JPH0867693A - 肝炎δの診断薬およびワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 Ｄ型肝炎の診断または受動的な治療に有用な
抗体を提供すること。 【解決手段】 ポリペプチドｐ１をコードするヌクレオ
チド配列で形質転換された細胞から得られる精製ＨＤＶ
抗原性タンパク質により誘起される抗体およびその製造
方法であり、好ましくは、このポリペプチドはｐ２４δ
またはｐ２７δである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、肝炎δの感染の拡
大を制御する材料および方法論に関する。さらに特定す
ると、肝炎δウイルスに関する診断DNA断片、診断タン
パク、および防御抗原と抗体に関する。

【０００２】

【従来の技術】この出願は、1986年６月17日に提出され
「肝炎δの診断薬およびワクチン」と命名された米国出
願第 875,337号の一部継続出願である。

【０００３】肝炎ウイルスの異常型、Ｄ型肝炎（HDV)
（これは、またδ因子とも呼ばれる）は、Rizzetto,
M., ら、Gut(1977)18：997-1003により、1977年に発見
された。このウイルスは、Ｂ型肝炎に感染した患者の肝
臓細胞の免疫蛍光により、新抗原／抗体系として検出さ
れた。事実、その後の研究によれば、Ｄ型肝炎ウイルス
は、複製のためにはＢ型肝炎ウイルスとの同時感染に依
存することが示された。このヘルパー機能の性質は今の
ところ明らかでない。しかし、このHDVは、明らかに
「δ抗原」タンパクにより囲まれている１本鎖RNAゲノ
ムを含む。このタンパクはさらにＢ型肝炎表面抗原(HBs
Ag)に囲まれており、35〜37nmの粒子形態をとっている
(Rizzetto, M., et al, Proc Natl Acad Sci USA(1980)
77：6124-6128；Bonino, F., et al, Hepatology(1981)
1：127-131)。それゆえ、感染中に生成されるDNAは「ゲ
ノム」鎖および相補鎖を有するだろう。

【０００４】伝染の疫学および様式は、Ｂ型肝炎(HBV)
とHDVとで類似しているらしい。そこでは、HDVは、輸血
を通して、および体液の密接な直接接触により伝染す
る。HDV（またはδ）感染の３つの型が同定されてい
る：慢性Ｂ型への急性δの重感染、慢性Ｂ型への慢性δ
の併発、および急性δとＢ型肝炎との同時感染（Schif
f, E.R., et al, Diagnostic Medicine（1985, ３月）1
7-22)。この病気は最初は地中海海域で確認されたが、
全世界に拡がったらしい（Jacobson, I.M., et al, Hep
atology(1985)5：188-191)。この病気の人口統計学的局
面および疫学的局面の再調査は、またRizzetto, M.,
ら、J Hepatol(1985)1：187-193に見出される。

【０００５】この病気の経過はよく知られており、そし
てこのビリオンの一般的構造も理解されている。しか
し、このウイルスの遺伝子構造として利用できる情報は
以前にはなく、しかもδ抗原の性質もわかっていなかっ
た。血液試料を用いることによるこの病気の存在の検出
に利用できる唯一の分析は、ヨーロッパで市場に出てい
る免疫分析である。これは、アメリカ合衆国ではまだFD
Aの認可を受けていない。以前の検出方法は、生検標本
での肝細胞の核の直接免疫蛍光法に限られていた。本検
出方法の一つの型は、標識抗δIgGのδ抗原自体への結
合を、検査血清中の抗体が阻止する能力に基づく。他の
形態は、検査血清からの抗δIgMが固相に固定された抗
ヒトIgM（μ鎖に特異的）に結合し、次いで標準δ抗原
および標識抗δIgM を加えることにより、検査血清中の
抗δIgMの存在（追加されたδ抗原とともに）によって
標識抗δIgMの結合を可能とする能力に依存する。これ
らの検査は、いずれもδ抗原タンパクの構造またはHDV
ゲノムの構造の分析、またはそれら構造の知見を必要と
しない。

【０００６】現在、DNAハイブリダイゼーションによる
この病気の診断に有効なプローブの設計が可能であり、
また同時にワクチンとして、そして診断薬として使える
組換えタンパクの生成も可能である。さらに、組換えに
より生産されるタンパクは、診断または受動的な治療に
有用な抗体を生成するために使用可能である。

【０００７】

【課題を解決するための手段】HDV診断薬またはワクチ
ンの生産に有用な本発明のヌクレオチド配列は、図２に
示されるＤ型肝炎ウイルス(HDV)ゲノムまたはその相補
体に由来する。この配列は、開放された読取り枠(ORF)
１−12、好ましくはORF1、ORF2、ORF5、ORF6、ORF7、さ
らに好ましくはORF5に由来する領域を包含する。

【０００８】本発明の組換え発現系は、所望の宿主と適
合可能な制御配列に作動し得るように連結し上記配列に
由来する、DNAのコード部分を包含する。

【０００９】本発明は、上記発現系で形質転換された宿
主細胞を包含する。本発明はまた、上記細胞により生産
されるタンパクを包含する。本発明はまた、上記タンパ
クにより生ずる抗体を包含する。

【００１０】HDV抗原に対する抗体を生ずる本発明の免
疫原性粒子は、アミノ酸配列が真核宿主で生産される場
合、粒子を形成し得る該アミノ酸配列を有する組換えポ
リペプチドを含有し、該ポリペプチドはHDVのエピトー
プを含む。

【００１１】生物試料中のHDVの存在を検出するのに有
用な本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、図９に示
されるHDVゲノム配列またはその相補体に由来する、８
またはそれ以上のヌクレオチドのDNA配列を包含する。

【００１２】HDVの存在について生物試料を分析するた
めの本発明のキットは、上記オリゴヌクレオチドプロー
ブ、および該分析の指示書を含む。

【００１３】生物試料中のHDV抗原の存在を分析するた
めの本発明の他のキットは、上記形質転換された細胞に
より生産されるタンパクまたは上記免疫原性粒子に対し
て生じる抗体、および該分析の指示書を含む。

【００１４】生物試料中のHDV抗体の存在を分析するた
めの本発明の他のキットは、上記ヌクレオチド配列内に
コードされるエピトープを含むポリペプチドを含有す
る。

【００１５】HDV感染の治療または予防のための本発明
のワクチンは、上記ヌクレオチド配列にコードされるポ
リペプチドを含有する。

【００１６】HDV抗原内に含まれるエピトープとして免
疫学的に同定可能なエピトープを含むタンパクを生産す
るための本発明の方法は、組換えベクターにより形質転
換された宿主細胞を該ベクターを発現させる条件下で培
養することを包含し、該ベクターは、図２に示されるHD
Vゲノムまたはその相補体に由来するヌクレオチド配列
を含む。

【００１７】HDVを検出する本発明の方法は、図２に示
すHDVゲノムまたはその相補体に由来するヌクレオチド
配列と生物試料とのハイブリダイズさせることを包含す
る。

【００１８】HDVに対する抗体を生産するための本発明
の方法は、HDV抗原内に含まれるエピトープとして免疫
学的に同定可能なエピトープを含むタンパクを用いて動
物に予防接種することを包含し、該タンパクは、図２に
示されるHDVゲノムまたはその相補体に由来するヌクレ
オチド配列を含む組換えベクターにより形質転換された
宿主細胞中で合成される。

【００１９】本発明は、完全なHDVゲノム配列のcDNA複
製物の群を提供する。これらのcDNA配列の一部は、臨床
試料中のウイルスの存在を診断するためのプローブとし
て、およびこのウイルスの天然で生ずる変種を単離する
ためのプローブとして有用である。この基本的なゲノム
配列（およびその相補体）を知ることは、また開放され
た読取り枠の１つにコードされるδ抗原のポリペプチド
配列を使用可能とし、これらペプチドまたはその一部
（これらは標準物または診断検査薬として、そしてワク
チンの成分として有用である）の生産を可能にする。同
様に、いずれかの鎖の他の開放された読取り枠の分析に
より、他のウイルスペプチド配列の推定が可能となる。
このペプチド配列は、HDVの特徴であり、そして同様に
有用であろう。保護抗体もまた、組換えで生産されるタ
ンパクからつくられ、そしてポリクローナル型またはモ
ノクローナル型で得られる。

【００２０】それゆえ、完全なHDV配列の有用性によ
り、ワクチンまたは診断薬のいずれかとして役立つポリ
ペプチド、またはこの病気に対する受動的免疫治療薬に
有用なモノクローナル抗体（Mab)調製物を生産する際の
中間体として役立つポリペプチド、または診断薬として
有用な抗体生産の中間体として役立つポリペプチドの設
計および構築が可能となる。治療成分または阻止成分の
設計者の随意になる完全なゲノム配列がなければ、最も
効果的な産物の望ましい生産は不可能であろう。

【００２１】従って、ある局面では、本発明はHDV診断
薬およびワクチンの生産に有用なヌクレオチド配列に関
する。この診断薬およびワクチンは、図２に示されるよ
うなHDVゲノムまたはその相補体に由来する。それゆ
え、本発明は、診断薬としてまたはワクチンとして役立
つペプチドの生産のために、これらペプチド自体に対す
るオリゴマープローブとして、および病気の診断と治療
に有用なポリクローナルおよびモノクローナル抗体に対
するオリゴマープローブとして、この配列またはその一
部の利用に関する。

【００２２】本発明の他の局面には発現系が包含され
る。この発現系は、所望タンパク（これは完全なゲノム
に由来の配列によってコードされている）の生産を生じ
得る。この発現系は、系またはその一部に含まれる組換
えベクター、このようなベクターで形質転換された組換
え宿主細胞、この形質転換細胞により生産されるタンパ
ク、およびこのようなタンパクから調製されるワクチン
に対する発現系である。さらに、本発明は、このゲノム
によりコードされるエピトープを表す特異的ペプチド配
列、および標識タンパクまたは担体タンパクに共有結合
で連結されたこのような配列に関する。より一般的な担
体に加えて、担体タンパクには、Ｂ型肝炎感染と関係の
ある22nm粒子が含まれる。この粒子はポリアルブミン
リセプター部位を有し、そして非集合サブユニット成分
の1000倍の免疫力がある。抗原性HDV決定基を22nm HBsA
g粒子に挿入することにより、これらのエピトープに対
する免疫原性を増大させ得る。

【００２３】本発明はまた、これら所望のポリペプチド
ワクチンおよび免疫グロブリンの調製方法およびプロー
ブ、ポリペプチド、および／または免疫グロブリンを含
む分析キットに関する。

【００２４】

【発明の実施の形態】

（Ａ．定義）ここで用いられるように、HDVゲノムまた
はcDNA「に由来する（から誘導される）」ヌクレオチド
配列とは、例示されるポリヌクレオチドの本質的な特性
を保持している配列を示す。このヌクレオチド配列は、
意図する目的に合うように、それが由来する全配列の一
部を表す。このような誘導体の特定の例（しかしこれに
限定されない）は、同一または実質的に同一のアミノ酸
配列をコードするが、しかし、コドンの縮重のために、
異なった特定のコドンを用いる配列により、示されるだ
ろう。別の例には相補鎖がある。診断試験で有用なプロ
ーブまたはオリゴヌクレオチドは、示された配列と相補
性を保つ必要がある。しかし、このプローブまたはオリ
ゴヌクレオチドは、全配列よりも短くてもよく、または
部分的にとんでいてもよい。しかし、操作または発現に
用いる場合、制限部位を作るもしくは欠失させる、プロ
セッシング部位を与える、あるいはコードされているア
ミノ酸配列を（機能性に悪い影響を与えない方法で）変
えるように、ヌクレオチドを変えることが望まれる。
「ヌクレオチド配列」とは、リボヌクレオチド配列およ
びデオキシリボヌクレオチド配列の両方を表し、そして
ゲノム鎖およびその相補鎖の両方を含む。

【００２５】従って、HDVのゲノムを含むヌクレオチド
配列に「由来する」DNAとは、ゲノムヌクレオチド配列
の領域（あるいはその相補体）中の配列に相当する配列
を含むDNA配列をいう。あるいは、このDNAは、それの意
図する使用に適合するように、当該分野で公知の方法で
修飾されたこの配列領域の組み合わせを含むDNA配列を
いう。もちろん、これらのDNAは、その遺伝子の塩基配
列からは必ずしも物理的に誘導されない。しかし、これ
らのDNAは、そのポリヌクレオチドが誘導される領域中
の塩基配列から与えられる情報に基づき、あらゆる様式
で生じるポリヌクレオチドのことをいう。例えば、典型
的なDNA配列が「誘導され」得る領域には、特定のエピ
トープをコードする領域、およびδ抗原の一部分をコー
ドする領域が含まれる。同様に、δ抗原に「由来する」
ペプチドは、これらのポリペプチドまたはそれらの一部
と実質的に同一のアミノ酸配列をいう。上記ペプチド
は、その部分と同じ生物学的特性を有する。このような
「誘導された」ペプチドの合成方法は重要ではない。例
えば、その方法は化学合成であり得、もしくは組換え方
法であり得る。

【００２６】「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細
胞」、「細胞系」、「細胞培養物」、および単細胞体と
して培養される微生物または高等な真核生物細胞を示す
ような他の用語は, 互換的に用いられ、組換えベクター
または他のトランスファーDNAの受容体として用いられ
得るか、あるいは用いられてきた細胞を示す。この細胞
は、トランスフェクトされたもとの細胞の子孫細胞を含
む。単一の親細胞の子孫細胞は、もとの親とは、形態
上、またはゲノムもしくは全DNAにおいて、必ずしも完
全に同一とはなり得ないことがわかった。これは偶然ま
たは故意の変異が原因となる。所望のペプチドをコード
するヌクレオチド配列の存在のような関連した特性によ
り特徴づけられた親細胞と、十分類似しているこの親細
胞の子孫細胞は、この定義により意図される子孫細胞に
含まれ、そして上の用語に包含される。

