JPS63316796A - 肝炎δの診断薬およびワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、肝炎δの感染の拡大を制御する材料および方
法論に関する。さらに特定すると、肝炎δウィルスに関
する診断ＤＮＡ断片断片１タ断タンパクよび防御抗原と
抗体に関する。

（従来の技術） 肝炎ウィルスの異常型、Ｂ型肝炎（ＨＤＶ）　（これは
、またδ因子とも呼ばれる）は、　Ｒｉｚｚｅｔｔｏ、
　Ｍ、＋ら、釦ｔ　（１９７７）　　１８　：　９９７
−１００３により、　１９７７年に発見された。このウ
ィルスは、Ｂ型肝炎に感染した患者の肝臓細胞の免疫蛍
光により、新抗原／抗体系として検出された。事実、そ
の後の研究によれば、Ｄ型肝炎ウィルスは、複製のため
にはＢ型肝炎ウィルスとの同時感染に依存することが示
された。このヘルパー機能の性質は今のところ明らかで
ない。しかし、このＨＤＶは、明らかに“°δ抗原パタ
ンバクにより囲まれている１木鎖ＲＮＡゲノムを含む。

このタンパクはさらにＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）
に囲まれており、３５〜３７ｎｍの粒子形態をとってい
る（Ｒｉｚｚｅｔｔｏ、　Ｍ、、　ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒ
ｏｃ　Ｎａｔｌ＾ｃａｄ　Ｓｃｉ　ＬＩＳ＾（１９８０
）　？７　：　６１２４−６１２８　；　Ｂｏｎｉｎｏ
。

Ｆ、、　ｅｔ　ａｌ、　　肛匹旦触■（１９８１）　１
　：　１２７−１３１）。

それゆえ、感染中に生成されるＤＮＡは“ゲノム鎖およ
び相補鎖を有するだろう。

伝染の疫学および様式は、Ｂ型肝炎（）ＩＢＶ）と１１
０νとで類似しているらしい。そこでは、　ＩＩＤＶは
、輸血を通して、および体液の密接な直接接触により伝
染する。ＨＤＶ　（またはδ）感染の３つの型が同定さ
れている：慢性Ｂ型への急性δの重感染、慢性Ｂ型への
慢性δの併発、および象、性δとＢ型肝炎との同時感染
（Ｓｃｈｉｆｆ、　Ｅ、Ｒ，＋　ｅｔ　ａｌ、」艮且亜
ｔｉｃＭｅｄｉｃｉｎｅ　（１９８５，３月）　１７−
２２）。この病気は最初は地中海海域で確認されたが、
全世界に拡がったらしい（Ｊａｃｏｂｓｏｎ＋　１．Ｍ
、＋　ｅｔ　ａＬ　ｊｊｇｇｉｏｌｏＢＬ（１９８５）
５　：　１８８−１９１）。この病気の人口統計学的局
面および疫学的局面の再調査は、またＲｉｚｚｅｔｔｏ
、　Ｍ、＋ら。

２Ｌ１Ｊす↓悼−（１９８５０：　１８７−１９３に見
出される。

この病気の経過はよく知られており、そしてこのピリオ
ンの一般的構造も理解されている。しかし、このウィル
スの遺伝子構造として利用できる情報は以前にはなく、
シかもδ抗原の性質もわかっていなかった。血液試料を
用いることによるこの病気の存在の検出に利用できる唯
一の分析は。

ヨーロッパで市場に出ている免疫分析である。これは、
アメリカ合衆国ではまだＦＤＡの認可を受けていない。

以前の検出方法は、生検標本での肝細胞の核の直接免疫
蛍光法に限られていた。本検出方法の一つの型は、標識
抗δＩｇＧのδ抗原自体への結合を、検査血清中の抗体
が阻止する能力に基づく。他の形態は、検査血清からの
抗δＩｇＭが固相に固定された抗ヒト■ｇＭ（μ鎖に特
異的）に結合し２次いで標準δ抗原および標識抗δＩｇ
Ｍを加えることにより、検査血清中の抗δＩｇＭの存在
（追加されたδ抗原とともに）によって標識抗δＩｇＭ
の結合を可能とする能力に依存する。これらの検査は、
いずれもδ抗原タンパクの構造またはＩＩＤＶゲノムの
構造の分析、またはそれら構造の知見を必要としない。

現在、　ＤＮ＾ハイブリダイせ−ショクによるこの病気
の診断に有効なプローブの設計が可能であり。

また同時にワクチンとして、そして診断検査の際の薬と
して使える組換えタンパクの生成も可能である。さらに
、！Ｊ１換えにより生産されるタンパクは９診断または
受動的な治療に有用な抗体を生成するために使用可能で
ある。

（発明の要旨） ＨＤＶ診断薬またはワクチンの生産に有用な本発明のヌ
クレオチド配列は、第２図に示されるＤ型肝炎ウィルス
（ＨＤＶ）ゲノムまたはその相補体に由来する。この配
列は、開放された読取り枠（ＯＲＦ）１−１２．　　好
ましくはＯＲＦ、１．０ＲＦ２．０ＲＦ５．０ＲＦ６．
０ＲＦ７゜さらに好ましくは０ＲＦ５に由来する領域を
包含する。

本発明の組換え発現系は、所望の宿主と適合可能な制御
配列に作動し得るように連結し上記配列に由来する。　
ＤＮＡのコード部分を包含する。

本発明は、上記発現系で形質転換された宿主細胞を包含
する。本発明はまた。上記細胞により生産されるタンパ
クを包含する。本発明はまた。上記タンパクにより生ず
る抗体を包含する。

ＨＤＶ抗原に対する抗体を生ずる本発明の免疫原性粒子
は、アミノ酸配列が真核宿主で生産される場合２粒子を
形成し得る該アミノ酸配列を有する組換えポリペプチド
を含有し、該ポリペプチドはＨＤＶのエピトープを含む
。

生物試料中のＨＤＶの存在を検出するのに有用な本発明
のオリゴヌクレオチドプローブは、第９図に示される）
ＩＤＶゲノム配列またはその相補体に由来する。８また
はそれ以上のヌクレオチドのＤＮＡ配列を包含する。

１１ＤＶの存在について生物試料を分析するための本発
明のキットは、上記オリゴヌクレオチドプローブ、およ
び該分析のＩ旨示書を含む。

生物試料中のＨＤＶ抗原の存在を分析するための本発明
の他のキットは、上記形質転換された細胞により生産さ
れるタンパクまたは上記免疫原性粒子に対して生じる抗
体、および該分析の指示書を含む。

生物試料中のＨＤＶ抗体の存在を分析するための本発明
の他のキットは、上記ヌクレオチド配列内にコードされ
るエピトープを含むポリペプチドを含有する。

１１ＤＶ感染の治療または予防のための本発明のワクチ
ンは、上記ヌクレオチド配列にコードされるポリペプチ
ドを含有する。

ＨＤＶ抗原内に含まれるエピトープとして免疫学的に同
定可能なエピトープを含むタンパクを生産するための本
発明の方法は１組換えベクターにより形質転換された宿
主細胞を該ベクターを発現させる条件下で培養すること
を包含し、該ベクターは、第２図に示されるＨＤＶゲノ
ムまたはその相補体に由来するヌクレオチド配列を含む
。

ＨＤＶを検出する本発明の方法は、第２図に示されるＨ
Ｄνゲノムまたはその相補体に由来するヌクレオチド配
列と生物試料をハイブリダイズさせることを包含する。

ＨＤＶに対する抗体を生産するための本発明の方法は、
　ＨＤＶ抗原内に含まれるエピトープとして免疫学的に
同定可能なエピトープを含むタンパクを用いて動物に予
防接種することを包含し、該タンパクは、第２図に示さ
れるＨＤＶゲノムまたはその相補体に由来するヌクレオ
チド配列を含む組換えベクターにより形質転換された宿
主細胞中で合成される。

本発明は１完全なＩＩＤＶゲノム配列のｃＤＮＡ複製物
の群を提供する。これらのｃＤＮＡ配列の一部は、臨床
試料中のウィルスの存在を診断するためのプローブとし
て、およびこのウィルスの天然で生ずる変種を単離する
ためのプローブとして有用である。

この基本的なゲノム配列（およびその相補体）を知るこ
とは、また開放された読取り枠の１つにコードされるδ
抗原のポリペプチド配列を使用可能とし、これらペプチ
ドまたはその一部（これらは標準物または診断検査薬と
して、そしてワクチンの成分として有用である）の生産
を可能にする。

同様に、いずれかの鎖の他の開放された読取り枠の分析
により、他のウィルスペプチド配列の推定が可能となる
。このペプチド配列は、　ＩＩＤＶの特徴であり、そし
て同様に有用であろう。保護抗体もまた１組換えで生産
されるタンパクからつくられ。

そしてポリクローナル型またはモノクローナル型で得ら
れる。

それゆえ、完全なＨＤＶ配列の有用性により、ワクチン
または診断薬のいずれかとして役立つポリペプチド、ま
たはこの病気に対する受動的免疫治療薬に有用なモノク
ローナル抗体（Ｍａｂ）ＡＩ調製物生産する際の中間体
として役立つポリペプチド。

または診断薬として有用な抗体生産の中間体として役立
つポリペプチドの設計および構築が可能となる。治療成
分または阻止成分の設計者の随意になる完全なゲノム配
列がなければ、最も効果的な産物の望ましい生産は不可
能であろう。

従って、ある局面では９本発明はｆｌＤＶｌ断薬および
ワクチンの生産に有用なヌクレオチド配列に関する。こ
の診断薬およびワクチンは、第２図に示されるようなＨ
ＤＶゲノムまたはその相補体に由来する。それゆえ２本
発明は２診断薬としてまたはワクチンとして役立つペプ
チドの生産のために。

これらペプチド自体に対するオリゴマープローブとして
、および病気の診断と治療に有用なポリクローナルおよ
びモノクローナル抗体に対するオリゴマープローブとし
て、この配列またはその一部の利用に関する。

本発明の他の局面には発現系が包含される。この発現系
は、所望タンパク（これは完全なゲノムに由来の配列に
よってコードされている）の生産を生じ得る。この発現
系は、系またはその一部に含まれる組換えベクター、こ
のようなベクターで形質転換された組換え宿主細胞、こ
の形質転換細胞により生産されるタンパク、およびこの
ようなタンパクから調製されるワクチンに対する発現系
である。さらに１本発明は、このゲノムによりコードさ
れるエピトープを表す特異的ペプチド配列。

および標識タンパクまたは担体タンパクに共有結合で連
結されたこのような配列に関する。より一般的な担体に
加えて、担体タンパクには、Ｂ型肝炎感染と関係のある
２２ｎｍ粒子が含まれる。この粒子はポリアルブミン　
リセプク一部位を有し、そして非集合サブユニット成分
の１０００倍の免疫力がある。抗原性）ＩＤＶ決定基を
２２ｎｍ　ＨＢｓＡｇ粒子に挿入することにより、これ
らのエピトープに対する免疫原性を増大させ得る。

本発明はまた。これら所望のポリペプチドワクチンおよ
び免疫グロブリンの調製方法、およびプローブ、ポリペ
プチド、および／または免疫グロブリンを含む分析キッ
トに関する。

（本発明の実施様式） ここで用いられるように、　ＨＤＶゲノムまたはｃＤＮ
Ａ“に由来する（から誘導される）゛ヌクレオチド配列
とは１例示されるポリヌクレオチドの本質的な特性を保
持している配列を示す。このヌクレオチド配列は、意図
する目的に合うように、それが由来する全配列の一部を
表す。このような誘導体の特定の例（しかしこれに限定
されない）は、同−または実質的に同一のアミノ酸配列
をコードするが、しかし、コドンの縮重のために、異な
った特定のコドンを用いる配列により、示されるだろう
。別の例には相補鎖がある。診断試験で有用なプローブ
またはオリゴヌクレオチドは、示された配列と相補性を
保つ必要がある。しかし、このプローブまたはオリゴヌ
クレオチドは、全配列よりも短くてもよく、または部分
的にとんでいてもよい。しかし、操作または発現に用い
る場合、制限部位を作るもしくは欠失させる。プロセッ
シング部位を与える。あるいはコードされているアミノ
酸配列を（機能性に悪い影響を与えない方法で）変える
ように、ヌクレオチドを変えることが望まれる。“ヌク
レオチド配列”とは、リボヌクレオチド配列およびデオ
キシリボヌクレオチド配列の両方を表し、そしてゲノム
鎖およびその相補鎖の両方を含む。

従って、　）ＩＤＶのゲノムを含むヌクレオチド配列に
“由来する゛”　　ＤＮＡとは、ゲノムヌクレオチド配
列の領域（あるいはその相補体）中の配列に相当する配
列を含むＤＮＡ配列をいう。あるいは、このＤＮＡは、
それの意図する使用に適合するように。

当該分野で公知の方法で修飾されたこの配列領域の組み
合わせを含むＤＮＡ配列をいう。もちろん。

これらのＤＮＡは、その遺伝子の塩基配列からは必ずし
も物理的に誘導されない。しかし、これらのＤＮＡは、
そのポリヌクレオチドが誘導される領域中の塩基配列か
ら与えられる情報に基づき、あらゆる様式で生じるポリ
ヌクレオチドのことをいう。

例えば、典型的なりＮＡ配列が“誘導され得る領域には
、特定のエピトープをコードする領域、およびδ抗原の
一部分をコードする領域が含まれる。

同様に、δ抗原に“由来する”ペプチドは、これらのポ
リペプチドまたはそれらの一部と実質的に同一のアミノ
酸配列をいう。上記ペプチドは、その部分と同じ生物学
的特性を有する。このような“誘導された”ペプチｙの
合成方法は重要ではない。例えば、その方法は化学合成
であり得、もしくは組換え方法であり得る。

“組換え宿主細胞”、“宿主細胞”、“°細胞°°。

°°細胞系”、“細胞培養物”、および単細胞体として
培養される微生物または高等な真核生物細胞を示すよう
な他の用語は、互換的に用いられ１組換えベクターまた
は他のトランスファーＤＮＡの受容体として用いられ得
るか、あるいは用いられてきた細胞を示す。この細胞は
、トランスフェクトされたもとの細胞の子孫細胞を含む
。単一の親細胞の子孫細胞は、もとの親とは、形態上、
またはゲノムもしくは全ＤＮＡにおいて、必ずしも完全
に同一とはなり得ないことがわかった。これは偶然また
は故意の変異が原因となる。所望のペプチドをコードす
るヌクレオチド配列の存在のような関連した特性により
特徴づけられた親細胞と、十分類偵しているこの親細胞
の子孫細胞は、この定義により意図される子孫細胞に含
まれ、そして上の用語に包含される。

“°制御配列゛とは、連結されているコード配列の発現
を生じさせるのに必要なりＮＡ配列を示す。

このような制御配列の性質は宿主生物によって異なる。

原核生物では、一般にこのような制御配列は、プロモー
ターおよびリボゾーム結合部位を含む、真核生物では、
一般に、このような制御配列は、プロモーター、ターミ
ネータ−を含み、またある場合には、エンハンサ−をも
含む。“制御配列”という用語は、最低限その存在が発
現に必要である全ての成分を含むことを意図している。

そして、それが存在することが有利であるという付加的
な成分を含んでいてもよい。

゛°動作可能に連結された”とは、記述の成分が。

意図された様式にてそれらを機能させるのを許容する関
係にある近位状態をいう。コード配列に３“動作可能に
連結された”制御配列は、このコード配列の発現が、制
御配列に適合可能な状態で達成されるようにして結合さ
れていることをいう。

“開放された読取り枠°”とは、ポリペプチドをコード
するポリヌクレオチド配列の領域である。

“〜と／〜とじて、免疫学に同一である゛とは。

非天然型のタンパク、すなわち人工的に合成されたタン
パク、または組換えタンパク中に、エピトープが存在す
ることを意味する。このようなタンバクは、このＨＤＶ
ウィルスタンパク中にも存在する。これらのエピトープ
は、このＨＤνタンパクに対して生じる抗体との免疫的
反応性により同定され得る。非天然型タンパク中でのそ
れらの存在は。

この＋ＩＤＶ抗体との直接的な反応、および非天然型タ
ンパクとＩＩＤＶタンパクとの競合分析（これは。

１１０Ｖタンパクに対する抗体の分析である）により。

検出され得る。抗体結合の検出方法、および結合の際の
競合の決定方法は、当該分野で標準的な技術者に公知で
あり、それらはまた以下に例示される。

（以下余白） Ｂ、二１１嘘亡り 本発明の有用な材料および方法は、その各々がＤ型肝炎
ウィルスの完全なゲノムを含む、一群のヌクレオチド配
列を与えることにより、実現される。この一群のポリヌ
クレオチドを利用することにより、まず第１に、わずか
な異質性を有する。

