JPH09309844A - 肝炎δのワクチン - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 HDV感染の治療または予防のためのワクチ
ンを提供すること。 【解決手段】 HDV感染の治療または予防のためのワ
クチンであって、ポリペプチドp1、p24δ、またはp
27δを含む、ワクチン。
ンを提供すること。 【解決手段】 HDV感染の治療または予防のためのワ
クチンであって、ポリペプチドp1、p24δ、またはp
27δを含む、ワクチン。
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】この出願は、1986年6月17日
に提出され「肝炎δの診断薬およびワクチン」と命名さ
れた米国出願第875,337号の一部継続出願である。
に提出され「肝炎δの診断薬およびワクチン」と命名さ
れた米国出願第875,337号の一部継続出願である。
【0002】本発明は、肝炎δの感染の拡大を制御する
材料および方法論に関する。さらに特定すると、肝炎δ
ウイルスに関する診断DNA断片、診断タンパク、および
防御抗原と抗体に関する。
材料および方法論に関する。さらに特定すると、肝炎δ
ウイルスに関する診断DNA断片、診断タンパク、および
防御抗原と抗体に関する。
【0003】
【従来の技術】肝炎ウイルスの異常型、D型肝炎(HDV)
(これは、またδ因子とも呼ばれる)は、Rizzetto,
M.,ら、Gut (1977) 18:997-1003により、1977年に発見
された。このウイルスは、B型肝炎に感染した患者の肝
臓細胞の免疫蛍光により、新抗原/抗体系として検出さ
れた。事実、その後の研究によれば、D型肝炎ウイルス
は、複製のためにはB型肝炎ウイルスとの同時感染に依
存することが示された。このヘルパー機能の性質は今の
ところ明らかでない。しかし、このHDVは、明らかに
「δ抗原」タンパクにより囲まれている1本鎖RNAゲノ
ムを含む。このタンパクはさらにB型肝炎表面抗原(HB
sAg)に囲まれており、35〜37nmの粒子形態をとっている
(Rizzetto, M., et al, Proc Natl Acad Sci USA (198
0) 77:6124-6128;Bonino,F.,et al, Hepatology (198
1) 1:127-131)。それゆえ、感染中に生成されるDNAは
「ゲノム」鎖および相補鎖を有するだろう。
(これは、またδ因子とも呼ばれる)は、Rizzetto,
M.,ら、Gut (1977) 18:997-1003により、1977年に発見
された。このウイルスは、B型肝炎に感染した患者の肝
臓細胞の免疫蛍光により、新抗原/抗体系として検出さ
れた。事実、その後の研究によれば、D型肝炎ウイルス
は、複製のためにはB型肝炎ウイルスとの同時感染に依
存することが示された。このヘルパー機能の性質は今の
ところ明らかでない。しかし、このHDVは、明らかに
「δ抗原」タンパクにより囲まれている1本鎖RNAゲノ
ムを含む。このタンパクはさらにB型肝炎表面抗原(HB
sAg)に囲まれており、35〜37nmの粒子形態をとっている
(Rizzetto, M., et al, Proc Natl Acad Sci USA (198
0) 77:6124-6128;Bonino,F.,et al, Hepatology (198
1) 1:127-131)。それゆえ、感染中に生成されるDNAは
「ゲノム」鎖および相補鎖を有するだろう。
【0004】伝染の疫学および様式は、B型肝炎(HBV)
とHDVとで類似しているらしい。そこでは、HDVは、輸血
を通して、および体液の密接な直接接触により伝染す
る。HDV(またはδ)感染の3つの型が同定されてい
る:慢性B型への急性δの重感染、慢性B型への慢性δ
の併発、および急性δとB型肝炎との同時感染(Schif
f,E.R.,et al, Diagnostic Medicine(1985,3月)17-
22)。この病気は最初は地中海海域で確認されたが、全
世界に拡がったらしい(Jacobson, I.M., et al, Hepat
ology (1985) 5:188-191)。この病気の人口統計学的局
面および疫学的局面の再調査は、またRizzetto, M.,
ら、J Hepatol (1985) 1:187-193に見出される。
とHDVとで類似しているらしい。そこでは、HDVは、輸血
を通して、および体液の密接な直接接触により伝染す
る。HDV(またはδ)感染の3つの型が同定されてい
る:慢性B型への急性δの重感染、慢性B型への慢性δ
の併発、および急性δとB型肝炎との同時感染(Schif
f,E.R.,et al, Diagnostic Medicine(1985,3月)17-
22)。この病気は最初は地中海海域で確認されたが、全
世界に拡がったらしい(Jacobson, I.M., et al, Hepat
ology (1985) 5:188-191)。この病気の人口統計学的局
面および疫学的局面の再調査は、またRizzetto, M.,
ら、J Hepatol (1985) 1:187-193に見出される。
【0005】この病気の経過はよく知られており、そし
てこのビリオンの一般的構造も理解されている。しか
し、このウイルスの遺伝子構造として利用できる情報は
以前にはなく、しかもδ抗原の性質もわかっていなかっ
た。血液試料を用いることによるこの病気の存在の検出
に利用できる唯一の分析は、ヨーロッパで市場に出てい
る免疫分析である。これは、アメリカ合衆国ではまだFD
Aの認可を受けていない。以前の検出方法は、生検標本
での肝細胞の核の直接免疫蛍光法に限られていた。本検
出方法の一つの型は、標識抗δIgGのδ抗原自体への結
合を、検査血清中の抗体が阻止する能力に基づく。他の
形態は、検査血清からの抗δIgMが固相に固定された抗
ヒトIgM(μ鎖に特異的)に結合し、次いで標準δ抗原
および標識抗δIgMを加えることにより、検査血清中の
抗δIgMの存在(追加されたδ抗原とともに)によって
標識抗δIgMの結合を可能とする能力に依存する。これ
らの検査は、いずれもδ抗原タンパクの構造またはHDV
ゲノムの構造の分析、またはそれら構造の知見を必要と
しない。
てこのビリオンの一般的構造も理解されている。しか
し、このウイルスの遺伝子構造として利用できる情報は
以前にはなく、しかもδ抗原の性質もわかっていなかっ
た。血液試料を用いることによるこの病気の存在の検出
に利用できる唯一の分析は、ヨーロッパで市場に出てい
る免疫分析である。これは、アメリカ合衆国ではまだFD
Aの認可を受けていない。以前の検出方法は、生検標本
での肝細胞の核の直接免疫蛍光法に限られていた。本検
出方法の一つの型は、標識抗δIgGのδ抗原自体への結
合を、検査血清中の抗体が阻止する能力に基づく。他の
形態は、検査血清からの抗δIgMが固相に固定された抗
ヒトIgM(μ鎖に特異的)に結合し、次いで標準δ抗原
および標識抗δIgMを加えることにより、検査血清中の
抗δIgMの存在(追加されたδ抗原とともに)によって
標識抗δIgMの結合を可能とする能力に依存する。これ
らの検査は、いずれもδ抗原タンパクの構造またはHDV
ゲノムの構造の分析、またはそれら構造の知見を必要と
しない。
【0006】現在、DNAハイブリダイゼーションによる
この病気の診断に有効なプローブの設計が可能であり、
また同時にワクチンとして、そして診断検査の際の薬と
して使える組換えタンパクの生成も可能である。さら
に、組換えにより生産されるタンパクは、診断または受
動的な治療に有用な抗体を生成するために使用可能であ
る。
この病気の診断に有効なプローブの設計が可能であり、
また同時にワクチンとして、そして診断検査の際の薬と
して使える組換えタンパクの生成も可能である。さら
に、組換えにより生産されるタンパクは、診断または受
動的な治療に有用な抗体を生成するために使用可能であ
る。
【0007】HDV診断薬またはワクチンの生産に有用な
本発明のヌクレオチド配列は、図2に示されるD型肝炎
ウイルス(HDV)ゲノムまたはその相補体に由来する。こ
の配列は、開放された読取り枠(ORF)1−12、好ましく
はORF1、ORF2、ORF5、ORF6、ORF7、さらに好ましくはOR
F5に由来する領域を包含する。
本発明のヌクレオチド配列は、図2に示されるD型肝炎
ウイルス(HDV)ゲノムまたはその相補体に由来する。こ
の配列は、開放された読取り枠(ORF)1−12、好ましく
はORF1、ORF2、ORF5、ORF6、ORF7、さらに好ましくはOR
F5に由来する領域を包含する。
【0008】本発明の組換え発現系は、所望の宿主と適
合可能な制御配列に作動し得るように連結し上記配列に
由来する、DNAのコード部分を包含する。
合可能な制御配列に作動し得るように連結し上記配列に
由来する、DNAのコード部分を包含する。
【0009】本発明は、上記発現系で形質転換された宿
主細胞を包含する。本発明はまた、上記細胞により生産
されるタンパクを包含する。本発明はまた、上記タンパ
クにより生ずる抗体を包含する。
主細胞を包含する。本発明はまた、上記細胞により生産
されるタンパクを包含する。本発明はまた、上記タンパ
クにより生ずる抗体を包含する。
【0010】HDV抗原に対する抗体を生ずる本発明の免
疫原性粒子は、アミノ酸配列が真核宿主で生産される場
合、粒子を形成し得る該アミノ酸配列を有する組換えポ
リペプチドを含有し、該ポリペプチドはHDVのエピトー
プを含む。
疫原性粒子は、アミノ酸配列が真核宿主で生産される場
合、粒子を形成し得る該アミノ酸配列を有する組換えポ
リペプチドを含有し、該ポリペプチドはHDVのエピトー
プを含む。
【0011】生物試料中のHDVの存在を検出するのに有
用な本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、図9に示
されるHDVゲノム配列またはその相補体に由来する、8
またはそれ以上のヌクレオチドのDNA配列を包含する。
用な本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、図9に示
されるHDVゲノム配列またはその相補体に由来する、8
またはそれ以上のヌクレオチドのDNA配列を包含する。
【0012】HDVの存在について生物試料を分析するた
めの本発明のキットは、上記オリゴヌクレオチドプロー
ブ、および該分析の指示書を含む。
めの本発明のキットは、上記オリゴヌクレオチドプロー
ブ、および該分析の指示書を含む。
【0013】生物試料中のHDV抗原の存在を分析するた
めの本発明の他のキットは、上記形質転換された細胞に
より生産されるタンパクまたは上記免疫原性粒子に対し
て生じる抗体、および該分析の指示書を含む。
めの本発明の他のキットは、上記形質転換された細胞に
より生産されるタンパクまたは上記免疫原性粒子に対し
て生じる抗体、および該分析の指示書を含む。
【0014】生物試料中のHDV抗体の存在を分析するた
めの本発明の他のキットは、上記ヌクレオチド配列内に
コードされるエピトープを含むポリペプチドを含有す
る。
めの本発明の他のキットは、上記ヌクレオチド配列内に
コードされるエピトープを含むポリペプチドを含有す
る。
【0015】HDV感染の治療または予防のための本発明
のワクチンは、上記ヌクレオチド配列にコードされるポ
リペプチドを含有する。
のワクチンは、上記ヌクレオチド配列にコードされるポ
リペプチドを含有する。
【0016】HDV抗原内に含まれるエピトープとして免
疫学的に同定可能なエピトープを含むタンパクを生産す
るための本発明の方法は、組換えベクターにより形質転
換された宿主細胞を該ベクターを発現させる条件下で培
養することを包含し、該ベクターは、図2に示されるHD
Vゲノムまたはその相補体に由来するヌクレオチド配列
を含む。
疫学的に同定可能なエピトープを含むタンパクを生産す
るための本発明の方法は、組換えベクターにより形質転
換された宿主細胞を該ベクターを発現させる条件下で培
養することを包含し、該ベクターは、図2に示されるHD
Vゲノムまたはその相補体に由来するヌクレオチド配列
を含む。
【0017】HDVを検出する本発明の方法は、図2に示
されるHDVゲノムまたはその相補体に由来するヌクレオ
チド配列と生物試料をハイブリダイズさせることを包含
する。
されるHDVゲノムまたはその相補体に由来するヌクレオ
チド配列と生物試料をハイブリダイズさせることを包含
する。
【0018】HDVに対する抗体を生産するための本発明
の方法は、HDV抗原内に含まれるエピトープとして免疫
学的に同定可能なエピトープを含むタンパクを用いて動
物に予防接種することを包含し、該タンパクは、図2に
示されるHDVゲノムまたはその相補体に由来するヌクレ
オチド配列を含む組換えベクターにより形質転換された
宿主細胞中で合成される。
の方法は、HDV抗原内に含まれるエピトープとして免疫
学的に同定可能なエピトープを含むタンパクを用いて動
物に予防接種することを包含し、該タンパクは、図2に
示されるHDVゲノムまたはその相補体に由来するヌクレ
オチド配列を含む組換えベクターにより形質転換された
宿主細胞中で合成される。
【0019】本発明は、完全なHDVゲノム配列のcDNA複
製物の群を提供する。これらのcDNA配列の一部は、臨床
試料中のウイルスの存在を診断するためのプローブとし
て、およびこのウイルスの天然で生ずる変種を単離する
ためのプローブとして有用である。この基本的なゲノム
配列(およびその相補体)を知ることは、また開放され
た読取り枠の1つにコードされるδ抗原のポリペプチド
配列を使用可能とし、これらペプチドまたはその一部
(これらは標準物または診断検査薬として、そしてワク
チンの成分として有用である)の生産を可能にする。同
様に、いずれかの鎖の他の開放された読取り枠の分析に
より、他のウイルスペプチド配列の推定が可能となる。
このペプチド配列は、HDVの特徴であり、そして同様に
有用であろう。保護抗体もまた、組換えで生産されるタ
ンパクからつくられ、そしてポリクローナル型またはモ
ノクローナル型で得られる。
製物の群を提供する。これらのcDNA配列の一部は、臨床
試料中のウイルスの存在を診断するためのプローブとし
て、およびこのウイルスの天然で生ずる変種を単離する
ためのプローブとして有用である。この基本的なゲノム
配列(およびその相補体)を知ることは、また開放され
た読取り枠の1つにコードされるδ抗原のポリペプチド
配列を使用可能とし、これらペプチドまたはその一部
(これらは標準物または診断検査薬として、そしてワク
チンの成分として有用である)の生産を可能にする。同
様に、いずれかの鎖の他の開放された読取り枠の分析に
より、他のウイルスペプチド配列の推定が可能となる。
このペプチド配列は、HDVの特徴であり、そして同様に
有用であろう。保護抗体もまた、組換えで生産されるタ
ンパクからつくられ、そしてポリクローナル型またはモ
ノクローナル型で得られる。
【0020】それゆえ、完全なHDV配列の有用性によ
り、ワクチンまたは診断薬のいずれかとして役立つポリ
ペプチド、またはこの病気に対する受動的免疫治療薬に
有用なモノクローナル抗体(Mab)調製物を生産する際の
中間体として役立つポリペプチド、または診断薬として
有用な抗体生産の中間体として役立つポリペプチドの設
計および構築が可能となる。治療成分または阻止成分の
設計者の随意になる完全なゲノム配列がなければ、最も
効果的な産物の望ましい生産は不可能であろう。
り、ワクチンまたは診断薬のいずれかとして役立つポリ
ペプチド、またはこの病気に対する受動的免疫治療薬に
有用なモノクローナル抗体(Mab)調製物を生産する際の
中間体として役立つポリペプチド、または診断薬として
有用な抗体生産の中間体として役立つポリペプチドの設
計および構築が可能となる。治療成分または阻止成分の
設計者の随意になる完全なゲノム配列がなければ、最も
効果的な産物の望ましい生産は不可能であろう。
【0021】従って、ある局面では、本発明はHDV診断
薬およびワクチンの生産に有用なヌクレオチド配列に関
する。この診断薬およびワクチンは、図2に示されるよ
うなHDVゲノムまたはその相補体に由来する。それゆ
え、本発明は、診断薬としてまたはワクチンとして役立
つペプチドの生産のために、これらペプチド自体に対す
るオリゴマープローブとして、および病気の診断と治療
に有用なポリクローナルおよびモノクローナル抗体に対
するオリゴマープローブとして、この配列またはその一
部の利用に関する。
薬およびワクチンの生産に有用なヌクレオチド配列に関
する。この診断薬およびワクチンは、図2に示されるよ
うなHDVゲノムまたはその相補体に由来する。それゆ
え、本発明は、診断薬としてまたはワクチンとして役立
つペプチドの生産のために、これらペプチド自体に対す
るオリゴマープローブとして、および病気の診断と治療
に有用なポリクローナルおよびモノクローナル抗体に対
するオリゴマープローブとして、この配列またはその一
部の利用に関する。
【0022】本発明の他の局面には発現系が包含され
る。この発現系は、所望タンパク(これは完全なゲノム
に由来の配列によってコードされている)の生産を生じ
得る。この発現系は、系またはその一部に含まれる組換
えベクター、このようなベクターで形質転換された組換
え宿主細胞、この形質転換細胞により生産されるタンパ
ク、およびこのようなタンパクから調製されるワクチン
に対する発現系である。さらに、本発明は、このゲノム
によりコードされるエピトープを表す特異的ペプチド配
列、および標識タンパクまたは担体タンパクに共有結合
で連結されたこのような配列に関する。より一般的な担
体に加えて、担体タンパクには、B型肝炎感染と関係の
ある22nm粒子が含まれる。この粒子はポリアルブミン
リセプター部位を有し、そして非集合サブユニット成分
の1000倍の免疫力がある。抗原性HDV決定基を22nm HBsA
g粒子に挿入することにより、これらのエピトープに対
する免疫原性を増大させ得る。
る。この発現系は、所望タンパク(これは完全なゲノム
に由来の配列によってコードされている)の生産を生じ
得る。この発現系は、系またはその一部に含まれる組換
えベクター、このようなベクターで形質転換された組換
え宿主細胞、この形質転換細胞により生産されるタンパ
ク、およびこのようなタンパクから調製されるワクチン
に対する発現系である。さらに、本発明は、このゲノム
によりコードされるエピトープを表す特異的ペプチド配
列、および標識タンパクまたは担体タンパクに共有結合
で連結されたこのような配列に関する。より一般的な担
体に加えて、担体タンパクには、B型肝炎感染と関係の
ある22nm粒子が含まれる。この粒子はポリアルブミン
リセプター部位を有し、そして非集合サブユニット成分
の1000倍の免疫力がある。抗原性HDV決定基を22nm HBsA
g粒子に挿入することにより、これらのエピトープに対
する免疫原性を増大させ得る。
【0023】本発明はまた、これら所望のポリペプチド
ワクチンおよび免疫グロブリンの調製方法、およびプロ
ーブ、ポリペプチド、および/または免疫グロブリンを
含む分析キットに関する。
ワクチンおよび免疫グロブリンの調製方法、およびプロ
ーブ、ポリペプチド、および/または免疫グロブリンを
含む分析キットに関する。
【0024】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、HDV感染の
治療または予防のためのワクチンを提供することを目的
とする。
治療または予防のためのワクチンを提供することを目的
とする。
【0025】
【課題を解決するための手段】本発明は、HDV感染を
治療または予防するためのワクチンであって、以下のア
ミノ酸配列を有するポリペプチドp1を含む、ワクチン
を提供する。
治療または予防するためのワクチンであって、以下のア
ミノ酸配列を有するポリペプチドp1を含む、ワクチン
を提供する。
【0026】
【化4】
【0027】好適な実施態様では、上記ポリペプチド
は、以下のアミノ酸配列を有するp24δである。
は、以下のアミノ酸配列を有するp24δである。
【0028】
【化5】
【0029】別の好適な実施態様では、上記ポリペプチ
ドは、以下のアミノ酸配列を有するp27δである。
ドは、以下のアミノ酸配列を有するp27δである。
【0030】
【化6】
【0031】
A.定義 ここで用いられるように、HDVゲノムまたはcDNA「に由
来する(から誘導される)」ヌクレオチド配列とは、例
示されるポリヌクレオチドの本質的な特性を保持してい
る配列を示す。このヌクレオチド配列は、意図する目的
に合うように、それが由来する全配列の一部を表す。こ
のような誘導体の特定の例(しかしこれに限定されな
い)は、同一または実質的に同一のアミノ酸配列をコー
ドするが、しかし、コドンの縮重のために、異なった特
定のコドンを用いる配列により、示されるだろう。別の
例には相補鎖がある。診断試験で有用なプローブまたは
オリゴヌクレオチドは、示された配列と相補性を保つ必
要がある。しかし、このプローブまたはオリゴヌクレオ
チドは、全配列よりも短くてもよく、または部分的にと
んでいてもよい。しかし、操作または発現に用いる場
合、制限部位を作るもしくは欠失させる、プロセッシン
グ部位を与える、あるいはコードされているアミノ酸配
列を(機能性に悪い影響を与えない方法で)変えるよう
に、ヌクレオチドを変えることが望まれる。「ヌクレオ
チド配列」とは、リボヌクレオチド配列およびデオキシ
リボヌクレオチド配列の両方を表し、そしてゲノム鎖お
よびその相補鎖の両方を含む。
来する(から誘導される)」ヌクレオチド配列とは、例
示されるポリヌクレオチドの本質的な特性を保持してい
る配列を示す。このヌクレオチド配列は、意図する目的
に合うように、それが由来する全配列の一部を表す。こ
のような誘導体の特定の例(しかしこれに限定されな
い)は、同一または実質的に同一のアミノ酸配列をコー
ドするが、しかし、コドンの縮重のために、異なった特
定のコドンを用いる配列により、示されるだろう。別の
例には相補鎖がある。診断試験で有用なプローブまたは
オリゴヌクレオチドは、示された配列と相補性を保つ必
要がある。しかし、このプローブまたはオリゴヌクレオ
チドは、全配列よりも短くてもよく、または部分的にと
んでいてもよい。しかし、操作または発現に用いる場
合、制限部位を作るもしくは欠失させる、プロセッシン
グ部位を与える、あるいはコードされているアミノ酸配
列を(機能性に悪い影響を与えない方法で)変えるよう
に、ヌクレオチドを変えることが望まれる。「ヌクレオ
チド配列」とは、リボヌクレオチド配列およびデオキシ
リボヌクレオチド配列の両方を表し、そしてゲノム鎖お
よびその相補鎖の両方を含む。
【0032】従って、HDVのゲノムを含むヌクレオチド
配列に「由来する」DNAとは、ゲノムヌクレオチド配列
の領域(あるいはその相補体)中の配列に相当する配列
を含むDNA配列をいう。あるいは、このDNAは、それの意
図する使用に適合するように、当該分野で公知の方法で
修飾されたこの配列領域の組み合わせを含むDNA配列を
いう。もちろん、これらのDNAは、その遺伝子の塩基配
列からは必ずしも物理的に誘導されない。しかし、これ
らのDNAは、そのポリヌクレオチドが誘導される領域中
の塩基配列から与えられる情報に基づき、あらゆる様式
で生じるポリヌクレオチドのことをいう。例えば、典型
的なDNA配列が「誘導され」得る領域には、特定のエピ
トープをコードする領域、およびδ抗原の一部分をコー
ドする領域が含まれる。同様に、δ抗原に「由来する」
ペプチドは、これらのポリペプチドまたはそれらの一部
と実質的に同一のアミノ酸配列をいう。上記ペプチド
は、その部分と同じ生物学的特性を有する。このような
「誘導された」ペプチドの合成方法は重要ではない。例
えば、その方法は化学合成であり得、もしくは組換え方
法であり得る。
配列に「由来する」DNAとは、ゲノムヌクレオチド配列
の領域(あるいはその相補体)中の配列に相当する配列
を含むDNA配列をいう。あるいは、このDNAは、それの意
図する使用に適合するように、当該分野で公知の方法で
修飾されたこの配列領域の組み合わせを含むDNA配列を
いう。もちろん、これらのDNAは、その遺伝子の塩基配
列からは必ずしも物理的に誘導されない。しかし、これ
らのDNAは、そのポリヌクレオチドが誘導される領域中
の塩基配列から与えられる情報に基づき、あらゆる様式
で生じるポリヌクレオチドのことをいう。例えば、典型
的なDNA配列が「誘導され」得る領域には、特定のエピ
トープをコードする領域、およびδ抗原の一部分をコー
ドする領域が含まれる。同様に、δ抗原に「由来する」
ペプチドは、これらのポリペプチドまたはそれらの一部
と実質的に同一のアミノ酸配列をいう。上記ペプチド
は、その部分と同じ生物学的特性を有する。このような
「誘導された」ペプチドの合成方法は重要ではない。例
えば、その方法は化学合成であり得、もしくは組換え方
法であり得る。
【0033】「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細
胞」、「細胞系」、「細胞培養物」、および単細胞体と
して培養される微生物または高等な真核生物細胞を示す
ような他の用語は、互換的に用いられ、組換えベクター
または他のトランスファーDNAの受容体として用いられ
得るか、あるいは用いられてきた細胞を示す。この細胞