【００２７】「制御配列」とは、連結されているコード
配列の発現を生じさせるのに必要なDNA配列を示す。こ
のような制御配列の性質は宿主生物によって異なる。原
核生物では、一般にこのような制御配列は、プロモータ
ーおよびリボゾーム結合部位を含む。真核生物では、一
般に、このような制御配列は、プロモーター、ターミネ
ーターを含み、またある場合には、エンハンサーをも含
む。「制御配列」という用語は、最低限その存在が発現
に必要である全ての成分を含むことを意図している。そ
して、それが存在することが有利であるという付加的な
成分を含んでいてもよい。

【００２８】「動作可能に連結された」とは、記述の成
分が、意図された様式にてそれらを機能させるのを許容
する関係にある近位状態をいう。コード配列に、「動作
可能に連結された」制御配列は、このコード配列の発現
が、制御配列に適合可能な状態で達成されるようにして
結合されていることをいう。

【００２９】「開放された読取り枠」とは、ポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチド配列の領域である。

【００３０】「〜と／〜として、免疫学に同一である」
とは、非天然型のタンパク、すなわち人工的に合成され
たタンパク、または組換えタンパク中に、エピトープが
存在することを意味する。このようなタンパクは、この
HDVウイルスタンパク中にも存在する。これらのエピト
ープは、このHDVタンパクに対して生じる抗体との免疫
的反応性により同定され得る。非天然型タンパク中での
それらの存在は、このHDV抗体との直接的な反応、およ
び非天然型タンパクとHDVタンパクとの競合分析（これ
は、HDVタンパクに対する抗体の分析である）により、
検出され得る。抗体結合の検出方法、および結合の際の
競合の決定方法は、当該分野で標準的な技術者に公知で
あり、それらはまた以下に例示される。

【００３１】（Ｂ．一般的記述）本発明の有用な材料お
よび方法は、その各々がＤ型肝炎ウイルスの完全なゲノ
ムを含む、一群のヌクレオチド配列を与えることによ
り、実現される。この一群のポリヌクレオチドを利用す
ることにより、まず第１に、わずかな異質性を有する、
このゲノム群の他のゲノムを単離し得る。第２に、診断
に有用なDNAおよびタンパクの構築を可能にする。このD
NA 、すなわち約８〜10bpあるいはそれ以上のオリゴマ
ーに関しては、病気診断の際のハイブリダイゼーション
プローブとして有用である。このようなプローブは、例
えば、ウイルスを保持すると思われる被検体の血清中に
て、ウイルスゲノムの存在を検出するのに用いられ得
る。このHDV 配列はまた、HDV-特異的ポリペプチドの設
計および生産を可能にする。このポリペプチドは、血清
または血液中で、HDVに起因する抗体の存在を調べる診
断薬として有用である。これらのポリペプチドに対して
生じた抗体はまた、診断薬として有用である（δ抗原に
対する開放読取り枠に加えた開放読取り枠が、完全なゲ
ノムあるいはその相補体中で解読され得るので、δ抗原
自身の他に、HDV関連タンパクの一次構造が推論され得
る。これらはまた、ウイルスに特有なマーカーペプチド
となり得、診断にも有用であり、おそらく免疫化にも有
用であろう）。最後に、この遺伝子配列の知見はまた、
HDVに対し効果的なワクチンの設計および生産を可能に
し、そして、感染を防御する抗体の生産をも可能にす
る。

【００３２】ゲノムから入手し得る配列情報は、δ抗原
または他のポリペプチドのアミノ酸配列の推論を可能と
し、そして、適したエピトープが同定させる。この完全
なδ抗原または、その適当な部分が、関連したDNA断片
（独立して得られかつ発現される）により生産され得、
それゆえ組換え技術に用いられる所望のポリペプチドが
供給される。原核生物宿主および真核生物宿主の両方
が、このような発現には有用である。短いポリペプチド
断片は、また化学的に合成され得、ワクチンとして用い
るべく、担体タンパクに連結される。さらに、このエピ
トープは、免疫原性を与えるタンパクに連結されて生産
され得る。このように生産されたタンパクは、それ自
体、ワクチンとして用いられ得、または宿主中で免疫応
答Ｂ細胞を生産するべく用いられる。次いで、このＢ細
胞は、受身免疫療法に有用な抗体を分泌するハイブリド
ーマを生産するために用いられ得る。

【００３３】（Ｂ．１．HDV遺伝子配列の調製）HDVが接
種され、高力価のウイルス（１ml当り、約1011のチンパ
ンジー感染量）を含むチンパンジーの血清が、ウイルス
源として用いられた。集められたウイルスから抽出され
た核酸は、変性ゲル電気泳動により分析したところ、常
に約1700ヌクレオチドを含む二本鎖RNAであった。このR
NAを鋳型として用いて、この二本鎖RNAに特異的にハイ
ブリダイズする、約164bpのcDNAクローン（pKD3）が得
られた。そしてそのDNA配列が決定された（Denniston,
K.J., et al, Science (1986) 232 : 873-975)。この決
定されたDNA配列（公表に先立って提供された）に基づ
いて、２つの相補的な合成オリゴマー（その１つはこの
二本鎖RNAとハイブリダイズする）が調製された。

【００３４】このハイブリダイズするオリゴマーは、次
いで、二本鎖RNAから、岡山／バーグ法によって調製さ
れたcDNAライブラリーのプローブに用いられた。その結
果、570bpの挿入断片を含むクローンδ１が得られ、こ
れはこの二本鎖RNAとハイブリダイズし、また同じライ
ブラリーから、重複しているクローンδ２を得るための
プローブとして用いられた。

【００３５】さらに、クローンδ４およびδ115は、単
離されたRNAのランダムプライミングを用いるpBR322に
調製されたcDNAライブラリーをδ１クローンとともに検
索することにより、得られた。次いで、δ115は、重複
しているクローンδ7a、δ3bおよびδ7bを得るために、
プローブとして用いられた。δ１およびδ２とともに、
独立のクローンδ3b、δ４、δ7a、δ7bおよびδ115に
より、図１において図示された環状一本鎖の1679ヌクレ
オチドRNAの完全な配列が供給された。

【００３６】この完全なHDVゲノムの検索法についての
記述は、もちろん、大部分は歴史的に興味深いことであ
る。得られる配列（またそれゆえに、その相補体も）が
ここで提供され、そして完全な配列、または、そのいず
れかの部分であっても、合成法を用い、あるいは合成法
と、ここで記述の方法に類似の方法を用いる部分的配列
の検索とを組み合わせることにより、調製され得る。

【００３７】（Ｂ．２．ウイルスポリペプチドおよびそ
の断片の調製）完全なゲノム配列は、δ抗原、およびゲ
ノムまたはその相補体によりコードされる他のウイルス
ポリペプチドの、抗原的に活性な領域をコードする発現
ベクターの構築を可能にするという有用性がある。所望
のタンパクをコードする断片は、従来の制限分解処理を
用いて、そのcDNAクローンから得られるか、または合成
法により得られる。これらの断片は、例えば、β−ガラ
クトシダーゼやスーパーオキシドデスムターゼ(SOD）、
好ましくはSOD、のような融合配列の一部を含むベクタ
ーに連結される。いずれかのセンス鎖において、開放読
取り枠を含むHDVゲノムの所望部分は、成熟タンパクま
たは融合タンパクのような組換えタンパクとして得られ
るか、または化学合成法や一般的な組換え法によって提
供され得る。

【００３８】所望のポリペプチド（それが融合型または
成熟型のいずれであっても、また分泌を可能にするシグ
ナル配列を含んでいるいないにかかわらず）をコードす
るDNAは、都合のよい宿主に対し適当な発現ベクターに
連結され得る。真核細胞宿主系および原核細胞宿主系の
両方が、現在、組換えポリペプチドを形成する際に用い
られる。より一般的な制御系のいくつかの要約、および
宿主細胞系を、以下のC.1.項に示す。次いで、このポリ
ペプチドは、溶菌細胞や培地から精製され、その意図し
た用途に必要な程度にまで精製される。このようなペプ
チドは診断に用いられ得、ワクチンに処方され得る。こ
れらのポリペプチドに対して生ずる抗体もまた、診断に
用いられ得る。

【００３９】このゲノムの分析により、多くの開放読取
り枠(ORF)の存在が明らかになり、それらのうちの少な
くとも１つであるORF5は、このδ抗原をコードしてい
る。他のものは、まだ未知のウイルスポリペプチドをコ
ードし得る。ATG開始コドンで始まる少なくとも約150ヌ
クレオチドを含むこのようないくつかの枠が同定され
た。別の読取り枠は、より長い開かれた配列とともに存
在するが、ATG開始コドンは有しない。このゲノムと同
じ意味を有するcDNA鎖中およびアンチゲノム鎖中の両方
にて、この読取り枠が見出された。

【００４０】このアミノ末端に近いメチオニンを含むポ
リペプチドをコードする５つの大きなORFは、微生物内
で発現された。このアンチゲノムORF5にコードされるポ
リペプチドだけが、肝炎ウイルスδに感染した患者から
得られた抗血清と交差反応した。ウイルス抽出物、およ
び組換えORFポリペプチド（これは細菌や酵母内で合成
された）を用いる免疫的分析に基づいて、ORF5は、δ肝
炎ウイルスポリペプチドのp27δおよび p24δの両方に
分かれている抗原性エピトープをコードし、そして、お
そらくp27δおよびp24δに対する完全な構造遺伝子を表
す。ここで記述の免疫競合研究に基づいて、この核の肝
炎δ抗原は、p27δおよびp24δの両方から構成される。

【００４１】クローン115、７ａ、１, 4, 2, ７ｂ、お
よび３ｂのcDNAヌクレオチド配列の比較により、重複し
ている配列（表２参照）中の異種性の程度は小さいこと
が示された。ウイルスを含むRNA中では、ヌクレオチド
配列の異種性は珍しくない（Holland, J., et al(1982)
Science 215：1577）。特に、ORF5の608番目での配列の
異種性は、p27δとp24δとの間の差異に基づく。すなわ
ち、２つのポリペプチドの大きさは、 p27δのＣ末端部
分での付加的なアミノ酸に起因し得る。もしその部分が
Ｇで占められるなら、それを含むトリプレットがトリプ
トファンをコードし、そして転写は、664番目から始ま
るオパール終止コドンまでつづく（図３参照）。他方、
もし608番目がＡであれば、それを含むトリプレット
が、アンバー終止コドンをコードする。そして、最後の
細胞がアンバーコドンを停止し、それにより、オパール
コドンまで転写を継続するような能力がないと、この点
で転写が停止する。

【００４２】（Ｂ．３．抗原性ポリペプチドの調製およ
びキャリアとの結合）ペプチドの抗原領域は、一般に、
比較的小さく、典型的には10アミノ酸またはそれ以下の
長さである。５アミノ酸ほどの断片が、典型的には、抗
原領域を特徴づける。これらの分節は、δ抗原の領域、
または付加的にコードされたマーカーポリペプチドの領
域に相当し得る。従って、HDVのゲノムを基準に用い
て、ペプチドの短い分節をコードするDNAは、融合タン
パクとしてまたは単離されたペプチドとしてのいずれか
で組換え的に発現され得る。さらに、短いアミノ酸配列
は、簡単に化学合成され得る。この合成されたペプチド
が、正しいエピトープを供給するために正確に配列する
場合であって、しかし、小さすぎて免疫原性を示さない
場合には、このペプチドは適当な担体に連結され得る。

【００４３】このような連結を得るための多くの技術
が、当該技術分野で公知であり、それらには、以下の物
質を用いるジスルフィド結合の形成が包含される。この
物質には、Ｎ−スクシニミジル−３−（２−ピリジル−
チオ）プロピオネート（SPDP）およびスクシニミジル−
４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カ
ルボキシレート（SMCC）がある（これは、Pierce Compa
ny, Rockford, Illinoisから得られた）。（もし、この
ペプチドが、スルフヒドリル基を欠いているなら、シス
テイン残基を加えることにより、これが得られる。）こ
れらの薬剤は、それ自体と、あるタンパク上のペプチド
システイン残基との間、およびリジン上のε−アミノ基
または他のアミノ酸の他の遊離アミノ基によるアミド結
合との間に、ジスルフィド結合を生じさせる。このよう
な種々のジスルフィド／アミド形成試薬が知られてい
る。例えば、Immun Rev (1982)62：185を参照。他の二
官能性カップリング剤は、ジスルフィド結合よりもむし
ろチオエーテル結合を形成する。これらのチオエーテル
結合の形成試薬の多くは、市販されており、６−マレイ
ミドカプロン酸、２−ブロモ酢酸、２−ヨード酢酸、４
−（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロヘキサン−１−カ
ルボン酸などから得られる反応性エステルが含まれる。
このカルボキシル基は、それらと、スクシンイミドまた
は１−ヒドロキシ−２−ニトロ−４−スルホン酸ナトリ
ウム塩とを組み合わせることにより、活性化され得る。
前記のリストは、全てを網羅する意味ではなく、挙げら
れた化合物の変性体も明らかに使用可能である。

【００４４】それ自体が、宿主に有害な抗体の生産を誘
導しない担体、例えば、種々の血清アルブミン、テタヌ
ストキソイド、またはキーホールリンピットヘモシアニ
ン(KLH）のような担体が用いられ得る。

【００４５】この結合物によれば、適当な被験体に結合
物を接種したとき、結合物にだけではなく、その配列と
類似の部分をもつ融合タンパクに対し、そして全HDV内
の適当な決定因子に対して、特異的に反応する免疫グロ
ブリンを含む抗血清の生産が得られる。

