JPS63502318A - ８：ｃ因子型タンパク質の改良生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ■二〇因子型タンパク質の改良生産方法発明の背景 ■因子複合体は明らかに異なる２つの生物学的機能：すなわち凝固活性および一 次止血における役割を有している。■因子欠損症の古典的血友病およびフォノ・ ビルプラント病の分析は、■因子が２種類の成分の複合体であるという結論へ導 いた。

■：Ｃ因子凝固活性タンパク質（抗血友病因子）および■因子関連抗原（フォノ ・ビルプラント因子、ＶＷＦ）は別々の遺伝子の支配下にあり、明らかに異なる 生化学的および免疫学的性質を有し、そして極めて重要な唯一の生理学的機能を 有している。

■二〇分子は血液凝固過程において重要な調節タンパク質である。トロンビンに よる活性化の後、それはＩＸａ因子によるＸ因子活性化の速度を促進し、終局的 にフィブリン凝塊の形成へ導く。■：Ｃ因子欠損症（古典的血友病）はＸ結合染 色体疾患であり、男性患者における出血性罹病および出血性死亡の主な原因とな っている。その治療法は通常頻繁な血液製剤の輸血から成っている。この治療法 は血友病の患者集団に感染合併症（例えばいろいろな型の肝炎および後天性免疫 不全症）の高い発生率をもたらした。

ＶＷＦ分子は血小板粘着において中心的な役割を演する接着性糖タンパク質であ る。それは血漿中の■：Ｃ因子のためのキャリアーとして役立ち、血小板−血管 壁の相互作用を促進する。糖タンパク質Ｉｂおよび糖タンパク質ＩＩｂ−ｍａ複 合体上の血小板レセプター部位、ならびにコラーゲン上の結合部位に結合するＶ ＷＦの別個のドメインが見出された。ＶＷＦはそれぞれ２３０．０００ダルトン の複数の、恐らくは同一のサブユニットから構成されており、血管内皮細胞およ び骨髄巨核球で合成される。血漿中ではそれは５刈０５〜１０７ダルトンの高分 子量マルチマーとして存在する。フォノ・ビルプラント因子は５〜６％の複合炭 水化物を含み、それは血小板に結合するこの分子の能力において重要であると思 われる。ＶＷＦ活性の多様な異常はフォノ・ビルプラント病を誘発しうる。この 疾患は一般に常染色体性優性遺伝により受け継がれ、そして２０００人に１人と いう高頻度で発生しうる。この疾患の軽いものは往々にして診断未確定になるが 、重症患者は危険が伴う血液製剤の頻繁な投与を必要とする。

最近、■：Ｃ因子およびフォノ・ビルプラント因子の両方の遺伝子が単離され、 それにより汚染ウィルスを本質的に含まない組換え■：Ｃ因子およびＶＷＦ因子 製剤の製造が可能になった〔トール（Ｔｏｏｌｅ）ら、　１９８４　、ウッド（ Ｗｏｏｄ）ら、　１９８４　；リンチ（Ｌｙｎｃｈ）ら、　Ｃｅ１ｌ　４１　： 　４９〜５６．１９８５　；ギンスバーグ（Ｇｉｎｓｂｅｒｇ）ら、　５ｃｉｅ ｎｃｅ　２２８　：　１４０１〜１４０８．１９８５を参照されたい〕。組換え ＤＮＡ技術による■：Ｃ因子およびその類似体の製造は、適当な発現ベクター中 に含まれる■：Ｃ因子（またはその類似体）をコードするＤＮＡの受容細胞とし て哺乳動物細胞を使用することにより達成された。組換え■：Ｃ因子の合成に関 する主な関心事には（１）培地から得られる組換え■：Ｃ因子の収率、（１１） 斯く生産された組換え■：Ｃ因子の安定性、（ｉｉｉ）■二〇因子の精製効率お よびコスト、ならびに（１ｖ）精製した組換え■：Ｃ因子の全生産コストが含ま れる。

最良の結果を得るために、本発明者らは■：Ｃ因子産生細胞を全培地容量に対し て約１０容量％の血清量で哺乳動物血清（例えばウシ胎児血清の慣用製剤）を含 有する培地中で培養した。

（簡略化するために、すべての血清濃度は以後全培地の容量％として示す。）本 発明者らは、このような血清の補足なしでは組換え■：Ｃ因子の収率および安定 性がともに著しく低下することを見出した。しかしながら、血清補足物のコスト および血清の使用により生ずる精製の煩雑さおよび経費の増大は、血清の使用を 望ましくないものにし、また血漿から精製した天然■：Ｃ因子に代わるべきもの としての組換え■：Ｃ因子の広範囲の使用を商業的に魅力のないものにした。

■：Ｃ因子（以後Ｆ■：Ｃと略す）産生細胞用の培地の十分な実験的修飾ののち に、本発明者らは驚くべきことに、低下した量の血清を含む培地（例えば半規定 培地）または本質的に血清を含まない培地（規定培地）を使用して安定したＦ■ ：Ｃ型タンパク質（以後で説明する）を高収量で生産する方法を見出した。本発 明者らは、半規定または規定培地が適量の疎水性物質（例えばＶＷＦまたはある 種のリン脂質）を含む場合に、Ｆ■：Ｃ型タンパク質を生産する宿主細胞が１０ ％血清の存在下で得られた収量に少なくとも匹敵する収量の回収可能な安定した Ｆ■：Ｃ型タンパク質を半規定および規定培地中で生産しうることを見出した。

本発明者らはさらにこの種の補足物を欠く半規定または規定培地で生産されたＦ ■：Ｃ型タンパク質が一般に著しい不安定性を示し、かつ回収されるにしても極 めて低い収量で回収されるにすぎないことを見出した。

今日までの文献は、ＶＷＦが血漿中の■：Ｃ因子に対して１ｎｖｉｖｏで安定作 用を有し、またＶＷＦが■：Ｃ因子の貯蔵所からのｉｎ　ｖｌｖｏ放出を誘起し 、また■：Ｃ因子のｉｎ　ｖｉｖｏ合成および／または分泌を刺激し得ることを 示唆している〔ワイス（Ｗｅｌｓｓ、　Ｈ，）ら、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖ ｅｓｔ、８０　：　３９０〜４０４．１９７７を参照されたい〕。また、トロン ビン活性化■因子（天然ヒトＦ■から誘導）はリン脂質により、恐らくはトロン ビン媒介分解に対して、安定化されることも示唆されている。アンダーソン（Ａ ｎｄｅｒｓｓｏｎ）およびブラウン（Ｂｒｏｗｎ）、　Ｂｌｏｃｈｅｍ、　Ｊ、 ２００　：１６１〜１６７、１９８１を参照されたい。しかしながら、我々の知 る限りでは、■：Ｃ因子型タンパク質のｉｎ　ｖ１ｔｒｏ生産（この場合は例え ばトロンビンが実質的に存在しない）に対するＶＷＦまたはリン脂質の効果に関 して従来技術に何ら示唆しておらず、また哺乳動物血清中に存在する成分の複合 混合物を実質的に含まないＶＷＦおよび／またはリン脂質から成る培地補足物に 関しても何ら示唆していない。