は、トランスフェクトされたもとの細胞の子孫細胞を含
む。単一の親細胞の子孫細胞は、もとの親とは、形態
上、またはゲノムもしくは全DNAにおいて、必ずしも完
全に同一とはなり得ないことがわかった。これは偶然ま
たは故意の変異が原因となる。所望のペプチドをコード
するヌクレオチド配列の存在のような関連した特性によ
り特徴づけられた親細胞と、十分類似しているこの親細
胞の子孫細胞は、この定義により意図される子孫細胞に
含まれ、そして上の用語に包含される。
胞」、「細胞系」、「細胞培養物」、および単細胞体と
して培養される微生物または高等な真核生物細胞を示す
ような他の用語は、互換的に用いられ、組換えベクター
または他のトランスファーDNAの受容体として用いられ
得るか、あるいは用いられてきた細胞を示す。この細胞
は、トランスフェクトされたもとの細胞の子孫細胞を含
む。単一の親細胞の子孫細胞は、もとの親とは、形態
上、またはゲノムもしくは全DNAにおいて、必ずしも完
全に同一とはなり得ないことがわかった。これは偶然ま
たは故意の変異が原因となる。所望のペプチドをコード
するヌクレオチド配列の存在のような関連した特性によ
り特徴づけられた親細胞と、十分類似しているこの親細
胞の子孫細胞は、この定義により意図される子孫細胞に
含まれ、そして上の用語に包含される。
【0034】「制御配列」とは、連結されているコード
配列の発現を生じさせるのに必要なDNA配列を示す。こ
のような制御配列の性質は宿主生物によって異なる。原
核生物では、一般にこのような制御配列は、プロモータ
ーおよびリボゾーム結合部位を含む。真核生物では、一
般に、このような制御配列は、プロモーター、ターミネ
ーターを含み、またある場合には、エンハンサーをも含
む。「制御配列」という用語は、最低限その存在が発現
に必要である全ての成分を含むことを意図している。そ
して、それが存在することが有利であるという付加的な
成分を含んでいてもよい。
配列の発現を生じさせるのに必要なDNA配列を示す。こ
のような制御配列の性質は宿主生物によって異なる。原
核生物では、一般にこのような制御配列は、プロモータ
ーおよびリボゾーム結合部位を含む。真核生物では、一
般に、このような制御配列は、プロモーター、ターミネ
ーターを含み、またある場合には、エンハンサーをも含
む。「制御配列」という用語は、最低限その存在が発現
に必要である全ての成分を含むことを意図している。そ
して、それが存在することが有利であるという付加的な
成分を含んでいてもよい。
【0035】「動作可能に連結された」とは、記述の成
分が、意図された様式にてそれらを機能させるのを許容
する関係にある近位状態をいう。コード配列に、「動作
可能に連結された」制御配列は、このコード配列の発現
が、制御配列に適合可能な状態で達成されるようにして
結合されていることをいう。
分が、意図された様式にてそれらを機能させるのを許容
する関係にある近位状態をいう。コード配列に、「動作
可能に連結された」制御配列は、このコード配列の発現
が、制御配列に適合可能な状態で達成されるようにして
結合されていることをいう。
【0036】「開放された読取り枠」とは、ポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチド配列の領域である。
ドをコードするポリヌクレオチド配列の領域である。
【0037】「〜と/〜として、免疫学に同一である」
とは、非天然型のタンパク、すなわち人工的に合成され
たタンパク、または組換えタンパク中に、エピトープが
存在することを意味する。このようなタンパクは、この
HDVウイルスタンパク中にも存在する。これらのエピト
ープは、このHDVタンパクに対して生じる抗体との免疫
的反応性により同定され得る。非天然型タンパク中での
それらの存在は、このHDV抗体との直接的な反応、およ
び非天然型タンパクとHDVタンパクとの競合分析(これ
は、HDVタンパクに対する抗体の分析である)により、
検出され得る。抗体結合の検出方法、および結合の際の
競合の決定方法は、当該分野で標準的な技術者に公知で
あり、それらはまた以下に例示される。
とは、非天然型のタンパク、すなわち人工的に合成され
たタンパク、または組換えタンパク中に、エピトープが
存在することを意味する。このようなタンパクは、この
HDVウイルスタンパク中にも存在する。これらのエピト
ープは、このHDVタンパクに対して生じる抗体との免疫
的反応性により同定され得る。非天然型タンパク中での
それらの存在は、このHDV抗体との直接的な反応、およ
び非天然型タンパクとHDVタンパクとの競合分析(これ
は、HDVタンパクに対する抗体の分析である)により、
検出され得る。抗体結合の検出方法、および結合の際の
競合の決定方法は、当該分野で標準的な技術者に公知で
あり、それらはまた以下に例示される。
【0038】B.一般的記述 本発明の有用な材料および方法は、その各々がD型肝炎
ウイルスの完全なゲノムを含む、一群のヌクレオチド配
列を与えることにより、実現される。この一群のポリヌ
クレオチドを利用することにより、まず第1に、わずか
な異質性を有する、このゲノム群の他のゲノムを単離し
得る。第2に、診断に有用なDNAおよびタンパクの構築
を可能にする。このDNA、すなわち約8〜10bpあるいは
それ以上のオリゴマーに関しては、病気診断の際のハイ
ブリダイゼーションプローブとして有用である。このよ
うなプローブは、例えば、ウイルスを保持すると思われ
る被検体の血清中にて、ウイルスゲノムの存在を検出す
るのに用いられ得る。このHDV配列はまた、HDV-特異的
ポリペプチドの設計および生産を可能にする。このポリ
ペプチドは、血清または血液中で、HDVに起因する抗体
の存在を調べる診断薬として有用である。これらのポリ
ペプチドに対して生じた抗体はまた、診断薬として有用
である(δ抗原に対する開放読取り枠に加えた開放読取
り枠が、完全なゲノムあるいはその相補体中で解読され
得るので、δ抗原自身の他に、HDV関連タンパクの一次
構造が推論され得る。これらはまた、ウイルスに特有な
マーカーペプチドとなり得、診断にも有用であり、おそ
らく免疫化にも有用であろう)。最後に、この遺伝子配
列の知見はまた、HDVに対し効果的なワクチンの設計お
よび生産を可能にし、そして、感染を防御する抗体の生
産をも可能にする。
ウイルスの完全なゲノムを含む、一群のヌクレオチド配
列を与えることにより、実現される。この一群のポリヌ
クレオチドを利用することにより、まず第1に、わずか
な異質性を有する、このゲノム群の他のゲノムを単離し
得る。第2に、診断に有用なDNAおよびタンパクの構築
を可能にする。このDNA、すなわち約8〜10bpあるいは
それ以上のオリゴマーに関しては、病気診断の際のハイ
ブリダイゼーションプローブとして有用である。このよ
うなプローブは、例えば、ウイルスを保持すると思われ
る被検体の血清中にて、ウイルスゲノムの存在を検出す
るのに用いられ得る。このHDV配列はまた、HDV-特異的
ポリペプチドの設計および生産を可能にする。このポリ
ペプチドは、血清または血液中で、HDVに起因する抗体
の存在を調べる診断薬として有用である。これらのポリ
ペプチドに対して生じた抗体はまた、診断薬として有用
である(δ抗原に対する開放読取り枠に加えた開放読取
り枠が、完全なゲノムあるいはその相補体中で解読され
得るので、δ抗原自身の他に、HDV関連タンパクの一次
構造が推論され得る。これらはまた、ウイルスに特有な
マーカーペプチドとなり得、診断にも有用であり、おそ
らく免疫化にも有用であろう)。最後に、この遺伝子配
列の知見はまた、HDVに対し効果的なワクチンの設計お
よび生産を可能にし、そして、感染を防御する抗体の生
産をも可能にする。
【0039】ゲノムから入手し得る配列情報は、δ抗原
または他のポリペプチドのアミノ酸配列の推論を可能と
し、そして、適したエピトープが同定させる。この完全
なδ抗原または、その適当な部分が、関連したDNA断片
(独立して得られかつ発現される)により生産され得、
それゆえ組換え技術に用いられる所望のポリペプチドが
供給される。原核生物宿主および真核生物宿主の両方
が、このような発現には有用である。短いポリペプチド
断片は、また化学的に合成され得、ワクチンとして用い
るべく、担体タンパクに連結される。さらに、このエピ
トープは、免疫原性を与えるタンパクに連結されて生産
され得る。このように生産されたタンパクは、それ自
体、ワクチンとして用いられ得、または宿主中で免疫応
答B細胞を生産するべく用いられる。次いで、このB細
胞は、受身免疫療法に有用な抗体を分泌するハイブリド
ーマを生産するために用いられ得る。
または他のポリペプチドのアミノ酸配列の推論を可能と
し、そして、適したエピトープが同定させる。この完全
なδ抗原または、その適当な部分が、関連したDNA断片
(独立して得られかつ発現される)により生産され得、
それゆえ組換え技術に用いられる所望のポリペプチドが
供給される。原核生物宿主および真核生物宿主の両方
が、このような発現には有用である。短いポリペプチド
断片は、また化学的に合成され得、ワクチンとして用い
るべく、担体タンパクに連結される。さらに、このエピ
トープは、免疫原性を与えるタンパクに連結されて生産
され得る。このように生産されたタンパクは、それ自
体、ワクチンとして用いられ得、または宿主中で免疫応
答B細胞を生産するべく用いられる。次いで、このB細
胞は、受身免疫療法に有用な抗体を分泌するハイブリド
ーマを生産するために用いられ得る。
【0040】B.1.HDV遺伝子配列の調製 HDVが接種され、高力価のウイルス(1ml当り、約1011
のチンパンジー感染量)を含むチンパンジーの血清が、
ウイルス源として用いられた。集められたウイルスから
抽出された核酸は、変性ゲル電気泳動により分析したと
ころ、常に約1700ヌクレオチドを含む二本鎖RNAであっ
た。このRNAを鋳型として用いて、この二本鎖RNAに特異
的にハイブリダイズする、約164bpのcDNAクローン(pKD
3)が得られた。そしてそのDNA配列が決定された(Denn
iston, K.J., et al, Science (1986) 232 :873-975)。
この決定されたDNA配列(公表に先立って提供された)
に基づいて、2つの相補的な合成オリゴマー(その1つ
はこの二本鎖RNAとハイブリダイズする)が調製され
た。
のチンパンジー感染量)を含むチンパンジーの血清が、
ウイルス源として用いられた。集められたウイルスから
抽出された核酸は、変性ゲル電気泳動により分析したと
ころ、常に約1700ヌクレオチドを含む二本鎖RNAであっ
た。このRNAを鋳型として用いて、この二本鎖RNAに特異
的にハイブリダイズする、約164bpのcDNAクローン(pKD
3)が得られた。そしてそのDNA配列が決定された(Denn
iston, K.J., et al, Science (1986) 232 :873-975)。
この決定されたDNA配列(公表に先立って提供された)
に基づいて、2つの相補的な合成オリゴマー(その1つ
はこの二本鎖RNAとハイブリダイズする)が調製され
た。
【0041】このハイブリダイズするオリゴマーは、次
いで、二本鎖RNAから、岡山/バーグ法によって調製さ
れたcDNAライブラリーのプローブに用いられた。その結
果、570bpの挿入断片を含むクローンδ1が得られ、こ
れはこの二本鎖RNAとハイブリダイズし、また同じライ
ブラリーから、重複しているクローンδ2を得るための
プローブとして用いられた。
いで、二本鎖RNAから、岡山/バーグ法によって調製さ
れたcDNAライブラリーのプローブに用いられた。その結
果、570bpの挿入断片を含むクローンδ1が得られ、こ
れはこの二本鎖RNAとハイブリダイズし、また同じライ
ブラリーから、重複しているクローンδ2を得るための
プローブとして用いられた。
【0042】さらに、クローンδ4およびδ115は、単
離されたRNAのランダムプライミングを用いるpBR322に
調製されたcDNAライブラリーをδ1クローンとともに検
索することにより、得られた。次いで、δ115は、重複
しているクローンδ7a、δ3bおよびδ7bを得るために、
プローブとして用いられた。δ1およびδ2とともに、
独立のクローンδ3b、δ4、δ7a、δ7bおよびδ115に
より、図1において図示された環状一本鎖の1679ヌクレ
オチドRNAの完全な配列が供給された。
離されたRNAのランダムプライミングを用いるpBR322に
調製されたcDNAライブラリーをδ1クローンとともに検
索することにより、得られた。次いで、δ115は、重複
しているクローンδ7a、δ3bおよびδ7bを得るために、
プローブとして用いられた。δ1およびδ2とともに、
独立のクローンδ3b、δ4、δ7a、δ7bおよびδ115に
より、図1において図示された環状一本鎖の1679ヌクレ
オチドRNAの完全な配列が供給された。
【0043】この完全なHDVゲノムの検索法についての
記述は、もちろん、大部分は歴史的に興味深いことであ
る。得られる配列(またそれゆえに、その相補体も)が
ここで提供され、そして完全な配列、または、そのいず
れかの部分であっても、合成法を用い、あるいは合成法
と、ここで記述の方法に類似の方法を用いる部分的配列
の検索とを組み合わせることにより、調製され得る。
記述は、もちろん、大部分は歴史的に興味深いことであ
る。得られる配列(またそれゆえに、その相補体も)が
ここで提供され、そして完全な配列、または、そのいず
れかの部分であっても、合成法を用い、あるいは合成法
と、ここで記述の方法に類似の方法を用いる部分的配列
の検索とを組み合わせることにより、調製され得る。
【0044】B.2.ウイルスポリペプチドおよびその
断片の調製 完全なゲノム配列は、δ抗原、およびゲノムまたはその
相補体によりコードされる他のウイルスポリペプチド
の、抗原的に活性な領域をコードする発現ベクターの構
築を可能にするという有用性がある。所望のタンパクを
コードする断片は、従来の制限分解処理を用いて、その
cDNAクローンから得られるか、または合成法により得ら
れる。これらの断片は、例えば、β−ガラクトシダーゼ
やスーパーオキシドデスムターゼ(SOD)、好ましくはSO
D、のような融合配列の一部を含むベクターに連結され
る。いずれかのセンス鎖において、開放読取り枠を含む
HDVゲノムの所望部分は、成熟タンパクまたは融合タン
パクのような組換えタンパクとして得られるか、または
化学合成法や一般的な組換え法によって提供され得る。
断片の調製 完全なゲノム配列は、δ抗原、およびゲノムまたはその
相補体によりコードされる他のウイルスポリペプチド
の、抗原的に活性な領域をコードする発現ベクターの構
築を可能にするという有用性がある。所望のタンパクを
コードする断片は、従来の制限分解処理を用いて、その
cDNAクローンから得られるか、または合成法により得ら
れる。これらの断片は、例えば、β−ガラクトシダーゼ
やスーパーオキシドデスムターゼ(SOD)、好ましくはSO
D、のような融合配列の一部を含むベクターに連結され
る。いずれかのセンス鎖において、開放読取り枠を含む
HDVゲノムの所望部分は、成熟タンパクまたは融合タン
パクのような組換えタンパクとして得られるか、または
化学合成法や一般的な組換え法によって提供され得る。
【0045】所望のポリペプチド(それが融合型または
成熟型のいずれであっても、また分泌を可能にするシグ
ナル配列を含んでいるいないにかかわらず)をコードす
るDNAは、都合のよい宿主に対し適当な発現ベクターに
連結され得る。真核細胞宿主系および原核細胞宿主系の
両方が、現在、組換えポリペプチドを形成する際に用い
られる。より一般的な制御系のいくつかの要約、および
宿主細胞系を、以下のC.1.項に示す。次いで、このポリ
ペプチドは、溶菌細胞や培地から精製され、その意図し
た用途に必要な程度にまで精製される。このようなペプ
チドは診断に用いられ得、ワクチンに処方され得る。こ
れらのポリペプチドに対して生ずる抗体もまた、診断に
用いられ得る。
成熟型のいずれであっても、また分泌を可能にするシグ
ナル配列を含んでいるいないにかかわらず)をコードす
るDNAは、都合のよい宿主に対し適当な発現ベクターに
連結され得る。真核細胞宿主系および原核細胞宿主系の
両方が、現在、組換えポリペプチドを形成する際に用い
られる。より一般的な制御系のいくつかの要約、および
宿主細胞系を、以下のC.1.項に示す。次いで、このポリ
ペプチドは、溶菌細胞や培地から精製され、その意図し
た用途に必要な程度にまで精製される。このようなペプ
チドは診断に用いられ得、ワクチンに処方され得る。こ
れらのポリペプチドに対して生ずる抗体もまた、診断に
用いられ得る。
【0046】このゲノムの分析により、多くの開放読取
り枠(ORF)の存在が明らかになり、それらのうちの少な
くとも1つであるORF5は、このδ抗原をコードしてい
る。他のものは、まだ未知のウイルスポリペプチドをコ
ードし得る。ATG開始コドンで始まる少なくとも約150ヌ
クレオチドを含むこのようないくつかの枠が同定され
た。別の読取り枠は、より長い開かれた配列とともに存
在するが、ATG開始コドンは有しない。このゲノムと同
じ意味を有するcDNA鎖中およびアンチゲノム鎖中の両方
にて、この読取り枠が見出された。
り枠(ORF)の存在が明らかになり、それらのうちの少な
くとも1つであるORF5は、このδ抗原をコードしてい
る。他のものは、まだ未知のウイルスポリペプチドをコ
ードし得る。ATG開始コドンで始まる少なくとも約150ヌ
クレオチドを含むこのようないくつかの枠が同定され
た。別の読取り枠は、より長い開かれた配列とともに存
在するが、ATG開始コドンは有しない。このゲノムと同
じ意味を有するcDNA鎖中およびアンチゲノム鎖中の両方
にて、この読取り枠が見出された。
【0047】このアミノ末端に近いメチオニンを含むポ
リペプチドをコードする5つの大きなORFは、微生物内
で発現された。このアンチゲノムORF5にコードされるポ
リペプチドだけが、肝炎ウイルスδに感染した患者から
得られた抗血清と交差反応した。ウイルス抽出物、およ
び組換えORFポリペプチド(これは細菌や酵母内で合成
された)を用いる免疫的分析に基づいて、ORF5は、δ肝
炎ウイルスポリペプチドのp27δおよびp24δの両方に分
かれている抗原性エピトープをコードし、そして、おそ
らくp27δおよびp24δに対する完全な構造遺伝子を表
す。ここで記述の免疫競合研究に基づいて、この核の肝
炎δ抗原は、p27δおよびp24δの両方から構成される。
リペプチドをコードする5つの大きなORFは、微生物内
で発現された。このアンチゲノムORF5にコードされるポ
リペプチドだけが、肝炎ウイルスδに感染した患者から
得られた抗血清と交差反応した。ウイルス抽出物、およ
び組換えORFポリペプチド(これは細菌や酵母内で合成
された)を用いる免疫的分析に基づいて、ORF5は、δ肝
炎ウイルスポリペプチドのp27δおよびp24δの両方に分
かれている抗原性エピトープをコードし、そして、おそ
らくp27δおよびp24δに対する完全な構造遺伝子を表
す。ここで記述の免疫競合研究に基づいて、この核の肝
炎δ抗原は、p27δおよびp24δの両方から構成される。
【0048】クローン115、7a、1、4、2、7b、お
よび3bのcDNAヌクレオチド配列の比較により、重複し
ている配列(表2参照)中の異種性の程度は小さいこと
が示された。ウイルスを含むRNA中では、ヌクレオチド
配列の異種性は珍しくない(Holland,J.,et al (1982)
Science 215:1577)。特に、ORF5の608番目での配列の
異種性は、p27δとp24δとの間の差異に基づく。すなわ
ち、2つのポリペプチドの大きさは、p27δのC末端部
分での付加的なアミノ酸に起因し得る。もしその部分が
Gで占められるなら、それを含むトリプレットがトリプ
トファンをコードし、そして転写は、664番目から始ま
るオパール終止コドンまでつづく(図3参照)。他方、
もし608番目がAであれば、それを含むトリプレット
が、アンバー終止コドンをコードする。そして、最後の
細胞がアンバーコドンを停止し、それにより、オパール
コドンまで転写を継続するような能力がないと、この点
で転写が停止する。
よび3bのcDNAヌクレオチド配列の比較により、重複し
ている配列(表2参照)中の異種性の程度は小さいこと
が示された。ウイルスを含むRNA中では、ヌクレオチド
配列の異種性は珍しくない(Holland,J.,et al (1982)
Science 215:1577)。特に、ORF5の608番目での配列の
異種性は、p27δとp24δとの間の差異に基づく。すなわ
ち、2つのポリペプチドの大きさは、p27δのC末端部
分での付加的なアミノ酸に起因し得る。もしその部分が
Gで占められるなら、それを含むトリプレットがトリプ
トファンをコードし、そして転写は、664番目から始ま
るオパール終止コドンまでつづく(図3参照)。他方、
もし608番目がAであれば、それを含むトリプレット
が、アンバー終止コドンをコードする。そして、最後の
細胞がアンバーコドンを停止し、それにより、オパール
コドンまで転写を継続するような能力がないと、この点
で転写が停止する。
【0049】B.3.抗原性ポリペプチドの調製および
キャリアとの結合 ペプチドの抗原領域は、一般に、比較的小さく、典型的
には10アミノ酸またはそれ以下の長さである。5アミノ
酸ほどの断片が、典型的には、抗原領域を特徴づける。
これらの分節は、δ抗原の領域、または付加的にコード
されたマーカーポリペプチドの領域に相当し得る。従っ
て、HDVのゲノムを基準に用いて、ペプチドの短い分節
をコードするDNAは、融合タンパクとしてまたは単離さ
れたペプチドとしてのいずれかで組換え的に発現され得
る。さらに、短いアミノ酸配列は、簡単に化学合成され
得る。この合成されたペプチドが、正しいエピトープを
供給するために正確に配列する場合であって、しかし、
小さすぎて免疫原性を示さない場合には、このペプチド
は適当な担体に連結され得る。
キャリアとの結合 ペプチドの抗原領域は、一般に、比較的小さく、典型的
には10アミノ酸またはそれ以下の長さである。5アミノ
酸ほどの断片が、典型的には、抗原領域を特徴づける。
これらの分節は、δ抗原の領域、または付加的にコード
されたマーカーポリペプチドの領域に相当し得る。従っ
て、HDVのゲノムを基準に用いて、ペプチドの短い分節
をコードするDNAは、融合タンパクとしてまたは単離さ
れたペプチドとしてのいずれかで組換え的に発現され得
る。さらに、短いアミノ酸配列は、簡単に化学合成され
得る。この合成されたペプチドが、正しいエピトープを
供給するために正確に配列する場合であって、しかし、
小さすぎて免疫原性を示さない場合には、このペプチド
は適当な担体に連結され得る。
【0050】このような連結を得るための多くの技術
が、当該技術分野で公知であり、それらには、以下の物
質を用いるジスルフィド結合の形成が包含される。この
物質には、N−スクシニミジル−3−(2−ピリジル−
チオ)プロピオネート(SPDP)およびスクシニミジル−
4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カ
ルボキシレート(SMCC)がある(これは、Pierce Compa
ny, Rockford, Illinoisから得られた)。(もし、この
ペプチドが、スルフヒドリル基を欠いているなら、シス
テイン残基を加えることにより、これが得られる。)こ
れらの薬剤は、それ自体と、あるタンパク上のペプチド
システイン残基との間、およびリジン上のε−アミノ基
または他のアミノ酸の他の遊離アミノ基によるアミド結
合との間に、ジスルフィド結合を生じさせる。このよう
な種々のジスルフィド/アミド形成試薬が知られてい
る。例えば、Immun Rev (1982) 62:185を参照。他の二
官能性カップリング剤は、ジスルフィド結合よりもむし
ろチオエーテル結合を形成する。これらのチオエーテル
結合の形成試薬の多くは、市販されており、6−マレイ
ミドカプロン酸、2−ブロモ酢酸、2−ヨード酢酸、4
−(N−マレイミド−メチル)シクロヘキサン−1−カ
ルボン酸などから得られる反応性エステルが含まれる。
このカルボキシル基は、それらと、スクシンイミドまた
は1−ヒドロキシ−2−ニトロ−4−スルホン酸ナトリ
ウム塩とを組み合わせることにより、活性化され得る。
前記のリストは、全てを網羅する意味ではなく、挙げら
れた化合物の変性体も明らかに使用可能である。
が、当該技術分野で公知であり、それらには、以下の物
質を用いるジスルフィド結合の形成が包含される。この
物質には、N−スクシニミジル−3−(2−ピリジル−
チオ)プロピオネート(SPDP)およびスクシニミジル−
4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カ
ルボキシレート(SMCC)がある(これは、Pierce Compa
ny, Rockford, Illinoisから得られた)。(もし、この
ペプチドが、スルフヒドリル基を欠いているなら、シス
テイン残基を加えることにより、これが得られる。)こ
れらの薬剤は、それ自体と、あるタンパク上のペプチド
システイン残基との間、およびリジン上のε−アミノ基
または他のアミノ酸の他の遊離アミノ基によるアミド結
合との間に、ジスルフィド結合を生じさせる。このよう