【００４６】（Ｂ．４．HDVエピトープを含むハイブリ
ッド粒子）免疫原の調製HDVのエピトープの免疫原性も
また、哺乳類系または酵母系にてＢ型肝炎表面抗原と関
連するタンパクのような粒子形成タンパクと融合させた
エピトープを調製することにより、高められ得る。この
HDVエピトープが、粒子形成タンパクをコードする配列
と直接連結される構築物は、このHDVエピトープに関し
て免疫原性のあるハイブリッドを生産する。さらに、調
製された全ベクターには、例えば、プレ−Ｓペプチドの
ような、種々の程度の免疫原性を有するＢ型肝炎ウイル
ス(HBV）に特異的なエピトープを包含する。それゆえ、
HDV 配列を含む粒子形成タンパクから構築された粒子
は、HDVおよびHBVの両方に関して、免疫性がある。

【００４７】肝炎表面抗原(HBsAg) は、例えば、哺乳類
細胞内（Valenzuela, P., et al,Hepatitis B(1984), M
illman, I., et al, ed, Plenum Press, pp. 225-236)
だけでなくサッカロマイセス・セレビシエ（S. cerevis
iae)中で形成され集められ得ることが示されている（Va
lenzuela, P,. et al,Nature (1982）298：344-350)。
このような粒子の形成は、単量体サブユニットの免疫原
性を高めることが示されている。この構築物もまた、プ
レ表面（プレ−Ｓ）領域の55アミノ酸を含む HBsAgの免
疫的に優性なエピトープを包含し得る（Neurath et al,
Science (1984)224：392-394）。酵母中で発現可能なプ
レ−Ｓ−HBsAg粒子の構築物は、米国出願第621,756号
（1984年６月18日出願）において開示されている。酵母
発現用の異種ウイルス配列を含むハイブリッドは、米国
出願第 650,323号（1984年９月13日出願）において開示
されている。両方の出願は、ここでは、譲渡人に譲渡さ
れ、その内容はここに示されている。これらの構築物
は、SV40ジヒドロホレートリダクターゼベクターを用い
るチャニーズハムスター卵巣細胞のような哺乳類細胞中
でも発現され得る（Michelle et al, Int Symp on Vira
l Hepatitis (1984))。

【００４８】さらに、この粒子形成タンパクをコードす
る配列自体の一部分は、HDV エピトープのコドンと置き
換えられ得る。この置換において、酵母または哺乳類中
で、小単位の集合体を媒介して免疫原性の粒子を形成す
るのに必要でない領域は、削除され得、それゆえ、この
HDVエピトープとの拮抗により、付加的なＢ型肝炎抗原
部位が除去される。

【００４９】（Ｂ．５．ワクチンの調製）活性成分とし
てのペプチド配列を含むワクチンの調製もまた、当該技
術分野でよく知られている。典型的には、溶液または懸
濁液のいずれかとして注射可能なワクチンが調製され
る。注射の前に液体に溶解させ、または懸濁させるのに
適当な固形物も調製され得る。この調製物は、乳化され
てもよく、またはリポソーム中にカプセル化されたタン
パクであってもよい。この活性免疫原成分は、活性成分
と和合可能であり、かつ薬学的に受容可能な賦形剤とし
ばしば混合される。適当な賦形剤には、例えば、水、生
理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノー
ル、または、それらの類似物およびその組み合わせがあ
る。さらに、もし望むなら、このワクチンは、湿潤剤ま
たは乳化剤、pH緩衝剤または、ワクチンの効果を高める
アジュバントのような、補助剤を少量で含有してもよ
い。このワクチンは、（例えば、皮下または筋肉内のい
ずれかの）注射によって、非経口的にうまく投与され
る。投与の他の様式に適する付加的な処方には、坐剤お
よび、ある場合には、経口処方が包含される。坐剤のた
めの伝統的な結合剤および担体には、例えば、ポリアル
カリグリコールまたはトリグリセリドが包含され得る。
このような坐剤は、活性成分を0.5％〜10％、好ましく
は１％〜２％の範囲で含有する混合物から形成され得
る。経口処方には、例えば、マンニトール、ラクトー
ス、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリン
セルロースナトリウム、炭酸マグネシウムおよびその類
似物の薬学的な等級のような通常使用される賦形剤が包
含される。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸
薬、カプセル、持続放出処方、または粉末の形態をと
り、10％〜95％（好ましくは25％〜70％）の活性成分を
含む。

【００５０】このタンパクは、中性または塩の形でワク
チンに処方され得る。薬学的に受容可能な塩には、酸付
加塩（このペプチドの遊離のアミノ基とともに形成され
る）が包含される。それらの塩は、例えば、塩酸または
リン酸のような無機酸；酢酸、シュウ酸、酒石酸、マン
デル酸などのような有機酸と形成される。この遊離のカ
ルボキシル基と形成される塩は、また、例えば、水酸化
ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水
酸化カルシウム、または水酸化第二鉄のような無機塩
基；およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２
−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインな
どのような有機塩基から誘導される。

【００５１】このワクチンは、用量処方に合致した方法
で投与され、治療上効果的でかつ免疫原性となるような
量で投与される。投与され得る量は、治療され得る患
者、その患者の抗体を合成する免疫系の許容量、および
所望の保護の程度に依存する。投与に必要な活性成分の
正確な量は、実行者の判断に依存し、各患者に特有であ
る。δ感染は、Ｂ型肝炎の感染に依存するので、抗δワ
クチンが特に有用な亜群はＢ型肝炎保有者群であること
に注目されるべきである。Ｂ抗原およびＤ抗原の両方を
含む「二重の」ワクチンを構築することも有益かもしれ
ない。

【００５２】ORF5内にコードされたポリペプチド（およ
びそれに由来のペプチド）は、ORF5がHDV粒子の中心側
の抗原をコードするという事実にもかかわらず、HDV感
染に対する防御に特に適したワクチン組成物である。組
換えにより生産されるHBVの中心部の抗原を含むワクチ
ンは、Ｂ型肝炎の感染に対する防御またはＢ型肝炎の感
染を緩和するのに効果的である（Murray, K., et al, E
MBO J(1984)3：645）。

【００５３】（Ｂ．６．HDVエピトープに対する抗体の
調製）上記のように調製された免疫原タンパクは、哺乳
類を免疫にするのに用いられる。得られる抗血清は、診
断試薬として有用である。これらの動物からのリンパ球
または脾臓細胞も、これらのエピトープに対して生じる
モノクローナル抗体を分泌し得るハイブリドーマであっ
て、感染ウイルスに対し交差反応するハイブリドーマを
調製するために用いられ得る。得られるモノクローナル
抗体は、診断に特に有用であり、そして中和しているモ
ノクローナル抗体は、受動免疫治療に有用である。

【００５４】ORF5内にコードされるポリペプチド、およ
びこれらのペプチドに対する抗体は、HDVの免疫診断に
特に有用である。以下に論じるように、ORF5はこのδ抗
原をコードし、このδ抗原は、明らかに２つのウイルス
ポリペプチド、p24δおよびp27δを含有する。

【００５５】（Ｂ．７．診断用オリゴヌクレオチドプロ
ーブおよびキット）開示されているHDVゲノム群を基礎
として用い、およそ８bpまたはそれ以上のオリゴマー
が、切り出しまたは合成により調製され得る。そして、
このオリゴマーは、各病人中のウイルスの検出に有用で
ある。８bpは、使用可能な長さであるものの、10〜12bp
の配列が好ましく、約20bpが最適である。好ましくは、
これらの配列は、異質性のない領域に由来する。これら
のプローブは、自動化オリゴヌクレオチド合成法を含
む、常法により調製され得る。有用なプローブの中に
は、例えば、クローンδ１、後に記すcDNAライブラリー
を検索する際に有用な種々のオリゴマー、およびここで
開示された付加的なクローンがある。ORF5の断片を含む
クローンは特に有用である。このゲノムまたはその相補
鎖のいずれの部分も十分適当であろう。プローブとして
用いるには、完全な相補性が望まれる。しかし、断片の
長さが増すことは必要ではないかも知れない。

【００５６】このようなプローブを診断に用いるには、
もし必要なら、血液または血清のような分析すべき生体
試料が、そこに含まれる核酸を抽出するために、処理さ
れる。得られた核酸は、ゲル電気泳動または他のサイズ
分画法、またはサイズ分画なしの簡単なドットブロット
にかけられる。次いで、例えば、ニックトランスレーシ
ョンまたはリン酸化を用いて、このプローブが標識化さ
れる。抽出された核酸は、次いで、適当なハイブリダイ
ゼーション条件下にて、標識されたプローブを用いて処
理される。

【００５７】このプローブは、ウイルスRNAと完全に相
補的に作製され得るので、間違った陽性反応を防ぐため
に、厳しい条件が望まれる。しかし、厳しい条件は、プ
ローブが異質性のないウイルスゲノムの領域に相補的な
場合にのみ、使用されるべきである。ハイブリダイゼー
ションの厳格さは、要因数によって決定される。この要
因には、温度、イオン強度、ハイブリダイゼーションに
かける時間の長さおよび洗浄時間の長さ、およびホルム
アミド濃度が含まれる。これらの要因は、例えば、Mani
atis, T., ら、分子クローニング：実験室マニュアル(1
982)、コールドスプリング ハーバー プレス、コール
ド スプリング ハーバー、ニューヨークに概説されて
いる。条件の厳しさを増すことは、例えば、温度を上げ
る、反応時間を短縮する、そしてイオン強度を調節する
ことにより、達成され得る。

【００５８】このプローブは、診断キットにパッケージ
ングされ得る。このキットには、標識化されたDNA、適
当にパッケージングされた付加的試薬、および指定のプ
ロトコールに必要な材料、および検定を行うための器具
が含まれる。

【００５９】（Ｂ．８．免疫検定診断キット）HDV抗体
を含む血清と免疫学的に反応するポリペプチド（例えば
ORF5にコードされるポリペプチド）、およびこれらのポ
リペプチドに対し生じる抗体の両方が、血液サンプルま
たは血清サンプル中でのHDV抗体の存在を検定するた
め、または場合しだいでウイルスの存在を検定するた
め、に設計された診断キットの構成物として、有用であ
る。この免疫検定の設計は、多くの変更がなされ、例え
ば、個体担体上での競争反応または直接反応、または免
疫沈降に基づく数種のプロトコールが利用可能である。
ほとんどの検定には、標識された抗体の使用、または標
識として蛍光分子、放射活性分子または色素分子を含む
ポリペプチドの使用が含まれる。酵素で標識されかつ媒
介される免疫検定もまた、通常用いられる。従って、こ
のようなプロトコールでの使用に適し、そして標識され
た適当な試薬を含むキットは、適当な材料のパッケージ
ングにより、構成される。このキットには、検定を行う
ための残る必要条件、および検定を行うための器具の適
当なセットとともに、適当な容器中にある本発明の抗体
またはポリペプチドが包含される。

【００６０】（Ｃ．一般的方法）ウイルスからのRNAの
抽出、cDNAライブラリーの調製および検索、クローンの
塩基配列決定、発現ベクターの構築、細胞の形質転換な
どに用いられる一般的技術は、当該技術分野で公知であ
り、そしてこれらの方法を記述した実験室手引きが利用
可能である。しかし、一般的指導書として、以下に述べ
る情報がこのような方法およびその実行に有用な材料に
ついて現在利用可能である。

【００６１】（Ｃ．１．宿主および発現制御配列）用い
た適当な制御配列が、指定された宿主に適合可能である
場合、原核生物および真核生物の宿主細胞は、所望のコ
ード配列の発現に使用し得る。原核生物宿主のうち、E.
coliは、最もよく用いられ、たいてい便利である。原核
生物の発現制御配列は、プロモーター（これは、必要に
応じてオペレーター部分を含む）とリボゾーム結合部位
を含む。原核生物の宿主と適合可能な転移ベクターは、
通常、例えばアンピシリン耐性およびテトラサイクリン
耐性を付与するオペロンを含むプラスミドpBR322、およ
び抗生物質耐性を付与する配列を含む種々のpUCベクタ
ーに由来する。前述のオペロンは、選択によって、成功
した形質転換体を得るためのマーカーとして用いられ得
る。通常用いられる原核生物制御配列には、βラクタマ
ーゼ系（ペニシリナーゼ）やラクトースプロモーター系
（Chang, et al, Nature(1977)198：1056）、トリプト
ファン(trp）プロモーター系（Goeddel,et al, Nuclei
c Acids Res(1980)8：4057)、λ由来のPLプロモーター
およびＮ遺伝子リボゾーム結合部位（Shimatake et al,
Nature(1981)292：128)、trpとlac UV5プロモーターの
配列由来のハイブリッドtacプロモーター（De Boer et
al, Proc Natl AcadSci(USA)(1983)80：21-25)が含まれ
る。前述の系は、特にE.coliと適合可能である；もし望
むなら、バチルス株やシュードモナス株のような他の原
核生物宿主が、対応する制御配列とともに用いられ得
る。

【００６２】真核生物の宿主には酵母および哺乳類培養
細胞が含まれる。サッカロミセスセレビシエ、またはパ
ン酵母やサッロミセス カールスベルゲンシスは、便利
なので最もよく用いられる酵母宿主である。酵母適合性
ベクターは、原栄養株を栄養要求性変異株に与えること
や野性株に抗生物質耐性または重金属耐性を付与するこ
とにより、成功した形質転換体を選択可能なマーカーを
運搬する。酵母適合性ベクターは、２μm の複製起源
（Broach, J., et al, Meth Enz(1983)101：307)、CEN3
およびARS1の結合物、または複製を保証する他の手段を
用い得る。この手段は、例えば宿主細胞ゲノムに適当な
断片を挿入させる配列である。酵母ベクターの制御配列
には、解糖系酵素の合成のためのプロモーター（Hess e
t al, JAdv Enzyme Reg（1968)7：149, Holland et al,
Biochemistry(1978)17：4900)、および３−ホスホグリ
セレートキナゼ（Hitzeman et al, J Biol Chem(1980)2
55：2073)のプロモーターが含まれる。酵母で発現させ
るためには、ターミネーターは、エラノーゼ遺伝子（Ho
lland, M. J., J Bio Chem(1981）256：1385）に由来の
ターミネーターも含み得る。特に有用な制御系には、こ
こで特別に記述の系が含まれる。この系は、グリセルア
ルデハイド−３−ホスフェート デヒドロゲナーゼ(GAP
DH）プロモーターまたはアルコール デヒドロゲナーゼ
(ADH）制御プロモーター、GAPDHに由来のターミネータ
ー、およびもし分泌が必要ならば、酵母α因子からのリ
ーダー配列、を含有する。これらの系は、米国特許出願
第 468,589号（1983年２月22日出願）および第 522,909
号（1983年８月12日出願）に詳細に記述され、両方とも
ここの譲渡人に譲渡され、そして参照文献としてここに
採用する。