発明の概要 本発明は■：Ｃ因子型タンパク質の改良生産方法に関する。

本明細書で用いる“■：Ｃ因子型”タンパク質なる用語は■：Ｃ因子型凝固活性 を示すタンパク質を意味する。本発明の範囲内に含まれる■：Ｃ因子型タンパク 質は、■：Ｃ因子をコードす、？Ｄ　Ｎ　Ａにハイブリダイズし得るＤＮＡ配列 によってコードされる。天然哺乳動物（例えばヒト）■：Ｃ因子のほかに、■二 〇因子型タンパク質には例えば国際特許出願番号ＰＣＴ／Ｕ３８６１００７７４ 　（１９８８年１０月２３日発行）に詳しく記載されるような、天然■：Ｃ因子 の９０Ｋｄ切断部位と６９Ｋｄ切断部位の間に１個またはそれ以上のアミノ酸の 欠失を含むタンパク質が含まれる。■：Ｃ因子因子型タンパクコまたＰＣＴ／Ｕ Ｓ８Ｂ１００７７４に記載されているものと類似の方法によって作ることのでき る５０／４０切断部位と６９Ｋｄ切断部位の間にアミノ酸欠失を含む■：Ｃ因子 類似体が含まれる。■：Ｃ因子因子型タンパクコさらに２２６゜３３８　、５８ ２　、７４０　、７７８　、１３１３．１８４１１１または１７２１位のアルギ ニン残基に架かる１つまたはそれ以上の切断部位が、例えば発現すべきｃＤＮＡ の慣例的な特定部位突然変異誘発により１個またはそれ以上のアミノ酸を異なる アミノ酸で置換することによって、加水分解に対して抵抗性となった類似体（上 記のような欠失を含んでいてもよい）が含まれる。こうして、■：Ｃ因子因子型 タンパクコ然■：Ｃ因子、凝固活性をもつ“組換え”■：Ｃ因子およびその類似 体、ならびにそのタンパク質を生産する細胞から誘導された細胞株によって生産 される非組換え■：Ｃ因子およびその類似体を包含する。

従って、本発明方法は■：Ｃ因子因子型タンパクコードするＤＮＡを含み且つそ のタンパク質を発現し得る哺乳動物細胞を使用する。本発明方法によれば、細胞 は■：Ｃ因子因子型タンパクコめの安定化物質を有効量含む培地中で培養される 。

この種の物質には（１）＠乳動物フオン・ビルプラント因子（ＶＷＦ）　、（１ １）安定化用リン脂質またはリン脂質混合物、および（ｆｉｉ）　ＶＷＦとリン 脂質の混合物が含まれ否。ＶＷＦの有効量は好ましくは約０．１〜１０μｇＶＷ Ｆ／ｍｌ培地の範囲であり、１〜３μｇ／ｍ１が特に好ましい。１つの容易に入 手しうる適当なリン脂質源は乾燥スキムミルクや低脂肪スキムミルクのような市 販の乾燥乳製品である。このような乾燥乳製品は約０．０１〜１０％（乾燥ミル クの重量／培地の容量）の量で培地に加えられる。■因子生産に対して最適な効 果を及ぼしつつ細胞に対する毒性作用を最小限に抑えるために、約１〜３％のド ライミルクが目下のところ好適である。ドライミルク製品は初めにミルクの１０ ％水性懸濁液を調製し、その後オートクレーブ滅菌することにより有利に滅菌す ることができる。他の容易に入手しうる適当なリン脂質源は市販の大豆レシチン であり、これは好ましくはリポソームの形で培地に添加される。

本明細書で用いる“リン脂質”なる用語は１つまたは２つの脂肪酸分子、アルコ ールおよび窒素含有塩基を含むリン酸のエステルを意味する。このようなリン脂 質の例にはセファリン、ホスファチジルセリン：ホスファチジルコリン混合物、 ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、大豆レシチン およびこれらの混合物が含まれ、大豆レシチンが特に好適である。この方法にお いて有用な他のリン脂質ならびにその有効かつ／また最適な濃度および／または それらの混合物は、以後に詳しく説明する方法を使用して当業者が容易に同定し 得るだろう。リン脂質またはリン脂質混合物の目下の好適な有効量は、培地１ｍ ｌ当たり約１〜１０００μｇのリン脂質またはリン脂質混合物であり、約１００ μｇ／ｍ１以上の濃度がより好適であり、そして約２００〜３００μｇ／ｍｌの 濃度が特に好適である。

さらに、リポソームの形（好ましくは直径が約５００ｎｏ＋以下のもの）で培地 にリン脂質混合物を加えることが好適である。リポソームは単ラメラ小胞である のが好ましいが、多重ラメラリポソームも使用できる。最も好ましくは、リポソ ームの直径は約１１００ｎ以下である。さらに、上記のリン脂質から慣用方法で 作られたリポソームは、■二〇因子型タンパク質と混合して又はそのタンパク質 をリポソーム内に保持させて、患者にそのタンパク質を投与するためのキャリア ーまたはビヒクルとして使用することができる。ドライミルクをリン脂質源とし て使用する場合、ドライミルクは培地に（リポソームの形でなく）直接添加する こともできる。

ＶＷＦは哺乳動物（例えばヒト、ウシ、ブタなど）の血清から、または血管内皮 細胞のようなＶＷＦ産生細胞から誘導された細胞株から慣用方法により得られる 。また、“組換え”ＶＷＦ　（すなわち、遺伝子工学的に処理された細胞から誘 導されるＶＷＦ）も使用できる。１つの実施態様において、ＶＷＦ産生細胞（例 えばＶＷＦを産生ずるように遺伝子操作された細胞）は培地をＶＷＦで調整する ために、■二〇因子型タンパク質を産生ずる細胞の培養に先立って又はその培養 と同時にそのされる培地に外因性補足物として添加することもできる。他の実施 態様では、■：Ｃ因子因子型タンパクコ産する細胞は、ＶＷＦおよび■：Ｃ因子 因子型タンパクコ一細胞によって同時発現されるように、ＶＷＦ転写単位で適切 に遺伝子操作、すなわち形質転換される。本発明のさらに別の実施態様では、■ ：Ｃ因子因子型タンパ炭質産生細胞養のために使用される培地がＶＷＦ　（上記 方法の１つを使用することによる）と安定化用リン脂質の両方を含む。その場合 に、単独で使用したときの使用量に比べて低下した量の各成分を使用することが 望ましい。

本発明に従って適切に補足された規定培地を使用することにより、高レベルの回 収可能な安定した■：Ｃ因子因子型タンパクコ産され、その後そのタンパク質は 血清成分を分離する必要性なしに回収・精製される。本発明で使用する培地はさ らに哺乳動物血清（例えばウシ胎児血清）を好ましくは約１０％以下、より好ま しくは約５％以下、さらに好ましくは０〜１％の量で含んでいてもよいが、本質 的に血清を含まない培地が特に好適である。その他の慣用の哺乳動物細胞培養の ための培地補足物も添加し得る。

本発明は、培地補足物としてリン脂質およびＶＷＦを使用することにより回収可 能な安定した■：Ｃ因子因子型タンパクコ産における血清依存を克服する能力に ついて特−に立証する以下の代表的実施例により例示される。これらの実施例は 本発明の理解を助けるために提供されるものであって、請求の範囲に記載の本発 明を何ら制限するものでなく、また制限するように解釈されるべきでない。

実施例　Ｉ ヒト■：Ｃ因子を発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞株の確立 本実施例で使用した■：Ｃ因子発現プラスミドは時計回りにポリオーマウィルス エンハンサ−、アデノウィルス三分節リーダー配列の第１リーダー配列、■：Ｃ 因子転写単位、ＤＨＦＲ遺伝子、ＳＶ４０ポリＡ化信号、およびテトラサイクリ ン耐性遺伝子を含むＲｘ　Ｐｙ■−■であった。このプラスミドはＤＨＦＲ発現 プラスミドとの同時形質転換、その後の添加ヌクレオチドの不在下で生育する細 胞の選択により、ジヒドロ葉酸還元酵素（Ｄ　ＨＦ　Ｒ）欠損チャイニーズハム スター卵巣細胞内に導入した。続いて１１ｇ１と命名した特定の形質転換体のプ ールは、ＤＨＦＲおよび■因子遺伝子を増幅するために次第に増加する濃度のメ トトレキセート（ＭＴＸ）中で増殖させた。