な種々のジスルフィド/アミド形成試薬が知られてい
る。例えば、Immun Rev (1982) 62:185を参照。他の二
官能性カップリング剤は、ジスルフィド結合よりもむし
ろチオエーテル結合を形成する。これらのチオエーテル
結合の形成試薬の多くは、市販されており、6−マレイ
ミドカプロン酸、2−ブロモ酢酸、2−ヨード酢酸、4
−(N−マレイミド−メチル)シクロヘキサン−1−カ
ルボン酸などから得られる反応性エステルが含まれる。
このカルボキシル基は、それらと、スクシンイミドまた
は1−ヒドロキシ−2−ニトロ−4−スルホン酸ナトリ
ウム塩とを組み合わせることにより、活性化され得る。
前記のリストは、全てを網羅する意味ではなく、挙げら
れた化合物の変性体も明らかに使用可能である。
【0051】それ自体が、宿主に有害な抗体の生産を誘
導しない担体、例えば、種々の血清アルブミン、テタヌ
ストキソイド、またはキーホールリンピットヘモシアニ
ン(KLH)のような担体が用いられ得る。
導しない担体、例えば、種々の血清アルブミン、テタヌ
ストキソイド、またはキーホールリンピットヘモシアニ
ン(KLH)のような担体が用いられ得る。
【0052】この結合物によれば、適当な被験体に結合
物を接種したとき、結合物にだけではなく、その配列と
類似の部分をもつ融合タンパクに対し、そして全HDV内
の適当な決定因子に対して、特異的に反応する免疫グロ
ブリンを含む抗血清の生産が得られる。
物を接種したとき、結合物にだけではなく、その配列と
類似の部分をもつ融合タンパクに対し、そして全HDV内
の適当な決定因子に対して、特異的に反応する免疫グロ
ブリンを含む抗血清の生産が得られる。
【0053】B.4.HDVエピトープを含むハイブリッ
ド粒子免疫原の調製 HDVのエピトープの免疫原性もまた、哺乳類系または酵
母系にてB型肝炎表面抗原と関連するタンパクのような
粒子形成タンパクと融合させたエピトープを調製するこ
とにより、高められ得る。このHDVエピトープが、粒子
形成タンパクをコードする配列と直接連結される構築物
は、このHDVエピトープに関して免疫原性のあるハイブ
リッドを生産する。さらに、調製された全ベクターに
は、例えば、プレ−Sペプチドのような、種々の程度の
免疫原性を有するB型肝炎ウイルス(HBV)に特異的なエ
ピトープを包含する。それゆえ、HDV配列を含む粒子形
成タンパクから構築された粒子は、HDVおよびHBVの両方
に関して、免疫性がある。
ド粒子免疫原の調製 HDVのエピトープの免疫原性もまた、哺乳類系または酵
母系にてB型肝炎表面抗原と関連するタンパクのような
粒子形成タンパクと融合させたエピトープを調製するこ
とにより、高められ得る。このHDVエピトープが、粒子
形成タンパクをコードする配列と直接連結される構築物
は、このHDVエピトープに関して免疫原性のあるハイブ
リッドを生産する。さらに、調製された全ベクターに
は、例えば、プレ−Sペプチドのような、種々の程度の
免疫原性を有するB型肝炎ウイルス(HBV)に特異的なエ
ピトープを包含する。それゆえ、HDV配列を含む粒子形
成タンパクから構築された粒子は、HDVおよびHBVの両方
に関して、免疫性がある。
【0054】肝炎表面抗原(HBsAg)は、例えば、哺乳類
細胞内(Valenzuela, P., et al, Hepatitis B (1984),
Millman, I., et al, ed, Plenum Press, pp. 225-23
6)だけでなくサッカロマイセス・セレビシエ(S. cerev
isiae)中で形成され集められ得ることが示されている
(Valenzuela, P,. et al, Nature (1982)298:344-35
0)。このような粒子の形成は、単量体サブユニットの免
疫原性を高めることが示されている。この構築物もま
た、プレ表面(プレ−S)領域の55アミノ酸を含むHBsA
gの免疫的に優性なエピトープを包含し得る(Neurath e
t al, Science (1984)224:392-394)。酵母中で発現可
能なプレ−S−HBsAg粒子の構築物は、米国出願第621,7
56号(1984年6月18日出願)において開示されている。
酵母発現用の異種ウイルス配列を含むハイブリッドは、
米国出願第650,323号(1984年9月13日出願)において
開示されている。両方の出願は、ここでは、譲渡人に譲
渡され、その内容はここに示されている。これらの構築
物は、SV40ジヒドロホレートリダクターゼ ベクターを
用いるチャニーズハムスター卵巣細胞のような哺乳類細
胞中でも発現され得る(Michelle et al, Int Symp on
Viral Hepatitis (1984))。
細胞内(Valenzuela, P., et al, Hepatitis B (1984),
Millman, I., et al, ed, Plenum Press, pp. 225-23
6)だけでなくサッカロマイセス・セレビシエ(S. cerev
isiae)中で形成され集められ得ることが示されている
(Valenzuela, P,. et al, Nature (1982)298:344-35
0)。このような粒子の形成は、単量体サブユニットの免
疫原性を高めることが示されている。この構築物もま
た、プレ表面(プレ−S)領域の55アミノ酸を含むHBsA
gの免疫的に優性なエピトープを包含し得る(Neurath e
t al, Science (1984)224:392-394)。酵母中で発現可
能なプレ−S−HBsAg粒子の構築物は、米国出願第621,7
56号(1984年6月18日出願)において開示されている。
酵母発現用の異種ウイルス配列を含むハイブリッドは、
米国出願第650,323号(1984年9月13日出願)において
開示されている。両方の出願は、ここでは、譲渡人に譲
渡され、その内容はここに示されている。これらの構築
物は、SV40ジヒドロホレートリダクターゼ ベクターを
用いるチャニーズハムスター卵巣細胞のような哺乳類細
胞中でも発現され得る(Michelle et al, Int Symp on
Viral Hepatitis (1984))。
【0055】さらに、この粒子形成タンパクをコードす
る配列自体の一部分は、HDVエピトープのコドンと置き
換えられ得る。この置換において、酵母または哺乳類中
で、小単位の集合体を媒介して免疫原性の粒子を形成す
るのに必要でない領域は、削除され得、それゆえ、この
HDVエピトープとの拮抗により、付加的なB型肝炎抗原
部位が除去される。
る配列自体の一部分は、HDVエピトープのコドンと置き
換えられ得る。この置換において、酵母または哺乳類中
で、小単位の集合体を媒介して免疫原性の粒子を形成す
るのに必要でない領域は、削除され得、それゆえ、この
HDVエピトープとの拮抗により、付加的なB型肝炎抗原
部位が除去される。
【0056】B.5.ワクチンの調製 活性成分としてのペプチド配列を含むワクチンの調製も
また、当該技術分野でよく知られている。典型的には、
溶液または懸濁液のいずれかとして注射可能なワクチン
が調製される。注射の前に液体に溶解させ、または懸濁
させるのに適当な固形物も調製され得る。この調製物
は、乳化されてもよく、またはリポソーム中にカプセル
化されたタンパクであってもよい。この活性免疫原成分
は、活性成分と和合可能であり、かつ薬学的に受容可能
な賦形剤としばしば混合される。適当な賦形剤には、例
えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロー
ル、エタノール、または、それらの類似物およびその組
み合わせがある。さらに、もし望むなら、このワクチン
は、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝剤または、ワクチンの
効果を高めるアジュバントのような、補助剤を少量で含
有してもよい。このワクチンは、(例えば、皮下または
筋肉内のいずれかの)注射によって、非経口的にうまく
投与される。投与の他の様式に適する付加的な処方に
は、坐剤および、ある場合には、経口処方が包含され
る。坐剤のための伝統的な結合剤および担体には、例え
ば、ポリアルカリグリコールまたはトリグリセリドが包
含され得る。このような坐剤は、活性成分を0.5%〜10
%、好ましくは1%〜2%の範囲で含有する混合物から
形成され得る。経口処方には、例えば、マンニトール、
ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サ
ッカリンセルロースナトリウム、炭酸マグネシウムおよ
びその類似物の薬学的な等級のような通常使用される賦
形剤が包含される。これらの組成物は、溶液、懸濁液、
錠剤、丸薬、カプセル、持続放出処方、または粉末の形
態をとり、10%〜95%(好ましくは25%〜70%)の活性
成分を含む。
また、当該技術分野でよく知られている。典型的には、
溶液または懸濁液のいずれかとして注射可能なワクチン
が調製される。注射の前に液体に溶解させ、または懸濁
させるのに適当な固形物も調製され得る。この調製物
は、乳化されてもよく、またはリポソーム中にカプセル
化されたタンパクであってもよい。この活性免疫原成分
は、活性成分と和合可能であり、かつ薬学的に受容可能
な賦形剤としばしば混合される。適当な賦形剤には、例
えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロー
ル、エタノール、または、それらの類似物およびその組
み合わせがある。さらに、もし望むなら、このワクチン
は、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝剤または、ワクチンの
効果を高めるアジュバントのような、補助剤を少量で含
有してもよい。このワクチンは、(例えば、皮下または
筋肉内のいずれかの)注射によって、非経口的にうまく
投与される。投与の他の様式に適する付加的な処方に
は、坐剤および、ある場合には、経口処方が包含され
る。坐剤のための伝統的な結合剤および担体には、例え
ば、ポリアルカリグリコールまたはトリグリセリドが包
含され得る。このような坐剤は、活性成分を0.5%〜10
%、好ましくは1%〜2%の範囲で含有する混合物から
形成され得る。経口処方には、例えば、マンニトール、
ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サ
ッカリンセルロースナトリウム、炭酸マグネシウムおよ
びその類似物の薬学的な等級のような通常使用される賦
形剤が包含される。これらの組成物は、溶液、懸濁液、
錠剤、丸薬、カプセル、持続放出処方、または粉末の形
態をとり、10%〜95%(好ましくは25%〜70%)の活性
成分を含む。
【0057】このタンパクは、中性または塩の形でワク
チンに処方され得る。薬学的に受容可能な塩には、酸付
加塩(このペプチドの遊離のアミノ基とともに形成され
る)が包含される。それらの塩は、例えば、塩酸または
リン酸のような無機酸;酢酸、シュウ酸、酒石酸、マン
デル酸などのような有機酸と形成される。この遊離のカ
ルボキシル基と形成される塩は、また、例えば、水酸化
ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水
酸化カルシウム、または水酸化第二鉄のような無機塩
基;およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、2
−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインな
どのような有機塩基から誘導される。
チンに処方され得る。薬学的に受容可能な塩には、酸付
加塩(このペプチドの遊離のアミノ基とともに形成され
る)が包含される。それらの塩は、例えば、塩酸または
リン酸のような無機酸;酢酸、シュウ酸、酒石酸、マン
デル酸などのような有機酸と形成される。この遊離のカ
ルボキシル基と形成される塩は、また、例えば、水酸化
ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水
酸化カルシウム、または水酸化第二鉄のような無機塩
基;およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、2
−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインな
どのような有機塩基から誘導される。
【0058】このワクチンは、用量処方に合致した方法
で投与され、治療上効果的でかつ免疫原性となるような
量で投与される。投与され得る量は、治療され得る患
者、その患者の抗体を合成する免疫系の許容量、および
所望の保護の程度に依存する。投与に必要な活性成分の
正確な量は、実行者の判断に依存し、各患者に特有であ
る。δ感染は、B型肝炎の感染に依存するので、抗δワ
クチンが特に有用な亜群はB型肝炎保有者群であること
に注目されるべきである。B抗原およびD抗原の両方を
含む「二重の」ワクチンを構築することも有益かもしれ
ない。
で投与され、治療上効果的でかつ免疫原性となるような
量で投与される。投与され得る量は、治療され得る患
者、その患者の抗体を合成する免疫系の許容量、および
所望の保護の程度に依存する。投与に必要な活性成分の
正確な量は、実行者の判断に依存し、各患者に特有であ
る。δ感染は、B型肝炎の感染に依存するので、抗δワ
クチンが特に有用な亜群はB型肝炎保有者群であること
に注目されるべきである。B抗原およびD抗原の両方を
含む「二重の」ワクチンを構築することも有益かもしれ
ない。
【0059】ORF5内にコードされたポリペプチド(およ
び、それに由来のペプチド)は、ORF5がHDV粒子の中心
側の抗原をコードするという事実にもかかわらず、HDV
感染に対する防御に特に適したワクチン組成物である。
組換えにより生産されるHBVの中心部の抗原を含むワク
チンは、B型肝炎の感染に対する防御または、B型肝炎
の感染を緩和するのに効果的である(Murray, K., et a
l, EMBO J (1984) 3:645)。
び、それに由来のペプチド)は、ORF5がHDV粒子の中心
側の抗原をコードするという事実にもかかわらず、HDV
感染に対する防御に特に適したワクチン組成物である。
組換えにより生産されるHBVの中心部の抗原を含むワク
チンは、B型肝炎の感染に対する防御または、B型肝炎
の感染を緩和するのに効果的である(Murray, K., et a
l, EMBO J (1984) 3:645)。
【0060】B.6.HDVエピトープに対する抗体の調
製 上記のように調製された免疫原タンパクは、哺乳類を免
疫にするのに用いられる。得られる抗血清は、診断試薬
として有用である。これらの動物からのリンパ球または
脾臓細胞も、これらのエピトープに対して生じるモノク
ローナル抗体を分泌し得るハイブリドーマであって、感
染ウイルスに対し交差反応するハイブリドーマを調製す
るために用いられ得る。得られるモノクローナル抗体
は、診断に特に有用であり、そして中和しているモノク
ローナル抗体は、受動免疫治療に有用である。
製 上記のように調製された免疫原タンパクは、哺乳類を免
疫にするのに用いられる。得られる抗血清は、診断試薬
として有用である。これらの動物からのリンパ球または
脾臓細胞も、これらのエピトープに対して生じるモノク
ローナル抗体を分泌し得るハイブリドーマであって、感
染ウイルスに対し交差反応するハイブリドーマを調製す
るために用いられ得る。得られるモノクローナル抗体
は、診断に特に有用であり、そして中和しているモノク
ローナル抗体は、受動免疫治療に有用である。
【0061】ORF5内にコードされるポリペプチド、およ
びこれらのペプチドに対する抗体は、HDVの免疫診断に
特に有用である。以下に論じるように、ORF5はこのδ抗
原をコードし、このδ抗原は、明らかに2つのウイルス
ポリペプチド、p24δおよびp27δを含有する。
びこれらのペプチドに対する抗体は、HDVの免疫診断に
特に有用である。以下に論じるように、ORF5はこのδ抗
原をコードし、このδ抗原は、明らかに2つのウイルス
ポリペプチド、p24δおよびp27δを含有する。
【0062】B.7.診断用オリゴヌクレオチドプロー
ブおよびキット 開示されているHDVゲノム群を基礎として用い、およそ
8bpまたはそれ以上のオリゴマーが、切り出しまたは合
成により調製され得る。そして、このオリゴマーは、各
病人中のウイルスの検出に有用である。8bpは、使用可
能な長さであるものの、10〜12bpの配列が好ましく、約
20bpが最適である。好ましくは、これらの配列は、異質
性のない領域に由来する。これらのプローブは、自動化
オリゴヌクレオチド合成法を含む、常法により調製され
得る。有用なプローブの中には、例えば、クローンδ
1、後に記すcDNAライブラリーを検索する際に有用な種
々のオリゴマー、およびここで開示された付加的なクロ
ーンがある。ORF5の断片を含むクローンは特に有用であ
る。このゲノムまたはその相補鎖のいずれの部分も十分
適当であろう。プローブとして用いるには、完全な相補
性が望まれる。しかし、断片の長さが増すことは必要で
はないかも知れない。
ブおよびキット 開示されているHDVゲノム群を基礎として用い、およそ
8bpまたはそれ以上のオリゴマーが、切り出しまたは合
成により調製され得る。そして、このオリゴマーは、各
病人中のウイルスの検出に有用である。8bpは、使用可
能な長さであるものの、10〜12bpの配列が好ましく、約
20bpが最適である。好ましくは、これらの配列は、異質
性のない領域に由来する。これらのプローブは、自動化
オリゴヌクレオチド合成法を含む、常法により調製され
得る。有用なプローブの中には、例えば、クローンδ
1、後に記すcDNAライブラリーを検索する際に有用な種
々のオリゴマー、およびここで開示された付加的なクロ
ーンがある。ORF5の断片を含むクローンは特に有用であ
る。このゲノムまたはその相補鎖のいずれの部分も十分
適当であろう。プローブとして用いるには、完全な相補
性が望まれる。しかし、断片の長さが増すことは必要で
はないかも知れない。
【0063】このようなプローブを診断に用いるには、
もし必要なら、血液または血清のような分析すべき生体
試料が、そこに含まれる核酸を抽出するために、処理さ
れる。得られた核酸は、ゲル電気泳動または他のサイズ
分画法、またはサイズ分画なしの簡単なドットブロット
にかけられる。次いで、例えば、ニックトランスレーシ
ョンまたはリン酸化を用いて、このプローブが標識化さ
れる。抽出された核酸は、次いで、適当なハイブリダイ
ゼーション条件下にて、標識されたプローブを用いて処
理される。
もし必要なら、血液または血清のような分析すべき生体
試料が、そこに含まれる核酸を抽出するために、処理さ
れる。得られた核酸は、ゲル電気泳動または他のサイズ
分画法、またはサイズ分画なしの簡単なドットブロット
にかけられる。次いで、例えば、ニックトランスレーシ
ョンまたはリン酸化を用いて、このプローブが標識化さ
れる。抽出された核酸は、次いで、適当なハイブリダイ
ゼーション条件下にて、標識されたプローブを用いて処
理される。
【0064】このプローブは、ウイルスRNAと完全に相
補的に作製され得るので、間違った陽性反応を防ぐため
に、厳しい条件が望まれる。しかし、厳しい条件は、プ
ローブが異質性のないウイルスゲノムの領域に相補的な
場合にのみ、使用されるべきである。ハイブリダイゼー
ションの厳格さは、要因数によって決定される。この要
因には、温度、イオン強度、ハイブリダイゼーションに
かける時間の長さおよび洗浄時間の長さ、およびホルム
アミド濃度が含まれる。これらの要因は、例えば、Mani
atis, T., ら、分子クローニング:実験室マニュアル
(1982)、コールド スプリング ハーバー プレス、
コールド スプリング ハーバー、ニューヨークに概説
されている。条件の厳しさを増すことは、例えば、温度
を上げる、反応時間を短縮する、そしてイオン強度を調
節することにより、達成され得る。
補的に作製され得るので、間違った陽性反応を防ぐため
に、厳しい条件が望まれる。しかし、厳しい条件は、プ
ローブが異質性のないウイルスゲノムの領域に相補的な
場合にのみ、使用されるべきである。ハイブリダイゼー
ションの厳格さは、要因数によって決定される。この要
因には、温度、イオン強度、ハイブリダイゼーションに
かける時間の長さおよび洗浄時間の長さ、およびホルム
アミド濃度が含まれる。これらの要因は、例えば、Mani
atis, T., ら、分子クローニング:実験室マニュアル
(1982)、コールド スプリング ハーバー プレス、
コールド スプリング ハーバー、ニューヨークに概説
されている。条件の厳しさを増すことは、例えば、温度
を上げる、反応時間を短縮する、そしてイオン強度を調
節することにより、達成され得る。
【0065】このプローブは、診断キットにパッケージ
ングされ得る。このキットには、標識化されたDNA、適
当にパッケージングされた付加的試薬、および指定のプ
ロトコールに必要な材料、および検定を行うための器具
が含まれる。
ングされ得る。このキットには、標識化されたDNA、適
当にパッケージングされた付加的試薬、および指定のプ
ロトコールに必要な材料、および検定を行うための器具
が含まれる。
【0066】B.8.免疫検定診断キット HDV抗体を含む血清と免疫学的に反応するポリペプチド
(例えばORF5にコードされるポリペプチド)、およびこ
れらのポリペプチドに対し生じる抗体の両方が、血液サ
ンプルまたは血清サンプル中でのHDV抗体の存在を検定
するため、または場合しだいでウイルスの存在を検定す
るため、に設計された診断キットの構成物として、有用
である。この免疫検定の設計は、多くの変更がなされ、
例えば、個体担体上での競争反応または直接反応、また
は免疫沈降に基づく数種のプロトコールが利用可能であ
る。ほとんどの検定には、標識された抗体の使用、また
は標識として蛍光分子、放射活性分子または色素分子を
含むポリペプチドの使用が含まれる。酵素で標識されか
つ媒介される免疫検定もまた、通常用いられる。従っ
て、このようなプロトコールでの使用に適し、そして標
識された適当な試薬を含むキットは、適当な材料のパッ
ケージングにより、構成される。このキットには、検定
を行うための残る必要条件、および検定を行うための器
具の適当なセットとともに、適当な容器中にある本発明
の抗体またはポリペプチドが包含される。
(例えばORF5にコードされるポリペプチド)、およびこ
れらのポリペプチドに対し生じる抗体の両方が、血液サ
ンプルまたは血清サンプル中でのHDV抗体の存在を検定
するため、または場合しだいでウイルスの存在を検定す
るため、に設計された診断キットの構成物として、有用
である。この免疫検定の設計は、多くの変更がなされ、
例えば、個体担体上での競争反応または直接反応、また
は免疫沈降に基づく数種のプロトコールが利用可能であ
る。ほとんどの検定には、標識された抗体の使用、また
は標識として蛍光分子、放射活性分子または色素分子を
含むポリペプチドの使用が含まれる。酵素で標識されか
つ媒介される免疫検定もまた、通常用いられる。従っ
て、このようなプロトコールでの使用に適し、そして標
識された適当な試薬を含むキットは、適当な材料のパッ
ケージングにより、構成される。このキットには、検定
を行うための残る必要条件、および検定を行うための器
具の適当なセットとともに、適当な容器中にある本発明
の抗体またはポリペプチドが包含される。
【0067】C.一般的方法 ウイルスからのRNAの抽出、cDNAライブラリーの調製お
よび検索、クローンの塩基配列決定、発現ベクターの構
築、細胞の形質転換などに用いられる一般的技術は、当
該技術分野で公知であり、そしてこれらの方法を記述し
た実験室手引きが利用可能である。しかし、一般的指導
書として、以下に述べる情報がこのような方法およびそ
の実行に有用な材料について現在利用可能である。
よび検索、クローンの塩基配列決定、発現ベクターの構
築、細胞の形質転換などに用いられる一般的技術は、当
該技術分野で公知であり、そしてこれらの方法を記述し
た実験室手引きが利用可能である。しかし、一般的指導
書として、以下に述べる情報がこのような方法およびそ
の実行に有用な材料について現在利用可能である。
【0068】C.1.宿主および発現制御配列 用いた適当な制御配列が、指定された宿主に適合可能で
ある場合、原核生物および真核生物の宿主細胞は、所望
のコード配列の発現に使用し得る。原核生物宿主のう
ち、E. coliは、最もよく用いられ、たいてい便利であ
る。原核生物の発現制御配列は、プロモーター(これ
は、必要に応じてオペレーター部分を含む)とリボゾー
ム結合部位を含む。原核生物の宿主と適合可能な転移ベ
クターは、通常、例えばアンピシリン耐性およびテトラ
サイクリン耐性を付与するオペロンを含むプラスミドpB
R322、および抗生物質耐性を付与する配列を含む種々の
pUCベクターに由来する。前述のオペロンは、選択によ
って、成功した形質転換体を得るためのマーカーとして
用いられ得る。通常用いられる原核生物制御配列には、
βラクタマーゼ系(ペニシリナーゼ)やラクトースプロ
モーター系(Chang, etal, Nature (1977) 198:105
6)、トリプトファン(trp)プロモーター系(Goeddel,e