このゲノム群の他のゲノムを単離し得る。第２に。

診断に有用なりＮＡおよびタンパクの構築を可能にする
。このＤＮＡ　、すなわち約８〜ｔｏｂｐあるいはそれ
以上のオリゴマーに関しては、病気診断の際のハイブリ
ダイゼーションプローブとして有用である。このような
プローブは５例えば、ウィルスを保持すると思われる被
検体の血清中にて、ウィルスゲノムの存在を検出するの
に用いられ得る。このＨＤＶ配列はまた。　ＨＤＶ−特
異的ポリペプチドの設計゛および生産を可能にする。こ
のポリペプチドは。

血清または血液中で、　ＨＤＶに起因する抗体の存在を
調べる診断薬として有用である。これらのポリペプチド
に対して生じた抗体はまた１診断薬として有用である（
δ抗原に対する開放読取り枠に加えた開放読取り枠が、
完全なゲノムあるいはその相補体中で解読され得るので
、δ抗原自身の他に。

１１ＤＶ関連タンパクの一次構造が推論され得る。これ
らはまた、ウィルスに特有なマーカーペプチドとなり得
１診断にも有用であり、おそらく免疫化にも有用であろ
う）。最後に、この遺伝子配列の知見はまた。　ＩＩＤ
Ｖに対し効果的なワクチンの設計および生産を可能にし
、そして、感染を防御する抗体の生産をも可能にする。

ゲノムから入手し得る配列情報は、δ抗原または他のポ
リペプチドのアミノ酸配列の推論を可能とし、そして、
適したエピトープが同定させる。

この完全なδ抗原または、その適当な部分が、関連した
ＤＮＡ断片（独立して得られかつ発現される）により生
産され得、それゆえ組換え技術に用いられる所望のポリ
ペプチドが供給される。原核生物宿主および真核生物宿
主の両方が、このような発現には有用である。短いポリ
ペプチド断片は、また化学的に合成され得、ワクチンと
して用いるべく、担体タンパクに連結される。さらに、
このエピトープは、免疫原性を与えるタンパクに連結さ
れて生産され得る。このように生産されたタンパクは、
それ自体、ワクチンとして用いられ得、または宿主中で
免疫応答Ｂ細胞を生産するべく用いられる。次いで、こ
のＢ細胞は、受身免疫療法に有用な抗体を分泌するハイ
プリドーマを生産するために用いられ得る。

Ｂ、　　１．１１ＤＶ這倣ヱ■剋■里盟１１０Ｖが接種
され、高力価のウィルス（ｌ　ｒｒｄｌ当り。

約１０”のチンパンジー惑染量）を含むチンパンジーの
血清が、ウィルス源として用いられた。集められたウィ
ルスから抽出された核酸は、変性ゲル電気泳動により分
析したところ、常に約１７００ヌクレオチドを含む二本
鎖ＲＮＡであった。このＲＮＡを鋳型として用いて、こ
の二本鎖１’ｌＮＡに特異的にハイフ゛リダイズする。

約１６４ｂｐのｃＤＮ八クワクローンＫＤ３）が得られ
た。そしてそのＤＮＡ配列が決定された（Ｄｅｎｎｉｓ
ｔｏｎ、に、Ｊ、、　ｅｔ　ａｌ、　５ｃｉｅｎｃｅ　
（１９８６）　２３２　：８７３−９７５）。この決定
されたＤＮＡ配列（公表に先立って提供された）に基づ
いて、２つの相補的な合成オリゴマー（その１つはこの
二本鎖ＲＮＡとハイブリダイズする）が調製された。

このハイブリダイズするオリゴマーは２次いで。

二本鎖ＲＮ＾から、岡山／バーブ法によって調製された
ｃＤＮＡライフ゛ラリ−のプローブ゛に用いられた。

その結果、　５７０ｂｐの挿入断片を含むクローンδ１
が得られ、これはこの二本鎖ＲＮＡとハイブリダイズし
、また同じライブラリーから１重複しているクローンδ
２を得るためのプローブとして用いられた。

さらに、クローンδ４およびδ１１５は、単離されたＲ
ＮＡのランダムプライミングを用いるｐＢＲ３２２に１
周製されたｃＤＮパライフ゛ラリ−をδ１クローンとと
もに検索することにより、得られた。次いで。

δ１１５は２重複しているクローンδ７ａ、　　δ３ｂ
およびδ７ｂを得るために、プローブとして用いられた
。

δ１およびδ２とともに、独立のクローンδ３ｂ。

δ４．δ７ａ、　　δ７ｂおよびδ１１５により、第１
図において図示された環状−末鎖の１６７９ヌクレオチ
ドＲＮ＾の完全な配列が供給された。

この完全なＩＩＤＶゲノムの検索法についての記述は、
もらろん、大部分は歴史的に興味深いことである。得ら
れる配列（またそれゆえに、その相補体も）がここで提
供され、そして完全な配列、または、そのいずれかの部
分であっても２合成法を用い、あるいは合成法と、ここ
で記述の方法に類似の方法を用いる部分的配列の検索と
を組み合わせることにより、調製され得る。

Ｂ、２．ウィルスポリペプチドおよびその断片の訓ｌ 完全なゲノム配列は、δ抗原、およびゲノムまたはその
相補体によりコードされる他のウィルスポリペプチドの
、抗原的に活性な領域をコードする発現ベクターの構築
を可能にするという有用性がある。所望のタンパクをコ
ードする断片は、従来の制限分解処理を用いて、そのｃ
ＤＮＡクローンから得られるか、または合成法により得
られる。これらの断片は２例えば、β−ガラクトシダー
ゼやスーパーオキシドデスムターゼ（Ｓ０口）、好まし
くはＳ００．のような融合配列の一部を含むベクターに
連結される。いずれかのセンス鎖において、開放読取り
枠を含むＨＤＶゲノムの所望部分は、成熟タンパクまた
は融合タンパクのような組換えタンパクとして得られる
か、または化学合成法や一般的な組換え法によって提供
され得る。

所望のポリペプチド（それが融合型または成熟型のいず
れであっても、また分泌を可能にするシグナル配列を含
んでいるいないにかかわらず）をコードするＤＮＡは、
都合のよい宿主に対し適当な発現ベクターに連結され得
る。真核細胞宿主系および原核細胞宿主系の両方が、現
在１組換えポリペプチドを形成する際に用いられる。よ
り一般的な制御系のいくつかの要約、および宿主細胞系
を。

以下の０．１１項に示す。次いで、このポリペプチドは
、溶菌細胞や培地から精製され、その意図した用途に必
要な程度にまで精製される。このようなペプチドは診断
に用いられ得、ワクチンに処方され得る。これらのポリ
ペプチドに対して生ずる抗体もまた１診断に用いられ得
る。

このゲノムの分析により、多くの開放読取り枠゛（ＯＲ
Ｆ）の存在が明らかになり、それらのうちの少なくとも
１つである０ＲＦ５は、このδ抗原をコードしている。

他のものは、まだ未知のウィルスポリペプチドをコード
し得る。＾ＴＧ開始コドンで始まる少なくとも約１５０
ヌクレオチドを含むこのようないくつかの枠が同定され
た。別の読取り枠は。

より長い開かれた配列とともに存在するが、＾ＴＧ開始
コドンは有しない。このゲノムと同じ意味を有するｃＤ
ＮＡ鎖中およびアンチゲノム鎖中の両方にて、この読取
り枠が見出された。

このアミノ末端に近いメチオニンを含むポリペプチドを
コードする５つの大きなＯＲＦは、微生物内で発現され
た。このアンチゲノム０ＲＦ５にコードされるポリペプ
チドだけが、肝炎ウィルスδに感染した患者から得られ
た抗血清と交差反応した。

つ゛イルス抽出物、および組換えＯＲＦポリペプチド（
これは細菌や酵母内で合成された）を用いる免疫的分析
に基づいて、　０ＲＦ５は、δ肝炎ウィルスポリペプチ
ドのｐ２７Ｊおよびｐ２４’の両方に分かれている抗原
性エピトープをコードし、そして、おそら＜　ｐ２７’
およびｐ２４δに対する完全な構造遺伝子を表す。ここ
で記述の免疫競合研究に基づいて、この核の肝炎δ抗原
は、　　ｐ２７’およびｐ２４’の両方から構成される
。

クローン１１５．　７　ａ、　　１．４．２．　７　ｂ
、および３ｂのｃＤＮＡヌクレオチド配列の比較により
２重複している配列（表２参照）中の異種性の程度は小
さいことが示された。ウィルスを含むＲＮＡ中では。

ヌクレオチド配列の異種性は珍しくない（Ｈｏｌｌａｎ
ｄ。

Ｊ、、　ｅｔ　ａｌ　（１９８２）Ｓｃｉｅｎｃｅ　　
２１５　：　１５７７）　、特に。

０ＲＦ５の６０８番目での配列の異種性は、ｐ２７δと
ｐ２４’との間の差異に基づく。すなわち、２つのポリ
ペプチドの大きさは、　　ｐ２’？’のＣ末端部分での
付加的なアミノ酸に起因し得る。もしその部分がＧで占
められるなら、それを含むトリプレットがトリプトファ
ンをコードし、そして転写は、６６４番目から始まるオ
パール終止コドンまでつづく（第３図参照）。他方、も
し６０８番目がＡであれば、それを含むトリプレットが
、アンバー終止コドンをコードする。そして、最後の細
胞がアンバーコドンを停止し、それにより、オパールコ
ドンまで転写を継続するような能力がないと、この点で
転写が停止する。

ペプチドの抗原領域は、一般に、比較的小さく。

典型的には１０アミノ酸またはそれ以下の長さである。

５アミノ酸はどの断片が、典型的には、抗原領域を特徴
づける。これらの分節は、δ抗原の領域、または付加的
にコードされたマーカーポリペプチドの領域に相当し得
る。従って、　ＨＤＶのゲノムを基準に用いて、ペプチ
ドの短い分節をコードするＤＮＡは、“融合タンパクと
してまたは単離されたペプチドとしてのいずれかで組換
え的に発現され得る。さらに、短いアミノ酸配列は、簡
単に化学合成され得る。この合成されたペプチドが、正
しいエピトープを供給するために正確に配列する場合で
あって、しかし、小さすぎて免疫原性を示さない場合に
は、このペプチドは適当な担体に連結され得る。

このような連結を得るための多くの技術が、当該技術分
野で公知であり、それらには、以下の物質を用いるジス
ルフィド結合の形成が包含される。

この物質には、Ｎ−スクシニミジル−３−（２−ピリジ
ル−チオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）およびスクシニ
ミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン
−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）がある（これは、
　Ｐｌｅｒｃｅ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ
、　ｌ１ｌｉｎｏｌｓから得られた）。（もし、このペ
プチドが、スルフヒドリル基を欠いているなら、システ
ィン残基を加えることにより、これが得られる。）これ
らの薬剤は、それ自体と、あるタンパク上のペプチドシ
スティン残基との間、およびリジン上のε−アミノ基ま
たは他のアミノ酸の他の遊離アミノ基によるアミド結合
との間に、ジスルフィド結合を生じさせる。このような
種々のジスルフィド／アミド形成試薬が知られている。

例えば、　ｌｍ５ｕｎ　Ｒｅｖ（１９８２）６２　：　
１８５を参照。他の二官能性カップリング剤は、ジスル
フィド結合よりもむしろチオエーテル結合を形成する。

これらのチオエーテル結合の形成試薬の多くは、市販さ
れており、６−マレイミドカプロン酸、２−ブロモ酢酸
、２−ヨード酢酸、４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シ
クロヘキサン−１−カルボン酸などから得られる反応性
エステルが含まれる。このカルボキシル基は、それらと
、スクシンイミドまたは１−ヒドロキシ−２−ニトロ−
４−スルホン酸ナトリウム塩とを組み合わせることによ
り、活性化され得る。前記のリストは、全てを網羅する
意味ではなく、挙げられた化合物の変性体も明らかに使
用可能である。

それ自体が、宿主に有害な抗体の生産を誘導しない担体
１例えば１種々の血清アルブミン、テタヌストキソイド
、またはキーホールリンビットヘモシアニン（ＫＬＨ）
のような担体が用いられ得る。

この結合物によれば、適当な被験体に結合物を接種した
とき、結合物にだけではなく、その配列と類似の部分を
もつ融合タンパクに対し、そして全１１ＤＶ内の適当な
決定因子に対して、特異的に反応する免疫グロブリンを
含む抗血清の生産が得られる。

Ｂ、４．　ＩＩＤＶエピトープを八むハイブリ・・ド１
）１０νのエピトープの免疫原性もまた。＠乳類系また
は酵母系にてＢ型肝炎表面抗原と関連するタンパクのよ
うな粒子形成タンパクと融合させたエピトープを調製す
ることにより、高められ得る。

このＩＩＤＶエピトープが１粒子形成タンパクをコード
する配列と直接連結される構築物は、この）ＩＤＶエピ
トープに関して免疫原性のあるハイブリッドを生産する
。さらに、調製された全ベクターには。

例えば、プレーＳペプチドのような９種々の程度の免疫
原性を有するＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）に特異的なエ
ピトープを包含する。それゆえ、　ＨＤＶ配列を含む粒
子形成タンパクから構築された粒子は。

ＨＤＶおよびＨＢＶの両方に関して、免疫性がある。

肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）は２例えば、＠乳類細胞内
（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ、　Ｐ、、　ｅｔ　ａｌ、Ｈｅ
　ａｔｉｔｉｓ　Ｂ　（１９８４）＋Ｍｉｌ１ｍａｎ、
　　１．、　　ｅｔ　　ａｌ、　　ｅｄ、　　Ｐｌｅｎ
ｕｍ　　Ｐｒｅｓｓ、　　９９．　２２５−２３６）だ
けでなくサツカロマイセス・セレビシェ（Ｓ、　ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ）中で形成され集められ得ることが示さ
れている（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ、　Ｐ、、　ｅｔ　ａ
ｌ、Ｎａｔｕｒｅ　（１９８２）益８　：　３４４−３
５０）。このような粒子の形成は。

単量体サブユニットの免疫原性を高めることが示されて
いる。この構築物もまた。プレ表面（プレー５）ｆＩＩ
域の５５アミノ酸を含むＨＢｓＡｇの免疫的に優性なエ
ピトープを包含し得る（Ｎｅｕｒａｔｈ　ｅｔ　ａｌ、
５ｃｉｅｎｃｅ（１９８４）−鏝２４　：　３９２−３
９４）。酵母中で発現可能なプレーＳ５−１１ＢｓＡ粒
子の構築物は、米国出願第６２１　、７５６号（１９８
４年６月１８日出願）において開示されている。酵母発
現用の異種ウィルス配列を含むハイブリッドは、米国出
願第６５０．３２３号（１９８４年９月１３日出願）に
おいて開示されている。両方の出願は。

ここでは、譲渡人に謹製され、その内容はここに示され
ている。これらの構築物は、　ＳＶ４０ジヒドロホレー
ト　リダクターゼ　ベクターを用いるチャニ°−ズハム
スター卵巣細胞のような哺乳類細胞中でも発現され得る
（Ｍｉｃｈｅｌｌｅ　ｅｔ　ａｌ、　Ｉｎｔ　Ｓ　ｍ　
　ｏｎ−Ｖｉｒａｌ　Ｈｅ　ａｔｉｔｉｓ　（１９８４
））。

さらに、この粒子形成タンパクをコードする配列自体の
一部分は、　ＨＤＶエピトープのコドンと置き換えられ
得る。この置換において、酵母または哺乳類中で、小単
位の集合体を媒介して免疫原性の粒子を形成するのに必
要でない領域は、削除され得、それゆえ、このＨＤＶエ
ピトープとの拮抗により、付加的なり型肝炎抗原部位が
除去される。

Ｂ、５．二叉±ｌ■旦袈 活性成分としてのペプチド配列を含むワクチンの調製も
また。当該技術分野でよ（知られている。

典型的には、溶液または懸濁液のいずれかとして注射可
能なワクチンが調製される。注射の前に液体に溶解させ
、または懸濁させるのに適当な固形物も調製され得る。

この調製物は、乳化されてもよく、またはリポソーム中
にカプセル化されたタンパクであってもよい。この活性
免疫原成分は。

活性成分と和合可能であり、かつ薬学的に受容可能な賦
形剤としばしば混合される。適当な賦形剤には９例えば
、水、生理食塩水、デキストロース。

グリセロール、エタノール、または、それらの類似物お
よびその組み合わせがある。さらに、もし望むなら、こ
のワクチンは、湿潤剤または乳化剤。

ｐｉｆ緩衝剤または、ワクチンの効果を高めるアジュバ
ントのような、補助剤を少量で含有してもよい。

このワクチンは、（例えば、皮下または筋肉内のいずれ
かの）注射によって、非経口的にうまく投与される。投
与の他の様式に適する付加的な処方には、坐剤および、
ある場合には、経口処方が包含される。坐剤のための伝
統的な結合剤および担体には９例えば、ポリアルカリグ
リコールまたはトリグリセリドが包含され得る。このよ
うな坐剤は、活性成分を０．５％〜ｌＯ％、好ましくは
１％〜２％の範囲で含有する混合物から形成され得る。