得られた細胞株は、■因子欠損血漿を凝固させる能力〔クロチク（Ａ　Ｐ　Ｐ　 Ｔ）検定〕により、あるいはＩＸａ因子、リン脂質、カルシウムおよびＸ因子の 存在下でＸａ因子を生成する能力〔カビ・コテスト（Ｋａｂｉ　Ｃｏｔｅｓｔ） 検定〕により測定したとき高レベルの■因子活性を発現した。■：Ｃ因子を生産 するこれらのＣＨＯ細胞の能力は表Ｉに示す。■因子活性は■因子遺伝子のコピ ー数と関連がある次第に増加するレベルのＭＴＸ耐性により１０，０００倍に増 強された。その他の発現ベクターも、それらが■：Ｃ因子またはその類似体を発 現させることができるならばＲｘ　ＰＹ■−工の代わりに使用し得る。この種の ベクターには例えばｐＣＶＳＶＬ２−■（ＡＴＣＣ３９８１３、欧州特許出願箱 ８５２０２１２１．１号を参照）およびｐ　Ｄ　Ｇ　Ｒ−２（ＡＴＣＣ５３１０ ０゜ＰＣＴ／ＵＳ８Ｂ１００７７４−欠失類似体を参照）が含まれる。他の■： Ｃ因子発現ベクターは例えばｐＣＶＳＶＬ２−■またはｐｓＰ６４−■（ＡＴＣ Ｃ３９８１２）由来の５ａｌＩフラグメントを含む慣用技術および通常の発現ベ クターを使用して作製することができる。これらのベクター由来の５ａｌＩフラ グメントは全長■：Ｃ因子をコードするＤＮＡ配列を含む。

表Ｉ：トランスフエクションされ且つ増幅されたＣＨＯ細胞による■因子発現 ブール　ＭＴＸ　（、ｃｚＭ）　■：Ｃのａ＋Ｕ／ｍｌ／日Ｌｉｇｌ　Ｏ，８０ ，１ ０，０２１１，５ ０，１８８，０ １，０２８８，５４５＊ ５．０　Ｂ４４，８７５本 ２０．０　１０７５ プラスミドｐＡｄＤ２６ｓＶｐＡ（３）Ｃカウフマン（Ｋａｕｆｍａｎ）および シャープ（Ｓｈａｒｐ）、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、　１９８２を 参照〕およびプラスミドｐＲＸＰｙ−■−ＩはＣ１ａＩで消化し、得られた線状 ＤＮＡをｉｎ　ｖｉｔｒｏで連結し、ＣａＰｏ４で共沈させ、そしてＣＨＯＤＨ ＦＲ欠損ＤＵＫＸ−ＢＩＩ細胞をトランスフェクションするために使用した。効 率よ＜ＤＨＦＲを発現する細胞はｐＡｄＤ２８ｓＶｐＡ（３）由来のＤＨＦＲ遺 伝子と共にｐＲＸＰｙ■−■由来のエンハンサ−を含むことが期待されるだろう 。結果はこの仮説と一致した。細胞を次第に増加する濃度のＭＴＸ中で増殖させ ることによる増大したＤＨＦＲ発現についてのその後の選択は、■因子遺伝子と ＤＨＦＲ遺伝子が増幅した細胞をもたらす。ＭＴＸ選択のそれぞれのレベルにお いて、■二〇因子活性検定（０，０５ｍＵ／ｍ１以上の感度を得るように改良し たカビ・コアテスト（Ｋａｂｉ　Ｃｏａｔｅｓｔ）法により測定〕のために調整 培地（１０％ウシ胎児血清を補足したアルファ培地中１０６細胞／ｍ１）の試料 を採取した。■：Ｃ因子欠損血漿を使用する１段階活性化部分トロンボプラスチ ン時間（ａｃｔｉｖａｔｅｄｐａｒｔｉａｌ　ｔｈｒｏｍｂｏｐｌａｓｔｉｎ　 Ｌｆｍｅ　；　ＡＰＴＴ）凝固検定によっても匹敵する結果が得られた。すべて の試料は３０〜５０倍のトロンビン活性化を示した。トロンビン活性化のために 、試料は０．２単位／ｍｌのトロンビンを用いて室温で１〜１０分間予備処理し た。

実施例　■ ■：Ｃ因子合成の血清依存 洗浄して、１０％ＦＣ３を含む培地または規定培地（血清不含、５■／ｍ１Ｂｓ Ａ、インシュリン、トランスフェリン、セレン、ヒドロコルチゾンおよびプトレ シンを含む）を供給したＣＨＯ細胞（８０％の集密生長で０．１μＭ　ＭＴＸ中 のＬｉｇｌ　２ＡサブクローンＢＩＯ）は■因子活性を蓄積する。規定培地にお ける出現率は血清含有培地よりも約４倍低い。４倍の差は細胞が血清の不在下で 増殖するにつれて大きくなる。このことは細胞の不十分な洗浄によって生じる。

■二〇因子の出現率は２４時間までほぼ直線的に増加し、これは■因子が培地中 で安定であることを示唆しでいる。この結果は低レベルの■因子発現（約１０１ １ＩＵ／ｍ！／日）のＣｏＳ細胞の場合に得られた結果と類似している。

数種のリン脂質の混合物であるセファリンは血清欠損に少なくとも部分的に反作 用することができる。ＣＨＯ細胞（２ａＩＭＭＴＸ中のＬｉｇ２Ａプール）は血 清の存在下および不在下で別々に培養し、４時間後に洗浄した。その後２つのＣ ＨＯ培養物を再分割し、血清　ＣＨＯ細胞の一部と血清−ＣＨ０細胞の一部に５ μＭセファリンを補足してさらに２時間培養した。血清１および血清−ＣＨ０細 胞の他の部分にはセファリンを補給しなかった。培地は６時間後と２５時間後に 検定し、結果は次の通りである： 血　清　セファリン　６時間　２５時間＋ＦＣ３＋セファ　５９４　１０４４ −Ｆｅ２　＋セファ　４０８　５１４ ＋ＦＣ８−セファ　５８３　１４９２ −Ｆｅ２　−セファ　１４０　３７２ ＊ｍＵ／ｍｌ これらの結果は、セファリン単独が血清の不在下で■因子活性を増強しうるがそ の効果は短い（すなわち２時間後には観察されだが２５時間後には消失する）こ とを示唆している。１つの実験において、セファリンの濃度を高めたが■因子活 性のそれ以上の増加は見られなかった。このことはセファリン中のある成分が律 速成分でないことを示している。

セファリン効果の一部は類似のリン脂質混合物または単一のリン脂質により誘起 される。細胞（２０μＭ　ＭＴＸ中のＬｌｇｌ　２Ａ、０２プール）に１０％ウ シ胎児血清含有培地または無血清培地を２４時間供給し、その後セファリン（５ μｍ）またはホスファチジルセリンとホスファチジルコリンの１：４混合物（Ｐ ＣＰＳ）を無血清培養物に加えた。２時間後に検定した培地からの結果は次の通 りである： 条　件　Ｆ■：Ｃ活性 無血清　１１０ 無血清十セフアリン　４８９ 無血清十Ｐ　ＣＰ　Ｓ　２３０ １０％　Ｆ　ＣＳ　Ｅ１１３ この結果はリン脂質単独が調整培地中で■因子活性を増強させうろことを証明し ている。

