、５ 352−
360（1983）〕はエポキシ化されるが、プロピレン、
１−ブテン、２−オクテン、シス−５−デセン、
シクロヘキセンおよびスチレン〔S.W.May、R.
D.Schwartz、B.J.Abbott and O.S.Zaborsky、
Biochim.Biophys.Acta、403、245−255（1975）〕
はエポキシ化されないことが報告されている。 他方、ノカルデイア・コラリーナは、炭素数３
から18までのα−オレフイン（特公昭56−40号）
をエポキシ化し、また２−オクテン、３−オクテ
ン等の内部オレフイン（特開昭58−141791号）も
エポキシ化する。 このように微生物によるエポキシ化では用いる
微生物の種類によりエポキシ化し得るオレフイン
の種類が異なるために、個々の微生物あるいは
個々のオレフインについての検討が必要となつて
いる。炭素一炭素二重結合を有する化合物のうち
エーテル類のような含酸素不飽和化合物から微生
物を利用してエポキシドを生産する方法は未だ知
られていない。 さらに、微生物による光学活性エポキシドの生
産に関しては、コリネバクテリウム属及びシユー
ドモナス属に属する微生物による直鎖状オレフイ
ンからのエポキシドの生産及びシユードモナス属
に属する微生物によるアリルベンゼンからのエポ
キシドの生産において光学活性キポキシドの生成
が知られているがエーテル類のような含酸素不飽
和化合物から微生物を利用して光学活性エポキシ
ドを生産する方法は未だ知られていない。 本発明者は、種々の属に属する微生物について
エーテル類からエポキシド生産能を有するものを
探索した結果、アルスロバクター属、ブレビバク
テリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロコツ
カス属、ノカルデイア属およびロドコツカス属に
属するエポキシド生産菌がアリルベンジルエーテ
ルから相当するエポキシドであるフエニルメトキ
シメチルオキシランを産生すること及び産生され
たエポキシドが光学活性体であることを見出し、
本発明をなすに至つた。 すなわち、本発明の目的はアリルベンジルエー
テルからアルスロバクター属、ブレビバクテリウ
ム属、コリネバクテリウム属、ミクロコツカス
属、ノカルデイア属およびロドコツカス属に属す
るエポキシド生産菌を利用して、医薬等の製造上
の中間体として有用なフエニルメトキシメチルオ
キシランを製造する新規な方法を提供することに
ある。 以下本発明を詳しく説明する。 発明の構成 本発明の構成上の特徴は、アルスロバクター
属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム
属、ミクロコツカス属、ノカルデイア属およびロ
ドコツカス属に属する群から選択されるエポキシ
ド生産能を有する微生物を、アリルベンジルエー
テルに好気的条件下に作用させて相当するフエニ
ルメトキシメチルオキシランを産生し、得られた
該エポキシドを分離、採取することにある。 また、本発明は、上記微生物を水不溶性有機溶
剤の存在下に上記と同様にして作用させることに
より、上記エポキシドを更に有利に産生させるこ
とも特徴とする。 問題点を解決するための手段 本発明で利用するアルスロバクター属、ブレビ
バクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロ
コツカス属、ノカルデイア属およびロドコツカス
属に属する微生物としては第１表の菌株を例示し
得る。なお、これらの菌株はアメリカン・タイ
プ・カルチヤー・コレクシヨン（American
Type Culture Collection）に下記番号で寄託さ
れていて容易に入手が可能である。 【表】 本発明において上記各微生物を作用させてエポ
キシドを生産するための反応基質に用いられるア
リルベンジルエーテル（以下原料エーテルと称す
る）は、アリルハライドとベンジルアルコールと
から例えば〔H.C.Arndt and S.A.Carroll、
Synth−esis、202（1979）〕に記載の方法で容易に
高収率で合成することができる。 本発明においては、原料エーテルに前記アルス
ロバクター属、ブレビバクテリウム属、コリネバ
クテリウム属、ミクロコツカス属、ノカルデイア
属およびロドコツカス属に属する微生物を作用さ