経口処方には１例えば、マンニトール、ラクトース、デ
ンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンセルロ
ースナトリウム、炭酸マグネシウムおよびその類似物の
薬学的な等級のような通常使用される賦形剤が包含され
る。これらの組成物は。

溶液、懸濁液１錠剤、丸薬、カプセル、持続放出処方、
または粉末の形態をとり、１０％〜９５％（好ましくは
２５％〜７０％）の活性成分を含む。

このタンパクは、中性または塩の形でワクチンに処方さ
れ得る。薬学的に受容可能な塩には、酸付加塩（このペ
プチドのＪＡＩのアミノ基とともに形成される）が包含
される。それらの塩は１例えば、塩酸またはリン酸のよ
うな無機酸；酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸など
のような有機酸と形成される。この遊離のカルボキシル
基と形成される塩は、また１例えば、水酸化ナトリウム
。

水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウ
ム、または水酸化第二鉄のような無機塩基；およびイソ
プロピルアミン、トリメチルアミン。

２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン１プロ力イン
などのような有機塩基から誘導される。

このワクチンは、用量処方に合致した方法で投与され、
治療上効果的でかつ免疫原性となるような量で投与され
る。投与され得る量は、治療され得る患者、その患者の
抗体を合成する免疫系の許容量、および所望の保護の程
度に依存する。投与に必要な活性成分の正確な量は、−
実行者の判断に依存し、各患者に特有である。δ感染は
、Ｂ型肝炎の感染に依存するので、抗δワクチンが特に
有用な亜群はＢ型肝炎保有者群であることに注目される
べきである。Ｂ抗原およびＤ抗原の両方を含む“二重の
゛ワクチンを構築することも有益かもしれない。

０ＲＦＳ内にコードされたポリペプチド（および。

それに由来のペプチド）は、　０ＲＦ５がＩＩＤＶ粒子
の中心側の抗原をコードするという事実にもかかわらず
、　ＩＩＤＶ感染に対する防御に特に適したワクチン組
成物である。組換えにより生産されるＨＢＶの中心部の
抗原を含むワクチンは、Ｂ型肝炎の感染に対する防御ま
たは、Ｂ型肝炎の感染を緩和するのに効果的である（Ｍ
ｕｒｒａｙ＋　Ｋ、＋　ｅｔ　ａｌ、　ＥＭＢＯＪ　（
１９８４）３　：　６４５　’）。

Ｂ、６．ＨＤＶエピトープに・するｒ　の調製上記のよ
うに調製された免疫原タンパクは、＠乳類を免疫にする
のに用いられる。得られる抗血清は２診断試薬として有
用である。これらの動物からのリンパ球または肺臓細胞
も、これらのエピトープに対して生じるモノクローナル
抗体を分泌し得るハイブリドーマであって、感染ウィル
スに対し交差反応するハイプリドーマを調製するために
用いられ得る。得られるモノクローナル抗体は。

診断に特に有用であり、そして中和しているモノクロー
ナル抗体は、受動免疫治療に有用である。

０ＲＦＳ内にコードされるポリペプチド、およびこれら
のペプチドに対する抗体は、　ＨＤＶの免疫診断に特に
有用である。以下に論じるように、　０ＲＦ５はこのδ
抗原をコードし、このδ抗原は、明らかに２つのウィル
スポリペプチド、ρ２４８およびｐ２７８を含有する。

Ｂ、７．吟　用オリゴヌクレオチドプローブおよびキッ
ト 開示されているＨＤＶゲノム群を基礎として用い。

およそ８ｂｐまたはそれ以上のオリゴマーが、切り出し
または合成により調製され得る。そして、このオリゴマ
ーは、各病人中のウィルスの検出に有　。

用である。８ｂｐは、使用可能な長さであるものの。

１Ｏ−１２ｂｐの配列が好ましく、約２０ｂｐが最適で
ある。

好ましくは、これらの配列は、異質性のない領域に由来
する。これらのプローブは、自動化オリゴヌクレオチド
合成法を含む、常法により調製され得る。有用なプロー
ブの中には９例えば、クローンδ１．後に記すｃＤＮ＾
ライブラリーを検索する際に有用な種々のオリゴマー、
およびここで開示された付加的なりローンがある。０Ｒ
Ｆ５の断片を含むクローンは特に有用である。このゲノ
ムまたはその相補鎖のいずれの部分も十分適当であろう
。プローブとして用いるには、完全な相補性が望まれる
。しかし、断片の長さが増すことは必要ではないかも知
れない。

このようなプローブを診断に用いるには、もし必要なら
、血液または血清のような分析すべき生体試料が、そこ
に含まれる核酸を抽出するために。

処理される。得られた核酸は、ゲル電気泳動または他の
サイズ分画法、またはサイズ分画なしの簡単なドツトプ
ロットにかけられる０次いで９例えば、ニックトランス
レーションまたはリン酸化を用いて、このプローブが標
識化される。抽出された核酸は１次いで、適当なハイブ
リダイゼーション条件下にて、標識されたプローブを用
いて処理される。

このプローブは、ウィルスＲＮＡと完全に相補的に作製
され得るので１間違った陽性反応を防ぐために、厳しい
条件が望まれる。しかし、厳しい条件は、プローブが異
質性のないウィルスゲノムの領域に相補的な場合にのみ
、使用されるべきである。ハイブリダイゼーションの厳
格さは、要因数によって決定される。この要因には、温
度、イオン強度、ハイブリダイゼーションにかける時間
の長さおよび洗浄時間の長さ、およびホルムアミド濃度
が含まれる。これらの要因は１例えば、　Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ＋Ｔ、、ら、＼　クローニング：　、室マニュアル
（１９８２）　。

コールド　スプリング　ハーバ−プレス、コールド　ス
プリング　ハーバ−、ニューヨークに概説されている。

条件の厳しさを増すことは９例えば、温度を上げる９反
応時間を短縮する。そしてイオン強度を調節することに
より、達成され得る。

このプローブは１診断キットにパッケージングされ得る
。このキットには、標識化されたＤＮＡ　。

適当にパッケージングされた付加的試薬、および指定の
プロトコールに必要な材料、および検定を行うための器
具が含まれる。

Ｂ、８．九炎檎足並所土二上 １１ＤＶ抗体を含む血清と免疫学的に反応するポリペプ
チド（例えばＱＲＦ５にコードされるポリペプチド）、
およびこれらのポリペプチドに対し生じる抗体の両方が
、血液サンプルまたは血清サンプル中でのＩＩＤＶ抗体
の存在を検定するため、または場合しだいでウィルスの
存在を検定するため、に設計された診断キットの構成物
として、有用である。

この免疫検定の設計は、多くの変更がなされ５例えば２
個体担体上での競争反応または直接反応。

または免疫沈降に基づく数種のプロトコールが利用可能
である。はとんどの検定には、標識された抗体の使用、
または標識として蛍光分子、放射活性分子または色素分
子を含むポリペプチドの使用が含まれる。酵素で標識さ
れかつ媒介される免疫検定もまた２通常用いられる。従
って、このようなプロトコールでの使用に適し、そして
標識された適当な試薬を含むキットは、適当な材料のパ
ッケージングにより、構成される。このキットには。

検定を行うための残る必要条件、および検定を行うため
の器具の適当なセットとともに、適当な容器中にある本
発明の抗体またはポリペプチドが包含される。

Ｃ１二筬迫方迭 ウィルスからのＲＮＡの抽出、　ｃＤＮＡライブラリー
の調製および検索、クローンの塩基配列決定１発現ベク
ターの構築、細胞の形質転換などに用いられる一般的技
術は、当該技術分野で公知であり。

そしてこれらの方法を記述した実験室手引きが利用可能
である。しかし、一般的指導書として、以下に述べる情
報がこのような方法およびその実行に有用な材料につい
て現在利用可能である。

Ｃ１１，皇ま圭λで１１ｔ制御配列 用いた適当な制御配列が、指定された宿主に適合可能で
ある場合、原核生物および真核生物の宿主細胞は、所望
のコード配列の発現に使用し得る。

原核生物宿主のうち、　Ｅ、　ｃｏｌｉは、最もよく用
いられ、たいてい便利である。原核生物の発現制御配列
は、プロモーター（これは、必要に応じてオペレータ一
部分を含む）とりボゾーム結合部位を含む、原核生物の
宿主と適合可能な転移ベクターは９通常１例えばアンピ
シリン耐性およびテトラサイタリン耐性を付与するオペ
ロンを含むプラスミドｐＢＲ３２２，および抗生物質耐
性を付与する配列を含む種々のｐｕＣベクターに由来す
る。前述のオペロンは９選択によって、成功した形質転
換体を得るためのマーカーとして用いられ得る。通常用
いられる原核生物制御配列には、βラクタマーゼ系（ペ
ニシリナーゼ）やラクトースプロモーター、系（Ｃｈａ
ｎｇ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｎａｔｕｒｅ　（１９７？）　
１９８　：　１０５６）　。

トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄ
ｅｌ。

ｅｔ　ａｌ、　　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ
　（１９８０）　８　：　４０５７）。

λ由来のＰＬプロモーターおよびＮ遺伝子リボゾーム結
合部位（Ｓｈｉｍａｔａｋｅ　ｅｔ　ａｌ、　　Ｎａｔ
ｕｒｅ　（１９８１）２９２　：　１２８）、　皿とｌ
ａｃ　ＵＶ５プロモーターの配列由来のハイブリッド虱
プロモーター（Ｄｅ　Ｂｏｅｒｅｔ　ａｌ、’　　Ｐｒ
ｏｃ　Ｎａｔｌ　ＡｃａｄＳｃｉ　（ＵＳＡ）　（１９
８３）　　８０　：２ｌ−２５）が含まれる。前述の系
は、特にＥ、　ｃｏｌｉ　と適合可能である；もし望む
なら、バチルス株やシュードモナス株のような他の原核
生物宿主が、対応する制御配列とともに用いられ得る。

真核生物の宿主には酵母および哺乳類培養細胞が含まれ
る。サツカロミセス　セレビシェ、またはパン酵母やサ
ツロミセス　カールスベルゲンシスは１便利なので最も
よく用いられる酵母宿主である。酵母適合性ベクターは
、原栄養株を栄養要求性変異株に与えることや野性株に
抗生物質耐性または重金属耐性を付与することにより、
成功した形質転換体を選択可能なマーカーを運搬する。

酵母適合性ベクターは、２μ端の複製起源（Ｂｒｏａｃ
ｈ。

Ｊ、、　ｅｔ　ａｌ、　　Ｍｅｔｈ　Ｅｎｚ　（１９８
３）　１０１　：　３０７）、　ＣＥＮ３およびＡＲＳ
Ｉの結合物、または複製を保証する他の手段を用い得る
。この手段は１例えば宿主細胞ゲノムに適当な断片を挿
入させる配列である。酵母ベクターの制御配列には、解
糖系酵素の合成のためのプロモーター（Ｈｅｓｓ　ｅＬ
ａ１＋　Ｊ　Ａｄｖ　Ｅｎｚ　ｍｅ　Ｒｅ（１９６Ｂ）
　７　：　１４９＋　Ｈｏ１ｌａｎｄ　ｅｔ　ａｌ＋　
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ（１９７Ｂ）　１７　：　４９
００）、および３−ホスホグリセレートキナゼ（ｔｌｉ
ｔｚｅｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ
　（１９８０）２５５　：　２０７３）のプロモーター
が含まれる。酵母で発現させるためには、ターミネータ
−は、エラノーゼ遺伝子（ｌｌｏｌｌａｎｄ、　Ｍ、　
Ｊ、、　Ｊ　Ｂｉｏ　Ｃｈｅｍ　（１９８１）２５６　
：　１３８５）に由来のターミネータ−も含み得る。

特に有用な制御系には、ここで特別に記述の系が含まれ
る。この系は、グリセルアルデハイド−３−ホスフェー
ト　デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＩ＋）プロモーターま
たはアルコール 制御プロモーター、　ＧＡＰＤＨに由来のターミネータ
−、およびもし分泌が必要ならば．酵母α因子からのリ
ーダー配列．を含有する。これらの系は。

米国特許出該第４６８．５８９号（１９８３年２月２２
日出願）および第５２２．９０９号（１９８３年８月１
２日出願）に詳細に記述され，両方ともここの譲渡人に
譲渡され。

そ゛して参照文献としてここに採用する。

発現のための宿主として利用可能な哺乳類細胞系は．ア
メリカン　タイプ　カルチャー　コレクション（ＡＴＣ
Ｃ）から入手可能であり，　ＨｅＬａ細胞。

チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞，ベビー
ハムスター腎（ＢＩＩＫ）細胞．および多くの他の細胞
系を含む。哺乳類細胞に適したプロモーターは。

特にシミアンウィルス４０　（ＳＶ４０）　　（Ｆｉｅ
ｒｓ．　ｅｔ　ａｌ。

ハハ皿（１９７８）　　２互：　１１３）に由来のプロ
モーターのようなウィルスプロモーター、またはラウス
肉腫ウィルス（ＲＳＶ）　、アデノウィルス、ウシ乳頭
腫ウィルス（ＢＰＶ）のような他のウィルスプロモータ
ーがある。哺乳類の細胞には，またターミネータ−配列
が必要である．＠乳類細胞での複製に適したベクターは
，ウィルスのレプリコン、または適当な配列を宿主ゲノ
ム中に導入させる配列を包含し得る。

Ｃ．２．ルｊ■Ｌ泉 用いられる形質転換の方法は，形質転換されるべき宿主
に依存する。バクテリアの形質転換には。

一般に．塩化カルシウムまたは塩化ルビジウムによる処
理が用いられる（Ｃｏｈｅｎ．　ｓ．　Ｎ．、　Ｐｒｏ
ｃ　Ｎａｔｌ＾ｃａｄ　Ｓｃｉ　（ＩＪＳＡ）　（１９
７２）　６９　：　２１１０．　Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅ
ｔａｌ，　ノ　　クローニング：駐車マニュアル（１９
８２）コールド　スプリング　ハーバ−　プレス、ペー
ジ２５４）　、酵母の形質転換は．　Ｈｉｎｎｅｎら，
　ＰｒｏｃＮ１シＡｃａｄ　Ｓｃｉ　（１９７８）　７
５　：　１９２９−１９２３の方法を用いて実施し得る
．＠乳類の形質転換は，　Ｇｒａｈａｍ　ａｎｄ　ｖａ
ｎｄｅｒ　Ｅｂ，　カニ１」Ｊ（１９７８）　５２　：
　５４６のリン酸カルシウム沈澱法，またはその種々の
改良法を用いて行われる。

Ｃ．３．ベクター構築 ベクター構築には，現在全くよく知られた方法が用いら
れる。部位特異的なりＮＡ切断は．適当な制限酵素を用
いて処理することにより行われる。

この処理は，これらの市販の酵素の製造者により一般に
指定されている条件下で行われる（例えば。

ニューイングランド　バイオラボズの製品カタログを参
照されたい）。一般に，約１μｇのプラスミドまたはＤ
Ｎ＾配列は．約２０μｌの緩衝溶液中で１単位の酵素と
，約３７°Ｃにて約１〜２時間インキュベートすること
により、切断される。制限酵素とインキュベートした後
，タンパクはフェノール／クロロホルム抽出により除去
され，エタノール再沈澱によりＤＮＡが回収される。こ
の切断された断片は、ｆｉｎ　　労にお番る　ｉ　（１
９８０）　６５二４９９−５６０中にみられる。一般的
な方法に従って、ポリアクリルアミドまたはアガロース
ゲル電気泳動法を用いて分離し得る。粘性末端を有する
切断断片は。

ポリメラーゼに適当なインキュベート条件を用いて、適
当なデオキシヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰ）の存在
下にて、　Ｅ、　ｃｏｌｔ　ＤＮＡポリメラーゼＩ（ク
レノー）を用いて、平滑末端にし得る。このポリメラー
ゼは、突出している３゛−末鎖を切断するが。