異なる条件下で生育するＣＨＯ細胞により発現された■因子のトロンビン活性化 度の分析は、血清の存在がトロンビン活性化の度合を減少させることを示唆して いる。ＣＨＯ細胞（２０μＭ　ＭＴＸ中のＬｌｇｌ　２Ａプール）は洗浄し、そ して１０％ウシ胎児血清含有培地または規定培地（５ｍｇ／ｍ１ＢｓＡ、トラン スフェリン、セレン、インシュリン、ヒドロコルチゾン、プトレシン）を供給し た。２４時間後セファリンまたは１０％ＦＣ８のいずれかを加え、２時間後にト ロンビン活性化度の検定および測定のために試料を採取した：規定培地　３１５ 　３００　２０Ｘ 規定培地　５μＭセファリン　７５２　１０４０　３４Ｘ規定培地　１０％ＰＣ ８６８４４４０８，４Ｘ４１０％Ｆ’Ｃ８１０７８１２００１０Ｘ＋１０％ＦＣ Ｓ　５μＭセファリン　１１５４　１１２０　１４Ｘ規定培地　１０％沸騰ＦＣ ８５４３−−これらの結果は、血清の存在が無血清培地に比べて■因子活性を高 めるがトロンビン活性化度を低下させることを示している。反対に、セファリン は産生された■因子の活性の増強に対する血清の作用を補償しうるが、トロンビ ン活性化度を低下させない。従って、収穫の２時間前にセファリンを添加した無 血清培地において、ＣＨＯ細胞は１単位／ｍｌの■因子を産生じ、しかもこの物 質は３４倍のトロンビン活性化を示す。この実験はまた、検定の２時間前に無血 清培地に加えた１０％ＦＣ３が■因子活性を増強しうることを示している。この 能力は添加の１０分前に血清を沸騰させても消失しなかった。従って、■因子活 性に必要とされる血清因子は熱に安定である。我々は■因子活性の増強に必要と される血清因子が２つの成分：すなわちリン脂質およびそのリン脂質を安定化さ せるのに必要な別の熱安定性因子から成るという結論に達した。

１０％血清が高度に増幅されたＣＨＯ細胞株による■：Ｃ因子発現にとって制限 的であるかどうか調べるために、我々はその細胞株１０Ａ１において■：Ｃ因子 活性を誘発する能力に対する次第に増加する量の血清の作用を追跡した。１０Ａ １は１ｍＭＭＴＸ中での増殖についてＬｉｇｌプールを選択することにより誘導 されたクローンである。この実験は、次第に増加する世のウシ胎児血清をｌ０Ａ １細胞に２４時間の間添加することの■因子活性に対する効果を立証した。５０ ％血清は２４時間後の調整培地において１０％血清よりも３倍以上の活性をもた らした。他の結果は、細胞を５０％血清中で増殖させたとき、活性■因子抗原の 量が対応して増加することを示した。わずかに低いレベルの■：Ｃ因子を発現す る他の細胞株は、より高い濃度の血清中での増殖の際にも■：Ｃ因子活性の劇的 な増強を示さなかった。

こうして、より高産生性の細胞（例えば商業的規模での■因子製造にとって望ま しい細胞）での■：Ｃ因子発現のためには、いくつかの限定的な必要条件が存在 すると思われる。

実施例　■ ＣＨＯ懸濁培養物におけるγ■：Ｃ因子合成の血清依存以下の表は培養物中の血 清レベルに対する組換え■：Ｃ因子（γＦ■）活性の依存を示している。比較的 低いγＦ■産生細胞のクローンＩＥ６はいろいろな濃度のウシ胎児血清（Ｆ　Ｂ 　Ｓ）を含む培地中で３〜４日間懸濁培養下に増殖させた。

培地中の　３〜４日後の　平均生産性 １０％ＦＢＳ　３１８　０．１９ ５％ＦＢＳ　１００　０．０３ ＊　ＲＰＭ１１Ｂ４０をすべての基礎培地として使用した。

規定培地は５μｇ／ｍｌインシュリン、５μｇ／ｍｌ）ランスフェリン、５ｎｇ ／ｍｌセレン、１０’Ｍヒドロコルチゾン、１１００ｎ　／ｍｌプトレシン、５ ｍｇ／ｍ１ＢｓＡから成る。

同じ血清依存が他のγＦ■分泌ＣＨＯ細胞株の場合にも観察された。これらの結 果は、もとの発現レベルが血清の添加により再び得られるので遺伝子の不安定性 を反映していない。

本発明者らは、培地へのリン脂質の添加が血清の要求に取って代わり得るが、比 較的高濃度（以前に血清含有培地と共に使用したよりも１０〜２０倍高い濃度） のリン脂質が必要とされることを見出した。リン脂質濃度に対するＦ■活性の依 存性に関して、我々は規定培地（ＤＭ）への２４０μｇ／ｍｌ（培地）の大豆レ シチン（Ｓ　Ｌ）の補給が２４時間後に１６０μｇ／ｍ１ｓＬ含有ＤＭにおいて 得られたＦ■活性の約２倍、そして８０μｇ　／　ｍ１ＳＬ含有ＤＭにおいて得 られたＦ■活性の５倍のＦ■活性をもたらすことを見出した。それにもかかわら ず、８０μｇ／ｍ１ｓＬ含有ＤＭは１％ウシ胎児血清（Ｆ　Ｂ　Ｓ）を含むＤＭ （半規定培地）よりもかなり高いＦ■活性を与え、一方半規定培地はＤＭだけの ときよりも有意に高いＦ■活性を与えた。意義あることに、２４０μｚ／ｒｎ１ のＳＬを含む規定培地中で２４時間にわたって生産されたγＦ■のレベルは、１ ０％ＦＢＳを補給したＤＭ中で生産されたγＦ■のレベルと少なくとも同程度に 高かった。

この実験においてＳＬの濃度を２４０μｇ／ｍ１以上に高めても、γＦ■活性の それ以上の増強はもはや起こらなかった。１つの実験の例示的結果を以下に示す ： 培　地　２４時間後のγＦ■活性 規定培地（ＤＭ）　約４ｈＵ／ｍｌ ＤＭ十大豆レシチン（ＳＬ）　約２７８ｍ　Ｕ／ｍ１（２４０μｇ　Ｓ　Ｌ　／ ｍｌ培地） このデータはウシ胎児血清の不在下で比較的高濃度（例えば２４０μｇ／ｍｌ） の大豆レシチンリン脂質を用いた際に得られるγＦ■：Ｃ活性の増強を示してい る。ＣＨＯ細胞（０，１μＭＭＴＸ中のＩＦ５）はリン脂質を含む又は含まない ５ｇ／ｌウシ血清アルブミン含有規定培地もしくは１０％ＦＢＳ含有培地中に３ ×１０５細胞／ｍｌの濃度で懸濁し、３７℃で２４時間培養した。

インキュベーション終了時に、細胞を含まない調整培地の試料は色素源検定（ｃ ｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ　ａｓｓａｙ）により７Ｆ■：Ｃ活性について検定した。

我々は約３２０μｇ／ｍ１までの量のリン脂質の添加が規定培地または半規定培 地における細胞増殖に著しい変化を全く生じさせないことを見出した。−組の実 験において、我々は３２０μｇ／ｍｌのリン脂質を添加した培養物の場合に最大 γＦ■活性が得られることを見出した。半規定培地では最大レベルは２４０μｇ ／ｍｌの大豆レシチンを添加した場合に７２時間後に得られた。これらおよびｆ 也のデータは０．　１．２および３日目に段階的に添加された大豆レシチンがγ Ｆ■の生産を可能にしたことを示している。最適濃度はリン脂質の調製法にかか わりなくこれらおよび他の実験において約２４０μｇ／ｍｌであった。