t al, Nucleic Acids Res (1980) 8:4057)、λ由来のP
LプロモーターおよびN遺伝子リボゾーム結合部位(Shi
matake et al, Nature (1981) 292:128)、trpとlacUV5
プロモーターの配列由来のハイブリッドtacプロモータ
ー(De Boeret al, Proc Natl Acad Sci (USA) (1983)
80 :21-25)が含まれる。前述の系は、特にE. coliと適
合可能である;もし望むなら、バチルス株やシュードモ
ナス株のような他の原核生物宿主が、対応する制御配列
とともに用いられ得る。
ある場合、原核生物および真核生物の宿主細胞は、所望
のコード配列の発現に使用し得る。原核生物宿主のう
ち、E. coliは、最もよく用いられ、たいてい便利であ
る。原核生物の発現制御配列は、プロモーター(これ
は、必要に応じてオペレーター部分を含む)とリボゾー
ム結合部位を含む。原核生物の宿主と適合可能な転移ベ
クターは、通常、例えばアンピシリン耐性およびテトラ
サイクリン耐性を付与するオペロンを含むプラスミドpB
R322、および抗生物質耐性を付与する配列を含む種々の
pUCベクターに由来する。前述のオペロンは、選択によ
って、成功した形質転換体を得るためのマーカーとして
用いられ得る。通常用いられる原核生物制御配列には、
βラクタマーゼ系(ペニシリナーゼ)やラクトースプロ
モーター系(Chang, etal, Nature (1977) 198:105
6)、トリプトファン(trp)プロモーター系(Goeddel,e
t al, Nucleic Acids Res (1980) 8:4057)、λ由来のP
LプロモーターおよびN遺伝子リボゾーム結合部位(Shi
matake et al, Nature (1981) 292:128)、trpとlacUV5
プロモーターの配列由来のハイブリッドtacプロモータ
ー(De Boeret al, Proc Natl Acad Sci (USA) (1983)
80 :21-25)が含まれる。前述の系は、特にE. coliと適
合可能である;もし望むなら、バチルス株やシュードモ
ナス株のような他の原核生物宿主が、対応する制御配列
とともに用いられ得る。
【0069】真核生物の宿主には酵母および哺乳類培養
細胞が含まれる。サッカロミセスセレビシエ、またはパ
ン酵母やサッロミセス カールスベルゲンシスは、便利
なので最もよく用いられる酵母宿主である。酵母適合性
ベクターは、原栄養株を栄養要求性変異株に与えること
や野性株に抗生物質耐性または重金属耐性を付与するこ
とにより、成功した形質転換体を選択可能なマーカーを
運搬する。酵母適合性ベクターは、2μmの複製起源(B
roach, J., et al, Meth Enz (1983) 101:307)、CEN3
およびARS1の結合物、または複製を保証する他の手段を
用い得る。この手段は、例えば宿主細胞ゲノムに適当な
断片を挿入させる配列である。酵母ベクターの制御配列
には、解糖系酵素の合成のためのプロモーター(Hess e
t al,J Adv Enzyme Reg(1968) 7:149, Holland et a
l, Biochemistry (1978) 17:4900)、および3−ホスホ
グリセレートキナゼ(Hitzeman et al, J Biol Chem (1
980) 255:2073)のプロモーターが含まれる。酵母で発
現させるためには、ターミネーターは、エラノーゼ遺伝
子(Holland, M. J., J Bio Chem (1981)256:1385)
に由来のターミネーターも含み得る。特に有用な制御系
には、ここで特別に記述の系が含まれる。この系は、グ
リセルアルデハイド−3−ホスフェートデヒドロゲナー
ゼ(GAPDH)プロモーターまたはアルコール デヒドロゲ
ナーゼ(ADH)制御プロモーター、GAPDHに由来のターミ
ネーター、およびもし分泌が必要ならば、酵母α因子か
らのリーダー配列、を含有する。これらの系は、米国特
許出願第468,589号(1983年2月22日出願)および第52
2,909号(1983年8月12日出願)に詳細に記述され、両
方ともここの譲渡人に譲渡され、そして参照文献として
ここに採用する。
細胞が含まれる。サッカロミセスセレビシエ、またはパ
ン酵母やサッロミセス カールスベルゲンシスは、便利
なので最もよく用いられる酵母宿主である。酵母適合性
ベクターは、原栄養株を栄養要求性変異株に与えること
や野性株に抗生物質耐性または重金属耐性を付与するこ
とにより、成功した形質転換体を選択可能なマーカーを
運搬する。酵母適合性ベクターは、2μmの複製起源(B
roach, J., et al, Meth Enz (1983) 101:307)、CEN3
およびARS1の結合物、または複製を保証する他の手段を
用い得る。この手段は、例えば宿主細胞ゲノムに適当な
断片を挿入させる配列である。酵母ベクターの制御配列
には、解糖系酵素の合成のためのプロモーター(Hess e
t al,J Adv Enzyme Reg(1968) 7:149, Holland et a
l, Biochemistry (1978) 17:4900)、および3−ホスホ
グリセレートキナゼ(Hitzeman et al, J Biol Chem (1
980) 255:2073)のプロモーターが含まれる。酵母で発
現させるためには、ターミネーターは、エラノーゼ遺伝
子(Holland, M. J., J Bio Chem (1981)256:1385)
に由来のターミネーターも含み得る。特に有用な制御系
には、ここで特別に記述の系が含まれる。この系は、グ
リセルアルデハイド−3−ホスフェートデヒドロゲナー
ゼ(GAPDH)プロモーターまたはアルコール デヒドロゲ
ナーゼ(ADH)制御プロモーター、GAPDHに由来のターミ
ネーター、およびもし分泌が必要ならば、酵母α因子か
らのリーダー配列、を含有する。これらの系は、米国特
許出願第468,589号(1983年2月22日出願)および第52
2,909号(1983年8月12日出願)に詳細に記述され、両
方ともここの譲渡人に譲渡され、そして参照文献として
ここに採用する。
【0070】発現のための宿主として利用可能な哺乳類
細胞系は、アメリカン タイプ カルチャー コレクシ
ョン(ATCC)から入手可能であり、HeLa細胞、チャイニ
ーズハムスターの卵巣(CHO)細胞、ベビーハムスター腎
(BHK)細胞、および多くの他の細胞系を含む。哺乳類細
胞に適したプロモーターは、特にシミアンウイルス40
(SV40)(Fiers, et al, Nature (1978) 273:113)に
由来のプロモーターのようなウイルスプロモーター、ま
たはラウス肉腫ウイルス(RSV)、アデノウイルス、ウシ
乳頭腫ウイルス(BPV)のような他のウイルスプロモータ
ーがある。哺乳類の細胞には、またターミネーター配列
が必要である。哺乳類細胞での複製に適したベクター
は、ウイルスのレプリコン、または適当な配列を宿主ゲ
ノム中に導入させる配列を包含し得る。
細胞系は、アメリカン タイプ カルチャー コレクシ
ョン(ATCC)から入手可能であり、HeLa細胞、チャイニ
ーズハムスターの卵巣(CHO)細胞、ベビーハムスター腎
(BHK)細胞、および多くの他の細胞系を含む。哺乳類細
胞に適したプロモーターは、特にシミアンウイルス40
(SV40)(Fiers, et al, Nature (1978) 273:113)に
由来のプロモーターのようなウイルスプロモーター、ま
たはラウス肉腫ウイルス(RSV)、アデノウイルス、ウシ
乳頭腫ウイルス(BPV)のような他のウイルスプロモータ
ーがある。哺乳類の細胞には、またターミネーター配列
が必要である。哺乳類細胞での複製に適したベクター
は、ウイルスのレプリコン、または適当な配列を宿主ゲ
ノム中に導入させる配列を包含し得る。
【0071】C.2.形質転換 用いられる形質転換の方法は、形質転換されるべき宿主
に依存する。バクテリアの形質転換には、一般に、塩化
カルシウムまたは塩化ルビジウムによる処理が用いられ
る(Cohen, S. N., Proc Natl Acad Sci (USA) (1972)
69:2110, Maniatis etal, 分子クローニング:実験室
マニュアル(1982)コールド スプリング ハーバー
プレス、ページ254)。酵母の形質転換は、Hinnenら、Pr
oc NatlAcad Sci (1978) 75:1929-1923の方法を用いて
実施し得る。哺乳類の形質転換は、Graham and vander
Eb, Virology (1978) 52:546のリン酸カルシウム沈澱
法、またはその種々の改良法を用いて行われる。
に依存する。バクテリアの形質転換には、一般に、塩化
カルシウムまたは塩化ルビジウムによる処理が用いられ
る(Cohen, S. N., Proc Natl Acad Sci (USA) (1972)
69:2110, Maniatis etal, 分子クローニング:実験室
マニュアル(1982)コールド スプリング ハーバー
プレス、ページ254)。酵母の形質転換は、Hinnenら、Pr
oc NatlAcad Sci (1978) 75:1929-1923の方法を用いて
実施し得る。哺乳類の形質転換は、Graham and vander
Eb, Virology (1978) 52:546のリン酸カルシウム沈澱
法、またはその種々の改良法を用いて行われる。
【0072】C.3.ベクター構築 ベクター構築には、現在全くよく知られた方法が用いら
れる。部位特異的なDNA切断は、適当な制限酵素を用い
て処理することにより行われる。この処理は、これらの
市販の酵素の製造者により一般に指定されている条件下
で行われる(例えば、ニューイングランド バイオラボ
ズの製品カタログを参照されたい)。一般に、約1μg
のプラスミドまたはDNA配列は、約20μLの緩衝溶液中
で1単位の酵素と、約37℃にて約1〜2時間インキュベ
ートすることにより、切断される。制限酵素とインキュ
ベートした後、タンパクはフェノール/クロロホルム抽
出により除去され、エタノール再沈澱によりDNAが回収
される。この切断された断片は、酵素化学における方法
(1980)65:499-560中にみられる、一般的な方法に従
って、ポリアクリルアミドまたはアガロースゲル電気泳
動法を用いて分離し得る。粘性末端を有する切断断片
は、ポリメラーゼに適当なインキュベート条件を用い
て、適当なデオキシヌクレオチド3リン酸(dNTP)の存
在下にて、E. coliDNAポリメラーゼI(クレノー)を用
いて、平滑末端にし得る。このポリメラーゼは、突出し
ている3'一本鎖を切断するが、この混合物中に存在する
dNTPによって、突出している5'末端を埋める。S1ヌクレ
アーゼを用いた処理もまた、一本鎖DNA部分を加水分解
し得るので使用し得る。
れる。部位特異的なDNA切断は、適当な制限酵素を用い
て処理することにより行われる。この処理は、これらの
市販の酵素の製造者により一般に指定されている条件下
で行われる(例えば、ニューイングランド バイオラボ
ズの製品カタログを参照されたい)。一般に、約1μg
のプラスミドまたはDNA配列は、約20μLの緩衝溶液中
で1単位の酵素と、約37℃にて約1〜2時間インキュベ
ートすることにより、切断される。制限酵素とインキュ
ベートした後、タンパクはフェノール/クロロホルム抽
出により除去され、エタノール再沈澱によりDNAが回収
される。この切断された断片は、酵素化学における方法
(1980)65:499-560中にみられる、一般的な方法に従
って、ポリアクリルアミドまたはアガロースゲル電気泳
動法を用いて分離し得る。粘性末端を有する切断断片
は、ポリメラーゼに適当なインキュベート条件を用い
て、適当なデオキシヌクレオチド3リン酸(dNTP)の存
在下にて、E. coliDNAポリメラーゼI(クレノー)を用
いて、平滑末端にし得る。このポリメラーゼは、突出し
ている3'一本鎖を切断するが、この混合物中に存在する
dNTPによって、突出している5'末端を埋める。S1ヌクレ
アーゼを用いた処理もまた、一本鎖DNA部分を加水分解
し得るので使用し得る。
【0073】連結は、T4DNAリガーゼおよびATPを用いる
標準的な緩衝液および温度条件を使用して実施される。
粘性末端の連結は、平滑末端の連結ほどATPおよびリガ
ーゼを必要としない。ベクター断片を連結混合物の一部
として用いる場合、5'リン酸塩を除去してベクターの再
連結を防ぐために、ベクター断片は、しばしばバクテリ
アアルカリホスファターゼ(BAP)で処理される。あるい
は、再連結を防ぐために、不都合な断片を制限酵素で切
断することが使用され得る。
標準的な緩衝液および温度条件を使用して実施される。
粘性末端の連結は、平滑末端の連結ほどATPおよびリガ
ーゼを必要としない。ベクター断片を連結混合物の一部
として用いる場合、5'リン酸塩を除去してベクターの再
連結を防ぐために、ベクター断片は、しばしばバクテリ
アアルカリホスファターゼ(BAP)で処理される。あるい
は、再連結を防ぐために、不都合な断片を制限酵素で切
断することが使用され得る。
【0074】連結混合物は、E. coliのような適当なク
ローニング宿主中に形質転換され、そして成功した形質
転換体は、例えば抗生物質耐性によって選択され、正し
い構築物にスクリーニングされる。
ローニング宿主中に形質転換され、そして成功した形質
転換体は、例えば抗生物質耐性によって選択され、正し
い構築物にスクリーニングされる。
【0075】C.4.所望DNA配列の構築 合成オリゴヌクレオチドは、Warner, B.D., ら、DNA (1
984) 3:401-411の記述のような自動オリゴヌクレオチ
ド合成装置を用いて調製し得る。必要に応じて、これら
の合成鎖は、標準的なリン酸化条件にて、標識化された
ATPの存在下で、過剰のポリヌクレオチドキナーゼを用
いることにより、32Pで標識するためにリン酸化され得
る。
984) 3:401-411の記述のような自動オリゴヌクレオチ
ド合成装置を用いて調製し得る。必要に応じて、これら
の合成鎖は、標準的なリン酸化条件にて、標識化された
ATPの存在下で、過剰のポリヌクレオチドキナーゼを用
いることにより、32Pで標識するためにリン酸化され得
る。
【0076】ゲノムライブラリーまたはcDNAライブラリ
ーから単離された配列を含むDNA配列は、Zoller, M.,
ら、Nucleic Acids Res (1982) 10:6487-6499に記述の
ように、部位特異的な変異を誘発することによって修飾
し得る。簡単に言えば、修飾すべきDNAは、一本鎖配列
としてファージにパッケージされ、そしてDNAポリメラ
ーゼを用いて、二本鎖DNAに転換される。この際、修飾
すべきDNAの一部と相補的な合成ヌクレオチドをプライ
マーとして用い、そして所望の修飾をその配列に含め
る。得られた二本鎖DNAは、ファージを保持する宿主バ
クテリア中に形質転換され、そしてこの形質転換された
バクテリアの培養物(これは、ファージの各鎖の複製物
を含む)は、プラークを得るべく寒天中にプレート化さ
れる。理論的には、この新しいプラークの50%が一本鎖
として変異型を有するファージを含み;残りの50%が元
の配列を有する。このプラークの複製は、正しい鎖とハ
イブリダイズされるが、非修飾配列とはハイブリダイズ
されないような温度および条件下で、リン酸化された合
成プローブとハイブリダイズされる。次いで、このよう
に同定された、所望の修飾配列を回収し、所望のDNAの
ための起源として供するためにクローン化する。
ーから単離された配列を含むDNA配列は、Zoller, M.,
ら、Nucleic Acids Res (1982) 10:6487-6499に記述の
ように、部位特異的な変異を誘発することによって修飾
し得る。簡単に言えば、修飾すべきDNAは、一本鎖配列
としてファージにパッケージされ、そしてDNAポリメラ
ーゼを用いて、二本鎖DNAに転換される。この際、修飾
すべきDNAの一部と相補的な合成ヌクレオチドをプライ
マーとして用い、そして所望の修飾をその配列に含め
る。得られた二本鎖DNAは、ファージを保持する宿主バ
クテリア中に形質転換され、そしてこの形質転換された
バクテリアの培養物(これは、ファージの各鎖の複製物
を含む)は、プラークを得るべく寒天中にプレート化さ
れる。理論的には、この新しいプラークの50%が一本鎖
として変異型を有するファージを含み;残りの50%が元
の配列を有する。このプラークの複製は、正しい鎖とハ
イブリダイズされるが、非修飾配列とはハイブリダイズ
されないような温度および条件下で、リン酸化された合
成プローブとハイブリダイズされる。次いで、このよう
に同定された、所望の修飾配列を回収し、所望のDNAの
ための起源として供するためにクローン化する。
【0077】C.5.プローブとのハイブリダイゼーシ
ョン DNAライブラリーはGrunsteinおよびHogness (Proc Natl
Acad Sci (USA)(1975) 73:3961)の方法を用いて検索
される。この方法を簡単に述べると、検索されるDNA
は、ニトロセルロースフィルター上に固定化され、変性
され、0〜50%ホルムアミド、0.6M NaCl, 60mM クエン
酸ナトリウム、ウシ血清アルブミン、ポリビニルピロリ
ジンおよびフィコールの各0.02%(wt/v)、50mMのリン酸
ナトリウム(pH6.5)、1%グリシン、および100μg/ml
担体変性DNA、を含む緩衝液でプレハイブリダイズされ
る。この緩衝液中のホルムアミドのパーセントは、プレ
ハイブリダイゼーション段階およびその後のハイブリダ
イゼーション段階の時間条件および温度条件と同様に、
所望の厳密性に依存する。あまり厳密な条件を必要とし
ないオリゴマーのプローブは、一般に、低濃度のホルム
アミド、低温、および長いハイブリダイゼーション時間
が用いられる。30または40以上のヌクレオチドを含むプ
ローブ(これは、例えばcDNA配列またはゲノム配列に由
来のプローブである)は、一般に、高温(例えば約40〜
42℃)で高濃度(例えば50%ホルムアミド)で行われ
る。プレハイブリダイゼーションの後、32Pリン酸化オ
リゴヌクレオチドプローブを含む、この同じ緩衝液を添
加し、ハイブリダイゼーションを得る。このように処理
されたフィルターのラジオオートグラフィーから、ハイ
ブリダイズしたプローブの位置が得られ、検索されなか
った複製フィルター上の対応する位置を所望DNAの起源
として使用し得る。
ョン DNAライブラリーはGrunsteinおよびHogness (Proc Natl
Acad Sci (USA)(1975) 73:3961)の方法を用いて検索
される。この方法を簡単に述べると、検索されるDNA
は、ニトロセルロースフィルター上に固定化され、変性
され、0〜50%ホルムアミド、0.6M NaCl, 60mM クエン
酸ナトリウム、ウシ血清アルブミン、ポリビニルピロリ
ジンおよびフィコールの各0.02%(wt/v)、50mMのリン酸
ナトリウム(pH6.5)、1%グリシン、および100μg/ml
担体変性DNA、を含む緩衝液でプレハイブリダイズされ
る。この緩衝液中のホルムアミドのパーセントは、プレ
ハイブリダイゼーション段階およびその後のハイブリダ
イゼーション段階の時間条件および温度条件と同様に、
所望の厳密性に依存する。あまり厳密な条件を必要とし
ないオリゴマーのプローブは、一般に、低濃度のホルム
アミド、低温、および長いハイブリダイゼーション時間
が用いられる。30または40以上のヌクレオチドを含むプ
ローブ(これは、例えばcDNA配列またはゲノム配列に由
来のプローブである)は、一般に、高温(例えば約40〜
42℃)で高濃度(例えば50%ホルムアミド)で行われ
る。プレハイブリダイゼーションの後、32Pリン酸化オ
リゴヌクレオチドプローブを含む、この同じ緩衝液を添
加し、ハイブリダイゼーションを得る。このように処理
されたフィルターのラジオオートグラフィーから、ハイ
ブリダイズしたプローブの位置が得られ、検索されなか
った複製フィルター上の対応する位置を所望DNAの起源
として使用し得る。
【0078】C.6.構築の確認および配列決定 通常のベクター構築では、連結混合物は、E. coli株HB1
01または他の適当な宿主に形質転換され、成功した形質
転換体は抗生物質耐性マーカーまたは他のマーカーによ
り選択される。次いで、形質転換体に由来のプラスミド
は、Clewell,D.B.,ら、Proc Natl Acad Sci (USA) (196
9) 62:1159の方法に従って調製され、さらに通常、ク
ロラムフェニコール増幅(Clewell, D. B., J Bacterio
l (1972)110:667)が行われる。分離されたDNAは単離
され、そして制限分析により分析されるか、あるいは、
Sanger, F., ら、Proc Natl Acad Sci (USA) (1977) 7
4:5463により、さらにMessing、ら、Nucleic Acids Re
s (1981) 9:309のダイデオキシ法に記述のように、ま
たはMaxamら、Methods in Enzymology (1980) 65:499
の方法によって、配列決定される。時々、GCに富んだ領
域にて観察される、バンドが十分に分離されないという
問題を解決するため、T−デアゾグアノシンが用いられ
た(Barr, P., et al Biotechniques (1986) 4:428)。
01または他の適当な宿主に形質転換され、成功した形質
転換体は抗生物質耐性マーカーまたは他のマーカーによ
り選択される。次いで、形質転換体に由来のプラスミド
は、Clewell,D.B.,ら、Proc Natl Acad Sci (USA) (196
9) 62:1159の方法に従って調製され、さらに通常、ク
ロラムフェニコール増幅(Clewell, D. B., J Bacterio
l (1972)110:667)が行われる。分離されたDNAは単離
され、そして制限分析により分析されるか、あるいは、
Sanger, F., ら、Proc Natl Acad Sci (USA) (1977) 7
4:5463により、さらにMessing、ら、Nucleic Acids Re
s (1981) 9:309のダイデオキシ法に記述のように、ま
たはMaxamら、Methods in Enzymology (1980) 65:499
の方法によって、配列決定される。時々、GCに富んだ領
域にて観察される、バンドが十分に分離されないという
問題を解決するため、T−デアゾグアノシンが用いられ
た(Barr, P., et al Biotechniques (1986) 4:428)。
【0079】
【実施例】次の実施例は、本発明の例証を意図したもの
であり、制限するものではない。例えば、D.1.節中で述
べられる方法は、必要に応じて繰り返され得るが、その
必要のない場合もある。なぜなら、本発明によって提供
される情報に基づき、所望のヌクレオチドの配列の構築
に技術が利用できるからである。E. coliおよび酵母で
発現を例示する。しかし、他の系も、C.1.節中でさらに
充分に述べたように、利用し得る。ゲノム構造から由来
する付加的なエピトープもまた生産され得、そして後述
のように抗体を生成するために使用される。
であり、制限するものではない。例えば、D.1.節中で述
べられる方法は、必要に応じて繰り返され得るが、その
必要のない場合もある。なぜなら、本発明によって提供
される情報に基づき、所望のヌクレオチドの配列の構築
に技術が利用できるからである。E. coliおよび酵母で
発現を例示する。しかし、他の系も、C.1.節中でさらに
充分に述べたように、利用し得る。ゲノム構造から由来
する付加的なエピトープもまた生産され得、そして後述
のように抗体を生成するために使用される。
【0080】D.1.HDV cDNAの調製 1ml当り約1011感染量のδ剤を含むチンパンジー血清を
超遠心分離し、そしてタンパク分解酵素Kとともにイン
キュベートした後、得られたペレットから核酸を抽出し
た。簡単に言えば、RNAを、従来の方法によりビリオン
(ウイルス粒子)から抽出した。この方法は、例えば、
Ticehurst, J.E.,ら、Proc Acad Sci (USA) (1983) 8
0:5885-5889に記載されており、この方法は、タンパク
分解酵素による処理およびフェノール/クロロホルム抽
出、次いでエタノール沈澱を包含する。HDVを、pH7.5、
20mM HEPESおよび0.1% BSA中で20%のスクロースによ
り遠心分離した。1mg/mlのプロテイナーゼK、50μg/
ml酵母転移RNA、20mM HEPESpH7.5, 50mM EDTA, 200mM N
aClおよび1% SDSにより、37℃で一夜、タンパクを分
解した後、RNAを、フェノール/CHCl3抽出とエタノール
沈澱とにより精製した。
超遠心分離し、そしてタンパク分解酵素Kとともにイン
キュベートした後、得られたペレットから核酸を抽出し
た。簡単に言えば、RNAを、従来の方法によりビリオン
(ウイルス粒子)から抽出した。この方法は、例えば、
Ticehurst, J.E.,ら、Proc Acad Sci (USA) (1983) 8
0:5885-5889に記載されており、この方法は、タンパク