せてエポキシドを産生するには、例えば、(a)該微
生物を予め培養増殖して得られる菌体に原料エー
テルを好気的条件下で接触させて反応させる方
法、(b)上記微生物を原料エーテルを含む培養培地
中で好気的条件下で培養する方法を適用し得る。 上記(a)の増殖菌体に原料エーテルを接触させて
反応させる方法は、まず炭素源として糖質例えば
グルコース、シユクロース、糖蜜、澱粉加水分解
物、炭化水素例えばプロパン、ブタン、オクタ
ン、ドデカン、テトラデカンやエチレン、プロピ
レン、１−ブテン、１，３−ブタジエン及びその
ほか酢酸、エタノールの如き菌体増殖作用の高い
もの、或いは炭化水素の酸化酵素系の誘導に有効
なものを用い、これに塩化アンモニウム、硫酸ア
ンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニ
ウム、尿素、アンモニア水、アミノ酸及びその他
の資化性有機窒素化合物のような窒素源、リン酸
カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウ
ム、硫酸マンガン、硫酸第１鉄、塩化第２鉄、塩
化カルシウム、塩化マンガンのごとき無機塩類、
及びホウ素、銅、亜鉛などの塩、すなわち、いわ
ゆる微量元素、更には必要に応じてビタミン類、
酵母エキス、コーンステイープリカーの如き成長
促進物質を添加した培地に、上記各微生物の種菌
を接種し、好気的条件下で培養して菌体を増殖さ
せる。このようにして得られた菌体培養物、又は
該培養物から分離した菌体の懸濁液もしくは菌体
を固定化したものに原料エーテル及び必要に応じ
て後記する有機溶剤を添加し、空気、酸素、酸素
富化ガスのような酸素含有ガスを供給して反応さ
せる。 反応はPH５〜９、20〜50℃の範囲で用いる微生
物及び原料エーテルの種類により適宜定め、半日
〜６日間行なう。反応は通常常圧下で行なわれる
が、加圧下で行なうことによりエポキシドの生産
性を向上させることもできる。なお、反応中に菌
体増殖に用いた炭素源、窒素源、更にはその他の
成分を適宜添加することにより、菌体濃度や菌体
のエポキシド生産活性を維持し或いは高めること
が出来る。 反応に用いる原料エーテルの菌体含有水性液に
対する割合は通常0.1〜50vol／vol％、好ましく
は0.5〜20vol／vol％である。 反応は回分式又は連続式さらには原料エーテル
或いはその他の成分を反応中に連続的に又は間歇
的に補給する半回分式のいずれでも実施し得る。 上記反応により生成したエポキシドは相分離、
抽出、蒸留等の公知の手法を適用して分離、採取
する。 次に、前記(b)の培養による方法は、上記(a)の方
法における菌体増殖時に原料エーテル及び必要に
応じて後記する有機溶剤を添加し一段階でエポキ
シドの生産を図るものである。培養条件（PH、温
度、圧力及び原料エーテル類の添加量等）、培養
方式及び生成したエポキシドの分離、採取は前記
(a)の反応条件、反応方式及び分離、採取方法が同
様に用い得る。 本発明は、前述したように、前記微生物による
原料エーテルのエポキシ化反応を水不溶性溶剤の
存在下で行なう態様を包含するものであるので、
以下この態様について説明する。 本発明において、原料エーテルに前記微生物を
作用させてエポキシ化を行なうに際して存在させ
る水不溶性有機溶剤（以下単に有機溶剤と称す
る）は、炭素数９乃至17を有するパラフイン、炭
素数10乃至18を有するオレフイン、炭素数９乃至
16を有するハロゲン化パラフイン、および鎖長が
６乃至15の側鎖を有するアルキルベンゼンから成
る群から選択される有機溶剤であつて、これらは
単独もしくは２種以上の混合物としても使用し得
る。 これらの有機溶剤について詳しく説明すると、
炭素数９〜17を有するパラフインのうちノルマル
パラフインは石油の灯油及び軽油留分中に約20〜
25％含有されているものである。すなわち、沸点
約160℃〜350℃の留分を水素化脱硫した後、ゼオ
ライト（もしくはモレキユラーシーブ）等を用い
て分離、回収し得るものであつて、一般にソフト
洗剤の原料として使用されている。 上記パラフインのうちでも炭素数の多いものの
方がエポキシ化の促進作用が高く、特に炭素数12
〜16のものが好ましい。因に、炭素数が９より少
ないとエポキシ化の促進作用がみられず、一方17
より多くなつても該促進作用が低下し、加うるに