上記の実験に類似した実験からの２種の異なるＣＨＯ細胞株における細胞生産性 を以下に示す： １０％Ｆ　Ｂ　Ｓ　０．１９ ５％Ｆ　Ｂ　Ｓ　０．０３ 規　定　１／４〜０．Ｏ１ 規定＋Ｓ　Ｌ　０．２４ 規定＋１％Ｆ　Ｂ　Ｓ　＋　Ｓ　Ｌ　０．２５１０％Ｆ　Ｂ　Ｓ　０．４３ 規定＋１％Ｆ　Ｂ　Ｓ　＋Ｓ　Ｌ　０．５１＊上と同じ単位 従って、γＣＨＯ細胞からのγＦ■の生産性は血清含有培地の場合とリン脂質を 補給した規定培地の場合とで少なくとも同程度であった。しかしながら、上記デ ータによって示されるように、規定培地で生産されたγＦ■の量は血清含有培地 よりも少ない。このことは細胞がより生産性であるというよりもむしろ血清含有 培地中でより速やかにより高い細胞密度へ増殖するという事実によっている。規 定培地に少量の血清（例えば１％）を補給すると、細胞の生育が改善される。実 際、短期間の適応後に細胞は１０％ＦＢＳ含有培地とほとんど同程度に半規定培 地中で増殖するだろう。我々はγＣＨＯ細胞株（例えば我々のＨ９，０５）がリ ン脂質含有半規定培地中で１０％ＦＢＳ含存培地と同程度の細胞密度へ増殖し、 また少なくとも同程度に■因子生産性であることを見出した。

さらに、我々はまた大豆レシチン調製物の物理的性質について調べた。大豆レシ チンを食塩水に懸濁し、マントン−ガラリン（Ｗａｎｔｏｎ　−Ｇａｕｌｉｎ） ホモジナイザーを３回通過させ、その後０．２μｍフィルターを介して濾過した 場合の代表的なリン脂質調製物のサイズプロフィールが得られた。リポソームの 平均サイズは直径が約１１００ｎであり、このことはこの方法により得られた大 多数のリポソームが小さい単ラメラ小胞（ＳＵＶ）であることを示唆している。

次の実験は大豆レシチンリポソームのサイズがリン脂質の効能（すなわち、Ｆ■ ：Ｃ発現を増大させるＳＬの能力）において重要な役割を演することを示してい る。

大豆レシチン調製物は食塩水中でつくりたが、ホモジナイズしなかった。この調 製物は通常の（すなわちホモジナイザーシヨンを行った）調製物よりも有意に少 ないＳＵＶを含んでいた（リポソームの４４％のみが１００ｎｎ＋以下であるの に対して、通常の調製物では７４％が１１００ｎ以下であった）。それはまた直 径が約５００ｎｍの多重ラメラ小胞（ＭＶ）をかなりの割合で含んでいた（全リ ポソームの３０〜４０％がＭＶであるのに対して、通常の調製物ではほんの少量 、一般には５％以下がＭＶであった）。

この試料の効能は通常の試料の約６０％に低下し、このことはリポソームのサイ ズがリン脂質の効能において重要な役割を演することを示している。

実施例　■ ブタＶＷＦは血清の不在下で増殖させたＣＨＯ細胞から■：Ｃ因子活性を誘発す べく作用する。

Ｌｉｇｌ　（２０μＭ　ＭＴＸ）細胞は洗浄し、そして次第に増加する濃度のウ シ血清アルブミンまたは同様の濃度の卵アルブミンを加えた規定培地（インシュ リン、トランスフェリン、セレン、ヒドロコルチゾン、プトレシン、グルタミン 、ストレプトマイシンおよびペニシリンを含むアルファ培地）を供給した（表■ 参照）。両方のタンパク質は■：Ｃ因子発現を誘発するように働く。しかしなが ら、５ｇ／ρのウシ血清アルブミンを含む培地に部分精製したＶＷＦを加えると 、■：Ｃ因子活性が１０％ウシ胎児血清中で細胞を増殖させた際に得られたレベ ルよりも４倍またはそれ以上に高まった。これはまさしく血清の不在下で■：Ｃ 因子活性を誘発するＶＷＦの能力を示すものである。この結果はブタＶＷＦの異 なる調製物および精製したヒトＶＷＦを用いた場合にも繰り返された。

■：Ｃ因子を誘発する能力がＶＷＦに起因することを確かめるために、次の実験 を行った。■二〇因子を発現する細胞はヒトＶＷＦ欠損血漿から誘導される血清 を含む培地中でインキュベーションした。ＶＷＦ欠損血清中でインキュベーショ ンしたＣＨＯＬｉｇｌ細胞の■：Ｃ因子活性は正常のヒト血清の場合に得られた レベルの２５％であった。ブタＶＷＦ調製物をＶＷＦ欠損血清に加えた場合は、 ■因子活性が１０％ウシ胎児血清の場合に得られたレベルにまで増大した。この 効果は２．５０ｇｇ／ｍ１程度に少ないＶＷＦを用いた際にも誘発された（表ｍ Ａ参照）。

別の実験において、ＶＷＦ濃度を０．２５μｚ　／　ｍｌまで低下させると、そ の活性は１０％ウシ胎児血清レベルの５０％にすぎなかった。

血清の不在下に規定培地中で生育するように２〜３ケ月間にわたって適応させた ＣＨＯ細胞株ＩＥ６を以下の実験で使用して、外因性ＶＷＦが残留量のウシＶＷ Ｆでさえ含まない規定培地中でγＦ■発現レベルを上昇させうろことを証明した 。以下に示すデータは、規定培地への約１μｇ　／　ｍｌのブタＶＷＦの補給が ｌＯ％ウシ胎児血清含有培地で得られたレベルに等しいγＦ■の発現を可能にし たことを示している。これらの細胞はＦＢＳの不在下で３ケ月以上の間増殖させ たので、ウシＶＷＦは全く存在していなかった。従って、観察されたγＦ■：Ｃ レベルの上昇は外因性ＶＷＦによるものと思われた。

規定培地　（ＤＭ）　約４０ １０％ＦＢＳ含有培地　約２００ このデータはウシ胎児血清の不在下での外因性の部分精製ブタＶＷＦによるγＦ ■活性の増強を示している。ＣＨＯ細胞（０，１μＭ　ＭＴＸ中のＩＦ５）は部 分精製ブタｖＷＦ（約１μｇ　／　ｍｌ　）を含む又は含まない５ｇ／ｌウシ血 清アルブミン含有規定培地、もしくは１０％ＦＢＳ含有培地中に３Ｘ１０”細胞 ／ｍｌの濃度で懸濁し、３７℃で２４時間培養した。インキュベーションの終了 時に、細胞を含まない調整培地の試料は色素原検定によりγＦ■：Ｃ活性につい て検定した。