この混合物中に存在するｄＮＴＰによって、突出してい
る５゛末端を埋める。Ｓｌヌクレアーゼを用いた処理も
また。一本積ＤＮＡ部分を加水分解し得るので使用し得
る。

連結は、　Ｔ４ＤＮ＾リガーゼおよびＡＴＰを用いる標
準的な緩衝液および温度条件を使用して実施される。粘
性末端の連結は、平滑末端の連結はどＡＴＰおよびリガ
ーゼを必要としない。ベクター断片を連結混合物の一部
として用いる場合、５゛リン酸塩を除去してベクターの
再連結を防ぐために、ベクター断片は、しばしばバクテ
リアアルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）で処理される。

あるいは、再連結を防ぐために、不都合な断片を制限酵
素で切断することが使用され得る。

連結混合物は、　Ｅ、　ｃｏｌｉのような適当なりロー
ユング宿主中に形質転換され、そして成功した形質転換
体は２例えば抗生物質耐性によって選択され、正しい構
築物にスクリーニングされる。

Ｃ，４、Ｐ、ＤＮＡ配置の築 合成オリゴヌクレオチドは、　Ｗａｒｎｅｒ＋　Ｂ、Ｄ
、、　　ら。

叩Ａ　（１９８４）　３　：　４０１−４１１の記述の
ような自動オリゴヌクレオチド合成装置を用いて調製し
得る。必要に応じて、これらの合成鎖は、標準的なリン
酸化条件にて、標識化されたＡＴＰの存在下で、過剰の
ポリヌクレオチドキナーゼを用いることにより。

３ｔｐで標識するためにリン酸化され得る。

ゲノムライフ゛ラリ−またはｃＤＮパライフ゛ラリ−か
ら単離された配列を含むＤＮＡ配列は、　Ｚｏｌｌｅｒ
＋　Ｍ、＋ら、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ
　（１９８２）　　１０　：　６４Ｂ？−６４９９に記
述のように９部位特異的な変異を誘発することによって
修飾し得る。簡単に言えば、修飾すべきＤＮＡは、一本
積配列としてファージにパッケージされ、そしてＤＮＡ
ポリメラーゼを用いて、二本鎖ＤＮＡに転換される。こ
の際、修飾すべきＤＮＡの一部と相補的な合成ヌクレオ
チドをプライマーとして用い、そして所望の修飾をその
配列に含める。

得られた二本鎖ＤＮＡは、ファージを保持する宿主バク
テリア中に形質転換され、そしてこの形質転換されたバ
クテリアの培養物（これは、ファージの各鎖の複製物を
含む）は、プラークを得るべく寒天中にプレート化され
る。理論的には、この新しいプラークの５０％が一本鎖
として変異型を有するファージを含み；残りの５０％が
元の配列を有する。このプラークの複製は、正しい鎖と
ハイブリダイズされるが、非修飾配列とはハイブリダイ
ズされないような温度および条件下で、リン酸化された
合成プローブとハイブリダイズされる。次いで、このよ
うに同定された。所望の修飾配列を回収し、所望のＤＮ
Ａのための起源として供するためにクローン化する。

Ｃ０５，プローブ　のハイ　町　゛イゼーションＤＮＡ
ライブラリーはＧｒｕｎｓｔｅｉｎおよびＨｏｇｎｅｓ
ｓ（Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　（ＵＳＡ
）　（１９７５）　７３　：　３９６１）の方法を用い
て検索される。この方法を簡単に述べると、検索される
口Ｎ＾は、ニトロセルロースフィルター上に固定化され
、変性され、０〜５０％ホルムアミド、　０．６Ｍ　Ｎ
ａＣ１，６０ｍＭクエン酸ナトリウム、ウシ血清アルブ
ミン、ポリビニルピロリジンおよびフィコールの各０．
０２％（―ｔ／ν）、　５０ｍＭのリン酸ナトリウム（
ｐＨ６，５）　、　　１％グリシン、および１００μｇ
／ａｌｌ担体変性ＤＮ＾、を含む緩衝液でプレハイブリ
ダイズされる。この緩衝液中のホルムアミドのパーセン
トは、プレハイブリダイゼーション段階およびその後の
ハイブリダイゼーション段階の時間条件および温度条件
と同様に、所望の厳密性に依存する。あまり厳密な条件
を必要としないオリゴマーのプローブは１．一般に、低
濃度のホルムアミド、低温、および長いハイブリダイゼ
ーション時間が用いられる。３０または４０以上のヌク
レオチドを含むプローブ（これは９例えばｃＤＮＡ配列
またはゲノム配列に由来のプローブである）は。

一般に、高温（例えば約４０〜４２°Ｃ）で高濃度（例
えば５０％ホルムアミド）で行われる。プレハイブリダ
イゼーションの後、３２Ｐ　リン酸化オリゴヌクレオチ
ドプローブを含む、この同じ緩衝液を添加し、ハイブリ
ダイゼーションを得る。このように処理されたフィルタ
ーのラジオオートグラフィーから、ハイブリダイズした
プローブの位置が得られ、検索されなかった複製フィル
ター上の対応する位置を所望ＤＮＡの起源として使用し
得る。

Ｃ１６，構築の確Ｐおよび配りン 通常のベクター構築では、連結混合物は、　Ｅ、　ｃｏ
ｌｔ株ＨＢＩＯＩまたは他の適当な宿主に形質転換され
。

成功した形質転換体哄抗生物質耐性マーカーまたは他の
マーカーにより選択される。次いで、形質転換体に由来
のプラスミドは、　Ｃｌｅｗｅｌｌ＋Ｄ、　Ｂ、ｔら。

Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　（ＵＳＡ）　
（１９６９）　６２　：　１１５９の方法に従って調製
され、さらに通常、クロラムフェニコール増幅（Ｃｌｅ
ｗｅｌｌ、　ｏ、　Ｂ、＋　Ｊ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ（
１９７２）　１刊：　６６７）が行われる。分離された
ＤＮＡは単離され、そして制限分析により分析されるか
。

あるいは、　Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、、　　ら、　Ｐｒｏ
ｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　５ｃｉ（ＵＳＡ）　（１９７
７）　７４　：　５４６３により、さらにＭｅｓｓｉｎ
ｇ。

ら、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ　（１９８
１）　９　：　３０９のグイデオキシ法に記述のように
、またはＭａｘａｍら、　Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚ
　ｍｏｌｏ　　　（１９８０）　６５　：　４９９の方
法によって。

配列決定される。時々、　ＧＣに富んだ領域にて観察さ
れる。バンドが十分に分離されないという問題を解決す
るため、Ｔ−デアジグアノシンが用いられた（Ｂａｒｒ
、　Ｐ、、　ｅｔ　ａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉ　ｕｅｓ
　　（１９８６）４　：　４２Ｂ）。

（以下余白） Ｄ、尖施貫 次の実施例は２本発明の例証を意図したものであり、制
限するものではない。例えば、　０．１．筒中で述べら
れる方法は、必要に応じて繰り返され得るが、その必要
のない場合もある。なぜなら２本発明によって提供され
る情報に基づき、所望のヌクレオチドの配列の構築に技
術が利用できるからである。ＩＥ、　ｃｏｌｉおよび酵
母で発現を例示する。

しかし、他の系も、　Ｃ，１，筒中でさらに充分に述べ
たように、利用し得る。ゲノム構造から由来する付加的
なエピトープもまた生産され得、そして後述のように抗
体を生成するために使用される。

Ｄ、１．ＨＤＶ　ｃＤＮＡの調製 ｌ−当り約１０１惑染量のδ剤を含むチンパンジー血清
を超遠心分離し、そしてタンパク分解酵素にとともにイ
ンキュベートした後、得られたペレットから核酸を抽出
した。簡単に言えば、　ＲＮＡを。

従来の方法によりピリオン（ウィルス粒子）から抽出し
た。この方法は２例えば、　Ｔｉｃｅｈｕｒｓｔ＋　Ｊ
、Ｅ、＋ら、　Ｐｒｏｃ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　（ＵＳＡ
）　　（１９８３）８０　：　５８８５−５８８９に記
載されており、この方法は、タンパク分解酵素による処
理およびフェノール／クロロホルム抽出１次いでエタノ
ール沈澱を包含する。ＩＩＤＶを。

ｐＨ７，５，２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳおよび０．１％ＢＳ
Ａ中で２０％のスクロースにより遠心分離した。１■／
ｄのプロテイナーゼに、５０μｇ／ｄ酵母転移ＲＮＡ　
、　２０ｍＭ　ＩＩＥＰＥｓｐＨ７，５，５０ｍＭ　Ｅ
ＤＴＡ、　２ＱＱｄ　ＮａＣ１および１％ＳＯ３により
、３７°Ｃで一夜、タンパクを分解した後、　ＲＮＡを
、フェノール／（ｊｌｃｌ、抽出とエタノール沈澱とに
より精製した。

核酸を、変性ゲル電気泳動を使って分析し、　１７００
ヌクレオチドのＲＮＡダブレットを得た。これは。

ハイブリダイゼーション分析により決定された。

このダブレットは、　Ｄｅｎｎｉｓｔｏｎ、　Ｋ、Ｊ、
＋ら、　５ｃｉｅｎｃｅ（１９８６）　（前述）により
、約１６４ｂｐのｃＤＮＡクローン。

ｐｋＩ）３　（このダブレット、およびδ剤により感染
したサンプルに特異的にハイブリダイズする）を得るた
めに使用された。

２つの相補性のあるオリゴヌクレオチドを、　Ｄｅｎｎ
ｉｓｔｏｎらのｐｋＤ３　ｃＤＮＡクローンから得られ
た配列情報を基本として使用し２合成した。プローブ１
：５”−ＧＡＴＧＣＣＣＴＴＣＣＣＧＡＴＧＣＴＣＧＡ
ＴＴＣＣＧＡＣＴＣおよびプローブ゛２　　：　　５’
　−ＧＡＧＴＣＧＧＡＡＴＣＧＡＧＣＡＴＣＧＧＧＡＡ
ＧＧＧＣＡＴＣを、　２００μＣｉ”　（Ｐ　）　ＡＴ
Ｐ、　＞　５　Ｃｉ　／　Ｂ　ｍｏｌを用いてリン酸化
することにより標識化した。プローブは、その５°末端
をＬｉｌｌｅｈａｕｇら、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　
　（１９７６）　１５　：　１８５Ｂの方法によりＴ４
キナーゼでリン酸化し、そして次に、５０％ｖ／ｖのＣ
ｌ３０１１．、５０ｍＭ酢酸アンモニウム。

ｐｌ＋　７．５で？容出することにより５ｅｐ−ｐａｋ
　Ｃ１Ｂカートリツジ（ミリポア）で精製した。

ＤＮＡプローブへのハイブリダイゼーションのために、
　ＨＤＶ　ＲＮＡを、対照のチンパンジーＲＮＡおよび
ＤＮＡサイズマーカー（Ｌｅｈｒａｃｈ、　Ｈ，＋　ｅ
ｔ　ａｌ＋旦虹肋明圏江ｙ−（１９７７号玉：　４７４
３）と共に１％アガロース−ホルムアルデヒド　ゲルで
電気泳動にかけた。

それぞれのゲルを、　Ｔｈｏｍａｓ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎ
ａｔｌ　Ａｃａｄ　５ｃｉ（ｔｌｓ八）　（１９８０）
、ツマ７　：　５２０１に記載されているように。

ニトロセルロース膜の上に移し、標識化された特異的プ
ローブにハイブリダイズさせた。相補体ＲＮＡと適当な
対照とを含むゲルをこれらのプローブのそれぞれと処理
することにより、プローブ２だけが相補体にハイブリダ
イズすることが示され、ゲノムの一本鎖の性質が確かめ
られた。

ｃＤＮ＾ＤＮＡラリーを、　ＲＮへの３°−ヒドロキシ
末端にｐｏｌ）＋　（ｒＡ）尾部を付加後、　Ｏｋａｙ
ａｍａおよびｒｌｅｒｇ（Ｍｏｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏ！
　（１９８２）　２　：　１６１−１７０）の方法によ
り、チンパンジー血清ペレットのもとのＲＮＡ抽出液か
ら調製した。そのＲＮＡは、　ｐｏｌｙ（ｒＡ）ポリメ
ラーゼとインキュベーションする間にかなりの分解を示
した。しかし、得られたｃＤＮＡライブラリーをプロー
ブ２を用いて調べると、第４図に示される配列を有する
クローン、δ１．が回収されていた。より小さな（２５
０ｂｐ）重複しているクローン。

δ２．もまた。δ１のクローン化されたｃＤＮＡから切
り取られた４３５ｂｐのＮｃｏｌ断片を用いたところ。

こめライブラリー中に見出された。

ゲノムおよびｃＤＮＡの相補鎖を同定するために。

鎖特異的プローブを、〜９５０ｂｐの血ＩＩ／朋ＩＩＩ
制限断片（隣接した領域を含む）または〜４５０ｂｐの
Ｐｖｕｌｌ／　Ｐｓｔｌ断片を用いてδ１から、調製し
た。これらの断片を、相補する一本鎖のδ相補体を生じ
るように？＋１３ベクター中に連結した。ノ１イブリダ
イゼーシゴンプローブを調製するために。

０．８μｇの各相補体ＤＮＡを、　　２００．！ｒＭ　
ＮａＣ１中の０．１μｇのハイブリダイゼーション　プ
ローブ　プライマーにューイングランド　バイオラボズ
）と混合し１次に、沸騰湯浴中で１分間変性させた後。

３７°Ｃで１５分間インキュベートした。アニーリング
された混合物を、一本積の挿入物を標識化するため、　
２５０　Ｕ／ｍｌのクレノーと共に、　５０ｍＭ　Ｔｒ
ｉｓ−ＣＩ。

ｐＨ７，５，５ｍＭ　ＭｇＣｌ□、　１０ｍＭ　β−メ
ルカプトエタノール、　５０ｕｇ／ａｆｔ　ＢＳＡ、　
０．１ｍＭ　ｄＡＴＰ、　ｄＧＴＴ’、およびｄＴＴＰ
、　１４μＭ　ｄＣＴＰ　（１０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）
を含む２００μｌで１５°Ｃにて２時間インキュベート
した。反応を停止させ、そしてセファデックスＧ５０で
ＤＮＡを精製し、そしてボイドボリューム中に溶出され
て得られたプローブを、標識化した相補体ＲＮ＾を含む
ノーザンプロットにハイブリダイズさせるのに用いた。

成功２ｉニ得られたプローブ（〜４５０ｂｐ　　Ｐｖｕ
ｒｌ／Ｐｓｔｌ断片鎖の１つ）に対する結果を、第５図
に示す、第１列（レーン１）は、標識化マーカーを含み
、第２列は、血漿からのδピリオンＲＮＡ　１０ｎｇを
含み、第３列および第４列は、それぞれ、対照および感
染したチンパンジーからの肝臓ＲＮＡ　１．４μｇを含
む。第２列および第４列は、明らかにウィルス核酸の存
在を示す。

付加的なＨＤＶ　ｃＤＮＡライブラリーを、　ＨＤＶ　
ＲＮＡの逆転写を開始する子牛胸腺のランダムプライマ
ー（Ｔａｙｌｏｒ、　Ｊ、Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、　　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ　Ａｃｔａ（１９７６）肋
：　３２４−３３００）を使用して調製した。得られた
一本鎖ｃＤＮＡを次いで精製し、そして、　Ｅ、　ｃｏ
ｌｔのＤＮＡポリメラーゼＩとともにインキュベーショ
ンすることにより二本鎖にした。次に、Ｓ１ヌクレアー
ゼで処理し、　ｃＤＮＡに、ターミナルトランスフェ゛
ラーゼを用いオリゴ−ｄＣを末端につけ、そして。

前もってＰｓｔｌで制限処理したｄＧ末端についている
ｐＢＲ３２２を用いてアニーリングした０次に、そのプ
ラスミドを、宿主細菌のＥ、　ｃｏｌｔ　　ＭＣ１０６
１中に形質転換し、そしてテトラサイクリン耐性の組換
え体を、δクローンを選択するために、後述のようにコ
ロニー−ハイブリダイゼーションした。（これらの一般
的方法は、　Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、ら、により分ヱ
ー？旦二三７グ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏ
ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）ｐｐ、　２２９−２４２　
（１９８２）中に記載されている。）δ１のｃＤＮＡ挿
入物からの４３５ｂｐのＮｃｏ　Ｅ断片を。

ニックトランスレーションし、そして、上記ランダムプ
ライムしたｃＤＮＡライブラリーを選択するのに使用し
、δ４およびδ１１５を得た。δ１１５中のｃＤＮＡ挿
入物の４８１ｂｐのＨｉｎｄｌｌｌ／　Ｓｍａｌ断片を
、このライブラリーの選択に用い、δ７ａを得た。クロ
ーンδ３ｂおよびδ７ｂは、δ１１５からの配列（５”
−ＴＧＧＡＡＣＧＴＣＧＧＡＧＡＡＡＣ−３°）を基に
してオリゴヌクレオチドのプローブを用１いて得られた
。