【００６３】発現のための宿主として利用可能な哺乳類
細胞系は、アメリカンタイプカルチャーコレクション
（ATCC）から入手可能であり、HeLa細胞、チャイニーズ
ハムスターの卵巣(CHO）細胞、ベビーハムスター腎(BH
K）細胞、および多くの他の細胞系を含む。哺乳類細胞
に適したプロモーターは、特にシミアンウイルス40（SV
40）（Fiers, et al, Nature(1978)273：113)に由来の
プロモーターのようなウイルスプロモーター、またはラ
ウス肉腫ウイルス(RSV）、アデノウイルス、ウシ乳頭腫
ウイルス(BPV）のような他のウイルスプロモーターがあ
る。哺乳類の細胞には、またターミネーター配列が必要
である。哺乳類細胞での複製に適したベクターは、ウイ
ルスのレプリコン、または適当な配列を宿主ゲノム中に
導入させる配列を包含し得る。

【００６４】（Ｃ．２．形質転換）用いられる形質転換
の方法は、形質転換されるべき宿主に依存する。バクテ
リアの形質転換には、一般に、塩化カルシウムまたは塩
化ルビジウムによる処理が用いられる（Cohen, S. N.,
Proc Natl Acad Sci(USA)(1972)69：2110, Maniatis et
al, 分子クローニング：実験室マニュアル(1982)コー
ルドスプリングハーバープレス、ページ254) 。酵母の
形質転換は、Hinnenら、Proc Natl Acad Sci(1978)75：
1929-1923の方法を用いて実施し得る。哺乳類の形質転
換は、Graham and van der Eb, Virology(1978)52：546
のリン酸カルシウム沈澱法、またはその種々の改良法を
用いて行われる。

【００６５】（Ｃ．３．ベクター構築）ベクター構築に
は、現在全くよく知られた方法が用いられる。部位特異
的なDNA切断は、適当な制限酵素を用いて処理すること
により行われる。この処理は、これらの市販の酵素の製
造者により一般に指定されている条件下で行われる（例
えば、ニューイングランドバイオラボズの製品カタログ
を参照されたい）。一般に、約１μgのプラスミドまた
はDNA配列は、約20μlの緩衝溶液中で１単位の酵素と、
約37℃にて約１〜２時間インキュベートすることによ
り、切断される。制限酵素とインキュベートした後、タ
ンパクはフェノール／クロロホルム抽出により除去さ
れ、エタノール再沈澱によりDNA が回収される。この切
断された断片は、酵素化学における方法（1980）65 : 4
99-560中にみられる、一般的な方法に従って、ポリアク
リルアミドまたはアガロースゲル電気泳動法を用いて分
離し得る。粘性末端を有する切断断片は、ポリメラーゼ
に適当なインキュベート条件を用いて、適当なデオキシ
ヌクレオチド３リン酸（dNTP）の存在下にて、E.coli D
NAポリメラーゼＩ（クレノー）を用いて、平滑末端にし
得る。このポリメラーゼは、突出している3'一本鎖を切
断するが、この混合物中に存在するdNTPによって、突出
している5'末端を埋める。S1ヌクレアーゼを用いた処理
もまた、一本鎖DNA部分を加水分解し得るので使用し得
る。

【００６６】連結は、T4DNAリガーゼおよびATP を用い
る標準的な緩衝液および温度条件を使用して実施され
る。粘性末端の連結は、平滑末端の連結ほどATPおよび
リガーゼを必要としない。ベクター断片を連結混合物の
一部として用いる場合、5'リン酸塩を除去してベクター
の再連結を防ぐために、ベクター断片は、しばしばバク
テリアアルカリホスファターゼ(BAP）で処理される。あ
るいは、再連結を防ぐために、不都合な断片を制限酵素
で切断することが使用され得る。

【００６７】連結混合物は、E.coliのような適当なクロ
ーニング宿主中に形質転換され、そして成功した形質転
換体は、例えば抗生物質耐性によって選択され、正しい
構築物にスクリーニングされる。

【００６８】（Ｃ．４．所望DNA 配列の構築）合成オリ
ゴヌクレオチドは、Warner, B.D., ら、DNA(1984)3：40
1-411の記述のような自動オリゴヌクレオチド合成装置
を用いて調製し得る。必要に応じて、これらの合成鎖
は、標準的なリン酸化条件にて、標識化されたATPの存
在下で、過剰のポリヌクレオチドキナーゼを用いること
により、32Pで標識するためにリン酸化され得る。

【００６９】ゲノムライブラリーまたはcDNAライブラリ
ーから単離された配列を含むDNA 配列は、Zoller, M.,
ら、Nucleic Acids Res(1982)10：6487-6499に記述のよ
うに、部位特異的な変異を誘発することによって修飾し
得る。簡単に言えば、修飾すべきDNAは、一本鎖配列と
してファージにパッケージされ、そしてDNAポリメラー
ゼを用いて、二本鎖DNAに転換される。この際、修飾す
べきDNAの一部と相補的な合成ヌクレオチドをプライマ
ーとして用い、そして所望の修飾をその配列に含める。
得られた二本鎖DNAは、ファージを保持する宿主バクテ
リア中に形質転換され、そしてこの形質転換されたバク
テリアの培養物（これは、ファージの各鎖の複製物を含
む）は、プラークを得るべく寒天中にプレート化され
る。理論的には、この新しいプラークの50％が一本鎖と
して変異型を有するファージを含み；残りの50％が元の
配列を有する。このプラークの複製は、正しい鎖とハイ
ブリダイズされるが、非修飾配列とはハイブリダイズさ
れないような温度および条件下で、リン酸化された合成
プローブとハイブリダイズされる。次いで、このように
同定された、所望の修飾配列を回収し、所望のDNAのた
めの起源として供するためにクローン化する。

【００７０】（Ｃ．５．プローブとのハイブリダイゼー
ション）DNAライブラリーはGrunsteinおよびHogness(Pr
oc Natl Acad Sci(USA)(1975)73：3961)の方法を用いて
検索される。この方法を簡単に述べると、検索されるDN
Aは、ニトロセルロースフィルター上に固定化され、変
性され、０〜50％ホルムアミド、0.6M NaCl, 60mMクエ
ン酸ナトリウム、ウシ血清アルブミン、ポリビニルピロ
リジンおよびフィコールの各0.02％(wt/v)、50mMのリン
酸ナトリウム（pH6.5）、１％グリシン、および100μg/
ml担体変性DNA 、を含む緩衝液でプレハイブリダイズさ
れる。この緩衝液中のホルムアミドのパーセントは、プ
レハイブリダイゼーション段階およびその後のハイブリ
ダイゼーション段階の時間条件および温度条件と同様
に、所望の厳密性に依存する。あまり厳密な条件を必要
としないオリゴマーのプローブは、一般に、低濃度のホ
ルムアミド、低温、および長いハイブリダイゼーション
時間が用いられる。30または40以上のヌクレオチドを含
むプローブ（これは、例えばcDNA配列またはゲノム配列
に由来のプローブである）は、一般に、高温（例えば約
40〜42℃）で高濃度（例えば50％ホルムアミド）で行わ
れる。プレハイブリダイゼーションの後、32Pリン酸化
オリゴヌクレオチドプローブを含む、この同じ緩衝液を
添加し、ハイブリダイゼーションを得る。このように処
理されたフィルターのラジオオートグラフィーから、ハ
イブリダイズしたプローブの位置が得られ、検索されな
かった複製フィルター上の対応する位置を所望DNAの起
源として使用し得る。

【００７１】（Ｃ．６．構築の確認および配列決定）通
常のベクター構築では、連結混合物は、E.coli株HB101
または他の適当な宿主に形質転換され、成功した形質転
換体は抗生物質耐性マーカーまたは他のマーカーにより
選択される。次いで、形質転換体に由来のプラスミド
は、Clewell,D.B.,ら、Proc Natl Acad Sci(USA)(1969)
62：1159の方法に従って調製され、さらに通常、クロラ
ムフェニコール増幅（Clewell, D. B., J Bacteriol(19
72)110：667）が行われる。分離されたDNAは単離され、
そして制限分析により分析されるか、あるいは、Sange
r, F., ら、Proc Natl Acad Sci(USA)(1977)74：5463
により、さらにMessing、ら、Nucleic Acids Res (198
1)9：309のダイデオキシ法に記述のように、またはMaxa
mら、Methods in Enzymology(1980)65：499の方法によ
って、配列決定される。時々、GCに富んだ領域にて観察
される、バンドが十分に分離されないという問題を解決
するため、Ｔ−デアゾグアノシンが用いられた（Barr,
P., et al Biotechniques(1986)4：428)。

【００７２】

【実施例】次の実施例は、本発明の例証を意図したもの
であり、制限するものではない。例えば、D.1.節中で述
べられる方法は、必要に応じて繰り返され得るが、その
必要のない場合もある。なぜなら、本発明によって提供
される情報に基づき、所望のヌクレオチドの配列の構築
に技術が利用できるからである。E.coliおよび酵母で発
現を例示する。しかし、他の系も、C.1.節中でさらに充
分に述べたように、利用し得る。ゲノム構造から由来す
る付加的なエピトープもまた生産され得、そして後述の
ように抗体を生成するために使用される。

【００７３】（Ｄ．１．HDV cDNAの調製）１ml当り約10
11感染量のδ剤を含むチンパンジー血清を超遠心分離
し、そしてタンパク分解酵素Ｋとともにインキュベート
した後、得られたペレットから核酸を抽出した。簡単に
言えば、RNAを、従来の方法によりビリオン（ウイルス
粒子）から抽出した。この方法は、例えば、Ticehurst,
J.E.,ら、Proc Acad Sci(USA)(1983)80：5885-5889に
記載されており、この方法は、タンパク分解酵素による
処理およびフェノール／クロロホルム抽出、次いでエタ
ノール沈澱を包含する。HDVを、pH7.5、20mM HEPESおよ
び0.1％BSA中で20％のスクロースにより遠心分離した。
１mg／mlのプロテイナーゼＫ、50μg/ml酵母転移RNA、2
0mM HEPESpH7.5, 50mM EDTA, 200mM NaClおよび１％SDS
により、37℃で一夜、タンパクを分解した後、RNAを、
フェノール／CHCl3抽出とエタノール沈澱とにより精製
した。

【００７４】核酸を、変性ゲル電気泳動を使って分析
し、1700ヌクレオチドのRNAダブレットを得た。これ
は、ハイブリダイゼーション分析により決定された。こ
のダブレットは、Denniston, K.J.,ら、Science(1986)
（前述）により、約164bpのcDNAクローン、pkD3（この
ダブレット、およびδ剤により感染したサンプルに特異
的にハイブリダイズする）を得るために使用された。

【００７５】２つの相補性のあるオリゴヌクレオチド
を、DennistonらのpkD3 cDNAクローンから得られた配列
情報を基本として使用し、合成した。プローブ１：5'-G
ATGCCCTTCCCGATGCTCGATTCCGACTC およびプローブ２：5'
-GAGTCGGAATCGAGCATCGGGAAGGGCATC を、200μCi
³²〔Ｐ〕ATP,＞５Ci／μmolを用いてリン酸化すること
により標識化した。プローブは、その5'末端をLillehau
gら、Biochemistry(1976)15：1858の方法によりT4キナ
ーゼでリン酸化し、そして次に、50％v/vのCH₃OH, 50mM
酢酸アンモニウム、pH7.5で溶出することによりSep-pa
k C18カートリッジ（ミリポア）で精製した。

【００７６】DNAプローブへのハイブリダイゼーション
のために、HDV RNAを、対照のチンパンジーRNAおよびDN
Aサイズマーカー（Lehrach, H., et al, Bio-chemistry
(1977)16：4743)と共に１％アガロース−ホルムアルデ
ヒド ゲルで電気泳動にかけた。それぞれのゲルを、Th
omas, Proc Natl Acad Sci(USA)(1980)77：5201に記載
されているように、ニトロセルロース膜の上に移し、標
識化された特異的プローブにハイブリダイズさせた。相
補体RNAと適当な対照とを含むゲルをこれらのプローブ
のそれぞれと処理することにより、プローブ２だけが相
補体にハイブリダイズすることが示され、ゲノムの一本
鎖の性質が確かめられた。

【００７７】cDNAライブラリーを、RNAの3'−ヒドロキ
シ末端にpoly（rA）尾部を付加後、OkayamaおよびBerg
（Mol Cell Biol(1982)2：161-170）の方法により、チ
ンパンジー血清ペレットのもとのRNA 抽出液から調製し
た。そのRNA は、poly(rA)ポリメラーゼとインキュベー
ションする間にかなりの分解を示した。しかし、得られ
たcDNAライブラリーをプローブ２を用いて調べると、図
４に示される配列を有するクローン、δ１、が回収され
ていた。より小さな（250bp)重複しているクローン、δ
２、もまた、δ１のクローン化されたcDNAから切り取ら
れた435bpのNcoI断片を用いたところ、このライブラリ
ー中に見出された。