分解酵素による処理およびフェノール/クロロホルム抽
出、次いでエタノール沈澱を包含する。HDVを、pH7.5、
20mM HEPESおよび0.1% BSA中で20%のスクロースによ
り遠心分離した。1mg/mlのプロテイナーゼK、50μg/
ml酵母転移RNA、20mM HEPESpH7.5, 50mM EDTA, 200mM N
aClおよび1% SDSにより、37℃で一夜、タンパクを分
解した後、RNAを、フェノール/CHCl3抽出とエタノール
沈澱とにより精製した。
【0081】核酸を、変性ゲル電気泳動を使って分析
し、1700ヌクレオチドのRNAダブレットを得た。これ
は、ハイブリダイゼーション分析により決定された。こ
のダブレットは、Denniston, K.J.,ら、Science (1986)
(前述)により、約164bpのcDNAクローン、pkD3(この
ダブレット、およびδ剤により感染したサンプルに特異
的にハイブリダイズする)を得るために使用された。
し、1700ヌクレオチドのRNAダブレットを得た。これ
は、ハイブリダイゼーション分析により決定された。こ
のダブレットは、Denniston, K.J.,ら、Science (1986)
(前述)により、約164bpのcDNAクローン、pkD3(この
ダブレット、およびδ剤により感染したサンプルに特異
的にハイブリダイズする)を得るために使用された。
【0082】2つの相補性のあるオリゴヌクレオチド
を、DennistonらのpkD3 cDNAクローンから得られた配列
情報を基本として使用し、合成した。プローブ1:5'-G
ATGCCCTTCCCGATGCTCGATTCCGACTCおよびプローブ2:5'-
GAGTCGGAATCGAGCATCGGGAAGGGCATCを、200μCi32〔P〕A
TP,>5Ci/μmolを用いてリン酸化することにより標識
化した。プローブは、その5'末端をLillehaugら、Bioch
emistry (1976) 15:1858の方法によりT4キナーゼでリ
ン酸化し、そして次に、50% v/vのCH3OH, 50mM酢酸ア
ンモニウム、pH7.5で溶出することによりSep-pak C18カ
ートリッジ(ミリポア)で精製した。
を、DennistonらのpkD3 cDNAクローンから得られた配列
情報を基本として使用し、合成した。プローブ1:5'-G
ATGCCCTTCCCGATGCTCGATTCCGACTCおよびプローブ2:5'-
GAGTCGGAATCGAGCATCGGGAAGGGCATCを、200μCi32〔P〕A
TP,>5Ci/μmolを用いてリン酸化することにより標識
化した。プローブは、その5'末端をLillehaugら、Bioch
emistry (1976) 15:1858の方法によりT4キナーゼでリ
ン酸化し、そして次に、50% v/vのCH3OH, 50mM酢酸ア
ンモニウム、pH7.5で溶出することによりSep-pak C18カ
ートリッジ(ミリポア)で精製した。
【0083】DNAプローブへのハイブリダイゼーション
のために、HDV RNAを、対照のチンパンジーRNAおよびDN
Aサイズマーカー(Lehrach, H., et al, Bio-chemistry
(1977) 16:4743)と共に1%アガロース−ホルムアル
デヒドゲルで電気泳動にかけた。それぞれのゲルを、Th
omas, Proc Natl Acad Sci (USA) (1980) 77:5201に記
載されているように、ニトロセルロース膜の上に移し、
標識化された特異的プローブにハイブリダイズさせた。
相補体RNAと適当な対照とを含むゲルをこれらのプロー
ブのそれぞれと処理することにより、プローブ2だけが
相補体にハイブリダイズすることが示され、ゲノムの一
本鎖の性質が確かめられた。
のために、HDV RNAを、対照のチンパンジーRNAおよびDN
Aサイズマーカー(Lehrach, H., et al, Bio-chemistry
(1977) 16:4743)と共に1%アガロース−ホルムアル
デヒドゲルで電気泳動にかけた。それぞれのゲルを、Th
omas, Proc Natl Acad Sci (USA) (1980) 77:5201に記
載されているように、ニトロセルロース膜の上に移し、
標識化された特異的プローブにハイブリダイズさせた。
相補体RNAと適当な対照とを含むゲルをこれらのプロー
ブのそれぞれと処理することにより、プローブ2だけが
相補体にハイブリダイズすることが示され、ゲノムの一
本鎖の性質が確かめられた。
【0084】cDNAライブラリーを、RNAの3'−ヒドロキ
シ末端にpoly(rA)尾部を付加後、OkayamaおよびBerg
(Mol Cell Biol (1982) 2:161-170)の方法により、
チンパンジー血清ペレットのもとのRNA抽出液から調製
した。そのRNAは、poly(rA)ポリメラーゼとインキュベ
ーションする間にかなりの分解を示した。しかし、得ら
れたcDNAライブラリーをプローブ2を用いて調べると、
図4に示される配列を有するクローン、δ1、が回収さ
れていた。より小さな(250bp)重複しているクローン、
δ2、もまた、δ1のクローン化されたcDNAから切り取
られた435bpのNcoI断片を用いたところ、このライブラ
リー中に見出された。
シ末端にpoly(rA)尾部を付加後、OkayamaおよびBerg
(Mol Cell Biol (1982) 2:161-170)の方法により、
チンパンジー血清ペレットのもとのRNA抽出液から調製
した。そのRNAは、poly(rA)ポリメラーゼとインキュベ
ーションする間にかなりの分解を示した。しかし、得ら
れたcDNAライブラリーをプローブ2を用いて調べると、
図4に示される配列を有するクローン、δ1、が回収さ
れていた。より小さな(250bp)重複しているクローン、
δ2、もまた、δ1のクローン化されたcDNAから切り取
られた435bpのNcoI断片を用いたところ、このライブラ
リー中に見出された。
【0085】ゲノムおよびcDNAの相補鎖を同定するため
に、鎖特異的プローブを、〜950bpのPvuII/
HindIII制限断片(隣接した領域を含む)または〜450bp
のPvuII/PstI断片を用いてδ1から、調製した。これ
らの断片を、相補する一本鎖のδ相補体を生じるように
M13ベクター中に連結した。ハイブリダイゼーションプ
ローブを調製するために、0.8μgの各相補体DNAを、200
μM NaCl中の0.1μgのハイブリダイゼーション プロー
ブ プライマー(ニューイングランド バイオラボズ)
と混合し、次に、沸騰湯浴中で1分間変性させた後、37
℃で15分間インキュベートした。アニーリングされた混
合物を、一本鎖の挿入物を標識化するため、250U/mlの
クレノーと共に、50mM Tris-Cl, pH7.5, 5mM MgCl2, 10
mM β−メルカプトエタノール、50μg/ml BSA, 0.1mM d
ATP, dGTP, およびdTTP, 14μM dCTP (1000Ci/mmol)を
含む200μLで15℃にて2時間インキュベートした。反
応を停止させ、そしてセファデックスG50でDNAを精製
し、そしてボイドボリューム中に溶出されて得られたプ
ローブを、標識化した相補体RNAを含むノーザンブロッ
トにハイブリダイズさせるのに用いた。
に、鎖特異的プローブを、〜950bpのPvuII/
HindIII制限断片(隣接した領域を含む)または〜450bp
のPvuII/PstI断片を用いてδ1から、調製した。これ
らの断片を、相補する一本鎖のδ相補体を生じるように
M13ベクター中に連結した。ハイブリダイゼーションプ
ローブを調製するために、0.8μgの各相補体DNAを、200
μM NaCl中の0.1μgのハイブリダイゼーション プロー
ブ プライマー(ニューイングランド バイオラボズ)
と混合し、次に、沸騰湯浴中で1分間変性させた後、37
℃で15分間インキュベートした。アニーリングされた混
合物を、一本鎖の挿入物を標識化するため、250U/mlの
クレノーと共に、50mM Tris-Cl, pH7.5, 5mM MgCl2, 10
mM β−メルカプトエタノール、50μg/ml BSA, 0.1mM d
ATP, dGTP, およびdTTP, 14μM dCTP (1000Ci/mmol)を
含む200μLで15℃にて2時間インキュベートした。反
応を停止させ、そしてセファデックスG50でDNAを精製
し、そしてボイドボリューム中に溶出されて得られたプ
ローブを、標識化した相補体RNAを含むノーザンブロッ
トにハイブリダイズさせるのに用いた。
【0086】成功裏に得られたプローブ(〜450bp PvuI
I/PstI断片鎖の1つ)に対する結果を、図5に示す。
第1列(レーン1)は、標識化マーカーを含み、第2列
は、血漿からのδビリオンRNA 10ngを含み、第3列およ
び第4列は、それぞれ、対照および感染したチンパンジ
ーからの肝臓RNA 1.4μgを含む。第2列および第4列
は、明らかにウイルス核酸の存在を示す。
I/PstI断片鎖の1つ)に対する結果を、図5に示す。
第1列(レーン1)は、標識化マーカーを含み、第2列
は、血漿からのδビリオンRNA 10ngを含み、第3列およ
び第4列は、それぞれ、対照および感染したチンパンジ
ーからの肝臓RNA 1.4μgを含む。第2列および第4列
は、明らかにウイルス核酸の存在を示す。
【0087】付加的なHDV cDNAライブラリーを、HDV RN
Aの逆転写を開始する子牛胸腺のランダムプライマー(T
aylor, J.M., et al, Biochem Biophys Acta(1976)44
2:324-3300)を使用して調製した。得られた一本鎖cDN
Aを次いで精製し、そして、E. coliのDNAポリメラーゼ
Iとともにインキュベーションすることにより二本鎖に
した。次に、S1ヌクレアーゼで処理し、cDNAに、ターミ
ナルトランスフェラーゼを用いオリゴ−dCを末端につ
け、そして、前もってPstIで制限処理したdG末端につい
ているpBR322を用いてアニーリングした。次に、そのプ
ラスミドを、宿主細菌のE. coli MC1061中に形質転換
し、そしてテトラサイクリン耐性の組換え体を、δクロ
ーンを選択するために、後述のようにコロニー−ハイブ
リダイゼーションした。(これらの一般的方法は、Mani
atis, T.ら、により分子クローニング(Cold Spring Ha
rbor Laboratory)pp. 229-242 (1982)中に記載されて
いる)。
Aの逆転写を開始する子牛胸腺のランダムプライマー(T
aylor, J.M., et al, Biochem Biophys Acta(1976)44
2:324-3300)を使用して調製した。得られた一本鎖cDN
Aを次いで精製し、そして、E. coliのDNAポリメラーゼ
Iとともにインキュベーションすることにより二本鎖に
した。次に、S1ヌクレアーゼで処理し、cDNAに、ターミ
ナルトランスフェラーゼを用いオリゴ−dCを末端につ
け、そして、前もってPstIで制限処理したdG末端につい
ているpBR322を用いてアニーリングした。次に、そのプ
ラスミドを、宿主細菌のE. coli MC1061中に形質転換
し、そしてテトラサイクリン耐性の組換え体を、δクロ
ーンを選択するために、後述のようにコロニー−ハイブ
リダイゼーションした。(これらの一般的方法は、Mani
atis, T.ら、により分子クローニング(Cold Spring Ha
rbor Laboratory)pp. 229-242 (1982)中に記載されて
いる)。
【0088】δ1のcDNA挿入物からの435bpのNcoI断片
を、ニックトランスレーションし、そして、上記ランダ
ムプライムしたcDNAライブラリーを選択するのに使用
し、δ4およびδ115を得た。δ115中のcDNA挿入物の48
1bpのHindIII/SmaI断片を、このライブラリーの選択に
用い、δ7aを得た。クローンδ3bおよびδ7bは、δ115
からの配列(5'-TGGAACGTCGGAGAAAC-3')を基にしてオリ
ゴヌクレオチドのプローブを用いて得られた。
を、ニックトランスレーションし、そして、上記ランダ
ムプライムしたcDNAライブラリーを選択するのに使用
し、δ4およびδ115を得た。δ115中のcDNA挿入物の48
1bpのHindIII/SmaI断片を、このライブラリーの選択に
用い、δ7aを得た。クローンδ3bおよびδ7bは、δ115
からの配列(5'-TGGAACGTCGGAGAAAC-3')を基にしてオリ
ゴヌクレオチドのプローブを用いて得られた。
【0089】このようにして、次のような付加的なクロ
ーンをこのライブラリーから回収した:δ3b(829bp)、
δ4(1123bp)、δ7a(474bp)、δ7b(1378bp)、およ
びδ115 (1362bp)。これらのクローンと、δ1およびδ
2との配列を決定すると、図1に示すように、ゲノムの
重なっている部分が得られた。この配列のデータによ
り、もとのHDV RNAが、環状分子であることが強く示唆
された。なぜなら、7つの異なったcDNAクローンの配列
が、長さにしてほんの〜1700ヌクレオチドの線状分子に
適合し得ないからである。この仮説は、変性条件下で電
子顕微鏡により環状HDV RNA分子を観察することにより
確認された。ゲノムおよびその相補体を示すDNAの完全
な配列は、図2に示されており、そしてそれは、種々な
クローンの重複している部分は考慮して描かれている。
その上方の鎖は、HDVのゲノムRNAを示し、下方鎖は、そ
の相補体である。図2に示されるように、種々のクロー
ン間で、配列にある程度の異質性があった。
ーンをこのライブラリーから回収した:δ3b(829bp)、
δ4(1123bp)、δ7a(474bp)、δ7b(1378bp)、およ
びδ115 (1362bp)。これらのクローンと、δ1およびδ
2との配列を決定すると、図1に示すように、ゲノムの
重なっている部分が得られた。この配列のデータによ
り、もとのHDV RNAが、環状分子であることが強く示唆
された。なぜなら、7つの異なったcDNAクローンの配列
が、長さにしてほんの〜1700ヌクレオチドの線状分子に
適合し得ないからである。この仮説は、変性条件下で電
子顕微鏡により環状HDV RNA分子を観察することにより
確認された。ゲノムおよびその相補体を示すDNAの完全
な配列は、図2に示されており、そしてそれは、種々な
クローンの重複している部分は考慮して描かれている。
その上方の鎖は、HDVのゲノムRNAを示し、下方鎖は、そ
の相補体である。図2に示されるように、種々のクロー
ン間で、配列にある程度の異質性があった。
【0090】ヌクレオチド配列における異質性は、ゲノ
ム鎖上に示される。コードされるアミノ酸を、相補鎖の
下に示す。AMは、アンバー終止コドンを示し、そしてOP
は、オパール終止コドンを示す。表1は、いくつかのク
ローンの異質性の比較を示す。
ム鎖上に示される。コードされるアミノ酸を、相補鎖の
下に示す。AMは、アンバー終止コドンを示し、そしてOP
は、オパール終止コドンを示す。表1は、いくつかのク
ローンの異質性の比較を示す。
【0091】
【表1】
【0092】
【表2】
【0093】表2は、少なくとも300ヌクレオチドの開
放読み取り枠(ORF)によってコードされるポリペプチド
(推定)を示す。各開放読み取り枠のはじめのヌクレオ
チドの位置は、図2に示される上方鎖の番号に従って示
される。ゲノム配列を表す上方鎖は、1−1679と番号づ
けられた。相補体の位置は同じ番号を持つが、しかしx
によって前置きされる。従って、相補体の領域によって
コードされるポリペプチドは、「リバース(逆向き)」
の順序の番号が与えられる。例えば、ORF5に対してx16
19−x1014が与えられる。表中の第1番目のヌクレオチ
ドの番号は、該枠の最初のヌクレオチドのそれであり、
ATGではない。ORF5の翻訳読み取り枠を、図2(表2の
推定ポリペプチドp1)に示し、そして、N−グリコシル
化されている可能性のある部位を*により示す。
放読み取り枠(ORF)によってコードされるポリペプチド
(推定)を示す。各開放読み取り枠のはじめのヌクレオ
チドの位置は、図2に示される上方鎖の番号に従って示
される。ゲノム配列を表す上方鎖は、1−1679と番号づ
けられた。相補体の位置は同じ番号を持つが、しかしx
によって前置きされる。従って、相補体の領域によって
コードされるポリペプチドは、「リバース(逆向き)」
の順序の番号が与えられる。例えば、ORF5に対してx16
19−x1014が与えられる。表中の第1番目のヌクレオチ
ドの番号は、該枠の最初のヌクレオチドのそれであり、
ATGではない。ORF5の翻訳読み取り枠を、図2(表2の
推定ポリペプチドp1)に示し、そして、N−グリコシル
化されている可能性のある部位を*により示す。
【0094】ORF5領域を含んでいるクローンのヌクレオ
チド配列分析により、この領域中のいくつかの配列異質
性が解明された。これらの異質性は、図3に示される。
この図3は、ORF5のヌクレオチド配列を示す。他のクロ
ーンから決定されるヌクレオチド配列の異質性を、ヌク
レオチド配列の上に示す。その配列異質性から生じる別
のアミノ酸を、上記推定されるアミノ酸配列の上に示
す。配列中のこの異質性の結果により、ORF5は、極めて
密接な関連性のあるポリペプチドをコードする。
チド配列分析により、この領域中のいくつかの配列異質
性が解明された。これらの異質性は、図3に示される。
この図3は、ORF5のヌクレオチド配列を示す。他のクロ
ーンから決定されるヌクレオチド配列の異質性を、ヌク
レオチド配列の上に示す。その配列異質性から生じる別
のアミノ酸を、上記推定されるアミノ酸配列の上に示
す。配列中のこの異質性の結果により、ORF5は、極めて
密接な関連性のあるポリペプチドをコードする。
【0095】以下に論ぜられるように、p24δおよびp27
δの両方のウイルスポリペプチドがORF5中にコードされ
ているようであるため、ORF5のヌクレオチド608位の異
質性(図3参照)は、特に興味深い。608位がAを含む
ならば、生じるコドンは、(もし、宿主が、アンバーサ
プレッサーシステムを有していなければ)翻訳されてp2
4δのサイズのポリペプチドを生じるアンバー終止コド
ンである。しかし、608位が、Gを含んでいるならば
(宿主が、アンバー変異を抑制する能力をもつならば)
664位のオパール終止シグナルまでのコドンの読み通し
により、p27δのサイズのポリペプチドが生じる。この
示唆は、次の知見により支持される。その知見とは、po
rf5で形質転換されたE. coli D1210中のORF5の発現は、
大きさと免疫反応性(D.3.節参照)によりウイルス抗原
p24δおよびp27δと同定され得る2つの生産物を生じる
という知見である。E. coli D1210は、リーキーアンバ
ーサプレッサー系を含む。従って、翻訳の一部分は、ア
ンバーコドンで終結する。その示唆の確認は、porf5中
に存在するORFの608位でAをGに置換することによって
得られる。この置換は、in vitro位置特異的変異を用い
ることにより、達成され得る。位置特異的変異の手法
は、平均的当業者に公知である。
δの両方のウイルスポリペプチドがORF5中にコードされ
ているようであるため、ORF5のヌクレオチド608位の異
質性(図3参照)は、特に興味深い。608位がAを含む
ならば、生じるコドンは、(もし、宿主が、アンバーサ
プレッサーシステムを有していなければ)翻訳されてp2
4δのサイズのポリペプチドを生じるアンバー終止コド
ンである。しかし、608位が、Gを含んでいるならば
(宿主が、アンバー変異を抑制する能力をもつならば)
664位のオパール終止シグナルまでのコドンの読み通し
により、p27δのサイズのポリペプチドが生じる。この
示唆は、次の知見により支持される。その知見とは、po
rf5で形質転換されたE. coli D1210中のORF5の発現は、
大きさと免疫反応性(D.3.節参照)によりウイルス抗原
p24δおよびp27δと同定され得る2つの生産物を生じる
という知見である。E. coli D1210は、リーキーアンバ
ーサプレッサー系を含む。従って、翻訳の一部分は、ア
ンバーコドンで終結する。その示唆の確認は、porf5中
に存在するORFの608位でAをGに置換することによって
得られる。この置換は、in vitro位置特異的変異を用い
ることにより、達成され得る。位置特異的変異の手法
は、平均的当業者に公知である。
【0096】HDVの完全なゲノムは、1679ヌクレオチド
の環状配列を示す。相補的な合成オリゴマーのうちのた
だ1つと、一本鎖δ1、M13プローブとが、その鋳型に
ハイブリダイズするので、上記ゲノムRNAは一本鎖であ
ると推定される。さらに、その鋳型RNAを、in vitroに
おいてウサギ網状赤血球溶解産物に翻訳することはでき
ない。このことは、該ゲノムが、事実上アンチセンス鎖
を表す可能性を示す。
の環状配列を示す。相補的な合成オリゴマーのうちのた
だ1つと、一本鎖δ1、M13プローブとが、その鋳型に
ハイブリダイズするので、上記ゲノムRNAは一本鎖であ
ると推定される。さらに、その鋳型RNAを、in vitroに
おいてウサギ網状赤血球溶解産物に翻訳することはでき
ない。このことは、該ゲノムが、事実上アンチセンス鎖
を表す可能性を示す。
【0097】D.2.ポリペプチドをコードしているク
ローンの確認 感染した血漿に由来するウイルスRNAを、ランダムプラ
イムし、そして生じたcDNAを、上記のように、GC末端鎖
を使いpBR322のPstI部位中にクローン化した。連結混合
物を、E. coli MC 1061に形質転換し、約20,000の組換
え体のプールからプラスミドDNAを調製した。そのプラ
スミドDNAを、PstIを用いて開裂し、そして、cDNA挿入
物を、アガロースゲルから溶出し、クレノーを使って平
滑末端とした。これをEcoRIリンカーに連結し、そし
て、宿主としてY1090(r-)を用い、ファージベクターλ
gt11(Young, et al, Proc Natl Acad Sci USA (1983)
80:1194-1198)の唯一のEcoRI部位にクローン化した。
このファージ−ランダムcDNAライブラリーを、次に、上
記の関連するδ4およびδ115クローンから誘導された
2つのプローブにハイブリダイゼーションすることによ
りスクリーニングした。さらに、コロニーを、B型肝炎
およびδウイルスに慢性的に感染したヒト由来の抗血清
を用いて、免疫スクリーニングした。
ローンの確認 感染した血漿に由来するウイルスRNAを、ランダムプラ
イムし、そして生じたcDNAを、上記のように、GC末端鎖
を使いpBR322のPstI部位中にクローン化した。連結混合
物を、E. coli MC 1061に形質転換し、約20,000の組換
え体のプールからプラスミドDNAを調製した。そのプラ
スミドDNAを、PstIを用いて開裂し、そして、cDNA挿入
物を、アガロースゲルから溶出し、クレノーを使って平
滑末端とした。これをEcoRIリンカーに連結し、そし
て、宿主としてY1090(r-)を用い、ファージベクターλ
gt11(Young, et al, Proc Natl Acad Sci USA (1983)
80:1194-1198)の唯一のEcoRI部位にクローン化した。
このファージ−ランダムcDNAライブラリーを、次に、上
記の関連するδ4およびδ115クローンから誘導された
2つのプローブにハイブリダイゼーションすることによ
りスクリーニングした。さらに、コロニーを、B型肝炎
およびδウイルスに慢性的に感染したヒト由来の抗血清
を用いて、免疫スクリーニングした。
【0098】プローブと抗血清との両方に結合する、い
くつかのプラークを得た。1つの回収プラークを、塩基
配列決定した。そしてそれは、約200bpのcDNAを含んで
いた。このcDNAの翻訳読み取り枠は、表2に示されるア
ンチゲノム鎖から翻訳されたポリペプチドp1の部分に相
当する。このλgt11により生産されるβ−ガラクトシダ
ーゼ融合タンパクは、そのカルボキシル末端に、δ抗血
清の特異的な結合に応答するポリペプチドp1の領域を含
んでいた。A型肝炎、B型肝炎および非A/非B型肝炎
に前もって感染させておいたものから得られる対照の抗
血清は、この融合タンパクに結合しなかった。従って、
p1は、δに感染した抗血清への特異的結合能力のある抗
原領域を明らかに含み、それゆえ、診断に有用である。
くつかのプラークを得た。1つの回収プラークを、塩基
配列決定した。そしてそれは、約200bpのcDNAを含んで
いた。このcDNAの翻訳読み取り枠は、表2に示されるア
ンチゲノム鎖から翻訳されたポリペプチドp1の部分に相
当する。このλgt11により生産されるβ−ガラクトシダ
ーゼ融合タンパクは、そのカルボキシル末端に、δ抗血
清の特異的な結合に応答するポリペプチドp1の領域を含
んでいた。A型肝炎、B型肝炎および非A/非B型肝炎
に前もって感染させておいたものから得られる対照の抗
血清は、この融合タンパクに結合しなかった。従って、
p1は、δに感染した抗血清への特異的結合能力のある抗
原領域を明らかに含み、それゆえ、診断に有用である。
【0099】D.3.発現ベクターの構築およびHDV配
列の発現 HDVゲノムおよびその相補体は、多くのORFを含む(D.1.