このようにして２次のような付加的なりローンをこのラ
イブラリーから回収した：δ３ｂ　（８２９ｂｐ）。

δ４　（１１２３ｂｐ）　、　　δ７ａ　（４７４ｂｐ
）、　　δ７ｂ　（１３７８ｂｐ）　。

およびδ１１５　（１３６２ｂｐ）、これらのクローン
と、δ１およびδ２との配列を決定すると、第１図に示
すように、ゲノムの重なっている部分が得られた。

この配列のデータにより、もとのＩＩＤＶ　ＲＮＡが、
環状分子であることが強く示唆された。なぜなら。

７つの異なったｃＤＮ＾クローンの配列が、長さにして
ほんの〜１７００ヌクレオチドの線状分子に適合し得な
いからである。この仮説は、変性条件下で電子顕微鏡に
より環状ＨＤＶ　ＲＮＡ分子を観察することにより確認
された。ゲノムおよびその相補体を示すＤＮＡの完全な
配列は、第２図に示されており。

そしてそれは９種々なりローンの重複している部分は考
慮して描かれている。その上方の鎖は、　ＨＤＶのゲノ
ムＲＮＡを示し、下方鎖は、その相補体である。第２図
に示されるように１種々のクローン間で、配列にある程
度の異質性があった。

ヌクレオチド配列における異質性は、ゲノム鎖車に示さ
れる。コードされるアミノ酸を、相補鎖め下に示す。静
は、アンバー終止コドンを示し。

そしてＯＰは、オパール終止コドンを示す。表１は。

い（つかのクローンの異質性の比較を示す。

（以下余白） 肝炎 −は、決定されなかったか。

５　ｃＤＮＡの異質性 クローン中にないことを示す。

鎖　　　　　　　　ＯＲＦ　　Ｎα　　　　ヌクレオチ
Ｆｉｌｌイ立置＊　　１０１２位でのクローンの異 ＋２６４位でのクローンの異 Δ　１０１２位でのクローンの異 表２ 質性から生じる不明確性（第２図） 質性から生じる不明確性（第２図） 質性から生じる不明確性（第２図） 表２は、少なくとも３００ヌクレオチドの開放読み取り
枠（ＯＲＦ）によってコードされるポリペプチド（推定
）を示す。各開放読み取り枠のはじめのヌクレオチドの
位置は、第２図に示される上方鎖の番号に従って示され
る。ゲノム配列を表す上方鎖は、１−１６７９と番号づ
けられた。相補体の位置は同じ番号を持つが、しかしＸ
によって前置きされる。従って、相補体の領域によって
コードされるポリペプチドは、°“リバース（逆向き）
”の順序の番号が与えられる。例えば、　０ＲＦ５に対
してＸ１６１９−Ｘ１０１４が与えられる。表中の第１
番目のヌクレオチドの番号は、該粋の最初のヌクレオチ
ドのそれであり、＾ＴＧではない。０ＲＦ５の翻訳読み
取り枠を、第２図（表２の推定ポリペプチドｐｉ）に示
し、そして、Ｎ−グリコジル化されている可能性のある
部位を＊により示す。

０ＲＦ５領域を含んでいるクローンのヌクレオチド配列
分析により、この領域中のいくつかの配列異質性が解明
された。これらの異質性は、第３図に示される。この第
３図は、　０ＲＦ５のヌクレオチド配列を示す。他のク
ローンから決定されるヌクレオチド配列の異質性を、ヌ
クレオチド配列の上に示す。その配列異質性から生じる
別のアミノ酸を。

上記推定されるアミノ酸配列の上に示す。配列中のこの
異質性の結果により、　０ＲＦ５は、極めて密接な関連
性のあるポリペプチドをコードする。

以下に論ぜられるように、　　ｐ２４’およびｐ２７’
の両方のウィルスポリペプチドが０ＲＦＳ中にコードさ
れているようであるため、　０ＲＦ５のヌクレオチド６
０８位の異質性（第３図参照）は、特に興味深い。

６０８位がＡを含むならば、生じるコドンは、　（もし
、宿主が、アンバーサプレッサーシステムを有していな
ければ）翻訳されてｐ２４Ｂのサイズのポリペプチドを
生じるアンバー終止コドンである。

しかし、６０８位が、Ｇを含んでいるならば（宿主が、
アンバー変異を抑制する能力をもつならば）６６４位の
オパール終止シグナルまでのコドンの読み通しにより、
　　ｐ２７Ｊのサイズのポリペプチドが生じる。この示
唆は１次の知見により支持される。

その知見とは、　ｐｏｒｆ５で形質転換されたＥ、　ｃ
ｏｌｉ０１２１０中の０ＲＦ５の発現は、大きさと免疫
反応性（Ｄ、３９節参照）によりウィルス抗原ｐ２４’
およびｐ２’？’と同定され得る２つの生産物を生じる
という知見である。Ｅ、ｃｏｌｉ　　０１２１０は、リ
ーキーアンバーサプレッサー系を含む。従って、翻訳の
一部分は。

アンバーコドンで終結する。その示唆の確認は。

ｐｏｒｆ５中に存在するＯＲＦの６０８位でＡをＧに置
換することによって得られる。この置換は、　ｉｎ　ｖ
ｉｔｒ。

位置特異的変異を用いることにより、達成され得る。位
置特異的変異の手法は、平均的当業者に公知である。

１１ＤＶの完全なゲノムは、　１６７９ヌクレオチドの
環状配列を示す、相補的な合成オリゴマーのうちのただ
１つと、−末鎖δ１．Ｍ１３プローブとが、その鋳型に
ハイブリダイズするので、上記ゲノムＲＮＡは一本鎖で
あると推定される。さらに、その鋳型ＲＮＡを、　ｉｎ
　ｖｉｔｒｏにおいてウサギ網状赤血球溶解産物に翻訳
することはできない。このことは、該ゲノムが、事実上
アンチセンス鎖を表す可能性を示す。

Ｄ、２．ポリペプチドをコードしているクローン感染し
た血漿に由来するウィルスＲＮＡを、ランダムプライム
し、そして生じたｃＤＮＡを、上記のように、　ＧＣ末
端鎖を使いｐＢＲ３２２のＰｓｔ１部位中にクローン化
した。連結混合物を、　Ｅ、　ｃｏｌｉ　　ＭＣ１０６
１に形質転換し、約２０　、０００の組換え体のプール
からプラスミドＤＮ＾を調製した。そのプラスミドＤＮ
Ａを、　　Ｐｓｔｌを用いて開裂し、そして、　ｃＤＮ
Ａ挿入物を、アガロースゲルから溶出し、クレノーを使
って平滑末端とした。これをＥｃｏＲＩリンカ−に連結
し、そして、宿主としてＹ１０９０（ｒ−）を用い、フ
ァージベクターλｇｔｌｌ　（Ｙｏｕｎｇ、　ｅｔ　ａ
ｌ、　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ＾ｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　
（１９８３）　８０　：　１１９４−１１９８）の唯一
のＥｃｏＲ１部位にクローン化した。このファージ−ラ
ンダムｃＤＮＡライブラリーを９次に、上記の関連する
δ４およびδ１１５クローンから誘導された２つのプロ
ーブにハイブリダイゼーションすることによりスクリー
ニングした。さらに、コロニーを。

Ｂ型肝炎およびδウィルスに慢性的に感染したヒト由来
の抗血清を用いて、免疫スクリーニングした。

プローブと抗血清との両方に結合する。いくつかのプラ
ークを得た。１つの回収プラークを、塩基配列決定した
。そしてそれは、約２００ｂｐのｃＤＮＡを含んでいた
。このｃＤＮＡの翻訳読み取り枠は１表２に示されるア
ンチゲノム鎖から翻訳されたポリペプチドｐ１の部分に
相当する。このλｇｔｌｌにより生産されるβ−ガラク
トシダーゼ融合タンパクは。

そのカルボキシル末端に、δ抗血清の特異的な結合に応
答するポリペプチドｐｉの領域を含んでいた。

Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎および非Ａ／非Ｂ型肝炎に前もって
感染させておいたものから得られる対照の抗血清は、こ
の融合タンパクに結合しなかった。

従って、ｐｌは、δに感染した抗血清への特異的結合能
力のある抗原領域を明らかに含み、それゆえ。

診断に有用である。

（以下余白） Ｄ、３．　　　　ベク　−の　　およびＨＤＶ配置のＨ
ＤＶゲノムおよびその相補体は、多くのＯＲＦを含む（
０，１，節参照）。これらＯＲＦのいくつかは発現して
おり、そしてコードされているポリペプチドの抗原性が
、　　ＨＤＶ抗血清への結合能力について調べられた。

第７図は、　　ＨＤＶ　ＯＲＦのダイアダラムである。

ＡＴＧで始まっている３００ヌクレオチドより大きい全
てのＨＤＶ　ＯＲＦは、　　ＨＤＶゲノムの円形座標の
形で示されている。太い綿は、バクテリア中に発現され
る各ＯＲＦの部分を示す。三角（ム）は。

各ＯＲＦの最初の枠内のＡＴＧを示す。矢印は、ゲノム
または反ゲノムの鎖の翻訳１時計回りまたは反時計回り
をそれぞれ示す。各全てのＯＲＦの座標。

細菌中および関係のある翻訳枠の中に表現されている領
域を１表の形で示した。

融合タンパクの合成を指示する細菌の発現プラスミドを
構築した。上記融合タンパクは、ヒトのスーパーオキシ
ドジスムターゼ（ＳＯＳ）　（Ｈａｌｌｅｗｅｌｌｅｔ
　ａｔ、　　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ　（
１９８５）１３　：　２０１？）　。

およびさらに、　　０ＲＦ５またはＯＲＦ　６中にコー
ドされたＨＤＶタンパクの部分（つまりＰｉおよびｐ２
）をそれぞれ含む。このプラスミドは、　　０ＲＦ５に
コードされたｐｌまたはＯＲＦ　６にコードされたｐ２
　（ＳＯＤのカルボキシル末端に融合されている）のほ
とんどを合成した。

発現プラスミドは、　Ｈａｌｌｅｗｅｌｌ　らの発現プ
ラスミドｐｓＯＤ１６　（前出）を働かせるｔａｃプロ
モーターに基づく。プラスミドｐｓＯＤ１６ｃｆ　２は
、　　ＳＯＯ遺伝子のカルボキシル末端をコードする部
分と、下流のポリリンカー配列の部分とを、　Ｍｂｏ１
部位を介して次の新しいポリリンカー配列により交換す
ることにより、　ｐｓＯＤ１６から生じた： ５’　ＧＡＴＣＧＣＣＡＴＧＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＴＣ
ＧＡＣＴＡＡＡＴＧＡＣＴＡＧ　３’３’　ＣＧＧＴＡ
ＣＣＣＡＴＧＧＧＣＣＣＡＧＣＴＧＡＴＴＴＡＣＴＧＡ
ＴＣＴＴＡＡ　５’このポリリンカー配列の置換の結果
、　　ＳＯＯの元のカルボキシル末端のＧｌｎが除去さ
れる。

ＨＤＶゲノム由来の配列を挿入するために、　（Ｓｔｅ
ｉｍｅｒｅｔ　ａｌ、Ｊ　Ｖｉｒｏｌ　（１９８６）５
８：９−１６）の方法を採用した。

ｐｓＯＤ１６ｃｆ　２を、以下に記載するように所望の
特別なコード配列に調節するために、適当に分解した。

ｐｌについては１回収したＤＮＡクローンδ１１５を。

Ｓｓｔ　ＩＩで分解し、クレノーで平滑末端とし、そし
て拡１で分解し、　　６００ｂｐ断片を回収（アガロー
スゲルから単離）した。単離された断片を、あらかじめ
Ｎｅｏ　Ｉで分解したｐｓＯＤ１６ｃｆ　２に連結し、
平滑末端とし、そしてＳａｌ　Ｉで分解してｐｓＯＤ−
δｐ１を得た。コードされた融合タンパクは、ヌクレオ
チドｘ１５６７からｘ９６３によりコードされるｐ１ア
ミノ酸配列の２０５残基を含んでいる。

ｐ２タンパクについては９組換えＤＮＡプラスミドｄ４
をＥｃｏ　Ｒ１と鎖虹Ｉとで切断し、　　６２２ｂｐの
断片を回収した。この断片は、　Ｅｃｏ　Ｒ１／Ｓｅａ
　Ｉで分解したｐｓＯＤ１６ｃｆ　２の中に連結され、
　ｐｓｏｏ−δｐ２が生じた。

（得られたプラスミドの両方を配列決定して。

ＳＯＤタンパクのＣ末端で配列をコードしているｐｌお
よびｐ２の位置と方向とを確認した。）連結生産物を、
　Ｅ、　ｃｏｌｔ　０１２１０（Ｓａｄｌｅｒ　ｅｔ　
ａｌ。

釦並（１９８０）　８　：２７９−３００）の中に形質
転換した。単一コロニーの形質転換体を１００μｇ／ｙ
ｄｌアンピシリンを添加したし一ブロース培地中２　ｒ
ｎｌで３７℃にて一夜増殖させた。これら培養物のグリ
セロール（５０％）貯蔵物を調製し、　−２０’Ｃで保
存した。

タンパクの発現分析のために、上記の培地中での終夜培
養を、グリセロール貯蔵物を用いて始めた。これらの培
養物を、上記と同一の培地中に１／１００希釈し、　０
Ｄｂｓ。が０．６となるまで３７℃で培養を行った。そ
のとき、その一部を溶菌するか、もしくは、　　１ｍＭ
　ＩＰＴＧの添加を行い溶菌前の４時間にさらにインキ
ュベートすることにより、最高の発現が達成される。

変成ポリアクリルアミドゲル（Ｌａｅｍｍｌｉ、　Ｎａ
ｔｕｒｅ（１９７０）匪：６８０）上で分析するために
、細胞を。

ＳＯＤおよびＤＴＴの存在下で溶解させた。そして。

Ｔｏｗｂｉｎら、　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓ
ｃｉ　ＵＳＡ　（１９７９）　７６　：４３５０に従っ
てイムノプロッティングを行った。その結果を、第６図
に示す。

イムノプロットを、慢性的に感染した患者（パネルＡ）
または、　ｎｏｎ−δ肝炎ウィルスに感染した抗血清を
含む対照の抗血清（パネルＢ）からのδ抗血清と反応さ
せた。さらに、５％のヤギ血清に前結合させた後、イム
ノプロットを、０．３％Ｔｗｅｅｎ−２０と５％ヤギ血
清とを含むＩＸＰＢＳで希釈された抗血清の１：３００
希釈物と反応させ９次に、西洋ワサビペルオキシダーゼ
と接合したヤギ抗ヒトＩｇＧの１：２００希釈物でイン
キュベートし、そしてその沈降物（プロット）を、クロ
モ−ケン４−クロロ−１−ナフトール（Ｂｉｏｒａｄ）
の存在下で、展開した。

第６図において、第１〜４列は、　ｐｓｏｏ−６９１組
換え体ベクターを含む細胞の抽出物を含み；第５および
第６列は、宿主ベクターに形質転換した細胞からの抽出
物を含み；第７〜１０列は、対応するｐｓＯＤ−６２２
組換え体ベクターを含んでいた。第３゜４．６．９およ
び１０列の検体は、　ＩＰＴＧで誘発されていない培養
物からのものであり；残りの第１゜２，５．７および８
列からの検体は、　ＩＰＴＧで、さらに誘発された培養
物からのものであった。第５〜１０列に比較したときの
第１〜４列中の付加的なタンパクバンドの存在は、　ｐ
ｓｏｏ−δｐ２からではなく。

ＳＯＤ　−ｐｔと命名されたｐｓＯＤ−δｐｔからの抗
原的に反応するタンパクの生産を示す。従って、　ＯＲ
Ｆ　６でな（０ＲＦ５が、ヒ）　ＨＤＶ抗血清に特異的
に結合するタンパクをコードする。特異的な免疫反応性
のＯＲＦ　６融合ポリペプチドを検出することができな
いのは、細胞宿主中での発現の欠失によるためでなかっ
た。というのも、ヒト　スーパーオキシドジスムターゼ
に対して生じるウサギ抗血清への結合をモニターすると
、　ｐｓｏｏ−６１およびｐｓＯＤ　−６２から発現し
た生産物が、同様のレベルで存在したからであった。