【００７８】ゲノムおよびcDNAの相補鎖を同定するため
に、鎖特異的プローブを、〜950bpのPvuII／HindIII制
限断片（隣接した領域を含む）または〜450bpのPvuII／
PstI断片を用いてδ１から、調製した。これらの断片
を、相補する一本鎖のδ相補体を生じるようにM13ベク
ター中に連結した。ハイブリダイゼーションプローブを
調製するために、0.8μgの各相補体DNAを、 200μM NaC
l中の0.1μgのハイブリダイゼーションプローブプライ
マー（ニューイングランド バイオラボズ）と混合し、
次に、沸騰湯浴中で１分間変性させた後、37℃で15分間
インキュベートした。アニーリングされた混合物を、一
本鎖の挿入物を標識化するため、250U/mlのクレノーと
共に、50mM Tris-Cl, pH7.5, 5mM MgCl2, 10mM β−メ
ルカプトエタノール、50μg/ml BSA, 0.1mM dATP, dGT
P, およびdTTP, 14μM dCTP (1000Ci/mmol)を含む200μ
lで15℃にて２時間インキュベートした。反応を停止さ
せ、そしてセファデックスG50でDNA を精製し、そして
ボイドボリューム中に溶出されて得られたプローブを、
標識化した相補体RNAを含むノーザンブロットにハイブ
リダイズさせるのに用いた。

【００７９】成功裏に得られたプローブ（〜450bp PvuI
I／PstI断片鎖の１つ）に対する結果を、図５に示す。
第１列（レーン１）は、標識化マーカーを含み、第２列
は、血漿からのδビリオンRNA 10ngを含み、第３列およ
び第４列は、それぞれ、対照および感染したチンパンジ
ーからの肝臓RNA1.4μgを含む。第２列および第４列
は、明らかにウイルス核酸の存在を示す。

【００８０】付加的なHDV cDNAライブラリーを、HDV RN
Aの逆転写を開始する子牛胸腺のランダムプライマー（T
aylor, J.M., et al,Biochem Biophys Acta(1976)442：
324-3300）を使用して調製した。得られた一本鎖cDNAを
次いで精製し、そして、E.coliのDNAポリメラーゼＩと
ともにインキュベーションすることにより二本鎖にし
た。次に、S1ヌクレアーゼで処理し、cDNAに、ターミナ
ルトランスフェラーゼを用いオリゴ−dCを末端につけ、
そして、前もってPstIで制限処理したdG末端についてい
るpBR322を用いてアニーリングした。次に、そのプラス
ミドを、宿主細菌のE.coli MC1061中に形質転換し、そ
してテトラサイクリン耐性の組換え体を、δクローンを
選択するために、後述のようにコロニー−ハイブリダイ
ゼーションした。（これらの一般的方法は、Maniatis,
T.ら、により分子クローニング（Cold Spring Harbor L
aboratory)pp. 229-242(1982)中に記載されている。）
δ１のcDNA挿入物からの435bpのNcoI断片を、ニックト
ランスレーションし、そして、上記ランダムプライムし
たcDNAライブラリーを選択するのに使用し、δ４および
δ115 を得た。δ115中のcDNA挿入物の481bpのHindIII
／SmaI断片を、このライブラリーの選択に用い、δ7aを
得た。クローンδ3bおよびδ7bは、δ115からの配列
（5'-TGGAACGTCGGAGAAAC-3')を基にしてオリゴヌクレオ
チドのプローブを用いて得られた。

【００８１】このようにして、次のような付加的なクロ
ーンをこのライブラリーから回収した：δ3b（829bp)、
δ４（1123bp）、δ7a（474bp)、δ7b（1378bp）、およ
びδ115(1362bp)。これらのクローンと、δ１およびδ
２との配列を決定すると、図１に示すように、ゲノムの
重なっている部分が得られた。この配列のデータによ
り、もとのHDV RNAが、環状分子であることが強く示唆
された。なぜなら、７つの異なったcDNAクローンの配列
が、長さにしてほんの〜1700ヌクレオチドの線状分子に
適合し得ないからである。この仮説は、変性条件下で電
子顕微鏡により環状HDV RNA分子を観察することにより
確認された。ゲノムおよびその相補体を示すDNAの完全
な配列は、図２に示されており、そしてそれは、種々な
クローンの重複している部分は考慮して描かれている。
その上方の鎖は、HDVのゲノムRNAを示し、下方鎖は、そ
の相補体である。図２に示されるように、種々のクロー
ン間で、配列にある程度の異質性があった。

【００８２】ヌクレオチド配列における異質性は、ゲノ
ム鎖上に示される。コードされるアミノ酸を、相補鎖の
下に示す。AMは、アンバー終止コドンを示し、そしてOP
は、オパール終止コドンを示す。以下の表１は、いくつ
かのクローンの異質性の比較を示す。

【００８３】

【表１】

【００８４】

【表２】

【００８５】上記の表２は、少なくとも300ヌクレオチ
ドの開放読み取り枠(ORF）によってコードされるポリペ
プチド（推定）を示す。各開放読み取り枠のはじめのヌ
クレオチドの位置は、図２に示される上方鎖の番号に従
って示される。ゲノム配列を表す上方鎖は、１−1679と
番号づけられた。相補体の位置は同じ番号を持つが、し
かしｘによって前置きされる。従って、相補体の領域に
よってコードされるポリペプチドは、「リバース（逆向
き）」の順序の番号が与えられる。例えば、ORF5に対し
てｘ1619−ｘ1014が与えられる。表中の第１番目のヌク
レオチドの番号は、該枠の最初のヌクレオチドのそれで
あり、ATG ではない。ORF5の翻訳読み取り枠を、図２
（表２の推定ポリペプチドp1）に示し、そして、Ｎ−グ
リコシル化されている可能性のある部位を＊により示
す。

【００８６】ORF5領域を含んでいるクローンのヌクレオ
チド配列分析により、この領域中のいくつかの配列異質
性が解明された。これらの異質性は、図３に示される。
この図３は、ORF5のヌクレオチド配列を示す。他のクロ
ーンから決定されるヌクレオチド配列の異質性をヌクレ
オチド配列の上に示す。その配列異質性から生じる別の
アミノ酸を上記推定されるアミノ酸配列の上に示す。配
列中のこの異質性の結果により、ORF5は、極めて密接な
関連性のあるポリペプチドをコードする。

【００８７】以下に論ぜられるように、 p24δおよび p
27δの両方のウイルスポリペプチドがORF5中にコードさ
れているようであるため、ORF5のヌクレオチド608位の
異質性（図３参照）は、特に興味深い。608位がＡを含
むならば、生じるコドンは、（もし、宿主が、アンバー
サプレッサーシステムを有していなければ）翻訳されて
p24δのサイズのポリペプチドを生じるアンバー終止コ
ドンである。しかし、608位が、Ｇを含んでいるならば
（宿主が、アンバー変異を抑制する能力をもつならば）
664位のオパール終止シグナルまでのコドンの読み通し
により、 p27δのサイズのポリペプチドが生じる。この
示唆は、次の知見により支持される。その知見とは、po
rf5で形質転換されたE.coli D1210 中のORF5の発現は、
大きさと免疫反応性（D.3.節参照）によりウイルス抗原
p24δおよびp27δと同定され得る２つの生産物を生じ
るという知見である。E.coli D1210は、リーキーアンバ
ーサプレッサー系を含む。従って、翻訳の一部分は、ア
ンバーコドンで終結する。その示唆の確認は、porf5中
に存在するORFの608位でＡをＧに置換することによって
得られる。この置換は、in vitro位置特異的変異を用い
ることにより、達成され得る。位置特異的変異の手法
は、平均的当業者に公知である。

【００８８】HDVの完全なゲノムは、1679ヌクレオチド
の環状配列を示す。相補的な合成オリゴマーのうちのた
だ１つと、一本鎖δ１、M13プローブとが、その鋳型に
ハイブリダイズするので、上記ゲノムRNAは一本鎖であ
ると推定される。さらに、その鋳型RNAを、in vitroに
おいてウサギ網状赤血球溶解産物に翻訳することはでき
ない。このことは、該ゲノムが、事実上アンチセンス鎖
を表す可能性を示す。

【００８９】（Ｄ．２．ポリペプチドをコードしている
クローンの確認）感染した血漿に由来するウイルスRNA
を、ランダムプライムし、そして生じたcDNAを、上記の
ように、GC末端鎖を使いpBR322のPstI部位中にクローン
化した。連結混合物を、E.coli MC1061に形質転換し、
約20,000の組換え体のプールからプラスミドDNAを調製
した。そのプラスミドDNAを、PstIを用いて開裂し、そ
して、cDNA挿入物を、アガロースゲルから溶出し、クレ
ノーを使って平滑末端とした。これをEcoRIリンカーに
連結し、そして、宿主としてY1090(r- ）を用い、ファ
ージベクターλgt11（Young, et al, Proc Natl Acad S
ci USA(1983)80：1194-1198）の唯一のEcoRI部位にクロ
ーン化した。このファージ−ランダムcDNAライブラリー
を、次に、上記の関連するδ４およびδ115クローンか
ら誘導された２つのプローブにハイブリダイゼーション
することによりスクリーニングした。さらに、コロニー
を、Ｂ型肝炎およびδウイルスに慢性的に感染したヒト
由来の抗血清を用いて、免疫スクリーニングした。

【００９０】プローブと抗血清との両方に結合する、い
くつかのプラークを得た。１つの回収プラークを、塩基
配列決定した。そしてそれは、約200bpのcDNAを含んで
いた。このcDNAの翻訳読み取り枠は、表２に示されるア
ンチゲノム鎖から翻訳されたポリペプチドp1の部分に相
当する。このλgt11により生産されるβ−ガラクトシダ
ーゼ融合タンパクは、そのカルボキシル末端に、δ抗血
清の特異的な結合に応答するポリペプチドp1の領域を含
んでいた。Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎および非Ａ／非Ｂ型肝炎
に前もって感染させておいたものから得られる対照の抗
血清は、この融合タンパクに結合しなかった。従って、
p1は、δに感染した抗血清への特異的結合能力のある抗
原領域を明らかに含み、それゆえ、診断に有用である。

【００９１】（Ｄ．３．発現ベクターの構築およびHDV
配列の発現）HDVゲノムおよびその相補体は、多くのORF
を含む（D.1.節参照）。これらORFのいくつかは発現し
ており、そしてコードされているポリペプチドの抗原性
が、HDV抗血清への結合能力について調べられた。図７
は、HDV ORFのダイアグラムである。ATGで始まっている
300ヌクレオチドより大きい全てのHDV ORFは、HDVゲノ
ムの円形座標の形で示されている。太い線は、バクテリ
ア中に発現される各ORFの部分を示す。三角（▲）は、
各ORFの最初の枠内のATGを示す。矢印は、ゲノムまたは
反ゲノムの鎖の翻訳、時計回りまたは反時計回りをそれ
ぞれ示す。各全てのORFの座標、細菌中および関係のあ
る翻訳枠の中に表現されている領域を、表の形で示し
た。

【００９２】（Ｄ．３．ａ．ORF５およびORF６中にコー
ドされるHDVポリペプチドを含む融合タンパクのE.coli
中での発現）融合タンパクの合成を指示する細菌の発現
プラスミドを構築した。上記融合タンパクは、ヒトのス
ーパーオキシドジスムターゼ(SDS）(Hallewell et al,
Nucleic Acids Res(1985)13：2017）、およびさらに、O
RF５またはORF６中にコードされたHDVタンパクの部分
（つまりp1およびp2）をそれぞれ含む。このプラスミド
は、ORF５にコードされたp1またはORF６にコードされた
p2(SODのカルボキシル末端に融合されている）のほとん
どを合成した。

【００９３】発現プラスミドは、Hallewellらの発現プ
ラスミドpSOD16（前出）を働かせるtacプロモーターに
基づく。プラスミドpSOD16cf２は、SOD遺伝子のカルボ
キシル末端をコードする部分と、下流のポリリンカー配
列の部分とを、MboI部位を介して次の新しいポリリンカ
ー配列により交換することにより、pSOD16から生じた：

【００９４】

【化４】

【００９５】このポリリンカー配列の置換の結果、SOD
の元のカルボキシル末端の Glnが除去される。

【００９６】HDVゲノム由来の配列を挿入するために、
(Steimer et al,J Virol (1986)58:9-16)の方法を採用
した。pSOD16cf２を、以下に記載するように所望の特別
なコード配列に調節するために、適当に分解した。

【００９７】p1については、回収したDNAクローンδ115
を、SstIIで分解し、クレノーで平滑末端とし、そしてS
alIで分解し、600bp断片を回収（アガロースゲルから単
離）した。単離された断片を、あらかじめNcoIで分解し
たpSOD16cf２に連結し、平滑末端とし、そしてSalIで分
解してpSOD−δp1を得た。コードされた融合タンパク
は、ヌクレオチドx1567からx963によりコードされるp1
アミノ酸配列の205残基を含んでいる。

【００９８】p2タンパクについては、組換えDNAプラス
ミドδ４をEcoRIおよびSmaIで切断し、622bpの断片を回
収した。この断片は、EcoRI／SmaIで分解したpSOD16cf
２の中に連結され、pSOD−δp2が生じた（得られたプラ
スミドの両方を配列決定して、SODタンパクのＣ末端で
配列をコードしているp1およびp2の位置および方向を確
認した）。

【００９９】連結生産物を、E.coli D1210(Sadler et a
l, Gene(1980)８:279-300）の中に形質転換した。単一
コロニーの形質転換体を 100μg/mlアンピシリンを添加
したＬ−ブロース培地中２mlで37℃にて一夜増殖させ
た。これら培養物のグリセロール（50％）貯蔵物を調製
し、−20℃で保存した。