節参照)。これらORFのいくつかは発現しており、そし
てコードされているポリペプチドの抗原性が、HDV抗血
清への結合能力について調べられた。図7は、HDV ORF
のダイアグラムである。ATGで始まっている300ヌクレオ
チドより大きい全てのHDV ORFは、HDVゲノムの円形座標
の形で示されている。太い線は、バクテリア中に発現さ
れる各ORFの部分を示す。黒三角は、各ORFの最初の枠内
のATGを示す。矢印は、ゲノムまたは反ゲノムの鎖の翻
訳、時計回りまたは反時計回りをそれぞれ示す。各全て
のORFの座標、細菌中および関係のある翻訳枠の中に表
現されている領域を、表の形で示した。
列の発現 HDVゲノムおよびその相補体は、多くのORFを含む(D.1.
節参照)。これらORFのいくつかは発現しており、そし
てコードされているポリペプチドの抗原性が、HDV抗血
清への結合能力について調べられた。図7は、HDV ORF
のダイアグラムである。ATGで始まっている300ヌクレオ
チドより大きい全てのHDV ORFは、HDVゲノムの円形座標
の形で示されている。太い線は、バクテリア中に発現さ
れる各ORFの部分を示す。黒三角は、各ORFの最初の枠内
のATGを示す。矢印は、ゲノムまたは反ゲノムの鎖の翻
訳、時計回りまたは反時計回りをそれぞれ示す。各全て
のORFの座標、細菌中および関係のある翻訳枠の中に表
現されている領域を、表の形で示した。
【0100】D.3.a.ORF5およびORF6中にコード
されるHDVポリペプチドを含む融合タンパクのE. coli中
での発現 融合タンパクの合成を指示する細菌の発現プラスミドを
構築した。上記融合タンパクは、ヒトのスーパーオキシ
ドジスムターゼ(SDS)(Hallewellet al, Nucleic Acids
Res (1985) 13:2017)、およびさらに、ORF5またはO
RF6中にコードされたHDVタンパクの部分(つまりp1お
よびp2)をそれぞれ含む。このプラスミドは、ORF5に
コードされたp1またはORF6にコードされたp2(SODのカ
ルボキシル末端に融合されている)のほとんどを合成し
た。
されるHDVポリペプチドを含む融合タンパクのE. coli中
での発現 融合タンパクの合成を指示する細菌の発現プラスミドを
構築した。上記融合タンパクは、ヒトのスーパーオキシ
ドジスムターゼ(SDS)(Hallewellet al, Nucleic Acids
Res (1985) 13:2017)、およびさらに、ORF5またはO
RF6中にコードされたHDVタンパクの部分(つまりp1お
よびp2)をそれぞれ含む。このプラスミドは、ORF5に
コードされたp1またはORF6にコードされたp2(SODのカ
ルボキシル末端に融合されている)のほとんどを合成し
た。
【0101】発現プラスミドは、Hallewellらの発現プ
ラスミドpSOD16(前出)を働かせるtacプロモーターに
基づく。プラスミドpSOD16cf2は、SOD遺伝子のカルボ
キシル末端をコードする部分と、下流のポリリンカー配
列の部分とを、MboI部位を介して次の新しいポリリンカ
ー配列により交換することにより、pSOD16から生じた:
ラスミドpSOD16(前出)を働かせるtacプロモーターに
基づく。プラスミドpSOD16cf2は、SOD遺伝子のカルボ
キシル末端をコードする部分と、下流のポリリンカー配
列の部分とを、MboI部位を介して次の新しいポリリンカ
ー配列により交換することにより、pSOD16から生じた:
【0102】
【化7】
【0103】このポリリンカー配列の置換の結果、SOD
の元のカルボキシル末端のGlnが除去される。
の元のカルボキシル末端のGlnが除去される。
【0104】HDVゲノム由来の配列を挿入するために、
(Steimeret al, J Virol (1986) 58:9-16)の方法を採用
した。pSOD16cf2を、以下に記載するように所望の特別
なコード配列に調節するために、適当に分解した。
(Steimeret al, J Virol (1986) 58:9-16)の方法を採用
した。pSOD16cf2を、以下に記載するように所望の特別
なコード配列に調節するために、適当に分解した。
【0105】p1については、回収したDNAクローンδ115
を、SstIIで分解し、クレノーで平滑末端とし、そしてS
alIで分解し、600bp断片を回収(アガロースゲルから単
離)した。単離された断片を、あらかじめNcoIで分解し
たpSOD16cf2に連結し、平滑末端とし、そしてSalIで分
解してpSOD−δp1を得た。コードされた融合タンパク
は、ヌクレオチドx1567からx963によりコードされるp1
アミノ酸配列の205残基を含んでいる。
を、SstIIで分解し、クレノーで平滑末端とし、そしてS
alIで分解し、600bp断片を回収(アガロースゲルから単
離)した。単離された断片を、あらかじめNcoIで分解し
たpSOD16cf2に連結し、平滑末端とし、そしてSalIで分
解してpSOD−δp1を得た。コードされた融合タンパク
は、ヌクレオチドx1567からx963によりコードされるp1
アミノ酸配列の205残基を含んでいる。
【0106】p2タンパクについては、組換えDNAプラス
ミドδ4をEcoRIとSmaIとで切断し、622bpの断片を回収
した。この断片は、EcoRI/SmaIで分解したpSOD16cf2
の中に連結され、pSOD−δp2が生じた。
ミドδ4をEcoRIとSmaIとで切断し、622bpの断片を回収
した。この断片は、EcoRI/SmaIで分解したpSOD16cf2
の中に連結され、pSOD−δp2が生じた。
【0107】(得られたプラスミドの両方を配列決定し
て、SODタンパクのC末端で配列をコードしているp1お
よびp2の位置と方向とを確認した)。
て、SODタンパクのC末端で配列をコードしているp1お
よびp2の位置と方向とを確認した)。
【0108】連結生産物を、E. coli D1210(Sadler et
al, Gene (1980) 8:279-300)の中に形質転換した。単
一コロニーの形質転換体を100μg/mlアンピシリンを添
加したL−ブロース培地中2mlで37℃にて一夜増殖させ
た。これら培養物のグリセロール(50%)貯蔵物を調製
し、−20℃で保存した。
al, Gene (1980) 8:279-300)の中に形質転換した。単
一コロニーの形質転換体を100μg/mlアンピシリンを添
加したL−ブロース培地中2mlで37℃にて一夜増殖させ
た。これら培養物のグリセロール(50%)貯蔵物を調製
し、−20℃で保存した。
【0109】タンパクの発現分析のために、上記の培地
中での終夜培養を、グリセロール貯蔵物を用いて始め
た。これらの培養物を、上記と同一の培地中に1/100希
釈し、OD650が0.6となるまで37℃で培養を行った。その
とき、その一部を溶菌するか、もしくは、1mM IPTGの
添加を行い溶菌前の4時間にさらにインキュベートする
ことにより、最高の発現が達成される。
中での終夜培養を、グリセロール貯蔵物を用いて始め
た。これらの培養物を、上記と同一の培地中に1/100希
釈し、OD650が0.6となるまで37℃で培養を行った。その
とき、その一部を溶菌するか、もしくは、1mM IPTGの
添加を行い溶菌前の4時間にさらにインキュベートする
ことにより、最高の発現が達成される。
【0110】変成ポリアクリルアミドゲル(Laemmli, Na
ture (1970) 277 :680)上で分析するために、細胞を、
SODおよびDTTの存在下で溶解させた。そして、Towbin
ら、Proc Natl Acad Sci USA (1979) 76:4350に従って
イムノブロッティングを行った。その結果を、図6に示
す。
ture (1970) 277 :680)上で分析するために、細胞を、
SODおよびDTTの存在下で溶解させた。そして、Towbin
ら、Proc Natl Acad Sci USA (1979) 76:4350に従って
イムノブロッティングを行った。その結果を、図6に示
す。
【0111】イムノブロットを、慢性的に感染した患者
(パネルA)または、non-δ肝炎ウイルスに感染した抗
血清を含む対照の抗血清(パネルB)からのδ抗血清と
反応させた。さらに、5%のヤギ血清に前結合させた
後、イムノブロットを、0.3%Tween-20と5%ヤギ血清
とを含む1×PBSで希釈された抗血清の1:300希釈物と
反応させ、次に、西洋ワサビペルオキシダーゼと接合し
たヤギ抗ヒトIgGの1:200希釈物でインキュベートし、
そしてその沈降物(ブロット)を、クロモーゲン4−ク
ロロ−1−ナフトール(Biorad)の存在下で、展開した。
(パネルA)または、non-δ肝炎ウイルスに感染した抗
血清を含む対照の抗血清(パネルB)からのδ抗血清と
反応させた。さらに、5%のヤギ血清に前結合させた
後、イムノブロットを、0.3%Tween-20と5%ヤギ血清
とを含む1×PBSで希釈された抗血清の1:300希釈物と
反応させ、次に、西洋ワサビペルオキシダーゼと接合し
たヤギ抗ヒトIgGの1:200希釈物でインキュベートし、
そしてその沈降物(ブロット)を、クロモーゲン4−ク
ロロ−1−ナフトール(Biorad)の存在下で、展開した。
【0112】図6において、第1〜4列は、pSOD−δp1
組換え体ベクターを含む細胞の抽出物を含み;第5およ
び第6列は、宿主ベクターに形質転換した細胞からの抽
出物を含み;第7〜10列は、対応するpSOD−δp2組換え
体ベクターを含んでいた。第3、4、6、9および10列
の検体は、IPTGで誘発されていない培養物からのもので
あり;残りの第1、2、5、7および8列からの検体
は、IPTGで、さらに誘発された培養物からのものであっ
た。第5〜10列に比較したときの第1〜4列中の付加的
なタンパクバンドの存在は、pSOD−δp2からではなく、
SOD−p1と命名されたpSOD−δp1からの抗原的に反応す
るタンパクの生産を示す。従って、ORF6でなくORF5
が、ヒトHDV抗血清に特異的に結合するタンパクをコー
ドする。特異的な免疫反応性のORF6融合ポリペプチド
を検出することができないのは、細胞宿主中での発現の
欠失によるためでなかった。というのも、ヒト スーパ
ーオキシドジスムターゼに対して生じるウサギ抗血清へ
の結合をモニターすると、pSOD−δ1およびpSOD−δ2
から発現した生産物が、同様のレベルで存在したからで
あった。
組換え体ベクターを含む細胞の抽出物を含み;第5およ
び第6列は、宿主ベクターに形質転換した細胞からの抽
出物を含み;第7〜10列は、対応するpSOD−δp2組換え
体ベクターを含んでいた。第3、4、6、9および10列
の検体は、IPTGで誘発されていない培養物からのもので
あり;残りの第1、2、5、7および8列からの検体
は、IPTGで、さらに誘発された培養物からのものであっ
た。第5〜10列に比較したときの第1〜4列中の付加的
なタンパクバンドの存在は、pSOD−δp2からではなく、
SOD−p1と命名されたpSOD−δp1からの抗原的に反応す
るタンパクの生産を示す。従って、ORF6でなくORF5
が、ヒトHDV抗血清に特異的に結合するタンパクをコー
ドする。特異的な免疫反応性のORF6融合ポリペプチド
を検出することができないのは、細胞宿主中での発現の
欠失によるためでなかった。というのも、ヒト スーパ
ーオキシドジスムターゼに対して生じるウサギ抗血清へ
の結合をモニターすると、pSOD−δ1およびpSOD−δ2
から発現した生産物が、同様のレベルで存在したからで
あった。
【0113】図6のAに見られるように、HDV抗血清に
免疫反応性であるpSOD−δ1からの2つの翻訳生産物
が、優性的に存在する。最も大きい主要な免疫反応性OR
F5ポリペプチドの推定の大きさは、49,000ダルトンで
あり、そしてそれは、スーパーオキシドジスムターゼの
154アミノ酸とORF5によって特徴づけられる205アミノ
酸とを含む融合タンパクと一致する。このポリペプチド
は、ORF5中のアンバーコドンの抑制から生じうる(図
2参照)。このアンバーコドンはpSOD−δ1中に存在
し、そして、宿主株E. coli D1210は、アンバーサプレ
ッサー株である。より小さい第2の主要なポリペプチド
生産物は、サプレッションの濡れから生じる。そのた
め、アンバーコドンにおける転写集結を許容する。他の
可能な別の説明としては、上記小さい方のタンパク(単
数もしくは複数)は、単一生産物の翻訳後プロセッシン
グから生じうること、またはORF5のコード領域内に別
の開始部位が存在する、ということがある。
免疫反応性であるpSOD−δ1からの2つの翻訳生産物
が、優性的に存在する。最も大きい主要な免疫反応性OR
F5ポリペプチドの推定の大きさは、49,000ダルトンで
あり、そしてそれは、スーパーオキシドジスムターゼの
154アミノ酸とORF5によって特徴づけられる205アミノ
酸とを含む融合タンパクと一致する。このポリペプチド
は、ORF5中のアンバーコドンの抑制から生じうる(図
2参照)。このアンバーコドンはpSOD−δ1中に存在
し、そして、宿主株E. coli D1210は、アンバーサプレ
ッサー株である。より小さい第2の主要なポリペプチド
生産物は、サプレッションの濡れから生じる。そのた
め、アンバーコドンにおける転写集結を許容する。他の
可能な別の説明としては、上記小さい方のタンパク(単
数もしくは複数)は、単一生産物の翻訳後プロセッシン
グから生じうること、またはORF5のコード領域内に別
の開始部位が存在する、ということがある。
【0114】E. coli株 D1210(pSOD−δ1)のサンプ
ルを、アメリカンタイプ カルチャーコレクション(ATC
C)、12310 Parklawn drive, Rockville, MD 20852,に寄
託し、そして、寄託No.67131を得た。この寄託物は、ブ
ダペスト条約により規定される条件下で維持される。
ルを、アメリカンタイプ カルチャーコレクション(ATC
C)、12310 Parklawn drive, Rockville, MD 20852,に寄
託し、そして、寄託No.67131を得た。この寄託物は、ブ
ダペスト条約により規定される条件下で維持される。
【0115】D.3.b.ORF1、2および7にコード
されたHDVポリペプチドを含むタンパクのE. coli中での
発現 ORF1、2および7中にコードされ、SODとHDVタンパク
とを含む融合タンパクの合成を指示する、細菌の発現ベ
クター(つまりベクターpSOD−orf1、pSOD−orf2および
pSOD−orf7)を構築した。構築の条件と配列決定法は、
次の事項を除いてD.3.a.節におけるpSOD−δ1および
pSOD−δ2についての記載と同様に行った。
されたHDVポリペプチドを含むタンパクのE. coli中での
発現 ORF1、2および7中にコードされ、SODとHDVタンパク
とを含む融合タンパクの合成を指示する、細菌の発現ベ
クター(つまりベクターpSOD−orf1、pSOD−orf2および
pSOD−orf7)を構築した。構築の条件と配列決定法は、
次の事項を除いてD.3.a.節におけるpSOD−δ1および
pSOD−δ2についての記載と同様に行った。
【0116】pSOD−orf1については、436bpの挿入物断
片を、そのプラスミドNcoIで分解することにより、クロ
ーンδ1から単離し、次にゲル精製を行った。この断片
を、Nco I処理し、ホスファターゼ処理したpSOD16cf2
に連結した。そのクローン中のORF1断片は、ゲノムの
方向性を有する。
片を、そのプラスミドNcoIで分解することにより、クロ
ーンδ1から単離し、次にゲル精製を行った。この断片
を、Nco I処理し、ホスファターゼ処理したpSOD16cf2
に連結した。そのクローン中のORF1断片は、ゲノムの
方向性を有する。
【0117】pSOD−orf2については、593bpの挿入物ゲ
ル精製断片を、BstXIによるクローンδ115の分解後、単
離し、クレノーで処理し、次にEcoRIで分解した。この
断片を、Nco Iで切断したpSOD16cf2に連結し、クレノ
ーで平滑末端とし、そしてEcoRIで分解した。
ル精製断片を、BstXIによるクローンδ115の分解後、単
離し、クレノーで処理し、次にEcoRIで分解した。この
断片を、Nco Iで切断したpSOD16cf2に連結し、クレノ
ーで平滑末端とし、そしてEcoRIで分解した。
【0118】pSOD−orf7については、439bpの挿入物ゲ
ル精製断片を、AluIとSmaIとでクローンδ115を分解し
た後に分離した。この断片を、SmaI切断しホスファター
ゼ処理したpSOD16cf2に連結した。
ル精製断片を、AluIとSmaIとでクローンδ115を分解し
た後に分離した。この断片を、SmaI切断しホスファター
ゼ処理したpSOD16cf2に連結した。
【0119】pSOD−orf1、pSOD−orf2およびpSOD−orf7
中に発現したタンパクをpSOD−δ1およびpSOD−δ2に
おいて記載したようにイムノブロットにより分析を行っ
た(D.3.a.節参照)。
中に発現したタンパクをpSOD−δ1およびpSOD−δ2に
おいて記載したようにイムノブロットにより分析を行っ
た(D.3.a.節参照)。
【0120】発現条件もまた、D.3.a.節に記載したの
と同様である。細菌溶解産物中のORF1、2および7hSO
D融合生産物の存在は、hSODに対するウサギ抗−hSODポ
リクローナル抗体の部分的活性により、実証された。各
ORFを発現する細菌培養物の溶解産物を、ニトロセルロ
ースの上にイムノブロットし、そして慢性のHDV感染物
を有する12の異なる患者からの個々の抗血清と共にイン
キュベートした。pSOD−orf1、pSOD−orf2、そしてpSOD
−orf7から発現した生産物は、HDV抗血清に結合しなか
った。しかし、pORF5(その構造は、D.3.c.節に記載
されている)から発現した生産物は、そのHDV抗血清に
結合した。
と同様である。細菌溶解産物中のORF1、2および7hSO
D融合生産物の存在は、hSODに対するウサギ抗−hSODポ
リクローナル抗体の部分的活性により、実証された。各
ORFを発現する細菌培養物の溶解産物を、ニトロセルロ
ースの上にイムノブロットし、そして慢性のHDV感染物
を有する12の異なる患者からの個々の抗血清と共にイン
キュベートした。pSOD−orf1、pSOD−orf2、そしてpSOD
−orf7から発現した生産物は、HDV抗血清に結合しなか
った。しかし、pORF5(その構造は、D.3.c.節に記載
されている)から発現した生産物は、そのHDV抗血清に
結合した。
【0121】D.3.c.ORF5にコードされた融合し
ていないHDVポリペプチドのE. coli中で発現 細菌の発現プラスミド(ORF5でコードされた融合してい
ないポリペプチドの合成を指示する)を構築した。この
ベクターporf5は、第2の合成リンカーを含んでいるこ
とを除いて、融合したSOD-orfポリペプチドを発現する
ために使われるもの(pSOD−δp1、D.3.a.節参照)と
類似している。上記第2の合成リンカーは、hSODコード
配列のあとの翻訳を終結するため、およびHDV配列の最
初のATGで翻訳を再開始するために設計された。このリ
ンカーは、ORF5中にもとから存在する10アミノ酸をコ
ードしており、アミノ末端ATGを含む。さらに明確に
は、そのベクターは、次のものを共に連結することによ
り構築された:a)δ115から制限し、そしてゲル精製
した605b.p.のSstII/SalI断片;b)第2のリンカー;
およびc)NcoIとSalIとでpSOD16cf2を処理することに
よって得られた大きいベクター断片。上記リンカー配列
は、次のとおりである:
ていないHDVポリペプチドのE. coli中で発現 細菌の発現プラスミド(ORF5でコードされた融合してい
ないポリペプチドの合成を指示する)を構築した。この
ベクターporf5は、第2の合成リンカーを含んでいるこ
とを除いて、融合したSOD-orfポリペプチドを発現する
ために使われるもの(pSOD−δp1、D.3.a.節参照)と
類似している。上記第2の合成リンカーは、hSODコード
配列のあとの翻訳を終結するため、およびHDV配列の最
初のATGで翻訳を再開始するために設計された。このリ
ンカーは、ORF5中にもとから存在する10アミノ酸をコ
ードしており、アミノ末端ATGを含む。さらに明確に
は、そのベクターは、次のものを共に連結することによ
り構築された:a)δ115から制限し、そしてゲル精製
した605b.p.のSstII/SalI断片;b)第2のリンカー;
およびc)NcoIとSalIとでpSOD16cf2を処理することに
よって得られた大きいベクター断片。上記リンカー配列
は、次のとおりである:
【0122】
【化8】
【0123】プラスミドporf5でE. coli D1210の形質
転換を、D.3.a.節に記述されている(他のプラスミド
での形質転換が記載されている)ようにして行った。po
rf5の中のその挿入物の構築は、DNA配列分析によって
確証された。この分析により、ORF5のδ115誘導体中の
アンバーコドンの存在もまた確証された(ORF5の配列異
質性についての図3参照)。
転換を、D.3.a.節に記述されている(他のプラスミド
での形質転換が記載されている)ようにして行った。po
rf5の中のその挿入物の構築は、DNA配列分析によって
確証された。この分析により、ORF5のδ115誘導体中の
アンバーコドンの存在もまた確証された(ORF5の配列異
質性についての図3参照)。
【0124】porf5内にコードされるORF5ポリペプチ
ドを発現させ、発現生産物のHDV抗血清との免疫反応性
をD.3.a.節に記述されるように行った。そして、pSOD
−orf1、pSOD−orf2、およびpSOD−orf6、およびpSOD−
orf7からの発現生産物の分析を同時に行った。図8(イ
ムノブロットを示す)に見られるように、ORF5をコー
ドするポリペプチドだけが、HDV抗血清に結合した。そ
して、これらのポリペプチドは、感染していない個体か
らの抗血清には結合しなかった。
ドを発現させ、発現生産物のHDV抗血清との免疫反応性
をD.3.a.節に記述されるように行った。そして、pSOD
−orf1、pSOD−orf2、およびpSOD−orf6、およびpSOD−
orf7からの発現生産物の分析を同時に行った。図8(イ
ムノブロットを示す)に見られるように、ORF5をコー
ドするポリペプチドだけが、HDV抗血清に結合した。そ
して、これらのポリペプチドは、感染していない個体か
らの抗血清には結合しなかった。
【0125】図8のイムノブロットの分析については、
対照のプラスミド(pSOD16cf2)またはhSOD−orf1、
2、6、7およびORF5の発現プラスミドを有する細菌
培養物を、IPTGにより約4時間誘発させて行った。細胞
をペレット化し、細胞の0.024Dに相当する脂質およびタ
ンパクを、D.3.節に記載されるように12%Laemmliゲル
上で電気泳動にかけた。タンパクを、炭酸緩衝液中のニ
トロセルロースフィルター上に移行させた。イムノブロ
ットをヒトHDV抗血清の1:200希釈物でインキュベート
し、次に、125Iで標識化ヒツジ抗ヒトIgG抗体でインキ
ュベートした。そして、D.3.a.節に記載されるように
洗浄した。溶解産物は、次の順序で現れる:第1列、pS
OD16cf2;第2列、pSOD−orf1;第3列、pSOD−orf2;
第4列、porf5;第5列、pSDS−orf6;および第6列、
pSOD−orf7。
対照のプラスミド(pSOD16cf2)またはhSOD−orf1、
2、6、7およびORF5の発現プラスミドを有する細菌
培養物を、IPTGにより約4時間誘発させて行った。細胞
をペレット化し、細胞の0.024Dに相当する脂質およびタ
ンパクを、D.3.節に記載されるように12%Laemmliゲル
上で電気泳動にかけた。タンパクを、炭酸緩衝液中のニ
トロセルロースフィルター上に移行させた。イムノブロ
ットをヒトHDV抗血清の1:200希釈物でインキュベート
し、次に、125Iで標識化ヒツジ抗ヒトIgG抗体でインキ
ュベートした。そして、D.3.a.節に記載されるように