■：Ｃ因子発現 規定培地＋卵アルブミン（ｇ／ｌ）　０　０．１６４０．５　０．１ｇ９ １．０　０．２１５ ２．０　０．２８０ ５．０　０．２９０ ２０．０　０．３８０ ２．５μｇ／ｍｌのブタＶＷＦを加える　５．８　１．２００規定培地十 ウシ血清アルブミン（ｇ／Ω）　０　０．１９００．５　０．３２０ １．０　０．３８０ ２．０　０．３７５ ５．０　０．４３０ ２０．０　０．４９０ ２−５μｇ／ｍｌのブタＶＷＦを加える　５．０　１．３５０１θ％ウシ胎児血 清　０．９７ｇ、１．０７５表■Ａ：■因子生産に対するＶＷＦの作用１０％ウ シ胎児血清　１３２１ 規定培地＋５ｇ／ｌウシ血清アルブミン　３４２１０％正常ヒト血清　９３７ １Ｏ％ＶＷＦ欠損ヒト血清　２４６ １０％ＶＷＦ欠損ヒト血清十 下記の量のブタＶＷＦ ２．５μｇ／ｍｌ　１１２４ ２０　ｉｔ　ｇ／ｍｌ　１３９７ 調整培地中の■：Ｃ因子の量に対する添加ＶＷＦの作用を調べるために、細胞を ３５−Ｓメチオニンの１時間パルスで標識し、そして１０％ウシ胎児血清、１０ ％ＶＷＦ欠損ヒト血清、またはブタＶＷＦを加えた１０％ＶＷＦ欠損ヒト血清を 含むいずれかの培地中で追跡した。結果は、ＶＷＦ欠損血清にＶＷＦを添加する と、より多くの■：Ｃ因子（２００ｋＤａの重鎖と７６ｋＤａの軽鎖の両方）が 培地中に存在することを示した。■：Ｃ因子の細胞内合成には何らの変化も観察 されなかった。ｌＯ％ウシ胎児血清へのＶＷＦの添加は調整培地中の■：Ｃ因子 のレベルに全く変化を及ぼさなかった。これらの実験はＶＷＦが■：Ｃ因子の分 泌お実施例　Ｖ ＣＯ３細胞によるＶＷＦの発現 ヒトＶＷＦｃＤＮＡの部分セグメントのクローニングは以前に報告されている（ ギンスバーグ（Ｇｉｎｓｂｅｒｇ）ら、　５ｃｉｅｎｃｅ　１９８５を参照〕。

この報告の後に、全長ＶＷＦｃＤＮＡが構築され、その塩基配列が決定された。

ＶＷＦのクローニング、塩基配列および発現は国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳｌｌ１ ６１００７６０　（１９８６年１０月２３日発行）に詳細に開示されている。我 々は発現ベクターｐＭＴ２に全長ｃＤＮＡクローンを挿入してｐＭＴ２−　ＶＷ Ｆ　（ＡＴＣＣ８７１２２）を作製した。ｐＭＴ２−ＶＷＦはアデノウィルス関 連（ＶＡ）遺伝子、転写エンハンサ−を含むＳＶ４０複製起点、アデノウィルス 三分節リーダーおよび５′スプライス部位を含むアデノウィルス主要後期プロモ ーター、免疫グロブリン遺伝子由来の３′スプライス部位、ＶＷＦコード領域、 非コードＤＨＦＲ挿入物、ＳＶ４０初期ポリＡ化部位、および大腸菌内での増殖 に必要とされるｐＢＲ３２２配列を含む。ｐＱ２の誘導体であるこのベクターの 詳細はカウフマン（Ｋａｕｆｍａｎ）、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ、　Ｓｃｉ、、　ＵＳＡ　８２　：　６８９〜８９３　（ １９８５）により提供される。ｐＭＴ２−ＶＷＦ　ＤＮＡはその後ＣＯＳ細胞ト ランスフェクションのために慣用方法で調製した。ＣＯ３細胞のＤＥＡＥデキス トラン媒介トランスフェクションの６０時間後に、細胞は３５−Ｓメチオニンで 標識し、培地および細胞抽出物をウサギ抗ヒトポリクローナル抗体（カルバイオ ケム社製）を使って免疫沈殿させ、そして沈殿物をＳＤＳ還元ゲル電気泳動によ り分析した。結果は有意量のＶＷＦがトランスフェクションされたＣＯ８細胞中 で合成され、その大部分が分泌されることを示した。調整培地中には、ＶＷＦの 完全にプロセッシングされた形に似ている約２８０ｋＤａタンパク質と２２０ｋ Ｄａタンパク質が含まれていた。合成されたＶＷＦの約５０％は２００ｋＤａの 形にプロセッシングされる。非還元ゲル電気泳動によりマルチマーの形成につい て分析したとき、ＶＷＦは会合してマルチマーになるが、血漿中に見られるよう な極めて高い分子量のマルチマーにはならないことが判明した。マルチマーは大 ざっばに見積もって１００万ダルトン以下の範囲であった。ＣＯ８細胞調整培地 中のＶＷＦ抗原の分析は０．３５μｇ／ｍｌのヒトＶＷＦの存在を示した。他の 分析は、ＣＯ８細胞中で発現されたＶＷＦが血小板とコラーゲンの両方に特異的 に結合することを示した。

実施例　■ 組換えＶＷＦはヒト■：Ｃ因子の発現を誘発することができる。

ＶＷＦ発現プラスミドｐＭＴ２−ＶＷＦ！；１ＤＥＡＥデキストラン媒介トラン スフエクシヨンによりＣＯ８細胞にトランスフェクションし、その８６時間後に 培地を無血清培地（血清不含ＤＭＥＭ）に変えた。７２時間後にＣＯ８細胞調整 培地を収穫し、無血清培地で予め洗浄したＣＨＯＬ１ｇｌ細胞（２０μＭＭＴＸ 耐性）に（１０６細胞／ｍｌで）加えた。２４時間後培地をＣＨＯ細胞から採取 して■因子活性について検定した。結果は１０％ウシ胎児血清中および無血清培 地中で２４時間増殖させたＣＨＯ細胞からの■：Ｃ因子活性と比較して以下に示 す：ＣＨＯＬｉｇｌ　（２０μＭ　ＭＴＸ）　■：Ｃ因子活性に対する培地　（ ｍｕ／ｍｌ） 擬似トランスフェクションされた ＣＯＳ細胞からの調整培地　１４１ ＶＷＦ　）ランスフエクションされた ｃｏｓ細胞からの調整培地＊４２３ １０％ウシ胎児血清　９５０ 無血清培地　３０ ＊　この実験での調整培地は０．３μｇ／ｍｌのヒトＶＷＦを含んでいた。

実施例　■ ■：Ｃ因子を発現するＣＨＯ細胞へのＶＷＦ遺伝子の導入、発現および増幅 チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞によるＶＷＦの発現のために、第２ の発現ベク９−ｐＭＴ２ＡＤＡ−ＶＷＦ（ＡＴＣＣ６７１７２）を使用して、ア デノシンデアミナーゼ酵素を過剰発現する細胞のための選択プロトコールにより プラスミド配列を増幅させた〔カウフマン（Ｋａｕｆｍａｎ）ら、　Ｐｒｏｃ、 　Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ。

Ｓｃｉ、８３　：　３１３８　（１９８８）　；米国特許出願第８１９８０１号 を参照〕。

１ｍＭ　ＭＴＸ中の（実施例Ｉからの）Ｌｉｇｌ　２−ａよりクローン化され、 １０Ａ１と命名された■：Ｃ因子発現細胞株をｐＭＴ２ＡＤＡ−ＶＷＦ移入のた めの受容細胞として使用した。

ｐＭＴ２ＡＤＡ−ＶＷＦはサンドリーゴールディン（Ｓａｎｄｒｉ　−Ｇｏｌｄ ｌｎ）ら、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、１　：　７４３　（１９８１） に記載されるようなプロトプラスト融合により１０Ａ１細胞内に導入した。

ｐＭＴ２ＡＤＡ−ＶＷＦを保有する大腸菌ＤＨ５細胞（ＤＨ５は相同組換えおよ びＶＷＦ配列の欠失を最小限に抑えるために使用した）は、５０μｇ／ｍ１アン ピシリンを含むし培地中でＡ　ｅｏｏ　”’　０　、８になるまで増殖させた。

クロラムフェニコールを２５０μｇ／ｍｌになるまで加え、この培養物を３７℃ でさらに１６時間インキュベーションしてプラスミドのコピー数を増幅させた。

プロトプラストの懸濁液をサンドリーゴールディンらの上記文献（１９８１）に 記載されるように調製し、約１〜２Ｘ１０’プロトプラスト／細胞の割合で１０ Ａ１細胞に加え、そしてＩＥＣモデルに遠心機を使って２００Ｏｒｐｍで８分間 細胞上に遠心した。