【０１００】タンパクの発現分析のために、上記の培地
中での終夜培養を、グリセロール貯蔵物を用いて始め
た。これらの培養物を、上記と同一の培地中に1/100希
釈し、OD₆₅₀が0.6となるまで37℃で培養を行った。その
とき、その一部を溶菌するか、もしくは、１mM IPTGの
添加を行い溶菌前の４時間にさらにインキュベートする
ことにより、最高の発現が達成される。

【０１０１】変成ポリアクリルアミドゲル(Laemmli, Na
ture(1970)277 :680）上で分析するために、細胞を、SO
Dおよび DTTの存在下で溶解させた。そして、Towbin
ら、Proc Natl Acad Sci USA (1979) 76：4350に従って
イムノブロッティングを行った。その結果を、図６に示
す。

【０１０２】イムノブロットを、慢性的に感染した患者
（パネルＡ）または、non-δ肝炎ウイルスに感染した抗
血清を含む対照の抗血清（パネルＢ）からのδ抗血清と
反応させた。さらに、５％のヤギ血清に前結合させた
後、イムノブロットを、0.3％Tween-20と５％ヤギ血清
とを含む１×PBSで希釈された抗血清の１：300希釈物と
反応させ、次に、西洋ワサビペルオキシダーゼと接合し
たヤギ抗ヒトIgGの１：200希釈物でインキュベートし、
そしてその沈降物（ブロット）を、クロモーゲン４−ク
ロロ−１−ナフトール(Biorad)の存在下で、展開した。

【０１０３】図６において、第１〜４列は、pSOD−δp1
組換え体ベクターを含む細胞の抽出物を含み；第５列お
よび第６列は、宿主ベクターに形質転換した細胞からの
抽出物を含み；第７〜10列は、対応するpSOD−δp2組換
え体ベクターを含んでいた。第３、４、６、９および10
列の検体は、IPTGで誘発されていない培養物からのもの
であり；残りの第１、２、５、７および８列からの検体
は、IPTGで、さらに誘発された培養物からのものであっ
た。第５〜10列に比較したときの第１〜４列中の付加的
なタンパクバンドの存在は、pSOD−δp2からではなく、
SOD−p1と命名されたpSOD−δp1からの抗原的に反応す
るタンパクの生産を示す。従って、ORF６ではなくORF５
が、ヒトHDV抗血清に特異的に結合するタンパクをコー
ドする。特異的な免疫反応性のORF６融合ポリペプチド
を検出することができないのは、細胞宿主中での発現の
欠失によるためでなかった。というのも、ヒトスーパー
オキシドジスムターゼに対して生じるウサギ抗血清への
結合をモニターすると、pSOD−δ１およびpSOD−δ２か
ら発現した生産物が、同様のレベルで存在したからであ
った。

【０１０４】図６Ａに見られるように、HDV抗血清に免
疫反応性であるpSOD−δ１からの２つの翻訳生産物が、
優性的に存在する。最も大きい主要な免疫反応性ORF５
ポリペプチドの推定の大きさは、49,000ダルトンであ
り、そしてそれは、スーパーオキシドジスムターゼの15
4アミノ酸とORF５によって特徴づけられる205アミノ酸
とを含む融合タンパクと一致する。このポリペプチド
は、ORF５中のアンバーコドンの抑制から生じうる（図
２参照）。このアンバーコドンはpSOD−δ１中に存在
し、そして、宿主株E.coli D1210は、アンバーサプレッ
サー株である。より小さい第２の主要なポリペプチド生
産物は、サプレッションの濡れから生じる。そのため、
アンバーコドンにおける転写集結を許容する。他の可能
な別の説明としては、上記小さい方のタンパク（単数も
しくは複数）は、単一生産物の翻訳後プロセッシングか
ら生じうること、または ORF５のコード領域内に別の開
始部位が存在する、ということがある。

【０１０５】E. coli株D1210（pSOD−δ１）のサンプル
を、アメリカンタイプ カルチャーコレクション(ATC
C)、12310 Parklawn drive, Rockville, MD 20852,に寄
託し、そして、寄託No.67131 を得た。この寄託物は、
ブダペスト条約により規定される条件下で維持される。

【０１０６】（Ｄ．３．ｂ．ORF１、２および７にコー
ドされたHDVポリペプチドを含むタンパクのE.coli中で
の発現）ORF１、２および７中にコードされ、そしてSOD
とHDVタンパクとを含む融合タンパクの合成を指示する
細菌の発現ベクター（つまりベクターpSOD−orf1、pSOD
−orf2およびpSOD−orf7）を構築した。構築の条件と配
列決定法は、次の事項を除いてD.3.ａ．節におけるpSOD
−δ１およびpSOD−δ２についての記載と同様に行っ
た。

【０１０７】pSOD−orf1については、436bpの挿入物断
片を、そのプラスミドNcoIで分解することにより、クロ
ーンδ１から単離し、次にゲル精製を行った。この断片
を、NcoI処理し、ホスファターゼ処理したpSOD16cf２に
連結した。そのクローン中のORF１断片は、ゲノムの方
向性を有する。

【０１０８】pSOD−orf2については、593bpの挿入物ゲ
ル精製断片を、Bst XIによるクローンδ115の分解後、
単離し、クレノーで処理し、次にEcoRIで分解した。こ
の断片を、NcoIで切断したpSOD16cf２に連結し、クレノ
ーで平滑末端とし、そしてEcoRIで分解した。

【０１０９】pSOD−orf7については、439bpの挿入物ゲ
ル精製断片を、AluIとSmaIとでクローンδ115を分解し
た後に分離した。この断片を、SmaI切断しホスファター
ゼ処理したpSOD16cf２に連結した。

【０１１０】pSOD−orf1、pSOD−orf2およびpSOD−orf7
中に発現したタンパクをpSOD−δ１およびpSOD−δ２に
おいて記載したようにイムノブロットにより分析を行っ
た（D.3.ａ．節参照）。

【０１１１】発現条件もまた、D.3.ａ．節に記載したの
と同様である。細菌溶解産物中の ORF１、２および７hS
OD融合生産物の存在は、hSODに対するウサギ抗−hSODポ
リクローナル抗体の部分的活性により、実証された。各
ORFを発現する細菌培養物の溶解産物を、ニトロセルロ
ースの上にイムノブロットし、そして慢性のHDV感染物
を有する12の異なる患者からの個々の抗血清と共にイン
キュベートした。pSOD−orf1、pSOD−orf2、そしてpSOD
−orf7から発現した生産物は、HDV抗血清に結合しなか
った。しかし、pORF５（その構造は、D.3.ｃ．節に記載
されている）から発現した生産物は、その HDV抗血清に
結合した。

【０１１２】（Ｄ．３．ｃ．ORF５にコードされた融合
していないHDVポリペプチドのE.coli中で発現）細菌の
発現プラスミド(ORF５でコードされた融合していないポ
リペプチドの合成を指示する）を構築した。このベクタ
ーporf５は、第２の合成リンカーを含んでいることを除
いて、融合したSOD-orf ポリペプチドを発現するために
使われるもの（pSOD−δp1、D.3.ａ．節参照）と類似し
ている。上記第２の合成リンカーは、hSODコード配列の
あとの翻訳を終結するため、および HDV配列の最初のAT
Gで翻訳を再開始するために設計された。このリンカー
は、ORF５中にもとから存在する10アミノ酸をコードし
ており、アミノ末端ATGを含む。さらに明確には、その
ベクターは、次のものを共に連結することにより構築さ
れた：ａ）δ115から制限し、そしてゲル精製した605b.
p.のSstII/SalI断片；ｂ）第２のリンカー；およびｃ）
NcoIとSalIとでpSOD16cf２を処理することによって得ら
れた大きいベクター断片。上記リンカー配列は、次のと
おりである：

【０１１３】

【化５】

【０１１４】プラスミドporf５でE.coli D1210の形質転
換を、D.3.ａ．節に記述されている（他のプラスミドで
の形質転換が記載されている）ようにして行った。porf
５の中のその挿入物の構築は、DNA配列分析によって確
証された。この分析により、ORF５のδ115誘導体中のア
ンバーコドンの存在もまた確証された(ORF５の配列異質
性についての図３参照）。

【０１１５】porf５内にコードされるORF５ポリペプチ
ドを発現させ、発現生産物の HDV抗血清との免疫反応性
をD.3.ａ．節に記述されるように行った。そして、pSOD
−orf1、pSOD−orf2、およびpSOD−orf6、およびpSOD−
orf7からの発現生産物の分析を同時に行った。図８（イ
ムノブロットを示す）に見られるように、ORF５をコー
ドするポリペプチドだけが、HDV抗血清に結合した。そ
して、これらのポリペプチドは、感染していない個体か
らの抗血清には結合しなかった。

【０１１６】図８のイムノブロットの分析については、
対照のプラスミド（pSOD16cf２）またはhSOD−orf1、
２、６、７および ORF５の発現プラスミドを有する細菌
培養物を、IPTGにより約４時間誘発させて行った。細胞
をペレット化し、細胞の0.024Dに相当する脂質およびタ
ンパクを、D.3.節に記載されるように12％Laemmliゲル
上で電気泳動にかけた。タンパクを、炭酸緩衝液中のニ
トロセルロースフィルター上に移行させた。イムノブロ
ットをヒトHDV抗血清の１：200希釈物でインキュベート
し、次に、¹²⁵Iで標識化ヒツジ抗ヒトIgG抗体でインキ
ュベートした。そして、D.3.ａ．節に記載されるように
洗浄した。溶解産物は、次の順序で現れる：第１列、pS
OD16cf２；第２列、pSOD−orf1；第３列、pSOD−orf2；
第４列、porf５；第５列、pSDS−orf6；および第６列、
pSOD−orf7。

【０１１７】図８はまた、次の事柄を示す。それは、po
rf５から発現し、HDVに特異的な抗体と反応する生産物
には、２つの分子量種があり、それらのポリペプチドは
約27k および24kであるという事柄である。以下に示す
ように、これらのポリペプチドは、２つの肝炎ウイルス
ポリペプチドp27δとp24δとにより共有される免疫原性
のエピトープを含む。HDV中の27kdおよび24kdポリペプ
チドの存在は、最近報告されている。Bergmann, K.F.お
よびGerin, J.L., J of Inf Diseases (1986)154：70
2；および Bonino, F. ら、J Virol(1986)58：945。さ
らに、以下に示されるように、これらのポリペプチドは
また、おそらく、肝炎デルタ抗原(HDAg)を有する。HDAg
は、元来、感染した個体の肝細胞の核中に見出されてい
た。Rizzetto, M.ら、Gut(1977)18:997。

【０１１８】（Ｄ．３．ｄ．ORF５にコードされるHDVポ
リペプチドの酵母中での発現、およびその生産物の部分
的精製）ORF５がコードする所望のHDVポリペプチドの合
成を指示する酵母の発現ベクターを構築した。酵母株AB
110中でのこのプラスミド（pYAG−δp1）の発現により1
95アミノ酸ポリペプチドが生じた。このポリペプチド
は、免疫学的にHDV抗血清と反応性を有し、おそらくウ
イルスタンパクp24δであろう。

【０１１９】酵母発現ベクターpYAG−δp1は、次のよう
に構築された：第１に、pBS100中の発現カセットの内
に、新しいリンカーに連結したクローンδ115からのORF
５を挿入することによりpAG−δp1を構築した。Bam HI
で切り出され得るそのカセットは、唯一のNcoI部位の上
流にADH2−GAPを制御し得るプロモーター、および唯一
のSalI部位の下流にGAPターミネーターを含む。E.coli
HB101中にpAG−δp1をクローニングした後、ORF５を含
む発現カセットを、pAG−δp1からBam HIで制限切断
し、そして、あらかじめBam HIで制限切断した酵母シャ
トルベクターpBA24中に連結した。生じたプラスミド
を、E.coli HB101中にクローン化し、そして、シャトル
プラスミドpYAG−δp1を選択した。ORF５の発現につい
ては、酵母株AB110を、このプラスミドにより形質転換
し、AB110（pYAG−δp1）を形成させた。

【０１２０】酵母株AB110(pYAG−δp1）のサンプルをAT
CC、12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 2085
2に寄託した。そして、登録No.20845を得た。この寄託
物は、ブタペスト条約に規定され条件下で維持される。

【０１２１】さらに詳細には、ORF５を含有する発現カ
セットは、次のものを連結させて構築された：SstIIとS
alIとでクローンδ115を分解することによって得られ、
ゲル精製された605b.p.の断片；新しいリンカー（リン
カー３）；およびNcoIとSalIとでPBS100を分解すること
によって得られ、ゲル精製した5841b.p.断片。上記リン
カー３の配列は、次のとおりである：