第６図Ａに見られるように、　　ＨＤＶ抗血清に免疫反
応性であるρ５ＯＤ−δ１からの２つの翻訳生産物が、
優性的に存在する。最も大きい主要な免疫反応性ＯＲＰ
　５ポリペプチドの推定の大きさは、　４９．０００ダ
ルトンであり、そしてそれは、スーパーオキシドジスム
ターゼの１５４アミノ酸とＯＲＦ　５によって特徴づけ
られる２０５アミノ酸とを含む融合タンパクと一致する
。このポリペプチドは、　　０ＲＦＳ中のアンバーコド
ンの抑制から生じうる（第２図参照）。

このアンバーコドンはｐｓＯＤ−６１中に存在し、そし
て、宿主株Ｅ、　ｃｏｌｔ　０１２１０は、アンバーサ
プレッサー株である。より小さい第２の主要なポリペプ
チド生産物は、サプレッションの濡れから生じる。その
ため、アンバーコドンにおける転写集結を許容する。他
の可能な別の説明としては、上記小さい方のタンパク（
単数もしくは複数）は、単一生産物の翻訳後プロセッシ
ングから生じうるこ。

と、またはＯＲＦ　５のコード領域内に別の開始部位が
存在する。ということがある。

Ｅ、　ｃｏｌｔ株０１２１０　（ｐｓＯＤ−δｌ）のサ
ンプルを。

アメリカンタイプ　カルチャーコレクション（八ＴＣＣ
）　。

１２３１０　Ｐａｒｋｌａｗｎ　ｄｒｉｖｅ、　Ｒｏｃ
ｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤ　２０８５２＋に寄託し、そして
、寄託に６７１３１を得た。この寄託物は、ブダペスト
条約により規定される条件下で維持される。

０ＲＦ１．２および７中ニコードされ、　　ＳＯＤとＨ
ＤＶタンパクとを含む融合タンパクの合成を指示する。

細菌の発現ベクター（つまりベクターｐｓＯＤ　−ｏｒ
ｆ　１　。

ｐｓＯＤ−ｏｒｆ２およびｐｓＯＤ−ｏｒｆ７）を構築
した。構築の条件と配列決定法は９次の事項を除いてり
、３．　ａ　。

節におけるｐｓｏｏ−δ１およびｐｓＯＤ−δ２につい
ての記載と同様に行った。

ｐｓＯＤ−ｏｒｆｌについては、　４３６ｂｐの挿入物
断片を。

そのプラスミドＮｅｏ　Ｉで分解することにより、クロ
ーンδｌから単離し９次にゲル精製を行った。

この断片を、　Ｎｅｏ　Ｉ処理し、ホスファターゼ処理
したｐｓＯＤ１６ｃｆ　２に連結した。そのクローン中
の０ＲＦ１断片は、ゲノムの方向性を有する。

ｐｓＯＤ−ｏｒｆ２については、　　５９３ｂｐの挿入
物ゲル精製断片を、　Ｂｓｔ　ＸＩによるクローンδ１
１５の分解後。

単離し、クレノーで処理し１次にＥｃｏ　Ｒ１で分解し
た。この断片を、　Ｎｅｏ　Ｉで切断したｐｓＯＤ１６
ｃｆ　２に連結し、クレノーで平滑末端とし、そしてＥ
ｃｏ　Ｒ１で分解した。

ｐｓＯＤ−ｏｒｆ７については、　　４３９ｂｐの挿入
物ゲル精製断片を、…ｕｌとと虹！とでクローンδ１１
５を分解した後に分離した。この断片を、　Ｓｍａ　Ｉ
切断しホスファターゼ処理したｐｓＯＤ１６ｃｆ　２に
連結した。

ｐｓＯＤ−ｏｒｆｌ、　ｐｓＯＤ−ｏｒｆ２およびｐｓ
ＯＤ−ｏｒｆＴ中に発現したタンパクをｐｓｏｏ−δ１
およびｐｓｏｏ−δ２において記載したようにイムノプ
ロットにより分析を行った（Ｄ、３．　ａ　０節参照）
。

発現条件もまた。Ｄ、３．ａ、節に記載したのと同様で
ある。細菌溶解産物中の０ＲＦＩ、２および７ｈｓｏｏ
融合生産物の存在は、　ｈｓｏｏに対するウサギ抗−ｈ
ｓＯＤポリクローナル抗体の部分的活性により、実証さ
れた。各ＯＲＦを発現する細菌培養物の溶解産物を、ニ
トロセルロースの上にイムノプロットし。

そして慢性のＨＤν感染物を有する１２の異なる患者か
らの個々の抗血清と共にインキュベートした。

ｐｓＯＤ−ｏｒｆｌ、　ｐｓＯＤ−ｏｒｆ２．そしてｐ
ｓＯＤ−ｏｒｆ７から発現した生産物は、　　ＨＤＶ抗
血清に結合しなかった。

しかし、　ｐＯＲＦ５　（その構造は、Ｄ、３．δ０節
に記載されている）から発現した生産物は、そのＨＤＶ
抗血清に結合した。

細菌の発現プラスミド（ＯＲＦ５でコードされた融合し
ていないポリペプチドの合成を指示する）を構築した。

このヘクターｐｏｒｆ　５は、第２の合成リンカ−を含
んでいることを除いて、融合したＳＯローｏｒｆポリペ
プチドを発現するために使われるもの（ｐｓＯＤ−δｐ
ｉ、　Ｄ、３．ａ０節参照）と類似しテイル。

上記第２の合成リンカ−は、　ｈｓＯＤコード配列のあ
との翻訳を終結するため、およびＨＤＶ配列の最初の＾
ＴＧで翻訳を再開始するために設計された。このリンカ
−は、　　０ＲＦ５中にもとから存在する１０アミノ酸
をコードしており、アミノ末端ＡＴＧを含む。

さらに明確には、そのベクターは１次のものを共に連結
することにより構築された：ａ）δ１１５から制限し、
そしてゲル精製した６０５ｂ、ｐ、のＳｓｔ　ＩＩ／Ｓ
ａｔ　Ｉ断片；ｂ）第２のリンカ−；およびｃ　）　Ｎ
ｃｏ　１とＳａｌ　Ｉ　とでｐｓＯＤ１６ｃｆ　２を処
理することによって得られた大きいベクター断片。上記
リンカ−配列は２次のとおりである： ５’　　ＣＡＴＧ　　ＧＣＴ　　ＡＣＡ　　ＧＡＧ　　
ＧＡＡ　　ＴＴＡ　　ＴＡＡＴ　　ＡＴＧ　　ＡＧＣＣ
ＧＧ　　ＴＣＣ３’　　ＣＧＡ　　ＴＧＴ　　ＣＴＣ（
：ＴＴ　　ＡＡＴ　　ＡＴＴＡ　　ＴＡＣＴＣＧ　　Ｇ
ＣＣＡＧＧプラスミドｐｏｒｆ　５でＥ、　ｃｏｌｔ　
０１２１０の形質転換を、Ｄ、３．ａ、節に記述されて
いる（他のプラスミドでの形質転換が記載されている）
ようにして行った。ｐｏｒｆ５の中のその挿入物の構築
は、　ＤＮＡ配列分析によって確証された。この分析に
より、　０ＲＦ５のδ１１５誘導体中のアンバーコドン
の存在もまた確証された（ＯＲＦ　５の配列異質性につ
いての第３歯参照）。

ｐｏｒｆ　５内にコードされるＯＲＦ　５ポリペプチド
を発現させ９発現生産物のＨＤＶ抗血清との免疫反応性
を０．３．　ａ　、節に記述されるように行った。そし
て、　ｐｓＯＤ−ｏｒｆｌ、　ｐｓＯＤ−ｏｒｆ２．お
よびｐｓＯＤ−ｏｒｆ６゜およびｐｓＯＤ−ｏｒｆ７か
らの発現生産物の分析を同時に行った。第８図（イムノ
プロットを示す）に見られるように、　　０ＲＦ５をコ
ードするポリペプチドだけが、　　ＩＩＤＶ抗血清に結
合した。そして、これらのポリペプチドは、感染してい
ない個体からの抗血清には結合しなかった。

第８図のイムノプロットの分析については、対照のプラ
スミド（ｐｓＯＤ１６ｃｆ　２　）またはｈｓＯＤ−ｏ
ｒｆｌ。

２．６．７およびＯＲＦ　５の発現プラスミドを有する
細菌培養物を、　ＩＰＴＧにより約４時間誘発させて行
った。細胞をペレット化し、細胞の０．０２４０に相当
する脂質およびタンパクを、　Ｄ、３．節に記載される
ように１２％Ｌａｅｍｍ　１　ｉゲル上で電気泳動にか
けた。

タンパクを、炭酸緩衝液中のニトロセルロースフィルタ
ー上に移行させた。イムノプロットをヒト！１ＤＶ抗血
清の１：２００希釈物でインキュベートし。

次に　１２５１で標識化ヒツジ抗ヒトＩｇＧ抗体でイン
キュベートした。そして、Ｄ、３．ａ、節に記載される
ように洗浄した。溶解産物は２次の順序で現れる：第１
列、　ｐｓＯＤ１６ｃｆ２　；第２列、　ｐｓＯＤ−ｏ
ｒｆｌ　ｉ第３列、　ｐｓＯＤ−ｏｒｆ２　；第４列、
　ｐｏｒｆ５　；第５列。

ｐｓｉｓ−ｏｒｆ６　；および第６列、　ｐｓＯＤ　　
ｏｒｆ？。

第８図はまた１次の事柄を示す。それは、　ｐｏｒｆ５
から発現し、　　）ＩＤＶに特異的な抗体と反応する生
産物には、２つの分子量種があり、それらのポリペプチ
ドは約２７におよび２４にであるという事柄である。以
下に示すように、これらのポリペプチドは、２つの肝炎
ウィルスポリペプチドｐ２７’　とｐ２４δとにより共
有される免疫原性のエピトープを含む。

）ＩＤＶ中の２７ｋｄおよび２４ｋｄポリペプチドの存
在は。

最近報告されている。Ｂｅｒｇｍａｎｎ＋に、Ｆ、およ
びＧｅｒｉｎ＋Ｊ、Ｌ、、　Ｊ　ｏｆ　Ｉｎｆ　Ｄｉｓ
ｅａｓｅｓ　（１９８６）　１５４　：　７０２　　；
およびＢｏｎｉｎｏ、　Ｆ、　　ら、　Ｊ　Ｖｉｒｏｌ
　（１９８６）５８　：　９４５゜さらに、以下に示さ
れるように、これらのポリペプチドはまた。おそらく、
肝炎デルタ抗原（ＨＤＡｇ）を有する。ＨＤＡｇは９元
来、感染した個体の肝細胞の核中に見出されてい、た。

Ｒｔｚｚｅｔｔｏ、　Ｍ、ら、販［（１９７７）　１８
：９９７゜ Ｄ、３．ｄ、　　０ＲＦ５にコード　れるＨＤＶポ１ペ
プチドの　　　での　　　およびその戸　　の合分遣１
艮 ＯＲＦ　５がコードする所望のＨＤＶポリペプチドの合
成を指示する酵母の発現ベクターを構築した。

酵母株ＡＢＩＩＯ中でのこのプラスミド（ｐＹＡＧ−δ
ｐｉ）の発現により　１９５アミノ酸ポリペプチドが生
じた。

このポリペプチドは、免疫学的にＨＤＶ抗血清と反応性
を有し、おそらくウィルスタンパクｐ２４δであろう。

酵母発現ベクターｐＹＡＧ−δｐ１は１次のように構築
された：第１に、　ｐＢ５１００中の発現カセットの内
に、新しいリンカ−に連結したクローンδ１１５カらの
ＯＲＦ　５を挿入することによりｐＡＧ−δｐ１を構築
した。Ｒａｍ旧で切り出され得るそのカセットは。

唯一のＮｃｏ　１部位の上流にＡＤＨ２−ＧＡＰを制御
し得るプロモーター、および唯一のＳａｌ　１部位の下
流にＧＡＰターミネータ−を含む。Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｈ
Ｂ　１０１中にｐＡＧ−δｐｔをクローニングした後、
　　０ＲＦ５を含む発現カセットを、　　ｐＡＧ−δｐ
ｔがらＢａｇ旧で制限切断し、そして、あらかじめハＬ
旧で制限切断した酵母シャトルベクターｐＢＡ２４中に
連結した。生じたプラスミドを、　Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｈ
Ｂ　１０１中にクローン化し、そして、シャトルプラス
ミドｐＹＡＧ−δｐｌを選択した。ＯＲＦ　５の発現に
ついては、酵母株ＡＢＩＩＯを、このプラスミドにより
形質転換し、　ＡＢＩＩＯ（ｐＹＡＧ−δｐｉ）を形成
させた。

酵母株へＢＩＩＯ（ｐＹＡＧ−δｐｉ）のサンプルをＡ
ＴＣＣ。

１２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｒｏｃ
ｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ２０８５２に寄託し
た。そして、登録Ｎα２０８４５を得た。

この寄託物は、ブタペスト条約に規定され条件下で維持
される。

さらに詳細には、　　０ＲＦ５を含有する発現力セント
は９次のものを連結させて構築された：５ｓｔｌｌとＳ
ａｌ　Ｉ　とでクローンδ１１５を分解することによっ
て得られ、ゲル精製された６ｏｓｂ、ｐ、の断片；新し
いリンカ−（リンカ−３）；およｆｆＮｃｏ　Ｉ　とＳ
ａｌ　ＩとでＰＢＳｌｏｏを分解することによって得ら
れ、ゲル精製した５８４１ｂ、ｐ、断片。上記リンカ−
３の配列は。

次のとおりである： ５’　ＣＡＴＧ　ＡＧＣＣＧＧ　ＴＣＣＧＡＧ　ＴＣＧ
　ＡＧＧ　ＡＡＧ　ＡＡＣＣＧＣ３’ＴＧＣＧＣＣＡＧ
Ｇ　ＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＧ　ＧプラスミドＰ
ＢＳ１００は、米国特許出該第７６０．１９７号に記載
されている。この特許出願は、ここに譲受人に譲渡され
ており、これにより参照文献として採用する。このプラ
スミドは、　ｐＢＲ３２２誘導体のｐＡＢ１２にクロー
ン化された酵母発現カセットを含んでいる。この発現カ
セットは、ハイブリッドＡＤＨ２−ＧＡＰプロモーター
、　ＧＡＰターミネータ−１そして」図！部位とＳａｌ
１部位間の本質的ではない配列を含んでいる；これらの
後者の配列は、クローンδ　１１５の０ＲＰ５領域と置
換された。ＡＤＨ２−ＧＡＰプロモーターは、プラスミ
ドｐＪｓ１０３から単離された１２００ｂｐ勿旧−」並
Ｉ断片である。

プラスミドｐＪｓ１０３は、以下のように構築したニブ
ラスミドｐＡＤＲ２（Ｂｅｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　　Ｎ
ａｔｕｒｅ　（１９８２）別０　：　７２４−７２８）
の野性型ＡＤＨ２遺伝子を含むプラスミドを制限酵素」
ｃｏＲＶで切断することによって。

プロモーターのＡＤＨ２部分を構築した。制限酵素Ｅｃ
ｏＲＶは、　ｐＡＤＲ２中の他の２つの部位と同様に、
　ＡＤＨ２領域の外側にある＾ＴＧ開始コドンに関連す
る＋６６位において切断する。得られたベクター断片お
よび２つのより小さな断片の混合物を」１３１エクソヌ
クレアーゼで再び切除し、約３ｏｏｂｐを除去した。

合成Ｘｈｏｌ　リンカ−を、　　Ｂａ１３１で処理した
ＤＮＡ上に連結した。得られたＤＮＡリンカ−ベクター
断片（約５ｋｂ）を、カラムクロマトグラフィーによっ
てリンカ一群から分離し、制限酵素ＸｈｏＩで切断。

連結し、そしてＥ、　ｃｏｌｉをアン腎“シリン耐性に
形質転換させるために用いた。ＸｈｏＩ　リンカ−の位
置は、　ＤＮＡの配列決定により決められた。ＭＤＩ＋
２遺伝子（＾ＴＧから一２３２位）の５゛非転写領域内
のＸｈｏｌリンカ−を含む１つのプラスミドを、制限酵
素Ｘｈｏ　１で切断し、ヌクレアーゼＳ１で処理し２次
いで制限酵素ＥｃｏＲＩで処理し、　　Ｘｈｏｌ　リン
カ一部位の１つの平滑末端およびＥｃｏＲＩ末端を有す
る線状ベクター分子を得た。酵素」亜旧およびＥｃｏＲ
ＩでプラスミドｐＰＧＡＰＩを切断し２次イＴ：　０．
４ｋｂｐ　（７）　ＤＮＡＩｒ片を単離することによっ
て、プロモーターのＧＡＰ部分を構築した。次いで、こ
の精製した断片を酵素Ａｌｕｌで完全に切断し、そして
約２００ｂｐ断片を単離した。二〇〇ＡＰプロモーター
断片を上記の線状べフター上に存在するＡＤＨ２断片に
連結し、プラスミドｐＪｓ１０３を得た。