洗浄した。溶解産物は、次の順序で現れる:第1列、pS
OD16cf2;第2列、pSOD−orf1;第3列、pSOD−orf2;
第4列、porf5;第5列、pSDS−orf6;および第6列、
pSOD−orf7。
【0126】図8はまた、次の事柄を示す。それは、po
rf5から発現し、HDVに特異的な抗体と反応する生産物
には、2つの分子量種があり、それらのポリペプチドは
約27kおよび24kであるという事柄である。以下に示すよ
うに、これらのポリペプチドは、2つの肝炎ウイルスポ
リペプチドp27δとp24δとにより共有される免疫原性の
エピトープを含む。HDV中の27kdおよび24kdポリペプチ
ドの存在は、最近報告されている。Bergmann,K.F.およ
びGerin,J.L., J of Inf Diseases (1986) 154:702;
およびBonino, F.ら、J Virol (1986) 58:945。さら
に、以下に示されるように、これらのポリペプチドはま
た、おそらく、肝炎デルタ抗原(HDAg)を有する。HDAg
は、元来、感染した個体の肝細胞の核中に見出されてい
た。Rizzetto, M.ら、Gut (1977) 18:997。
rf5から発現し、HDVに特異的な抗体と反応する生産物
には、2つの分子量種があり、それらのポリペプチドは
約27kおよび24kであるという事柄である。以下に示すよ
うに、これらのポリペプチドは、2つの肝炎ウイルスポ
リペプチドp27δとp24δとにより共有される免疫原性の
エピトープを含む。HDV中の27kdおよび24kdポリペプチ
ドの存在は、最近報告されている。Bergmann,K.F.およ
びGerin,J.L., J of Inf Diseases (1986) 154:702;
およびBonino, F.ら、J Virol (1986) 58:945。さら
に、以下に示されるように、これらのポリペプチドはま
た、おそらく、肝炎デルタ抗原(HDAg)を有する。HDAg
は、元来、感染した個体の肝細胞の核中に見出されてい
た。Rizzetto, M.ら、Gut (1977) 18:997。
【0127】D.3.d.ORF5にコードされるHDVポリ
ペプチドの酵母中での発現、およびその生産物の部分的
精製 ORF5がコードする所望のHDVポリペプチドの合成を指示
する酵母の発現ベクターを構築した。酵母株AB110中で
のこのプラスミド(pYAG−δp1)の発現により195アミ
ノ酸ポリペプチドが生じた。このポリペプチドは、免疫
学的にHDV抗血清と反応性を有し、おそらくウイルスタ
ンパクp24δであろう。
ペプチドの酵母中での発現、およびその生産物の部分的
精製 ORF5がコードする所望のHDVポリペプチドの合成を指示
する酵母の発現ベクターを構築した。酵母株AB110中で
のこのプラスミド(pYAG−δp1)の発現により195アミ
ノ酸ポリペプチドが生じた。このポリペプチドは、免疫
学的にHDV抗血清と反応性を有し、おそらくウイルスタ
ンパクp24δであろう。
【0128】酵母発現ベクターpYAG−δp1は、次のよう
に構築された:第1に、pBS100中の発現カセットの内
に、新しいリンカーに連結したクローンδ115からのORF
5を挿入することによりpAG−δp1を構築した。BamHIで
切り出され得るそのカセットは、唯一のNco I部位の上
流にADH2−GAPを制御し得るプロモーター、および唯一
のSalI部位の下流にGAPターミネーターを含む。E. coli
HB 101中にpAG−δp1をクローニングした後、ORF5を
含む発現カセットを、pAG−δp1からBamHIで制限切断
し、そして、あらかじめBamHIで制限切断した酵母シャ
トルベクターpBA24中に連結した。生じたプラスミド
を、E. coli HB 101中にクローン化し、そして、シャト
ルプラスミドpYAG−δp1を選択した。ORF5の発現につ
いては、酵母株AB110を、このプラスミドにより形質転
換し、AB110(pYAG−δp1)を形成させた。
に構築された:第1に、pBS100中の発現カセットの内
に、新しいリンカーに連結したクローンδ115からのORF
5を挿入することによりpAG−δp1を構築した。BamHIで
切り出され得るそのカセットは、唯一のNco I部位の上
流にADH2−GAPを制御し得るプロモーター、および唯一
のSalI部位の下流にGAPターミネーターを含む。E. coli
HB 101中にpAG−δp1をクローニングした後、ORF5を
含む発現カセットを、pAG−δp1からBamHIで制限切断
し、そして、あらかじめBamHIで制限切断した酵母シャ
トルベクターpBA24中に連結した。生じたプラスミド
を、E. coli HB 101中にクローン化し、そして、シャト
ルプラスミドpYAG−δp1を選択した。ORF5の発現につ
いては、酵母株AB110を、このプラスミドにより形質転
換し、AB110(pYAG−δp1)を形成させた。
【0129】酵母株AB110(pYAG−δp1)のサンプルをAT
CC、12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 2085
2に寄託した。そして、登録No.20845を得た。この寄託
物は、ブタペスト条約に規定され条件下で維持される。
CC、12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 2085
2に寄託した。そして、登録No.20845を得た。この寄託
物は、ブタペスト条約に規定され条件下で維持される。
【0130】さらに詳細には、ORF5を含有する発現カ
セットは、次のものを連結させて構築された:SstIIとS
alIとでクローンδ115を分解することによって得られ、
ゲル精製された605b.p.の断片;新しいリンカー(リン
カー3);およびNcoIとSalIとでPBS100を分解すること
によって得られ、ゲル精製した5841b.p.断片。上記リン
カー3の配列は、次のとおりである:
セットは、次のものを連結させて構築された:SstIIとS
alIとでクローンδ115を分解することによって得られ、
ゲル精製された605b.p.の断片;新しいリンカー(リン
カー3);およびNcoIとSalIとでPBS100を分解すること
によって得られ、ゲル精製した5841b.p.断片。上記リン
カー3の配列は、次のとおりである:
【0131】
【化9】
【0132】プラスミドPBS100は、米国特許出願第760,
197号に記載されている。この特許出願は、ここに譲受
人に譲渡されており、これにより参照文献として採用す
る。このプラスミドは、pBR322誘導体のpAB12にクロー
ン化された酵母発現カセットを含んでいる。この発現カ
セットは、ハイブリッドADH2-GAPプロモーター、GAPタ
ーミネーター、そしてNcoI部位とSalI部位間の本質的で
はない配列を含んでいる;これらの後者の配列は、クロ
ーンδ115のORF5領域と置換された。ADH2-GAPプロモー
ターは、プラスミドpJS103から単離された1200bp BamHI
−NcoI断片である。
197号に記載されている。この特許出願は、ここに譲受
人に譲渡されており、これにより参照文献として採用す
る。このプラスミドは、pBR322誘導体のpAB12にクロー
ン化された酵母発現カセットを含んでいる。この発現カ
セットは、ハイブリッドADH2-GAPプロモーター、GAPタ
ーミネーター、そしてNcoI部位とSalI部位間の本質的で
はない配列を含んでいる;これらの後者の配列は、クロ
ーンδ115のORF5領域と置換された。ADH2-GAPプロモー
ターは、プラスミドpJS103から単離された1200bp BamHI
−NcoI断片である。
【0133】プラスミドpJS103は、以下のように構築し
た:プラスミドpADR2(Beier et al,Nature (1982) 30
0:724-728)の野性型ADH2遺伝子を含むプラスミドを制
限酵素EcoRVで切断することによって、プロモーターのA
DH2部分を構築した。制限酵素EcoRVは、pADR2中の他の
2つの部位と同様に、ADH2領域の外側にあるATG開始コ
ドンに関連する+66位において切断する。得られたベク
ター断片および2つのより小さな断片の混合物をBal31
エクソヌクレアーゼで再び切除し、約300bpを除去し
た。合成XhoIリンカーを、Bal31で処理したDNA上に連結
した。得られたDNAリンカーベクター断片(約5kb)
を、カラムクロマトグラフィーによってリンカー群から
分離し、制限酵素XhoIで切断、連結し、そしてE. coli
をアンピシリン耐性に形質転換させるために用いた。Xh
oIリンカーの位置は、DNAの配列決定により決められ
た。ADH2遺伝子(ATGから-232位)の5'非転写領域内のX
hoIリンカーを含む1つのプラスミドを、制限酵素XhoI
で切断し、ヌクレアーゼS1で処理し、次いで制限酵素Ec
oRIで処理し、XhoIリンカー部位の1つの平滑末端およ
びEcoRI末端を有する線状ベクター分子を得た。酵素Bam
HIおよびEcoRIでプラスミドpPGAP1を切断し、次いで0.4
kbpのDNA断片を単離することによって、プロモーターの
GAP部分を構築した。次いで、この精製した断片を酵素A
luIで完全に切断し、そして約200bp断片を単離した。こ
のGAPプロモーター断片を上記の線状ベクター上に存在
するADH2断片に連結し、プラスミドpJS103を得た。
た:プラスミドpADR2(Beier et al,Nature (1982) 30
0:724-728)の野性型ADH2遺伝子を含むプラスミドを制
限酵素EcoRVで切断することによって、プロモーターのA
DH2部分を構築した。制限酵素EcoRVは、pADR2中の他の
2つの部位と同様に、ADH2領域の外側にあるATG開始コ
ドンに関連する+66位において切断する。得られたベク
ター断片および2つのより小さな断片の混合物をBal31
エクソヌクレアーゼで再び切除し、約300bpを除去し
た。合成XhoIリンカーを、Bal31で処理したDNA上に連結
した。得られたDNAリンカーベクター断片(約5kb)
を、カラムクロマトグラフィーによってリンカー群から
分離し、制限酵素XhoIで切断、連結し、そしてE. coli
をアンピシリン耐性に形質転換させるために用いた。Xh
oIリンカーの位置は、DNAの配列決定により決められ
た。ADH2遺伝子(ATGから-232位)の5'非転写領域内のX
hoIリンカーを含む1つのプラスミドを、制限酵素XhoI
で切断し、ヌクレアーゼS1で処理し、次いで制限酵素Ec
oRIで処理し、XhoIリンカー部位の1つの平滑末端およ
びEcoRI末端を有する線状ベクター分子を得た。酵素Bam
HIおよびEcoRIでプラスミドpPGAP1を切断し、次いで0.4
kbpのDNA断片を単離することによって、プロモーターの
GAP部分を構築した。次いで、この精製した断片を酵素A
luIで完全に切断し、そして約200bp断片を単離した。こ
のGAPプロモーター断片を上記の線状ベクター上に存在
するADH2断片に連結し、プラスミドpJS103を得た。
【0134】プラスミドpPGAP1は、GAPDHターミネータ
ーと先端を切ったGAPDHプロモーター領域の間に多制限
部位リンカーを有する酵母発現カセットベクターであ
る。この多制限部位は、NcoI, EcoRIおよびSalIに対す
る認識部位を含み、そしてこのカセットは、BamHI断片
として切断し得る。pPGAP1の調製は、欧州特許出願公報
No.EPO O 164 556およびTravis, J.ら、J Biol Chem (1
985) 260(7):4384-4389中に記載されている。両方の参
照文献において、pPGAP1はpPGAPと呼ばれている。
ーと先端を切ったGAPDHプロモーター領域の間に多制限
部位リンカーを有する酵母発現カセットベクターであ
る。この多制限部位は、NcoI, EcoRIおよびSalIに対す
る認識部位を含み、そしてこのカセットは、BamHI断片
として切断し得る。pPGAP1の調製は、欧州特許出願公報
No.EPO O 164 556およびTravis, J.ら、J Biol Chem (1
985) 260(7):4384-4389中に記載されている。両方の参
照文献において、pPGAP1はpPGAPと呼ばれている。
【0135】プラスミドpAB12は、特異なHindIII部位お
よびSalI部位の間の領域を欠くpBR322誘導体であって、
特異なEcoRI部位中にBamHIリンカーを含んでいる。Hind
IIIおよびSalIでpBR322を完全に切断し、次いでBal1ヌ
クレアーゼで限定分解することによってベクターを構築
した。得られた末端は、クレノーで溶離し、そして平滑
化された末端をT4 DNAリガーゼで連結し、閉じた共有結
合環を再形成させた。次いで、これらの環状物をEcoRI
で完全に切断し、突出部はクレノーで満たし、そして平
滑末端をBamHIリンカーで連結した。過剰のリンカー
は、BamHIで切断することにより除去し、そして連結す
ることによって、共有結合性閉環状物を形成させた。
よびSalI部位の間の領域を欠くpBR322誘導体であって、
特異なEcoRI部位中にBamHIリンカーを含んでいる。Hind
IIIおよびSalIでpBR322を完全に切断し、次いでBal1ヌ
クレアーゼで限定分解することによってベクターを構築
した。得られた末端は、クレノーで溶離し、そして平滑
化された末端をT4 DNAリガーゼで連結し、閉じた共有結
合環を再形成させた。次いで、これらの環状物をEcoRI
で完全に切断し、突出部はクレノーで満たし、そして平
滑末端をBamHIリンカーで連結した。過剰のリンカー
は、BamHIで切断することにより除去し、そして連結す
ることによって、共有結合性閉環状物を形成させた。
【0136】プラスミドpAB24は、完全な2μ配列(Bro
ach, 酵母サッカロマイセスの分子生物学、1:445,コ
ールドスプリングハーバープレス (1981))およびpBR322
配列を含む、酵母のシャトルベクターである。このプラ
スミドは、さらにプラスミドYEp24(Botstein, et al,
(1979) Gene 8:17)由来の酵母URA3遺伝子、およびプラ
スミドpC1/1(欧州特許出願公報No. EPO O 116 201に記
載)由来の酵母LEU2d遺伝子を含んでいる。EcoRIでYEp2
4を切断し、そしてベクターを再連結して部分的2μ配
列を除去することによって、プラスミドpAB24を構築し
た。得られたプラスミド、すなわちYEp24ΔRIをClaIで
切断して線状化し、そしてClaIで線状化されている完全
な2μプラスミドで連結した。次いで、得られたプラス
ミド、すなわちpCBouをXbaIで切断し、そして8605bpベ
クター断片をゲル分離した。この単離されたXbaI断片
は、pC1/1から単離したLEU2d遺伝子を含む4460bp XbaI
断片と連結した;LEU2d遺伝子の配向は、URA3遺伝子と
同じ方向にある。発現カセットは、pBR322配列の特異な
BamHI部位に挿入されており、従って細菌のテトラサイ
クリン耐性遺伝子を中断していた。制限酵素部位および
いくつかの顕著な特徴を表す、pAB24の地図を図9に示
す。
ach, 酵母サッカロマイセスの分子生物学、1:445,コ
ールドスプリングハーバープレス (1981))およびpBR322
配列を含む、酵母のシャトルベクターである。このプラ
スミドは、さらにプラスミドYEp24(Botstein, et al,
(1979) Gene 8:17)由来の酵母URA3遺伝子、およびプラ
スミドpC1/1(欧州特許出願公報No. EPO O 116 201に記
載)由来の酵母LEU2d遺伝子を含んでいる。EcoRIでYEp2
4を切断し、そしてベクターを再連結して部分的2μ配
列を除去することによって、プラスミドpAB24を構築し
た。得られたプラスミド、すなわちYEp24ΔRIをClaIで
切断して線状化し、そしてClaIで線状化されている完全
な2μプラスミドで連結した。次いで、得られたプラス
ミド、すなわちpCBouをXbaIで切断し、そして8605bpベ
クター断片をゲル分離した。この単離されたXbaI断片
は、pC1/1から単離したLEU2d遺伝子を含む4460bp XbaI
断片と連結した;LEU2d遺伝子の配向は、URA3遺伝子と
同じ方向にある。発現カセットは、pBR322配列の特異な
BamHI部位に挿入されており、従って細菌のテトラサイ
クリン耐性遺伝子を中断していた。制限酵素部位および
いくつかの顕著な特徴を表す、pAB24の地図を図9に示
す。
【0137】酵母におけるORF5の発現は、pYAG−δp1で
形質転換した酵母株AB110を用いて達成された。酵母株A
B110は、米国特許出願第620,662号に記載されている。
この特許出願は、ここに譲受人に譲渡されており、これ
により参照文献として採用する。AB110の遺伝子型は、M
ATα、ura3-52、leu2-04、またはleu2-3およびleu2-112
の両方、pep4-3, his4-500〔cir°〕である。
形質転換した酵母株AB110を用いて達成された。酵母株A
B110は、米国特許出願第620,662号に記載されている。
この特許出願は、ここに譲受人に譲渡されており、これ
により参照文献として採用する。AB110の遺伝子型は、M
ATα、ura3-52、leu2-04、またはleu2-3およびleu2-112
の両方、pep4-3, his4-500〔cir°〕である。
【0138】発現させるために、凍結貯蔵した細胞をLe
u-プレート上に筋状にまき、そして30℃でインキュベー
トした。単一コロニーを、ロイシン選択培地〔合成最小
培地、アミノ酸供給(w/o Leu)、8%グルコース;Sher
manら、酵母遺伝子学における方法に対する実験室マニ
ュアル、コールドスプリングハーバーラボラトリー、19
86, pp. 163-169〕に植菌し、そしてこの培養物を30℃
にて振盪しながらインキュベートした。次いで、2mlの
培養物を、100mlの3%グルコース含有Leu-培地に植菌
し、そして30℃にて振盪しながらインキュベートした。
この培養物が飽和状態に達したら、50mlを、1Lの1%
グルコース含有Leu-培地に植菌した。この培養物は、光
学密度がOD650=1.75OD/mlと測定されるまで、30℃にて
振盪しながらインキュベートした。光学密度がこのよう
な値になると、細胞はペレット化し、そして−80℃で貯
蔵するか、あるいはタンパク精製のためのプロセッシン
グを行った。
u-プレート上に筋状にまき、そして30℃でインキュベー
トした。単一コロニーを、ロイシン選択培地〔合成最小
培地、アミノ酸供給(w/o Leu)、8%グルコース;Sher
manら、酵母遺伝子学における方法に対する実験室マニ
ュアル、コールドスプリングハーバーラボラトリー、19
86, pp. 163-169〕に植菌し、そしてこの培養物を30℃
にて振盪しながらインキュベートした。次いで、2mlの
培養物を、100mlの3%グルコース含有Leu-培地に植菌
し、そして30℃にて振盪しながらインキュベートした。
この培養物が飽和状態に達したら、50mlを、1Lの1%
グルコース含有Leu-培地に植菌した。この培養物は、光
学密度がOD650=1.75OD/mlと測定されるまで、30℃にて
振盪しながらインキュベートした。光学密度がこのよう
な値になると、細胞はペレット化し、そして−80℃で貯
蔵するか、あるいはタンパク精製のためのプロセッシン
グを行った。
【0139】酵母中で発現する、ORF5がコードしたタン
パクを部分的に以下のように精製した。酵母発現培養
物、AB110(pYAG−δp1)をペレット化し、そしてパック
された細胞の体積を見積もった。δp1タンパクは、ガラ
スビーズ溶解法を用いて精製した。細胞ペレットは、緩
衝液I(50mM Tris-HCl pH8.0、1mM EDTA、1mMフェニ
ルメチルスルホニルフルオライド(PMSF)、1μg/mlペ
プスタチンA)の2容量、およびガラスビーズ(0.25m
m、酸処理および加熱処理済)の1容量中に再懸濁し
た。この細胞を激しく撹拌することによって溶解し、そ
して4℃で保存した。懸濁液を遠心分離して上澄を除去
し、そして細胞ペレットを2容量の1%TritonX-100含
有緩衝液Iで洗浄し、次いで遠心分離した。上澄を除去
し、そしてペレットを2容量の緩衝液Iで3回、洗浄し
た;最後の洗浄の間に、ガラスビーズをタンパク懸濁液
から除去した。洗浄したペレットは、同容量の6M尿素
含有緩衝液Iで2回、抽出し、タンパクを溶解させた。
上澄を集め、緩衝液Iを用いて1:10に希釈し、そして
防腐剤として20mMのアジ化ナトリウムを用いて4℃で保
存した。このタンパクを使用する前の最終段階として、
PMSFおよびペプスタチンを含まない緩衝液Iの100〜300
容量で2回、透析した。
パクを部分的に以下のように精製した。酵母発現培養
物、AB110(pYAG−δp1)をペレット化し、そしてパック
された細胞の体積を見積もった。δp1タンパクは、ガラ
スビーズ溶解法を用いて精製した。細胞ペレットは、緩
衝液I(50mM Tris-HCl pH8.0、1mM EDTA、1mMフェニ
ルメチルスルホニルフルオライド(PMSF)、1μg/mlペ
プスタチンA)の2容量、およびガラスビーズ(0.25m
m、酸処理および加熱処理済)の1容量中に再懸濁し
た。この細胞を激しく撹拌することによって溶解し、そ
して4℃で保存した。懸濁液を遠心分離して上澄を除去
し、そして細胞ペレットを2容量の1%TritonX-100含
有緩衝液Iで洗浄し、次いで遠心分離した。上澄を除去
し、そしてペレットを2容量の緩衝液Iで3回、洗浄し
た;最後の洗浄の間に、ガラスビーズをタンパク懸濁液
から除去した。洗浄したペレットは、同容量の6M尿素
含有緩衝液Iで2回、抽出し、タンパクを溶解させた。
上澄を集め、緩衝液Iを用いて1:10に希釈し、そして
防腐剤として20mMのアジ化ナトリウムを用いて4℃で保
存した。このタンパクを使用する前の最終段階として、
PMSFおよびペプスタチンを含まない緩衝液Iの100〜300
容量で2回、透析した。
【0140】D.4.ORF5内でコードされたポリペプチ
ドの同定 ORF5内でコードされたポリペプチドは、p27δおよびp24
δのポリペプチドとして同定されたが、この同定は細菌
の組換え非融合ポリペプチド中で発現した大きさを、HD
V粒子中およびHDAg陽性の肝臓抽出物中に存在するp27δ
およびp24δの大きさと直接比較することによって行っ
た。さらに、ORF5がコードしたポリペプチドは、酵母中
で発現した組換えポリペプチドと、p27δおよびp24δの
間のHDV抗体に対する免疫学的競合に基づいて、p27δお
よびp24δとして同定された。最後に、ORF5がコードし
ているポリペプチドは、組換えポリペプチドの、核HDAg
との競合結合により、核HDAgの成分として同定した。こ
の競合結合は、HDV感染肝臓切片の間接的な免疫ペルオ
キシダーゼ染色によってモニターされる。
ドの同定 ORF5内でコードされたポリペプチドは、p27δおよびp24
δのポリペプチドとして同定されたが、この同定は細菌
の組換え非融合ポリペプチド中で発現した大きさを、HD
V粒子中およびHDAg陽性の肝臓抽出物中に存在するp27δ
およびp24δの大きさと直接比較することによって行っ
た。さらに、ORF5がコードしたポリペプチドは、酵母中
で発現した組換えポリペプチドと、p27δおよびp24δの
間のHDV抗体に対する免疫学的競合に基づいて、p27δお
よびp24δとして同定された。最後に、ORF5がコードし
ているポリペプチドは、組換えポリペプチドの、核HDAg
との競合結合により、核HDAgの成分として同定した。こ
の競合結合は、HDV感染肝臓切片の間接的な免疫ペルオ
キシダーゼ染色によってモニターされる。
【0141】D.4.a.細菌中で発現した、porf5由
来のポリペプチドを結合している抗HDV抗体と、HDV粒子
中およびHDV感染肝臓中のp24δおよびp27δの比較 ORF5がコードした、porf5由来のポリペプチドの細菌中
における発現、およびその溶解産物の調製は、D.3.