【０１２２】

【化６】

【０１２３】プラスミドPBS100は、米国特許出願第760,
197号に記載されている。この特許出願は、ここに譲受
人に譲渡されており、これにより参照文献として採用す
る。このプラスミドは、pBR322誘導体のpAB12にクロー
ン化された酵母発現カセットを含んでいる。この発現カ
セットは、ハイブリッドADH2-GAPプロモーター、GAPタ
ーミネーター、そしてNcoI部位とSalI部位間の本質的で
はない配列を含んでいる；これらの後者の配列は、クロ
ーンδ115のORF5領域と置換された。ADH2-GAPプロモー
ターは、プラスミドpJS103から単離された1200bp BamHI
−NcoI断片である。 プラスミドpJS103は、以下のよう
に構築した：プラスミド pADR2（Beieret al, Nature(1
982)300：724-728)の野性型ADH2遺伝子を含むプラスミ
ドを制限酵素EcoRVで切断することによって、プロモー
ターのADH2部分を構築した。制限酵素EcoRVは、pADR2中
の他の２つの部位と同様に、ADH2領域の外側にあるATG
開始コドンに関連する＋66位において切断する。得られ
たベクター断片および２つのより小さな断片の混合物を
Bal31エクソヌクレアーゼで再び切除し、約300bpを除去
した。合成XhoIリンカーを、 Bal31で処理したDNA上に
連結した。得られたDNAリンカーベクター断片（約５k
b）を、カラムクロマトグラフィーによってリンカー群
から分離し、制限酵素XhoIで切断、連結し、そしてE.co
liをアンピシリン耐性に形質転換させるために用いた。
XhoIリンカーの位置は、DNAの配列決定により決められ
た。ADH2遺伝子（ATGから-232位）の5'非転写領域内のX
hoIリンカーを含む１つのプラスミドを、制限酵素XhoI
で切断し、ヌクレアーゼS1で処理し、次いで制限酵素Ec
oRIで処理し、XhoIリンカー部位の１つの平滑末端およ
びEcoRI末端を有する線状ベクター分子を得た。酵素Bam
HIおよびEcoRIでプラスミドpPGAP1を切断し、次いで0.4
kbpのDNA断片を単離することによって、プロモーターの
GAP部分を構築した。次いで、この精製した断片を酵素A
luIで完全に切断し、そして約200bp断片を単離した。こ
のGAPプロモーター断片を上記の線状ベクター上に存在
するADH2断片に連結し、プラスミドpJS103を得た。

【０１２４】プラスミドpPGAP1は、GAPDHターミネータ
ーと先端を切ったGAPDHプロモーター領域の間に多制限
部位リンカーを有する酵母発現カセットベクターであ
る。この多制限部位は、NcoI, EcoRIおよびSalIに対す
る認識部位を含み、そしてこのカセットは、BamHI断片
として切断し得る。pPGAP1の調製は、欧州特許出願公報
No.EPO O 164 556およびTravis, J. ら、J Biol Chem(1
985)260(7)：4384-4389中に記載されている。両方の参
照文献において、pPGAP1はpPGAPと呼ばれている。

【０１２５】プラスミドpAB12は、特異なHindIII部位お
よびSalI部位の間の領域を欠くpBR322誘導体であって、
特異なEcoRI部位中にBamHIリンカーを含んでいる。Hind
IIIおよびSalIでpBR322を完全に切断し、次いでBal1ヌ
クレアーゼで限定分解することによってベクターを構築
した。得られた末端は、クレノーで溶離し、そして平滑
化された末端をT4 DNAリガーゼで連結し、閉じた共有結
合環を再形成させた。次いで、これらの環状物をEcoRI
で完全に切断し、突出部はクレノーで満たし、そして平
滑末端をBamHIリンカーで連結した。過剰のリンカー
は、BamHIで切断することにより除去し、そして連結す
ることによって、共有結合性閉環状物を形成させた。

【０１２６】プラスミドpAB24は、完全な２μ配列（Bro
ach, 酵母サッカロマイセスの分子生物学、1：445,コー
ルドスプリングハーバープレス(1981))およびpBR322配
列を含む、酵母のシャトルベクターである。このプラス
ミドは、さらにプラスミドYEp24（Botstein, et al,(19
79)Gene 8：17)由来の酵母URA3遺伝子、およびプラスミ
ドpC1/1（欧州特許出願公報No. EPO O 116 201に記載）
由来の酵母LEU²d遺伝子を含んでいる。EcoRIでYEp24を
切断し、そしてベクターを再連結して部分的２μ配列を
除去することによって、プラスミドpAB24を構築した。
得られたプラスミド、すなわちYEp24ΔRIをClaIで切断
して線状化し、そしてClaIで線状化されている完全な２
μプラスミドで連結した。次いで、得られたプラスミ
ド、すなわちpCBouをXbaIで切断し、そして8605bpベク
ター断片をゲル分離した。この単離されたXbaI断片は、
pC1/1から単離したLEU²d遺伝子を含む4460bp XbaI断片
と連結した；LEU²d 遺伝子の配向は、URA3遺伝子と同じ
方向にある。発現カセットは、pBR322配列の特異なBamH
I部位に挿入されており、従って細菌のテトラサイクリ
ン耐性遺伝子を中断していた。制限酵素部位およびいく
つかの顕著な特徴を表す、pAB24の地図を図９に示す。

【０１２７】酵母におけるORF5の発現は、pYAG−δp1で
形質転換した酵母株AB110を用いて達成された。酵母株A
B110は、米国特許出願第620,662号に記載されている。
この特許出願は、ここに譲受人に譲渡されており、これ
により参照文献として採用する。AB110の遺伝子型は、M
ATα、ura 3-52、leu2-04、またはleu2-3 およびleu2-1
12の両方、pep4-3, his4-500〔cir°〕である。

【０１２８】発現させるために、凍結貯蔵した細胞をLe
u-プレート上に筋状にまき、そして30℃でインキュベー
トした。単一コロニーを、ロイシン選択培地〔合成最小
培地、アミノ酸供給（w/o Leu)、８％グルコース；Sher
manら、酵母遺伝子学における方法に対する実験室マニ
ュアル、コールドスプリングハーバーラボラトリー、19
86, pp. 163-169〕に植菌し、そしてこの培養物を30℃
にて振盪しながらインキュベートした。次いで、２mlの
培養物を、100mlの３％グルコース含有Leu-培地に植菌
し、そして30℃にて振盪しながらインキュベートした。
この培養物が飽和状態に達したら、50mlを、１lの１％
グルコース含有Leu-培地に植菌した。この培養物は、光
学密度がOD650＝1.75OD/mlと測定されるまで、30℃にて
振盪しながらインキュベートした。光学密度がこのよう
な値になると、細胞はペレット化し、そして−80℃で貯
蔵するか、あるいはタンパク精製のためのプロセッシン
グを行った。

【０１２９】酵母中で発現する、ORF5がコードしたタン
パクを部分的に以下のように精製した。酵母発現培養
物、AB110(pYAG−δp1）をペレット化し、そしてパック
された細胞の体積を見積もった。δp1タンパクは、ガラ
スビーズ溶解法を用いて精製した。細胞ペレットは、緩
衝液Ｉ （50mM Tris-HCl pH8.0、１mM EDTA、１mMフェ
ニルメチルスルホニルフルオライド（PMSF）、１μg/ml
ペプスタチンＡ）の２容量、およびガラスビーズ（0.25
mm、酸処理および加熱処理済）の１容量中に再懸濁し
た。この細胞を激しく攪拌することによって溶解し、そ
して４℃で保存した。懸濁液を遠心分離して上澄を除去
し、そして細胞ペレットを２容量の１％Triton X-100含
有緩衝液Ｉ で洗浄し、次いで遠心分離した。上澄を除
去し、そしてペレットを２容量の緩衝液Ｉ で３回、洗
浄した；最後の洗浄の間に、ガラスビーズをタンパク懸
濁液から除去した。洗浄したペレットは、同容量の６M
尿素含有緩衝液Ｉ で２回、抽出し、タンパクを溶解さ
せた。上澄を集め、緩衝液Ｉ を用いて１：10に希釈
し、そして防腐剤として20mMのアジ化ナトリウムを用い
て４℃で保存した。このタンパクを使用する前の最終段
階として、PMSFおよびペプスタチンを含まない緩衝液Ｉ
の100〜300容量で２回、透析した。

【０１３０】（Ｄ．４．ORF5内でコードされたポリペプ
チドの同定）ORF5内でコードされたポリペプチドは、p2
7δおよびp24δのポリペプチドとして同定されたが、こ
の同定は細菌の組換え非融合ポリペプチド中で発現した
大きさを、HDV粒子中およびHDAg陽性の肝臓抽出物中に
存在するp27δおよびp24δの大きさと直接比較すること
によって行った。さらに、ORF5がコードしたポリペプチ
ドは、酵母中で発現した組換えポリペプチドと、p27δ
およびp24δの間のHDV抗体に対する免疫学的競合に基づ
いて、p27δおよびp24δとして同定された。最後に、OR
F5がコードしているポリペプチドは、組換えポリペプチ
ドの、核HDAgとの競合結合により、核HDAgの成分として
同定した。この競合結合は、HDV感染肝臓切片の間接的
な免疫ペルオキシダーゼ染色によってモニターされる。

【０１３１】（Ｄ．４．ａ．細菌中で発現した、porf５
由来のポリペプチドを結合している抗HDV抗体と、HDV粒
子中およびHDV感染肝臓中のp24δおよびp27δの比較）O
RF5がコードした、porf５由来のポリペプチドの細菌中
における発現、およびその溶解産物の調製は、Ｄ．３．
節中で上述したように行った。HDV粒子およびHDV感染肝
臓の溶解産物は、K.F. BergmannおよびJ.L. Geria, J o
f Inf Diseases(1986)154：702(これにより参照文献と
して採用する）に記述されている方法に従って、親切に
もK.F. Bergmann氏によって調製された。肝臓溶解産物
の調製においては、肝臓の試料を鋏で細かく切り刻み、
そしてPBSで洗浄し、次いで６MのグアニジニウムHCl(pH
６）中でPotter-Elvejem装置を用いて均質化した。４℃
にて１〜３時間のインキュベーションの後、抽出物を10
分間、1500ｇで遠心分離し、PBSに対して透析し、そし
て再度、遠心分離した。ウイルスの溶解産物は、報告さ
れた方法を変更し、BSAを除くことによって調製され
た。血清試料を、20％スクロース、0.02M HEPES(pH7.
4), 0.01M CaCl2, 0.01M MgCl2上に積み重ね、そしてSW
41ローター中、150,000ｇで５時間、遠心分離し、ウイ
ルスをペレット化した。このペレットは、0.05M Tris
（pH 6.8）および２％SDS中で保持した。

【０１３２】ORF5を発現する細菌溶解産物は、12％ラエ
ムリ（Laemmli)ゲル上の、ペレット化したHDV抽出物、
またはHDAg陽性の肝臓抽出物に隣接したレーン中で電気
泳動を行い、ニトロセルロースフィルターにイムノブロ
ットさせ、そしてHDV抗血清（希釈率１：400)でインキ
ュベートした。図１０Ａは、HDVウイルスの抽出物（レ
ーン１）、感染した肝臓溶解産物（レーン２）、そして
prof５発現後の細菌溶解産物（レーン３）のイムノブロ
ットを表す。図１０Ａに明らかなように、細菌溶解産物
中の２つの主要な免疫反応性ポリペプチドは、ペレット
化したウイルスおよびHDAg陽性の肝臓から抽出されたp2
7δおよびp24δのポリペプチドと共に移動するようであ
った。いくつかの低分子量の免疫反応性ポリペプチド
も、細菌溶解産物中に存在した；これらは、p27および
／またはp24のタンパク分解産物を表している。

【０１３３】（Ｄ．４．ｂ．酵母または細菌中で発現し
たORF5ポリペプチドと、HDV粒子中またはHDV感染肝臓中
のp24δおよびp27δとの間の免疫学的競合）組換えORF5
産物と、ウイルスペプチドp24δおよびp27δとの間の免
疫学的競合は、競合結合測定法によって測定した。一般
に、HDV抗血清は、酵母または細菌中のいずれかで生産
された組換えORF5産物に吸収させた。前吸収させた血清
は、イムノブロッティング法におけるウイルスのp24δ
およびp27δへの結合能力に関して、対照血清と比較し
た。対照血清は、対照（親）ベクターで形質転換した、
酵母または細菌培養物の発現産物に前吸収されていたHD
V抗血清であった。発現条件は、ORF5を含む組換えベク
ターを発現させるような条件であった。

【０１３４】pYAG−δp1で形質転換した酵母株AB110中
で発現したORF5産物と、HDV粒子中のp24δおよびp27δ
との間の免疫学的競合は、以下のように測定した。組換
えORF5産物は、酵母中で発現させ、そしてＤ．３．節中
に記述した条件下で部分的に精製した。

【０１３５】HDV粒子の抽出物を調製し、ラエムリゲル
上で判読し、そしてイムノブロッティング法において、
ニトロセルロースフィルターをHDV抗血清とインキュベ
ートをする前に、阻止剤として１×PBS(0.14 M NaCl,
2.5mM KCl, 1.5mM KH2PO4,８mM Na2HPO4・ 12H2O 、pH
＝ 7.4）中の５％無脂肪ミルクを用いること以外は、
Ｄ．４．ａ．節中に記述されているようにブロットさせ
た。このイムノブロットさせたHDVポリペプチドは、1)
親の対照プラスミド、pAB24；または2)ORF5を含むプラ
スミド、pYAG−δp1のいずれかを発現している、0.44ml
の酵母培養物（OD₆₅₀＝16 OD/ml）からの抽出物に前吸
収させたHDV抗血清とインキュベートした。

【０１３６】図１０Ｂは、対照のプラスミド（レーン
１）；またはORF5を含むプラスミド（レーン２）のいず
れかを発現している酵母の溶解産物に前吸収させたHDV
抗血清を用いたイムノブロットを表す。この図に明らか
なように、組換えORF5ポリペプチドがHDV抗血清を前吸
収することにより、HDVポリペプチドp24δおよびp27δ
に結合している抗体は完全に排除された；対照の溶解産
物に前吸収させたADV抗血清を用いた前吸収では、結合
を阻止できなかった。図１０Ｂの弱い、拡散バンド、す
なわちレーン２は、非特異的な結合を表し得る。なぜな
ら、HDV抗体を欠く対照の血清をHDV抗血清に置き換えた
場合にも、このようなバンドが存在したからである。HD
V抗血清中のポリクローナル抗体に共通の結合から、ORF
ポリペプチドは、免疫学的にp24δおよびp27δとして同
定し得たと推論し得る。