プラスミドｐＰＧＡＰ１は、　ＧＡＰＤＩ＋クーミネー
ターと先端を切ったＧＡＰＤＨプロモーター領域の間に
多制限部位リンカ−を有する酵母発現カセットベクター
である。この多制限部位は、　　ＮｃｏＩ＋　ＥｃｏＲ
Ｉおよび５ａｉｌに対する認識部位を含み、そしてこの
カセットは、　　Ｂａｍ）ＩＩ断片として切断し得る。

ｐＰＧＡＰｌの調製は、欧州特許出願公報Ｎｏ、　ＥＰ
ＯＯ１６４５５６およびＴｒａｖｉｓ、　Ｊ、　　ら、
　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　（１９８５）　２６０（７
）　：　４３８４−４３８９中に記載されている。両方
の参照文献において、　ｐＰＧＡＰｌはｐＰＧＡＰと呼
ばれている。

プラスミドｐＡＢ１２は、特異なり１ｎｄｌｌＩ部位お
よび」計１部位の間の領域を欠（ｐＢＲ３２２誘導体で
あって、特異なＥｃｏＲ１部位中にＢａｍＨＩリンカ−
を含んでいる。」凰ｄｌｌｌおよび」虹！″’？！　ｐ
ＢＲ３２２を完全に切断し９次いでＢａ１ｌヌクレアー
ゼで限定分解することによってベクターを構築した。得
られた末端は、クレノーで溶離し、そして平滑化された
末端をＴ４　ＤＮＡリガーゼで連結し、閉じた共有結合
環を再形成させた。次いで、これらの環状物をＥｃｏＲ
Ｉで完全に切断し、突出部はクレノーで満たし、そして
平滑末端を勿旧リンカ−で連結した。過剰のリンカ−は
、　　Ｂａｍ旧で切断することにより除去し、そして連
結することによって、共有結合性閉環状物を形成させた
。

プラスミドｐＡＢ２４は、完全な２μ配列（Ｂｒｏａｃ
ｈ。

す・・カロマイセスの　　　　　、　１　：　４４５．
コールドスプリングハーバ−プレス（１９８１））およ
びｐＢＲ３２２配列を含む、酵母のシャトルベクターで
ある。このプラスミドは、さらにプラスミドＹＥｐ２４
（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ、　ｅｔ　ａｌ＋　（１９７９）　
Ｇｅｎｅ　８　：　１７）由来の酵母ＬＩＲＡ３遺伝子
、およびプラスミドｐｃｔ／１　（欧州特許出願公報Ｎ
ｏ、　ＥＰＯ０１１６２０１に記載）由来の酵母ＬＥｔ
ｌ”ｄ遺伝子を含んでいる。ＥｃｏＲＩでＹＥｐ２４番
切断し、そしてベクターを再連結して部分的２μ配列を
除去することによって、プラスミドｐＡＢ２４を構築し
た。得られたプラスミド、すなわちＹＥｐ２４ΔＲ１を
Ｃ１ａｌで切断して線状化し、そしてＣ１ａｌで線状化
されている完全な２μプラスミドで連結したｑ次いで、
得られたプラスミド、すなわちｐＣＢｏｕをＸｂａ　Ｉ
で切断し、そして８６０５ｂｐベクタ一断片をゲル分離
した。この単離されたＸｂａｌ断片は、　ｐｃｉ／１か
ら単離したＬＥＵ２ｄ遺伝子を含む４４６０ｂｐ　Ｘｂ
ａｌ断片と連結した；　ＬＥｔｌ”ｄ遺伝子の配向は、
υＲＡ３遺伝子と同じ方向にある。発現カセットは、　
ｐＢＲ３２２配列の特異な」憇旧部位に挿入されており
、従って細菌のテトラサイタリン耐性遺伝子を中断して
いた。制限酵素部位およびいくつかの顕著な特徴を表す
、　ｐＡＢ２４の地図を第９図に示す。

酵母における０ＲＦ５の発現は、　ｐＹＡＧ−δｐ１で
形質転換した酵母株ＡＢＩＩＯを用いて達成された。酵
母株ＡＢＬＩＯは、米国特許出該第６２０．６６２号に
記載されている。この特許出願は、ここに譲受人に譲渡
されており、これにより参照文献として採用する。

ＡＢＩＩＯの遺伝子型は、　　ＭＡＴα、肛虹３−５２
．ユ些２−０４゜または趣２−３および」朋２−１１２
の両方、」亜４−３゜」鎚４−５００　（ｃｉｒ’　）
である。

発現させるために、凍結貯蔵した細胞をＬｅｕ−プレー
ト上に筋状にまき、そして３０°Ｃでインキュベートし
た。単一コロニーを、ロイシン選択培地〔合成最小培地
、アミノ酸供給（ｗｌｏ　Ｌｅｕ）、　　８％グルコー
スｉ　Ｓｈｅｒｍａｎ　ら、　　　゛　云　　に゛ける
に１　る　　　マニュアル、コールドスプリングハーバ
−ラボラトリ−、１９８６，ρｐ、　１６３−１６９　
’）に植菌し、そしてこの培養物を３０℃にて振盪しな
がらインキュベートした。次いで、２ｍの培養物を、　
　１００ａ＋ｊ！の３％グルコース含有Ｌｅｕ−培地に
植菌し、そして３０°Ｃにて振盪しながらインキュベー
トした。この培養物が飽和状態に達したら、５０ｍｆｌ
を。

１１の１％グルコース含有Ｌｅｕ−培地に植菌した。

この培養物は、光学密度が０Ｄｉｓｏ＝１．７５００／
ｍｌｌと測定されるまで、３０°Ｃにて振盪しながらイ
ンキュベートした。光学密度がこのような値になると。

細胞はペレット化し、そして−８０°Ｃで貯蔵するか。

あるいはタンパク精製のためのプロセッシングを行った
。

、酵母中で発現する。　０ＲＦ５がコードしたタンパク
を部分的に以下のように精製した。酵母発現培養物、八
ＢＩＩＯ（ｐＹＡＧ−δｐｉ）をペレット化し、そして
バックされた細胞の体積を見積もった。δｐｉルミタン
パクガラスピーズ溶解法を用いて精製した。

細胞ペレットは、緩衝液１　（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ
ＣＩ　ｐ）１Ｂ、０　。

１ｍＭεＤＴＡ、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフル
オライド（ＰＭＳＦ）　、　　１Ｍｇ／ｒｔｄｌペプス
タチンＡ）の２容量、およびガラスピーズ（０，２５ｍ
ｍ、酸処理および加熱処理済）の１容量中に再懸濁した
。この細胞を激しく撹拌することによって溶解し、そし
て４°Ｃで保存した。懸濁液を遠心分離して上澄を除去
し、そして細胞ペレットを２容量の１％Ｔｒｉ　ｔｏｎ
Ｘ−１００含有緩衝液！で洗浄し８次いで遠心分離した
。上澄を除去し、そしてペレットを２容量の緩衝液１で
３回、洗浄した；最後の洗浄の間に、ガラスピーズをタ
ンパク懸濁液から除去した。洗浄したペレットは、同容
量の６Ｍ尿素含有緩衝液■で２回、抽出し、タンパクを
熔解させた。上澄を集め、緩衝液■を用いて１：１０に
希釈し、そして防腐剤として２０−Ｍのアジ化ナトリウ
ムを用いて４°Ｃで保存した。このタンパクを使用する
前の最終段階として、　ＰＭＳＦおよびペブスクチンを
含まない緩衝液■の１００〜３００容量で２回、透析し
た。

Ｄ、４，０ＲＦ５　　でコードされたポリペプチドの「
５足 ０ＲＦＳ内でコードされたポリペプチドは、　ｐ２１Ｂ
およびｐ２４Ｊのポリペプチドとして同定されたが、こ
の同定は細菌の組換え非融合ポリペプチド中で発現した
大きさを、　ＨＤＶ粒子中およびＨＤ　Ａ　ｇ陽性の肝
臓抽出物中に存在するｐ２７δおよびｐ２４δの大きさ
と直接比較することによって行った。さらに、　０１？
Ｆ５がコードしたポリペプチドは、酵母中で発現した組
換えポリペプチドと、　ｐ２１ｇおよびｐ２４δの間の
ＩＩＤＶ抗体に対する免疫学的競合に基づいて、ρ２７
δおよびρ２４Ｊとして同定された。最後に、　０ＲＦ
５がコードしているポリペプチドは１組換えポリペプチ
ドの。

核ＨＤＡｇとの競合結合により、核Ｉ口＾ｇの成分とし
て同定した。この競合結合は、　ＩＩＤＶ惑染肝感染片
の間接的な免疫ペルオキシダーゼ染色によってモニター
される。

Ｄ、４．ａ、　　　　　で　　した　ｏｒｆ　５　　　
のボｉペプチド　　人している　ＨＤν″′　と　１１
猟およびＨＤＶ室　　　　の２４８および２７ｓの較 ０ＲＦ５がコードした。ｐｏｒｆ５由来のポリペプチド
の細菌中における発現、およびその溶解産物の調製は、
　Ｄ、　　３０節中で上述したように行った。ＨＤν粒
子およびＨＤＶ惑染感染の溶解産物は、　Ｋ、Ｆ、　Ｂ
ｅｒｇｓ＋ａｎｎおよびＪ、Ｌ、　Ｇｅｒｔａ＋　Ｊ　
ｏｆ　Ｉｎｆ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ　（１９８６）１５４
　：　７０２（これにより参照文献として採用する）に
記述されている方法に従って、親切にもに、Ｆ。

Ｂｅｒｇｍａｎｎ・氏によって調製された。肝臓溶解産
物の調製においては、肝臓の試料を鋏で細かく切り刻み
、そしてＰＢＳで洗浄し９次いで６Ｍのグアニジニウム
ＨＣＩ　（ｐＨ６）中でＰｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｊｅｍ
装置を用いて均質化した。４　’Ｃにて１〜３時間のイ
ンキュベーションの後、抽出物を１０分間、　１５００
ｇで遠心分離し、　ｐｕｓに対して透析し、そして再度
、遠心分離した。ウィルスの溶解産物は、報告された方
法を変更し、　ＢＳＡを除くことによって調製された。

血清試料を、　２０％スクロース、　０．０２Ｍ　ＨＥ
ＰＥＳ（ｐＨ７，４）。

０．０１Ｍ　ＣａＣ１ｇ＋　０．ＯＩＭ　ＭｇＣｈ上に
積み重ね、そしてＳ−４１０−ター中、　　１５０．０
００　ｇで５時間、遠心分離し、ウィルスをペレット化
した。このペレットは。

０．０５Ｍ　Ｔｒｉｓ　（ｐＨ６，８）および２％ＳＯ
Ｓ中で保持した。

０ＲＦ５を発現する細菌溶解産物は、１２％ラエムリ（
Ｌａｅｍｍｌｉ）ゲル上の、ペレット化したＨＤＶ抽出
物。

またはＨＤＡｇ陽性の肝臓抽出物に隣接したレーン中で
電気泳動を行い、ニトロセルロースフィルターにイムノ
プロットさせ、そして）ＩＤＶ抗血清（希釈率１：４０
０）でインキュベートした。第１０図Ａは。

ＨＤνウイルスの抽出物（レーン１）、感染した肝臓溶
解産物（レーン２）９．そしてｐｒｏｆ　５発現後の細
菌溶解産物（レーン３）のイムノプロットを表す。第１
Ｏ図Ａに明らかなように、細菌溶解産物中の２つの主要
な免疫反応性ポリペプチドは、ペレット化したウィルス
およびＨＤＡｇ陽性の肝臓から抽出されたｐ２７’およ
びｐ２４Ｂのポリペプチドと共に移動するようであった
。いくつかの低分子量の免疫反応性ポリペプチドも、細
菌溶解産物中に存在した；これらは、ｐ２７および／ま
たはｐ２４のタンパり分解産物を表している。

組換え０ＲＦ５産物と、ウィルスペプチドｐ２４δおよ
びｐ２７δとの間の免疫学的競合は、競合結合測定法に
よって測定した。一般に、　１（ＤＶ抗血清は、酵母ま
たは細菌中のいずれかで生産された組換え０ＲＦ５産物
に吸収させた。前吸収させた血清は、イムノプロッティ
ング法におけるウィルスのｐ２４’およびｐ２７’への
結合能力に関して、対照血清と比較した。

対照血清は、対照（親）ベクターで形質転換した。

酵母または細菌培養物の発現産物に前吸収されていたＩ
ＩＤＶ抗血清であった。発現条件は、　０ＲＦ５を含む
組換えベクターを発現させるような条件であった。

ｐＹＡＧ−δｐ１で形質転換した酵母株ＡＢＩＩＯ中で
発現した０ＲＦ５産物と、　ＨＤＶ粒子中（７）　ｐ２
４δおよびｐ２７’との間の免疫学的競合は、以下のよ
うに測定した。

組換え０ＲＦ５産物は、酵母中で発現させ、そしてり。

３、筒中に記述した条件下で部分的に精製した。

ＨＤＶ粒子の抽出物を調製し、ラエムリゲル上で判読し
、そしてイムノプロッティング法において。

ニトロセルロースフィルターをＨＤＶ抗血清とインキュ
ベートをする前に、阻止剤としてＩ　ＸＰＢＳ　（０，
１４Ｍ　ＮａＣ！、　２．５ｍＭ　ＫＣＩ、　１．５ｍ
Ｍ　ＫＨｚＰＯ４，８ｍＭ　ＮａｚｌｌＰＯ４゜１２１
１□０　、　ｐＨ＝　７．４）中の５％無脂肪ミルクを
用いること以外は、Ｄ、４．ａ６節中に記述されている
ようにプロットさせた。このイムノプロットさせたＨＤ
Ｖポリペプチドは、　（１）親の対照プラスミド。

ｐＡＢ２４　；または（２）ＯＲＦ　５を含む・プラス
ミド、　ｐＹＡＧ−δｐ１のいずれかを発現している。

　０．４４ｍ１の酵母培養物（００６５０＝　１６００
７ｍ１　）からの抽出物に前吸収させたＨＤＶ抗血清と
インキュベートした。

第１０図Ｂは、対照のプラスミド（レーン１）；または
０ＲＦ５を含むプラスミド（レーン２）のいずれかを発
現している酵母の溶解産物に前吸収させた）ＩＤＶ抗血
清を用いたイムノプロットを表す。この図に明らかなよ
うに９組換え０ＲＦ５ポリペプチドが）ＩＤＶ抗血清を
前吸収することにより、　ＨＤＶポリペプチドｐ２４Ｊ
およびｐ２’？’に結合している抗体は完全に排除され
た；対照の溶解産物に前吸収させた＾ＯＶ抗血清を用い
た前吸収では、結合を阻止できなかった。第１０図Ｂの
弱い、拡散バンド、すなわちレーン２は、非特異的な結
合を表し得る。なぜなら、　ＨＤＶ抗体を欠く対照の血
清をＨＤＶ抗血清に置き換えた場合にも、このようなバ
ンドが存在したからである。１（ＤＶ抗血清中のポリク
ローナル抗体に共通の結合から、　ＯＲＦポリペプチド
は、免疫学的にｐ２４ｇおよびｐ２７’として同定し得
たと推論し得る。

細菌または酵母中で発現した０ＲＦ５ポリペプチドと、
感染した肝臓中のｐ２４δおよびｐ２７’との間の免疫
学的競合も測定した。酵母株Ｈｅ１ｌｏ　（ｐＹＡＧ−
δｐｉ）における０ＲＦ５ポリペプチドの発現は、上述
のとおりであった；　ｐｏｒｆ　５で形質転換したＥ、
　ｃｏｌｉ　０１２１０における０ＲＦ５ポリペプチド
の発現は、　　Ｄ、　　３．筒中に記述された条件下で
なされた。肝臓の溶解産物を調製し、プロッティング方
法に上述の変更を用いること以外は、Ｄ、４．ａ、節に
記述されたようにプロットさせた。ＨＤＡｇ陽性の肝臓
抽出物中のポリペプチドのプロットは、以下のものとブ
レインキュベートした１ＩＤｖ抗血清とインキュベート
した：　　ｐＡＢ２４を発現する酵母培養物ＡＢＩＩＯ
の抽出物（対照）；ｐＹＡＧ−δｐ１からの０ＲＦ５を
発現する酵母培養物ＡＢＩＩＯの抽出物；　　ｐｓＯＤ
１６ｃｆ２を発現するＥ、　ｃｏｌｉ　０１２１０の抽
出物（対照）；そしてｐｏｒｆ　５を発現するＥ、　ｃ
ｏｌｉの抽出物。以下の（１）および（２）を用いて、
　ＨＤＶ抗血清の前吸収を行った：（１）酵母培養物は
、　００６５１１．＝１６００／１１１ｇのものを０．
４４ｍｆ；および（２）　Ｅ、　ｃｏｌｉは、　００．
、。＝０．６００７μｌのものを約１００１１．このプ
ロットは、前吸収させたＨＤＶ抗血清の１：１０００希
釈物とインキュベートした。