室温で固化するようになるので実用的でない。ま
た、上記パラフインのうちイソパラフインは、上
述した留分中にノルマルパラフインと共存してい
るものであつて、精密蒸留によりノルマルパラフ
インと分離し得るが、実際にはノルマルパラフイ
ンとの混合物として用いるのが便利である。な
お、側鎖がメチルやエチルのような短い鎖長のも
のが一般的であるが、炭素数が12〜16を有するイ
ソパラフインがエポキシ化促進上好ましい。 次に、炭素数10〜18を有するオレフインはプロ
ピレンやブチレンの低重合体又はオリゴマーであ
つてもよく、また試薬として市販されているもの
も適用し得る。一般には直鎖状又は低分岐状モノ
オレフインである。 なお、炭素数が10より少ないオレフインではエ
ポキシ化の促進効果がみられず、一方18より多い
ものでは該効果も低く、加うるに粘性が高くなる
ので実用的でない。 有機溶剤としての炭素数９〜16を有するハロゲ
ン化パラフインは、塩素化並びに臭素化パラフイ
ンであつて、塩化デシル、塩化ウンデシル、塩化
ドデシル、塩化トリデシル、塩化テトラデシル、
臭化デシル、臭化ウンデシル、臭化ドデシル、臭
化テトラデシル、臭化ヘキサデジル等を包含す
る。なお、炭素数が９より少なくても又16より多
くてもエポキシ化促進効果がみられなくなる。 次に、鎖長が６〜15の側鎖を有するアルキルベ
ンゼンは通常ハード又はソフト洗剤の中間体とし
て利用されているものであつて、炭素数６〜15の
直鎖もしくは分岐アルキル基を側鎖に有するもの
である。 なお、上記鎖長が６〜15の範囲外のものではエ
ポキシ化促進効果がみられないか、又は低くて実
用的でない。 上記有機溶剤の菌体培養液もしくは菌体懸濁液
などの菌体含有水性液に対する使用割合は、有機
溶剤の種類により異なることもあるが通常１〜
200vol／vol％、好ましくは５〜100vol／vol％で
ある。 なお、有機溶剤を存在させる場合の反応条件、
反応方式および生成エポキシドの分離、採取方法
は前述したと同様に適用することができ、この有
機溶剤の存在下での反応により、目的とするエポ
キシドの生産性を一そう顕著に高めることができ
る。 本発明により得られるエポキシドは光学活性を
有していることから医薬などの生理活性物質の合
成原料として特に有効に利用され得る。 発明の実施例と効果 以下に実施例により本発明を更に具体的に説明
する。 実施例 １ 菌懸濁液の調整 後記第２表に記載した９種の菌体の各３白金耳
をNBG培地（オキソイド社製ラブレンコパウダ
ー10ｇ、バクテリオロジカルペプトン10ｇ、グル
コース10ｇ及び塩化ナトリウム５ｇに水道水を加
えて１とし、1N−苛性ソーダ水溶液でPH7.5に
調整した後、オートクレーブ中で120℃15分加熱
殺菌した液体培地）100mlを収容した500ml容の坂
口フラスコに接種し、30℃で48時間振盪培養し
た。 これらの培養により生成した菌体を0.01M−リ
ン酸緩衝液（PH7.5）で１回洗浄し、ついで下記
に示す反応培地で１回洗浄後、同反応培地中に再
懸濁することにより９種の菌株についてそれぞれ
菌懸濁液を調整した。なお、菌懸濁液の菌濃度は
乾燥菌体濃度として3.5〜４・０ｇ／の範囲と
なる様にした。 反応培地 K₂HPO₄ 1.74ｇ ＭｇSO₄・7H₂O 1.50ｇ FeSO₄・7H₂O 0.05ｇ 脱イオン水 １ PHは2N−H₂SO₄で8.0に調整。 反応と生成物の分析 前記菌懸濁液20mlとアリルベンジルエーテル
400μおよびｎ−ヘキサデカン８mlを500ml容坂
口フラスコに入れ、30℃で24時間振盪培養した
後、40mlのエーテルで抽出して生成したフエニル
メトキシメチルオキシラン量を定量した。定量は
ジエチレングリコールサクシネートをユニポート
Ｂ（ガスクロ工業社製）80〜100メツシユに担持し
たカラムとイオン化炎検出器とを有するガスクロ
マトグラフを用いて行なつた。 結 果 第２表に用いた菌株の種類とそれぞれの場合の
生成したフエニルメトキシメチルオキシラン量を
示した。 【表】 実施例 ２ ノカルデイア・コラリーナ（Nocardia
corallina）ATCC31338を実施例１に記載の方法
で培養して菌懸濁液を調製した。の菌懸濁液５ml
を外径24mmの試験管に入れ、アリルベンジルエー
テル100μを加えて反応させる方法(A)法、アリ