遠心後、上清を吸引により除き、それぞれのプレートに２ｍｌのポリエチレング リコール溶液〔ダルベツコ変性培地５０ｍ１中のＰ　Ｅ　Ｇ１４５０　（ベーカ ーケミカル社製）５０ｇ）を加えた。細胞を２０００ｒｐｍで９０秒間再度遠心 し、ポリエチレングリコール溶液を除き、プレートは１０％（Ｖ／Ｖ）ウシ胎児 血清を含むアルファ培地中で３回洗浄した。その後、細胞は１００μｇ／ｒｎｌ カナマイシン、１０μｇ／ｍｌずつのペニシリンおよびストレプトマイシン、お よび２０μＭ　ＭＴＸを含む培地の組織培養皿にまいた。２日後細胞はトリプシ ン処理し、１０％透析ウシつ児血清、０．１μｍデオキシコホルマイシン、１０ μｇ／ｍｌずつのペニシリンおよびストレプトマイシンを含むＡＤＡ選択培地中 へ２０μＭ　ＭＴＸの存在下および不在下に１：１５で継代培養した。ＡＤＡ選 択培地（ＡＡＵ）は１．１ｍＭアデノシン、１０．ｃｚｇ／ｍｌアラノシンおよ び１ｍＭウリジンを含んでいた。その後、この段階でのＭＴＸ選択の撤去は■： Ｃ因子発現の減少をもたらすことがわかった。

以後はＭＴＸをＡＤＡ選択培地中にそのまま残しておいた。

細胞毒性濃度のアデノシンの存在下に次第に増加する濃度の２′　−デオキシコ ホルマイシン（ｄＣＦ）中での増殖を選択することにより、ＶＷＦ遺伝子を増幅 することができた。形質転換体のプール（６コロニー）は２０μＭ　ＭＴＸの存 在下でＡＤＡについて選択したプール中の１０Ａ１細胞の６コロニーから調製し た。ＡＤＡ選択手段はその後２０μＭ　ＭＴＸの存在下で２′　−デオキシコホ ルマイシンの濃度を（０，１μＭ、０．５μＭ。

１．０μＭおよび２．０μＭの諸段階に）増すことにより変更した。

それぞれの段階で、ＶＷＦおよび■：Ｃ因子の生産は１０％ウシ胎児血清（Ｆ　 ＣＳ）の存在下または規定培地中で２４時間後に測定した。結果を以下に要約す る： ＣＯ８細胞株によるＶＷＦおよびＦ■：Ｃの同時発現ｄｃＦ　ＭＴＸ　μＵ／細 胞 μＭ　μＭＪ１ぎ／ｍｌ　ｐｇ／細胞 １０Ａ　１　０．３８＊ （ＶＷＦなし）　０．９３” ０．１　２０　０．０７　０．１ ０．５　２０　０．８　１．１４　０．６３　＊１０Ａ１３−ａ　０．８９＊” プール　１．０　２０　２４　３０　０．６３＊１．１　＊　＊ ２．０　１０００　７．４　２４　１．４＊＊＝規定培地中；＊＊＝ｌＯ％ウシ 胎児血清含有培地中；ＶＷＦ抗原はアフィニティー精製したウサギ抗ＶＷＦ抗血 清（カルバイオケムーベーリング社製、　７８２３０１）　、標準および対照と して役立つ正常ヒト血漿プールからの精製ＶＷＦ抗原、およびカルバイオケムー ベーリング社製。

７８２３０１から単離し且つアルカリ性ホスファターゼに結合させたＩｇＧを使 用してＥＬＩＳＡ検定により測定した。

■：Ｃ因子活性は実施例Ｉに記載した色素原検定により測定した。

これらの結果は、ＶＷＦ発現が次第に増加するＡＤＡ選択により高められること を示している。さらに、■二〇因子の発現は１０Ａ１３−　ａラインの２μＭ　 ｄＣＦおよび１０００μＭ　ＭＴＸにおいて観察されるように血清の存在に依存 せず、規定培地中で１．４μＵ／細胞／日の■：Ｃ因子を発現した。

実施例　■ ■二〇因子を発現するＣＨＯ細胞とＶＷＦを発現するＣＨＯ細胞との融合 ＶＷＦ遺伝子はｃＨｏ　ＤＨＦＲ欠損細胞（ＤＵＫＸ−Ｂｌｌ。

チェイシン（Ｃｈａｓｌｎ）およびユーラウプ（Ｕｒｌａｕｂ）、　Ｐｒｏｃ、 　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃ１．　７７　：　４４２１Ｂ　（１９８０）を参照〕に導入し た。ｖＷＦ発現と共にＭＴＸ耐性またはｄＣＦ耐性を発現する細胞を得るために ２つの方法が採用された。その後どちらの細胞株も、ＭＴＸまたはｄＣＦ耐性に ついて選択する能力と共に■：Ｃ因子を発現する他の細胞に融合するために使用 される。

ＣＨＯＤＨＦＲ欠損細胞におけるＭＴＸ増幅プラスミドｐＭＴ２ＶＷＦおよびｐ 　Ａ　ｄ　Ｄ、２８Ｓ　Ｖ　ｐ　ａ　（３）は１０：１の割合で混合し、カウフ マン（Ｋａｕｆｍａｎ）およびシャープ（Ｓｈａｒｐ）、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂ ｉｏｌ、　１５し：　６０１　（１９８２）に記載されるようにＣａ　Ｐ　０４ 共沈によりＣＨＯＤＵＫＸ−Ｂｌｌにトランスフェクションした。細胞はヌクレ オシドの不在下で増殖させることによりＤＨＦＲ陽性表陽性表現−て選択し、コ ロニーをプールし、そして次第に増加するＭＴＸ耐性について選択した。

結果はＶＷＦ発現が次第に増加するＭＴＸ耐性と共に高められることを示してお り、以下の表に示す：選　択　ｎｇ／ｍｌ　ＶＷＦ Ｏ００２μＭ　ＭＴＸ　−−ｍ− 〇、２　μＭ　ＭＴＸ　５Ｂ １．０μＭ　ＭＴＸ　９１ プラスミドｐＭＴ２ＡＤＡ−ＶＷＦは実施例■に記載したようにＣＨＯＤＵＫＸ −Ｂｌｌ細胞に導入し、そして細胞は４μＭ　ｘｙｌ−Ａ、　０．０３μＭ　ｄ ＣＦ、　１０μｇ／ｍｌヒボキサンチン、１０μｇ／ｍｌチミジン、および１０ μｇ／ｍｌずつのペニシリンおよびストレプトマイシンを含むＡＤＡ選択アルフ ァ培地中での増殖について選択した。３〜５　ｐｇ、’細胞／日のＶＷＦを発現 する１つのクローンＰＭ５Ｆが誘導された。このクローンはその後■：Ｃ因子因 子遺伝子用入用容細胞として■：Ｃ因子細胞株に融合するために使用された。

■：Ｃ因子およびＶＷＦ発現細胞株の融合■：Ｃ因子発現プラスミドｐＬＡ２は すでに開示されている〔トゥール（’ｌ’ｏｏｌｅ）ら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ ｌ、　Ａｃａｄ、ｅ　１９８６　；国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８６１００７ ７４を参照〕。このプラスミドはプロトプラスト融合を行い、■因子−ＤＨＦＲ 転写物の３′領域からのＤＨＦＲを選択することにより、ＤＵＫＸ−Ｂｌｌ　Ｃ ＨＯ細胞内に導入した（ＰＣＴ／ＵＳ８６１００７７４を参照）。細胞株は１． ０μＭＭＴＸまでのＭＴＸ耐性について選択することにより誘導され、ＬＡ３− ５と命名された。この細胞株は（１０％ウシ胎児血清中で）３〜５μＵ／細胞／ 日の■：Ｃ因子の欠失体を発現する。