さらに、対照として、１つのプロットを、同量の透析さ
れた尿素抽出緩衝液とブレインキュベートされたＩＩＤ
Ｖ抗血清とインキュベートした。

第１０図Ｃは、対照のプラスミドを発現している酵母（
レーン１）；０ＲＦ５を発現している酵母（レーン２）
；対照のプラスミドを発現しているＥ、　ｃｏｌｔ（レ
ーン３）；０ＲＦ５を発現しているＥ、　ｃｏｌｔ　（
し−ン４）；そして緩衝液対照（レーン５）に前吸収さ
れた血清を用いたＨＤＶポリペプチドのイムノプロット
を表している。この図に明らかなように。

酵母中で発現された０ＲＦ５ポリペプチドが）ＩＤν抗
血清を前吸収することにより、　　ＨＤＶ特異的抗体が
１１０Ａｇ陽性の肝臓抽出物中のｐ２７δおよびｐ２４
’に結合することを完全に排除した。細菌培養物からの
０ＲＦ５ポリペプチドも、　ＨＤＶ特異的な抗体がｐ２
７３に結合することを排除するようであり、そしてこれ
らの抗体がｐ２４’に結合することを９元のオートラジ
オグラムのデンシトメトリーによる追跡に基づいて少な
くとも１０分の１に減少させた。ｐ２４ｇへのＨＤＶ抗
血清の残存する結合は、おそらく細菌抽出物における限
定量の０ＲＦ５ポリペプチドによるものである。ＨＤＶ
抗原がＨＤＡｇ感染肝臓からのｐ２４’およびｐ２７Ｊ
に結合することを著しく減少させた対照物は存在しなか
った。

ＨＤＡｇ陽性の肝臓切片を、酵母中で発現する。　０Ｒ
Ｆ５がコードしたポリペプチド、または対照の溶解産物
に吸収されていたＨＤＶ抗血清とインキュベートした。

対照を含む、前吸収されたＨＤＶ抗血清の調製は、Ｄ、
３．Ｂ、節に記述したように行った。

次いで、この切片は、抗ヒトＩｇＧを標識化したペルオ
キシダーゼとインキュベートし、そして間接的な免疫ペ
ルオキシダーゼ染色を行った。この方法は、　Ｇｏｖｉ
ｎｄａｒａｊａｎ、　Ｓ、ら、肛■亜旦橡圏■（１９８
４）８　：　６３　（これによって参照文献として採用
する）に従った。この方法において、内生のペルオキシ
ダーゼは、前もってブロックしておいた。脱柔軟化した
切片は、室温の温室中で３０分間、前吸収したＨＤＶ抗
血清とインキュベートし２次いでＰＢＳで２回、洗浄し
、そして温室中で、ウサギの抗ヒトＩｇＧを結合した西
洋ワサビペルオキシダーゼで処理した０次いで、これら
の切片をＰＢＳ中で１ｏ分間。

洗浄し、そして５〜８分間、３−３’ジアミノ−ベンジ
ジンハイドロクロライドおよび過酸化水素で処理した。

脱水後、これらの切片の被膜をとり。

そして光学顕微鏡によって観察した。

第１１図は、染色した肝臓切片の写真を表す。この写真
は、１５０倍の倍率で撮影した。第１１図Ａは。

対照の酵母溶解産物とインキュベートしたＨＤＶ抗血清
により得られた９間接的な免疫ペルオキシダーゼ染色を
表す。第１１図Ｂは、　）ＩＤＶ抗血清を、酵母中で発
現する。　０ＲＦ５がコードしたポリペプチドに前吸収
されている場合の染色を表す。対照の抽出物に前吸収し
たＨＤＶ抗血清中で観察された。　ＨＤＡｇに対する抗
体の核への明白な結合とは対照的に。

この抗血清が組換え０ＲＦ５ポリペプチドに前吸収され
ている場合には、結合は存在しなかった。

これまで、　ｐ２４Ｂおよびｐ２１Ｂが核デルタ抗原の
成分であるという直接的な証拠が不足していた。上に与
えたデータは、　０ＲＦ５がコードした産物が、　ＨＤ
Ｖ特異的な抗体に対する核デルタ抗原と競合することを
示している。このデータは、さらに０ＲＦ５が。

ｐ２４’およびｐ２１Ｂと同じ大きさのポリペプチドで
あって、これらのウィルスポリペプチドと同様の免疫反
応性エピトープを有する。２つのポリペプチドをコード
することを示す。従って、これらのデータを組み合わせ
ると、　０ＲＦ５がウィルスポリペプチドＰ２４’およ
びｐ２７Ｂをコードすること、およびこれらのポリペプ
チドが、　ＨＤＶ感染肝臓における核デルタ抗原の成分
であることが示される。

Ｄ、　５．　ハイブリ・）’、　　ＨＤＶ同一の譲受人
に壌渡された米国特許出該第６５０　、３２３号（１９
８４年４月１２日出願）をここに参照文献として採用す
る。この出願には、Ｂ型肝炎の表面抗原（ＨＢｓＡｇ）
に対するコドンを有する読取り枠中のプレサーフェイス
（ｐｒｅ−３）コーディング部分への外来免疫原の挿入
物を含んでいるＨＢｓＡｇのハイブリッド粒子の構築が
記載されている。そこに記述されているプラスミドｐＤ
ｃ１０１は、　ｐＢＲ３２２誘導体の勿Ｉ１１部位にク
ローン化されたＧＡＰＤＩＩＪ節発現カセット中に、　
ｐｒｅ−Ｓ領域の５５コドンを含む、　ｐｒｅ−５／ｌ
ｌＢｓＡｇ遺伝子の１部分を含んでいる。参照文献とし
て採用した出願には、　ｐＤｃｌｏｌのｐｒｅ−５Ｎ域
に存在する唯一のＥｃｏＲＩ部位に、ｇＤ（［タンパク
Ｄ）抗原部位のような、所望の免疫原を挿入し、ハイブ
リッドプラスミドｐＤｃ１０３を与えることが記載され
ている。同様に１本発明によれば、　ＩＩＤＶゲノムに
由来する所望のエピトープ、特に０ＲＦ５でコードされ
たエピトープが適切なＥｃｏＲＩリンカ−を用いて提供
され、そしてｐＤｃｌｏｌのＥｃｏＲ１部位中の正しい
読取り枠に挿入するか、あるいはｐＤｃ１０３ハイブリ
ッド中のｇｏコドンを置換するために用い得る。ｐＤｃ
１０３は、　ＡＴＣＣに供託されている（受託番号Ｎｏ
、　２０７２６）。

ハイブリッド粒子の免疫原は、このようにＨＢｓＡｇお
よびＨＤＶに対する融合されたコード配列を用いて調製
され、そしてＨＤＶエピトープに対する増幅された免疫
原性を提供する。

０ＲＦ５がコードしたポリペプチドに対する抗体は。

酵母株ＡＢＩＩＯ（ｐＹＡＧｊｐｌ）中で発現され２部
分的に精製された。　０１７Ｆ５がコードしたポリペプ
チドを用いて、動物に免疫性を与えることにより生産さ
れる。発現条件、および酵母０ＲＦ５産物に対する部分
的な精製方法は、前述の方法である。それにより導かれ
たポリクローナル抗体は、アフィニティークロマトグラ
フィー、すなわち親のプラスミドｐＡＢ２４の発現産物
を含んでいるアフィニティーカラムに。

この抗血清を通過させることによって、　０ＲＦ５がコ
ードしたポリペプチドに対する抗体から精製し得る。０
ＲＦ５産物に対する抗体は、その流出液中に存在するは
ずである。アフィニティーカラムの調製技術は、当該技
術分野における普通の業者に既知である。

（発明の効果） ここに開示された本発明は、以下のような産業上の用途
を有する。ＨＤＶゲノムのヌクレオチド配列に関する情
報は、　ＩＩＤＶ感染の診断に有用なヌクレオチドプロ
ーブの・設計に使用し得る；これらのプローブは、さら
に診断のキットに使用し得る。

このヌクレオチド配列の情報は、ペプチドおよび余りペ
プチドの合成にも使用し得る。これらのペプチドおよび
ポリペプチドは、以下のような用途を有する。０ＲＦ５
配列から合成されたペプチドおよびポリペプチドは、特
にＨＤＶ抗体の存在によって影響されるようなＨＤＶ感
染を診断することに有用である。なぜなら、　０ＲＦ５
がＨＤＶδ抗原を含むポリペプチドをコードするからで
ある。さらに、　０ＲＦ５配列の発現産物は、　　ＨＤ
Ｖに対するワクチンの生産。

およびポリクローナルとモノクローナルの両方のＩＩＤ
Ｖ抗体の調製に有用である。０ＲＦ５産物に対する１１
０ν抗体は、抗原自身の存在に基づ＜　ＨＤＶ抗原の診
断に使用し得る。これらの抗体は、　ＨＤＶに対する診
断キットの基礎を形成し得る。さらに、これらの抗体は
ＩＩＤＶに対するワクチンとして使用し得る。

他のＯＲＦ配列から合成されたペプチドまたはポリペプ
チドも、　ＨＤＶがコードした成分に対する抗体の生産
に使用し得る。これらの抗体は、　ＯＲＦ配列産物と同
様に、ウィルスの複製サイクル、およびウィルス成分と
の細胞内相互作用の測定に有用である。この知識は、ま
たＨＤＶに対するワクチンの商業的開発に有用である。

（発明の要約） Ｄ型肝炎ウィルスの完全なゲノムは、　１６７９塩基の
環状１本鎖ＲＮＡであることが示された。ゲノム鎖およ
び相補鎖の両方におけるいくつかの開放された読取り枠
は、タンパクを生産し得ることを示している。開放され
た読取り枠の１つ、　０ＲＦ５でコードされる産物は、
ウィルスのポリペプチド、すなわちｐ２４Ｂおよびｐ２
１Ｂとして同定され、　ＨＤＶ　５染肝臓の核δ抗原は
、これらのポリペプチドからなる。これらの産物は、　
０ＲＦＩ、　　２．　６および７でコードされる他のも
のと同様に２組換え発現系で生産される。特に、　０Ｒ
Ｆ５産物はＩＩＤＶ診断およびワクチンに有用である。

４、　°゛　　の　　　な蕾゛ 第１図は、　ＨＤＶの１本鎖ＲＮＡゲノムの図、および
その構造決定に用いられる重複するｃＤＮＡのクローン
の位置を示す。

第２図は、完全なＩＩＤＶ　ＲＮＡゲノムに対応する２
本ｔｌｃＤＮＡの完全なヌクレオチド配列を示す。

第３図は、　０ＲＦ５のＲＮＡに等価なｃＤＮＡの配列
を示す。さらに、導かれたアミノ酸配列、および他のク
ローンから決定されたヌクレオチドの異質性を示す。

第４図は、該ウィルスのヌクレオチド配列を得るのに有
用なりローンδ１の配列を示す。

第５図は、ウィルスＲＮＡへのプローブのハイブリダイ
ゼーションを示す。

第６図は、免疫反応性ＨＤＶペプチドのＥ、　ｃｏｌｉ
による生産を説明するゲルを示す。

第７図は、　ＨＤＶゲノムのＯＲＦの位置、およびその
相補鎖の位置を示す。

第８図は、Ｓ００に融合した０ＲＦＩ、　０ＲＦ２．　
ＯＲＦ６および０ＲＦ７の発現産物、および０ＲＦ５の
非融合発現産物の１１０ｖ抗血清を用いたイムノプロッ
トを示す。

第９図は、いくつかの遺伝的性質を含む、　ｐＡＢ２４
の制限地図である。

第１０図Ａは、　ＨＤＶ粒子中および感染肝Ｖ＆溶解産
物中に存在する抗原と比較して、　Ｅ、　ｃｏｌｉで発
現される非融合０ＲＦ５産物のＨＤＶ抗血清を用いたイ
ムノプロットを示す。

第１０図Ｂは、　）ＩＤＶ粒子中に存在する９２４Ｂお
よびｐ２７δと、酵母中で発現される０ＲＦ５産物との
間のＨＤＶ抗体に対する競合を表すイムノプロットを示
す。

第１０図Ｃは、　ＨＤＶ感染肝臓中に存在するｐ２４δ
およびρ２７ｓと、酵母および細菌中で発現される０Ｒ
Ｆ５産物との間のＨＤＶ抗体に対する競合を表すイムノ
プロットを示す。

第１１図は、酵母で発現される０ＲＦ５産物がＩＩＤＶ
抗体に対して肝［ＨＤＶδ抗原と競合することを示す。

間接イムノペルオキシダーゼ染色法により染色された肝
臓切片を示す。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、第２図に示されるＤ型肝炎ウィルス（ＨＤＶ）ゲノ
   ムまたはその相補体に由来する、ＨＤＶ診断薬またはワ
   クチンの生産に有用なヌクレオチド配列。 ２、開放された読取り枠（ＯＲＦ）１−１２、好ましく
   はＯＲＦ１、ＯＲＦ２、ＯＲＦ５、ＯＲＦ６、ＯＲＦ７
   、さらに好ましくはＯＲＦ５に由来する領域を包含する
   、特許請求の範囲第１項に記載のヌクレオチド配列。 ３、所望の宿主と適合可能な制御配列に作動し得るよう
   に連結し、特許請求の範囲第２項に記載の配列に由来す
   る、ＤＮＡのコード部分を包含する組換え発現系。 ４、特許請求の範囲第３項に記載の発現系で形質転換さ
   れた宿主細胞。 ５、特許請求の範囲第４項に記載の細胞により生産され
   るタンパク。 ６、特許請求の範囲第５項に記載のタンパクにより生ず
   る抗体。 ７、ＨＤＶ抗原に対する抗体を生ずる免疫原性粒子であ
   って、 アミノ酸配列が真核宿主で生産される場合、該粒子が、
   粒子を形成し得る該アミノ酸配列を有する組換えポリペ
   プチドを含有し、該ポリペプチドがＨＤＶのエピトープ
   を含む、 免疫原性粒子。 ８、生物試料中のＨＤＶの存在を検出するのに有用なオ
   リゴヌクレオチドプローブであって、 第９図に示されるＨＤＶゲノム配列またはその相補体に
   由来する、８またはそれ以上のヌクレオチドのＤＮＡ配
   列を包含する、 オリゴヌクレオチドプローブ。 ９、ＨＤＶの存在について生物試料を分析するためのキ
   ットであって、 特許請求の範囲第８項に記載のオリゴヌクレオチドプロ
   ーブ、および該分析の指示書を含む、 キット。 １０、生物試料中のＨＤＶ抗原の存在を分析するための
   キットであって、 特許請求の範囲第５項に記載のタンパクまたは特許請求
   の範囲第７項に記載の粒子に対して生じる抗体、および
   該分析の指示書を含む、 キット。 １１、生物試料中のＨＤＶ抗体の存在を分析するための
   キットであって、 特許請求の範囲第２項に記載のヌクレオチド配列内にコ
   ードされるエピトープを含むポリペプチドを含有する、 キット。 １２、ＨＤＶ感染の治療または予防のためのワクチンで
   あって、 特許請求の範囲第２項に記載のヌクレオチド配列にコー
   ドされるポリペプチドを含有する、 ワクチン。 １３、ＨＤＶ抗原内に含まれるエピトープとして免疫学
   的に同定可能なエピトープを含むタンパクを生産するた
   めの方法であって、 該方法は組換えベクターにより形質転換された宿主細胞
   を該ベクターを発現させる条件下で培養することを包含
   し、 該ベクターが第２図に示されるＨＤＶゲノムまたはその
   相補体に由来するヌクレオチド配列を含む、 方法。 １４、ＨＤＶを検出する方法であって、 第２図に示されるＨＤＶゲノムまたはその相補体に由来
   するヌクレオチド配列と生物試料をハイブリダイズさせ
   ることを包含する、 方法。 １５、ＨＤＶに対する抗体を生産するための方法であっ
   て、 該方法はＨＤＶ抗原内に含まれるエピトープとして免疫
   学的に同定可能なエピトープを含むタンパクを用いて動
   物に予防接種することを包含し、 該タンパクが第２図に示されるＨＤＶゲノムまたはその
   相補体に由来するヌクレオチド配列を含む組換えベクタ
   ーにより形質転換された宿主細胞中で合成される、 方法。