ルベンジルエーテル100μとｎ−ヘキサデカン
５mlを加えて反応させる方法(B)法、アリルベンジ
ルエーテル250μを加えて反応させる方法(C)法
及びアリルベンジルエーテル250μとｎ−ヘキ
サデカン５mlを加えて反応させる方法(D)法の４通
りの方法で試験管振盪培養機中30℃で24時間反応
を行ない、実施例１記載と同様の方法で分析を行
なつた。第３表にそれぞれの場合のフエニルメト
キシメチルオキシランの生成量を示した。 【表】 実施例 ３ ノカルデイア・コラリーナ（Nocardia
corallina）ATCC31338を実施例１に記載の方法
で培養して菌懸濁液を調製した。この菌懸濁液５
mlを外径24mmの試験管に入れ、アリルベンジルエ
ーテル100μと、第４表の記載の各種有機溶剤
55mlを加え、実施例２に記載と同様の方法で反応
を行なわせて、24時間の反応後、実施例１記載と
同様の方法で分析を行なつた。 第４表に生成したエポキシド量を示した。 【表】 【表】 ％との混合物。
実施例 ４ ノカルデイア・コラリーナ（Nocardia
corallina）ATCC31338の２白金耳を合成培地
〔（NH₄）₂HPO₄4ｇ、Na₂HPO₄・12H₂O2.5ｇ、
KH₂PO₄2ｇ、MgSO₄・7H₂O0.5ｇ、FeSO₄・
7H₂O30mg、CaCl₂・2H₂O60mg、Difco社製酵母
エキス200mgにイオン交換水を加えて１とした
後、オートクレーブ中で120℃15分加熱殺菌した
液体培地〕20mlを収容した500ml容の坂口フラス
コに接種し、密栓後120mlのプロピレンを圧入し、
30℃で96時間振盪培養した。培養により生成した
菌体を実施例１記載の方法で洗浄し、菌懸濁液を
調製した。 前記菌懸濁液５mlとアリルベンジルエーテル
250μ、ｎ−ヘキサデカン５mlを外径24mmの試
験管に入れ、実施例２記載の方法で反応させ、
6.6mgのフエニルメトキシメチルオキシランを得
た。 実施例 ５ 実施例１に記載した９種の反応生成物のエーテ
ル溶液よりエーテルを除去し、パイレツクス製20
ml容のアンプルに移し、イソプロパノール４ml、
イソプロピルアミン２mlを加え、封管後80℃で４
時間加熱した。反応終了後開封し、溶媒を除去後
残渣を10mlのベンゼンに溶解し、1N−HC120ml
で２回抽出後、水層に6N−NaOH20mlを加え、
ベンゼン20mlで抽出した。Na₂SO₄でベンゼンを
乾燥後、乾固し、７ml容バイアルに残渣を移した
後、100μのbis（trimethylsilyl）trifluoro−
acetamideを加え60℃で15分加熱した。冷後、Ｎ
−heptafluorobutyryl−Ｌ−prolylchlorideの1M
塩化メチレン溶液100μを加え15分放置後、2μ
を液相をOV225とする60cmのガラス製キヤピ
ラリーカラムで分析した。第５表に９種の菌株が
生産したフエニルメトキシメチルオキシランの絶
対配置と光学純度を示した。 【表】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ アルスロバクター属、ブレビバクテリウム
   属、コリネバクテリウム属、ミクロコツカス属、
   ノカルデイア属およびロドコツカス属に属する群
   から選択されるエポキシド生産能を有する微生物
   を、アリルベンジルエーテルに好気的条件下で作
   用させて相当するフエニルメトキシメチルオキシ
   ランを産生し、得られたフエニルメトキシメチル
   オキシランを分離、採取することを特徴とするア
   リルベンジルエーテルからフエニルメトキシメチ
   ルオキシランを製造する方法。 ２ 得られるフエニルメトキシメチルオキシラン
   が光学活性体である特許請求の範囲第１項記載の
   方法。 ３ アルスロバクター属、ブレビバクテリウム
   属、コリネバクテリウム属、ミクロコツカス属、
   ノカルデイア属およびロドコツカス属に属する群
   から選択されるエポキシド生産能を有する微生物
   を、水不溶性有機溶剤の存在下に、アリルベンジ
   ルエーテルに好気的条件下で作用させて相当する
   フエニルメトキシメチルオキシランを分離、採取
   することを特徴とするアリルベンジルエーテルか
   らフエニルメトキシメチルオキシランを製造する
   方法。