【０１３７】細菌または酵母中で発現させたORF5ポリペ
プチドと、感染した肝臓中のp24δおよびp27δとの間の
免疫学的競合も測定した。酵母株HB110（pYAG−δp1）
におけるORF5ポリペプチドの発現は、上述したとおりで
あった；porf５で形質転換した E.coli D1210におけるO
RF5ポリペプチドの発現は、Ｄ．３．節中に記述された
条件下でなされた。肝臓の溶解産物を調製し、ブロッテ
ィング方法に上述の変更を用いること以外は、Ｄ．４．
ａ．節に記述されたようにブロットさせた。HDAg陽性の
肝臓抽出物中のポリペプチドのブロットは、以下のもの
とプレインキュベートしたHDV抗血清とインキュベート
した：pAB24を発現する酵母培養物AB110の抽出物（対
照）；pYAG−δp1からのORF5を発現する酵母培養物AB11
0の抽出物；pSOD16cf2を発現するE.coli D1210の抽出物
（対照）；そしてporf５を発現するE.coliの抽出物。以
下の１）および２）を用いて、HDV抗血清の前吸収を行
った：1)酵母培養物は、OD650,＝16 OD/mlのものを0.44
ml；および2) E.coliは、OD650＝0.6OD／μlのものを約
100ml。このブロットは、前吸収させたHDV抗血清の１：
1000希釈物とインキュベートした。さらに、対照とし
て、１つのブロットを、同量の透析された尿素抽出緩衝
液とプレインキュベートしたHDV抗血清とインキュベー
トした。

【０１３８】図１０Ｃは、対照のプラスミドを発現して
いる酵母（レーン１）；ORF5を発現している酵母（レー
ン２）；対照のプラスミドを発現しているE.coli（レー
ン３）；ORF5を発現している E.coli（レーン４）；そ
して緩衝液対照（レーン５）に前吸収された血清を用い
たHDVポリペプチドのイムノブロットを表している。こ
の図に明らかなように、酵母中で発現されたORF5ポリペ
プチドがHDV抗血清を前吸収することにより、HDV特異的
抗体がHDAg陽性の肝臓抽出物中のp27δおよびp24δに結
合することを完全に排除した。細菌培養物からのORF5ポ
リペプチドも、HDV特異的な抗体がp27δに結合すること
を排除するようであり、そしてこれらの抗体がp24δに
結合することを、元のオートラジオグラムのデンシトメ
トリーによる追跡に基づいて少なくとも10分の１に減少
させた。p24δへのHDV抗血清の残存する結合は、おそら
く細菌抽出物における限定量のORF5ポリペプチドによる
ものである。HDV抗原がHDAg感染肝臓からのp24δおよび
p27δに結合することを著しく減少させた対照物は存在
しなかった。

【０１３９】（Ｄ．４．ｃ．ORF5がコードしたポリペプ
チドと HDV感染肝臓中の核HDAgとの間の免疫学的競合）
HDAg陽性の肝臓切片を、酵母中で発現する、ORF5がコー
ドしたポリペプチド、または対照の溶解産物に吸収され
ていたHDV抗血清とインキュベートした。対照を含む、
前吸収されたHDV抗血清の調製は、Ｄ．３．Ｂ．節に記
述したように行った。次いで、この切片は、抗ヒトIgG
を標識化したペルオキシダーゼとインキュベートし、そ
して間接的な免疫ペルオキシダーゼ染色を行った。この
方法は、Govindarajan, S.ら、Histopathology (1984)
8 : 63（これによって参照文献として採用する）に従っ
た。この方法において、内生のペルオキシダーゼは、前
もってブロックしておいた。脱柔軟化した切片は、室温
の湿室中で30分間、前吸収した HDV抗血清とインキュベ
ートし、次いでPBSで２回、洗浄し、そして湿室中で、
ウサギの抗ヒトIgGを結合した西洋ワサビペルオキシダ
ーゼで処理した。次いで、これらの切片をPBS中で10分
間、洗浄し、そして５〜８分間、３−3'ジアミノ−ベン
ジジンハイドロクロライドおよび過酸化水素で処理し
た。脱水後、これらの切片の被膜をとり、そして光学顕
微鏡によって観察した。

【０１４０】図１１は、染色した肝臓切片の写真を表
す。この写真は、150倍の倍率で撮影した。図１１Ａ
は、対照の酵母溶解産物とインキュベートしたHDV抗血
清により得られた、間接的な免疫ペルオキシダーゼ染色
を表す。図１１Ｂは、HDV抗血清を、酵母中で発現す
る、ORF5がコードしたポリペプチドに前吸収されている
場合の染色を表す。対照の抽出物に前吸収したHDV抗血
清中で観察された、HDAgに対する抗体の核への明白な結
合とは対照的に、この抗血清が組換えORF5ポリペプチド
に前吸収されている場合には、結合は存在しなかった。

【０１４１】これまで、p24δおよびp27δが核デルタ抗
原の成分であるという直接的な証拠が不足していた。上
に与えたデータは、ORF5がコードした産物が、HDV特異
的な抗体に対する核デルタ抗原と競合することを示して
いる。このデータは、さらにORF5が、p24δおよびp27δ
と同じ大きさのポリペプチドであって、これらのウイル
スポリペプチドと同様の免疫反応性エピトープを有す
る、２つのポリペプチドをコードすることを示す。従っ
て、これらのデータを組み合わせると、ORF5がウイルス
ポリペプチドp24δおよびp27δをコードすること、およ
びこれらのポリペプチドが、HDV感染肝臓における核デ
ルタ抗原の成分であることが示される。

【０１４２】（Ｄ．５．ハイブリッド粒子HDV免疫原）
同一の譲受人に譲渡された米国特許出願第650,323号（1
984年４月12日出願）をここに参照文献として採用す
る。この出願には、Ｂ型肝炎の表面抗原（HBsAg)に対す
るコドンを有する読取り枠中のプレサーフェイス（pre-
S)コーディング部分への外来免疫原の挿入物を含んでい
るHBsAg のハイブリッド粒子の構築が記載されている。
そこに記述されているプラスミドpDC101は、pBR322誘導
体のBamHI部位にクローン化されたGAPDH調節発現カセッ
ト中に、pre-S領域の55コドンを含む、pre-S/HBsAg遺伝
子の１部分を含んでいる。参照文献として採用した出願
には、pDC101のpre-S領域に存在する唯一の EcoRI部位
に、gD（糖タンパクＤ）抗原部位のような、所望の免疫
原を挿入し、ハイブリッドプラスミドpDC103を与えるこ
とが記載されている。同様に、本発明によれば、HDVゲ
ノムに由来する所望のエピトープ、特にORF5でコードさ
れたエピトープが適切なEcoRIリンカーを用いて提供さ
れ、そしてpDC101のEcoRI部位中の正しい読取り枠に挿
入するか、あるいはpDC103ハイブリッド中のgDコドンを
置換するために用い得る。pDC103は、ATCCに供託されて
いる（受託番号No. 20726)。

【０１４３】ハイブリッド粒子の免疫原は、このように
HBsAgおよびHDVに対する融合されたコード配列を用いて
調製され、そしてHDVエピトープに対する増幅された免
疫原性を提供する。

【０１４４】（Ｄ．６．ORF5がコードしたポリペプチド
に対する抗体の生産）ORF5がコードしたポリペプチドに
対する抗体は、酵母株AB110(pYAG-!p1)中で発現され、
部分的に精製された、ORF5がコードしたポリペプチドを
用いて、動物に免疫性を与えることにより生産される。
発現条件、および酵母ORF5産物に対する部分的な精製方
法は、前述の方法である。それにより導かれたポリクロ
ーナル抗体は、アフィニティークロマトグラフィー、す
なわち親のプラスミドpAB24の発現産物を含んでいるア
フィニティーカラムに、この抗血清を通過させることに
よって、ORF5がコードしたポリペプチドに対する抗体か
ら精製し得る。ORF5産物に対する抗体は、その流出液中
に存在するはずである。アフィニティーカラムの調製技
術は、当該技術分野における普通の業者に既知である。

【０１４５】

【発明の効果】ここに開示された本発明は、以下のよう
な産業上の用途を有する。HDVゲノムのヌクレオチド配
列に関する情報は、HDV感染の診断に有用なヌクレオチ
ドプローブの設計に使用し得る；これらのプローブは、
さらに診断のキットに使用し得る。このヌクレオチド配
列の情報は、ペプチドおよびポリペプチドの合成にも使
用し得る。これらのペプチドおよびポリペプチドは、以
下のような用途を有する。ORF5配列から合成されたペプ
チドおよびポリペプチドは、特にHDV抗体の存在によっ
て影響されるような HDV感染を診断することに有用であ
る。なぜなら、ORF5がHDVδ抗原を含むポリペプチドを
コードするからである。さらに、ORF5配列の発現産物
は、HDVに対するワクチンの生産、およびポリクローナ
ルとモノクローナルの両方のHDV抗体の調製に有用であ
る。ORF5産物に対するHDV抗体は、抗原自身の存在に基
づくHDV抗原の診断に使用し得る。これらの抗体は、HDV
に対する診断キットの基礎を形成し得る。さらに、こ
れらの抗体は HDVに対するワクチンとして使用し得る。

【０１４６】他のORF配列から合成されたペプチドまた
はポリペプチドも、HDVがコードした成分に対する抗体
の生産に使用し得る。これらの抗体は、ORF配列産物と
同様に、ウイルスの複製サイクル、およびウイルス成分
との細胞内相互作用の測定に有用である。この知識は、
またHDVに対するワクチンの商業的開発に有用である。

【０１４７】（発明の要約）Ｄ型肝炎ウイルスの完全な
ゲノムは、1679塩基の環状１本鎖RNAであることが示さ
れた。ゲノム鎖および相補鎖の両方におけるいくつかの
開放された読取り枠は、タンパクを生産し得ることを示
している。開放された読取り枠の１つ、ORF5でコードさ
れる産物は、ウイルスのポリペプチド、すなわちp24δ
およびp27δとして同定され、HDV感染肝臓の核δ抗原
は、これらのポリペプチドからなる。これらの産物は、
ORF1、２、６および７でコードされる他のものと同様
に、組換え発現系で生産される。特に、ORF5産物はHDV
診断およびワクチンに有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】HDVの１本鎖RNAゲノムの図、およびその構造決
定に用いられる重複するcDNAのクローンの位置を示す図
である。

【図２】完全なHDV RNAゲノムに対応する２本鎖cDNAの
完全なヌクレオチド配列を示す図である。

【図３】ORF5のRNAに等価なcDNAの配列、および導かれ
たアミノ酸配列、および他のクローンから決定されたヌ
クレオチドの異質性を示す図である。

【図４】該ウイルスのヌクレオチド配列を得るのに有用
なクローンδ１の配列を示す図である。

【図５】ウイルスＲＮＡへのプローブのハイブリダイゼ
ーションを示す電気泳動写真である。

【図６】免疫反応性HDVペプチドのE.coliによる生産を
説明するゲルを示す電気泳動写真である。

【図７】HDVゲノムのＯＲＦの位置、およびその相補鎖
の位置を示す図である。

【図８】SODに融合したORF1、ORF2、ORF6およびORF7の
発現産物、およびORF5の非融合発現産物の HDV抗血清を
用いたイムノブロットを示す電気泳動写真である。

【図９】いくつかの遺伝的性質を含むpAB24の制限地図
を示す図である。

【図１０】Ａは、HDV粒子中および感染肝臓溶解産物中
に存在する抗原と比較して、E.coliで発現される非融合
ORF5産物のHDV抗血清を用いたイムノブロットを示し、
Ｂは、HDV粒子中に存在するp24δおよびp27δと、酵母
中で発現されるORF5産物との間のHDV抗体に対する競合
を表すイムノブロットを示し、そしてＣは、HDV感染肝
臓中に存在するp24δおよびp27δと、酵母および細菌中
で発現されるORF5産物との間のHDV抗体に対する競合を
表すイムノブロットを示す電気泳動写真である。

【図１１】酵母で発現されるORF5産物がHDV抗体に対し
て肝臓HDVδ抗原と競合することを示す、間接イムノペ
ルオキシダーゼ染色法により染色された肝臓切片を示す
顕微鏡写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ 21/08 9358−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/576 Ｚ 33/577 Ｂ // Ａ６１Ｋ 39/29 ＡＤＹ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:92） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡ Ａ Ｃ１２Ｒ 1:92） (72)発明者 カン−シェン ワン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94608 オークランド，シャタック アベニュー 6420 (72)発明者 キイ−リム チョー アメリカ合衆国 カリフォルニア 94530 エル セリット，ファーン ストリート 5700 (72)発明者 アミー ジョアン ウェイナー アメリカ合衆国 カリフォルニア 94702 バークレー，アクトン 1416 (72)発明者 レイシー ラスコ オバービー アメリカ合衆国 カリフォルニア 94507 アラモ，チェリー ヒルズ コート 28

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下のアミノ酸配列を有するポリペプチ
   ドｐ１をコードするヌクレオチド配列で形質転換された
   細胞から得られる精製ＨＤＶ抗原性タンパク質により誘
   起される抗体： 【化１】
2. 【請求項２】 前記ポリペプチドが、以下のアミノ酸配
   列を有するｐ２４δである、請求項１に記載の抗体： 【化２】
3. 【請求項３】 前記ポリペプチドが、以下のアミノ酸配
   列を有するｐ２７δである、請求項１に記載の抗体： 【化３】
4. 【請求項４】 ＨＤＶに対する抗体を製造する方法であ
   って、ＨＤＶ抗原内に含まれるエピトープであると免疫
   学的に同定可能なエピトープを含むタンパク質を用いて
   動物に接種する工程、および該動物から抗体を得る工程
   を包含し、該タンパク質が、ｐ１、ｐ２４δ、またはｐ
   ２７δをコードするヌクレオチド配列を含む組換えベク
   ターで形質転換された宿主細胞中で合成される、方法。
5. 【請求項５】 生物学的試料中のＨＤＶ抗原の存在を分
   析するためのキットであって、ｐ１、ｐ２４δ、または
   ｐ２７δに対して生じる抗体、および該分析のための指
   示を含む、キット。