この修飾■：Ｃ因子はまた効率のよい合成のためにＶＷＦと結合し、ＶＷＦを必 要とする。ＬＡ３−５はＰＭ５Ｆに融合させ、そしてＭＴＸ耐性およびｄＣＦ耐 性の画表現型を発現するハイブリッドを選択した。

融合のために、ＰＭ５Ｆは（氷上で３０分間０．０３％の）ジエチルピロカーボ ネートで処理してＰＭ５Ｆを殺した。その後これらの細胞はポリエチレングリコ ール誘導細胞融合によりＬＡ３−５に融合させた：すなわちＤＥＰＣ処理ＰＭ５ Ｆ細胞はＩＥＣ−Ｅ−デルに遠心機を使ッテ２０００ｒｐｍで８分間ＬＡ３−５ （１，５Ｘ１０６細胞）上に遠心した。遠心後上清を捨て、２ｍｌの５０％ＰＥ Ｇ溶液を加えた。ＰＥＧを４５秒間そのままにし、その後細胞を無血清培地で十 分に洗浄した。細胞は血清含有培地中で４８時間培養し、次Ｅ＝３　μＭｘｙｌ 　−Ａ、　０．０３ＲＭｄ　ＣＦ。

１０Ｒｇ／ｍｌずつの次の成分：チミジン、ヒポキサンチン、ストレプトマイシ ン、およびペニシリンを含む選択培地で継代培養した。しかしながら、チミジン およびヒポキサンチンを含ませる必要はなかった。０．７３Ｒｇ／細胞／日のＶ ＷＦおよび０．２〜２、ＯＵ／ｍｌ／日の■：Ｃ因子を発現するハイブリッドの プールが得られた。このプールはその後０．５μＭ　ＭＴＸの存在下であってチ ミジンおよびヒポキサンチンの不在下に増殖させた。これらの細胞は４　ｕＭ　 ｘｙｌ　−Ａ、　０．０３ＲＭ−ｄ　ＣＦオ、Ｊ：び０．５μＭ　ＭＴＸを含む アルファ培地中でクローニングして次のクローンを得た： ＣＩＯ細胞による■：Ｃ因子およびＶＷＦの同時発現クローン　ＶＷＦ発現　■ ：Ｃ因子の発現（ｐｇ／細胞）　（μＵ／細胞−培地）Ｈ６１Ｂ　２．８−規定 培地 ３．８−１０％ＦＣ３ ８９２０４，５−規定培地 ５．１−１０％ＦＣ３ Ｈ６３４７，７−規定培地 ８　、７−１０％ＦＣ８ Ｂｌ　８．　１０．５−規定培地 １１．８−１０％ＦＣ３ これらの結果は規定培地中で高レベルの■：Ｃ因子を生産するＶＷＦ／■：Ｃ因 子同時発現細胞株の能力を示している。

実施例　■ ＶＷＦを発現する細胞への■：Ｃ因子遺伝子の導入９０７アミノ酸から成る■： Ｃ因子欠失変異体は、９０ＫＤａ切断部位（残基７４０）から７６ＫＤａ切断部 位（残基１８４７）までを直接融合させるヘテロ二重鎖突然変異誘発（ＰＣＴ／ ＵＳ８６１００７７４）により作製した。得られたプラスミド１）９０−７６Ｒ はｐＭＴ２中のポリシストロニツタ転写単位の５′側に■：Ｃ因子コード領域を 有する。このプラスミドを保有する大腸菌ＨＢ　１０１のプロトプラストを調製 し、実施例■のようにしてＶＷＦ発現細胞株ＰＭ５Ｆに融合させた。プロトプラ スト融合からの回復の４８時間後に、細胞は１０％透析ウシつ児血清、４μＭ　 ｘｙｌ　−Ａ、および０．０３ＲＭ　ｄＣＦを含むＤＨＦＲ選択培地（ヌクレオ シドを欠くアルファ培地）中で継代培養した。２週間後、形質転換体を単離して ■：°ｃ因子発現について検定した。出現した形質転換体の約２０％はＶＷＦと ■：Ｃ因子の両方を発現した。１つの形質転換体の結果を以下に示す： Ｆ　１　１．５　ｔｔＵ／細胞　１３７５ｍＵ／ｍｌ規定培地０．９４ＪＩＵ／ 細胞　１３３０ＩｌｌＵ／　ｍｌｌｏ％ＦＣ８（ＶＷＦ　＝１．６９．ｃｚ　ｇ ／ｍｌ、　１．８５Ｒｇ／細胞）これらの結果は、ＰＭ５Ｆ細胞株においてＤＨ ＦＲＨＦ型を選択する能力、ならびに■：Ｃ因子発現に対する血清依存を緩和す るために■：Ｃ因子とＶＷＦを同時発現する能力を示している。

国際調査報告

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. １．ＶＩＩＩ：ｃ因子型タンパク質を発現しうる哺乳動物細胞を培養することか ら成るＶＩＩＩ：ｃ因子型タンパク質の生産方法であって、その改良点が約１０ 容量％以下の哺乳動物血清を含み且つ（ａ）哺乳動物フォン・ビルブラント因子 （ＶＷＦ）；（ｂ）リン脂質またはリン脂質混合物；および（ｃ）（ａ）と（ｂ ）との混合物 より成る群から選ばれる成分を含む培地中で上記細胞を培養することから成る生 産方法。
2. ２．その成分はＶＷＦであり、培地は約１容量％以下の哺乳動物血清を含む、請 求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．培地は本質的に血清を含まない、請求の範囲第２項記載の方法。
4. ４．ＶＷＦは哺乳動物血清から誘導されるＶＷＦである、請求の範囲第１項記載 の方法。
5. ５．ＶＷＦは組換え哺乳動物ＶＷＦである、請求の範囲第１項記載の方法。
6. ６．培地はＶＷＦを産生する遺伝子工学的に処理された細胞により調整されるこ とによって組換えＶＷＦを含む、請求の範囲第４項記載の方法。
7. ７．ＶＷＦを産生する遺伝子工学的に処理された細胞はＶＩＩＩ：ｃ因子を同時 発現する、請求の範囲第６項記載の方法。
8. ８．組換えＶＷＦはＶＩＩＩ：ｃ因子と別々に生産され、そしてＶＩＩＩ：ｃ因 子産生細胞を培養する培地に添加される、請求の範囲第６項記載の方法。
9. ９．リン脂質またはリン脂質混合物はセファリン、ホスファチジルセリン、ホス ファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールア ミン、大豆レシチン、またはそれらの混合物から選ばれる、請求の範囲第１項記 載の方法。
10. １０．リン脂質は大豆レシチンである、請求の範囲第１項記載の方法。
11. １１．ＳＬ（大豆レシチン）は培地１ｍ１当たり約１〜１０００μｇの量で存在 する、請求の範囲第１０項記載の方法。
12. １２．ＳＬは培地１ｍ１当たり約１００〜３００μｇの量で存在する、請求の範 囲第１１項記載の方法。
13. １３．培地は約５容量％以下の血清を含む、請求の範囲第１０項記載の方法。
14. １４．培地は約１容量％以下の血清を含む、請求の範囲第１３項記載の方法。
15. １５．リン脂質またはリン脂質混合物は培地の容量に基づいて約０．０１〜１０ 重量％の量の乾燥ミルクの形である、請求の範囲第１項記載の方法。
16. １６．乾燥ミルクの量は培地の容量に基づいて約１〜３重量％である、請求の範 囲第１５項記載の方法。