節中で上述したように行った。HDV粒子およびHDV感染肝
臓の溶解産物は、K.F. BergmannおよびJ.L. Geria, J o
f Inf Diseases(1986) 154:702(これにより参照文献
として採用する)に記述されている方法に従って、親切
にもK.F. Bergmann氏によって調製された。肝臓溶解産
物の調製においては、肝臓の試料を鋏で細かく切り刻
み、そしてPBSで洗浄し、次いで6MのグアニジニウムHC
l(pH6)中でPotter-Elvejem装置を用いて均質化した。
4℃にて1〜3時間のインキュベーションの後、抽出物
を10分間、1500gで遠心分離し、PBSに対して透析し、
そして再度、遠心分離した。ウイルスの溶解産物は、報
告された方法を変更し、BSAを除くことによって調製さ
れた。血清試料を、20%スクロース、0.02M HEPES(pH7.
4), 0.01M CaCl2, 0.01M MgCl2上に積み重ね、そしてSW
41ローター中、150,000gで5時間、遠心分離し、ウイ
ルスをペレット化した。このペレットは、0.05M Tris
(pH6.8)および2% SDS中で保持した。
来のポリペプチドを結合している抗HDV抗体と、HDV粒子
中およびHDV感染肝臓中のp24δおよびp27δの比較 ORF5がコードした、porf5由来のポリペプチドの細菌中
における発現、およびその溶解産物の調製は、D.3.
節中で上述したように行った。HDV粒子およびHDV感染肝
臓の溶解産物は、K.F. BergmannおよびJ.L. Geria, J o
f Inf Diseases(1986) 154:702(これにより参照文献
として採用する)に記述されている方法に従って、親切
にもK.F. Bergmann氏によって調製された。肝臓溶解産
物の調製においては、肝臓の試料を鋏で細かく切り刻
み、そしてPBSで洗浄し、次いで6MのグアニジニウムHC
l(pH6)中でPotter-Elvejem装置を用いて均質化した。
4℃にて1〜3時間のインキュベーションの後、抽出物
を10分間、1500gで遠心分離し、PBSに対して透析し、
そして再度、遠心分離した。ウイルスの溶解産物は、報
告された方法を変更し、BSAを除くことによって調製さ
れた。血清試料を、20%スクロース、0.02M HEPES(pH7.
4), 0.01M CaCl2, 0.01M MgCl2上に積み重ね、そしてSW
41ローター中、150,000gで5時間、遠心分離し、ウイ
ルスをペレット化した。このペレットは、0.05M Tris
(pH6.8)および2% SDS中で保持した。
【0142】ORF5を発現する細菌溶解産物は、12%ラエ
ムリ(Laemmli)ゲル上の、ペレット化したHDV抽出物、
またはHDAg陽性の肝臓抽出物に隣接したレーン中で電気
泳動を行い、ニトロセルロースフィルターにイムノブロ
ットさせ、そしてHDV抗血清(希釈率1:400)でインキ
ュベートした。図10のAは、HDVウイルスの抽出物
(レーン1)、感染した肝臓溶解産物(レーン2)、そ
してprof5発現後の細菌溶解産物(レーン3)のイムノ
ブロットを表す。図10のAに明らかなように、細菌溶
解産物中の2つの主要な免疫反応性ポリペプチドは、ペ
レット化したウイルスおよびHDAg陽性の肝臓から抽出さ
れたp27δおよびp24δのポリペプチドと共に移動するよ
うであった。いくつかの低分子量の免疫反応性ポリペプ
チドも、細菌溶解産物中に存在した;これらは、p27お
よび/またはp24のタンパク分解産物を表している。
ムリ(Laemmli)ゲル上の、ペレット化したHDV抽出物、
またはHDAg陽性の肝臓抽出物に隣接したレーン中で電気
泳動を行い、ニトロセルロースフィルターにイムノブロ
ットさせ、そしてHDV抗血清(希釈率1:400)でインキ
ュベートした。図10のAは、HDVウイルスの抽出物
(レーン1)、感染した肝臓溶解産物(レーン2)、そ
してprof5発現後の細菌溶解産物(レーン3)のイムノ
ブロットを表す。図10のAに明らかなように、細菌溶
解産物中の2つの主要な免疫反応性ポリペプチドは、ペ
レット化したウイルスおよびHDAg陽性の肝臓から抽出さ
れたp27δおよびp24δのポリペプチドと共に移動するよ
うであった。いくつかの低分子量の免疫反応性ポリペプ
チドも、細菌溶解産物中に存在した;これらは、p27お
よび/またはp24のタンパク分解産物を表している。
【0143】D.4.b.酵母または細菌中で発現した
ORF5ポリペプチドと、HDV粒子中またはHDV感染肝臓中の
p24δおよびp27δとの間の免疫学的競合 組換えORF5産物と、ウイルスペプチドp24δおよびp27δ
との間の免疫学的競合は、競合結合測定法によって測定
した。一般に、HDV抗血清は、酵母または細菌中のいず
れかで生産された組換えORF5産物に吸収させた。前吸収
させた血清は、イムノブロッティング法におけるウイル
スのp24δおよびp27δへの結合能力に関して、対照血清
と比較した。対照血清は、対照(親)ベクターで形質転
換した、酵母または細菌培養物の発現産物に前吸収され
ていたHDV抗血清であった。発現条件は、ORF5を含む組
換えベクターを発現させるような条件であった。
ORF5ポリペプチドと、HDV粒子中またはHDV感染肝臓中の
p24δおよびp27δとの間の免疫学的競合 組換えORF5産物と、ウイルスペプチドp24δおよびp27δ
との間の免疫学的競合は、競合結合測定法によって測定
した。一般に、HDV抗血清は、酵母または細菌中のいず
れかで生産された組換えORF5産物に吸収させた。前吸収
させた血清は、イムノブロッティング法におけるウイル
スのp24δおよびp27δへの結合能力に関して、対照血清
と比較した。対照血清は、対照(親)ベクターで形質転
換した、酵母または細菌培養物の発現産物に前吸収され
ていたHDV抗血清であった。発現条件は、ORF5を含む組
換えベクターを発現させるような条件であった。
【0144】pYAG−δp1で形質転換した酵母株AB110中
で発現したORF5産物と、HDV粒子中のp24δおよびp27δ
との間の免疫学的競合は、以下のように測定した。組換
えORF5産物は、酵母中で発現させ、そしてD.3.節中
に記述した条件下で部分的に精製した。HDV粒子の抽出
物を調製し、ラエムリゲル上で判読し、そしてイムノブ
ロッティング法において、ニトロセルロースフィルター
をHDV抗血清とインキュベートをする前に、阻止剤とし
て1×PBS (0.14M NaCl, 2.5mM KCl, 1.5mM KH2PO4,8m
M Na2HPO4・ 12H2O、pH=7.4)中の5%無脂肪ミルクを
用いること以外は、D.4.a.節中に記述されている
ようにブロットさせた。このイムノブロットさせたHDV
ポリペプチドは、1)親の対照プラスミド、pAB24;ま
たは2)ORF5を含むプラスミド、pYAG−δp1のいずれか
を発現している、0.44mlの酵母培養物(OD650=16OD/m
l)からの抽出物に前吸収させたHDV抗血清とインキュベ
ートした。
で発現したORF5産物と、HDV粒子中のp24δおよびp27δ
との間の免疫学的競合は、以下のように測定した。組換
えORF5産物は、酵母中で発現させ、そしてD.3.節中
に記述した条件下で部分的に精製した。HDV粒子の抽出
物を調製し、ラエムリゲル上で判読し、そしてイムノブ
ロッティング法において、ニトロセルロースフィルター
をHDV抗血清とインキュベートをする前に、阻止剤とし
て1×PBS (0.14M NaCl, 2.5mM KCl, 1.5mM KH2PO4,8m
M Na2HPO4・ 12H2O、pH=7.4)中の5%無脂肪ミルクを
用いること以外は、D.4.a.節中に記述されている
ようにブロットさせた。このイムノブロットさせたHDV
ポリペプチドは、1)親の対照プラスミド、pAB24;ま
たは2)ORF5を含むプラスミド、pYAG−δp1のいずれか
を発現している、0.44mlの酵母培養物(OD650=16OD/m
l)からの抽出物に前吸収させたHDV抗血清とインキュベ
ートした。
【0145】図10のBは、対照のプラスミド(レーン
1);またはORF5を含むプラスミド(レーン2)のいず
れかを発現している酵母の溶解産物に前吸収させたHDV
抗血清を用いたイムノブロットを表す。この図に明らか
なように、組換えORF5ポリペプチドがHDV抗血清を前吸
収することにより、HDVポリペプチドp24δおよびp27δ
に結合している抗体は完全に排除された;対照の溶解産
物に前吸収させたADV抗血清を用いた前吸収では、結合
を阻止できなかった。図10のBの弱い、拡散バンド、
すなわちレーン2は、非特異的な結合を表し得る。なぜ
なら、HDV抗体を欠く対照の血清をHDV抗血清に置き換え
た場合にも、このようなバンドが存在したからである。
HDV抗血清中のポリクローナル抗体に共通の結合から、O
RFポリペプチドは、免疫学的にp24δおよびp27δとして
同定し得たと推論し得る。
1);またはORF5を含むプラスミド(レーン2)のいず
れかを発現している酵母の溶解産物に前吸収させたHDV
抗血清を用いたイムノブロットを表す。この図に明らか
なように、組換えORF5ポリペプチドがHDV抗血清を前吸
収することにより、HDVポリペプチドp24δおよびp27δ
に結合している抗体は完全に排除された;対照の溶解産
物に前吸収させたADV抗血清を用いた前吸収では、結合
を阻止できなかった。図10のBの弱い、拡散バンド、
すなわちレーン2は、非特異的な結合を表し得る。なぜ
なら、HDV抗体を欠く対照の血清をHDV抗血清に置き換え
た場合にも、このようなバンドが存在したからである。
HDV抗血清中のポリクローナル抗体に共通の結合から、O
RFポリペプチドは、免疫学的にp24δおよびp27δとして
同定し得たと推論し得る。
【0146】細菌または酵母中で発現したORF5ポリペプ
チドと、感染した肝臓中のp24δおよびp27δとの間の免
疫学的競合も測定した。酵母株HB110(pYAG−δp1)に
おけるORF5ポリペプチドの発現は、上述のとおりであっ
た;porf5で形質転換したE.coli D1210におけるORF5ポ
リペプチドの発現は、D.3.節中に記述された条件下
でなされた。肝臓の溶解産物を調製し、ブロッティング
方法に上述の変更を用いること以外は、D.4.a.節
に記述されたようにブロットさせた。HDAg陽性の肝臓抽
出物中のポリペプチドのブロットは、以下のものとプレ
インキュベートしたHDV抗血清とインキュベートした:p
AB24を発現する酵母培養物AB110の抽出物(対照);pYA
G−δp1からのORF5を発現する酵母培養物AB110の抽出
物;pSOD16cf2を発現するE. coli D1210の抽出物(対
照);そしてporf5を発現するE.coliの抽出物。以下の
1)および2)を用いて、HDV抗血清の前吸収を行っ
た:1)酵母培養物は、OD650,=16OD/mlのものを0.44m
l;および2)E. coliは、OD650=0.6OD/μLのものを
約100ml。このブロットは、前吸収させたHDV抗血清の
1:1000希釈物とインキュベートした。さらに、対照と
して、1つのブロットを、同量の透析された尿素抽出緩
衝液とプレインキュベートされたHDV抗血清とインキュ
ベートした。
チドと、感染した肝臓中のp24δおよびp27δとの間の免
疫学的競合も測定した。酵母株HB110(pYAG−δp1)に
おけるORF5ポリペプチドの発現は、上述のとおりであっ
た;porf5で形質転換したE.coli D1210におけるORF5ポ
リペプチドの発現は、D.3.節中に記述された条件下
でなされた。肝臓の溶解産物を調製し、ブロッティング
方法に上述の変更を用いること以外は、D.4.a.節
に記述されたようにブロットさせた。HDAg陽性の肝臓抽
出物中のポリペプチドのブロットは、以下のものとプレ
インキュベートしたHDV抗血清とインキュベートした:p
AB24を発現する酵母培養物AB110の抽出物(対照);pYA
G−δp1からのORF5を発現する酵母培養物AB110の抽出
物;pSOD16cf2を発現するE. coli D1210の抽出物(対
照);そしてporf5を発現するE.coliの抽出物。以下の
1)および2)を用いて、HDV抗血清の前吸収を行っ
た:1)酵母培養物は、OD650,=16OD/mlのものを0.44m
l;および2)E. coliは、OD650=0.6OD/μLのものを
約100ml。このブロットは、前吸収させたHDV抗血清の
1:1000希釈物とインキュベートした。さらに、対照と
して、1つのブロットを、同量の透析された尿素抽出緩
衝液とプレインキュベートされたHDV抗血清とインキュ
ベートした。
【0147】図10のCは、対照のプラスミドを発現し
ている酵母(レーン1);ORF5を発現している酵母(レ
ーン2);対照のプラスミドを発現しているE. coli
(レーン3);ORF5を発現しているE. coli(レーン
4);そして緩衝液対照(レーン5)に前吸収された血
清を用いたHDVポリペプチドのイムノブロットを表して
いる。この図に明らかなように、酵母中で発現されたOR
F5ポリペプチドがHDV抗血清を前吸収することにより、H
DV特異的抗体がHDAg陽性の肝臓抽出物中のp27δおよびp
24δに結合することを完全に排除した。細菌培養物から
のORF5ポリペプチドも、HDV特異的な抗体がp27δに結合
することを排除するようであり、そしてこれらの抗体が
p24δに結合することを、元のオートラジオグラムのデ
ンシトメトリーによる追跡に基づいて少なくとも10分の
1に減少させた。p24δへのHDV抗血清の残存する結合
は、おそらく細菌抽出物における限定量のORF5ポリペプ
チドによるものである。HDV抗原がHDAg感染肝臓からのp
24δおよびp27δに結合することを著しく減少させた対
照物は存在しなかった。
ている酵母(レーン1);ORF5を発現している酵母(レ
ーン2);対照のプラスミドを発現しているE. coli
(レーン3);ORF5を発現しているE. coli(レーン
4);そして緩衝液対照(レーン5)に前吸収された血
清を用いたHDVポリペプチドのイムノブロットを表して
いる。この図に明らかなように、酵母中で発現されたOR
F5ポリペプチドがHDV抗血清を前吸収することにより、H
DV特異的抗体がHDAg陽性の肝臓抽出物中のp27δおよびp
24δに結合することを完全に排除した。細菌培養物から
のORF5ポリペプチドも、HDV特異的な抗体がp27δに結合
することを排除するようであり、そしてこれらの抗体が
p24δに結合することを、元のオートラジオグラムのデ
ンシトメトリーによる追跡に基づいて少なくとも10分の
1に減少させた。p24δへのHDV抗血清の残存する結合
は、おそらく細菌抽出物における限定量のORF5ポリペプ
チドによるものである。HDV抗原がHDAg感染肝臓からのp
24δおよびp27δに結合することを著しく減少させた対
照物は存在しなかった。
【0148】D.4.c.ORF5がコードしたポリペプチ
ドとHDV感染肝臓中の核HDAgとの間の免疫学的競合 HDAg陽性の肝臓切片を、酵母中で発現する、ORF5がコー
ドしたポリペプチド、または対照の溶解産物に吸収され
ていたHDV抗血清とインキュベートした。対照を含む、
前吸収されたHDV抗血清の調製は、D.3.B.節に記
述したように行った。次いで、この切片は、抗ヒトIgG
を標識化したペルオキシダーゼとインキュベートし、そ
して間接的な免疫ペルオキシダーゼ染色を行った。この
方法は、Govindarajan, S.ら、Histopathology (1984)
8:63(これによって参照文献として採用する)に従っ
た。この方法において、内生のペルオキシダーゼは、前
もってブロックしておいた。脱柔軟化した切片は、室温
の湿室中で30分間、前吸収したHDV抗血清とインキュベ
ートし、次いでPBSで2回、洗浄し、そして湿室中で、
ウサギの抗ヒトIgGを結合した西洋ワサビペルオキシダ
ーゼで処理した。次いで、これらの切片をPBS中で10分
間、洗浄し、そして5〜8分間、3−3'ジアミノ−ベン
ジジンハイドロクロライドおよび過酸化水素で処理し
た。脱水後、これらの切片の被膜をとり、そして光学顕
微鏡によって観察した。
ドとHDV感染肝臓中の核HDAgとの間の免疫学的競合 HDAg陽性の肝臓切片を、酵母中で発現する、ORF5がコー
ドしたポリペプチド、または対照の溶解産物に吸収され
ていたHDV抗血清とインキュベートした。対照を含む、
前吸収されたHDV抗血清の調製は、D.3.B.節に記
述したように行った。次いで、この切片は、抗ヒトIgG
を標識化したペルオキシダーゼとインキュベートし、そ
して間接的な免疫ペルオキシダーゼ染色を行った。この
方法は、Govindarajan, S.ら、Histopathology (1984)
8:63(これによって参照文献として採用する)に従っ
た。この方法において、内生のペルオキシダーゼは、前
もってブロックしておいた。脱柔軟化した切片は、室温
の湿室中で30分間、前吸収したHDV抗血清とインキュベ
ートし、次いでPBSで2回、洗浄し、そして湿室中で、
ウサギの抗ヒトIgGを結合した西洋ワサビペルオキシダ
ーゼで処理した。次いで、これらの切片をPBS中で10分
間、洗浄し、そして5〜8分間、3−3'ジアミノ−ベン
ジジンハイドロクロライドおよび過酸化水素で処理し
た。脱水後、これらの切片の被膜をとり、そして光学顕
微鏡によって観察した。
【0149】図11は、染色した肝臓切片の写真を表
す。この写真は、150倍の倍率で撮影した。図11のA
は、対照の酵母溶解産物とインキュベートしたHDV抗血
清により得られた、間接的な免疫ペルオキシダーゼ染色
を表す。図11のBは、HDV抗血清を、酵母中で発現す
る、ORF5がコードしたポリペプチドに前吸収されている
場合の染色を表す。対照の抽出物に前吸収したHDV抗血
清中で観察された、HDAgに対する抗体の核への明白な結
合とは対照的に、この抗血清が組換えORF5ポリペプチド
に前吸収されている場合には、結合は存在しなかった。
す。この写真は、150倍の倍率で撮影した。図11のA
は、対照の酵母溶解産物とインキュベートしたHDV抗血
清により得られた、間接的な免疫ペルオキシダーゼ染色
を表す。図11のBは、HDV抗血清を、酵母中で発現す
る、ORF5がコードしたポリペプチドに前吸収されている
場合の染色を表す。対照の抽出物に前吸収したHDV抗血
清中で観察された、HDAgに対する抗体の核への明白な結
合とは対照的に、この抗血清が組換えORF5ポリペプチド
に前吸収されている場合には、結合は存在しなかった。
【0150】これまで、p24δおよびp27δが核デルタ抗
原の成分であるという直接的な証拠が不足していた。上
に与えたデータは、ORF5がコードした産物が、HDV特異
的な抗体に対する核デルタ抗原と競合することを示して
いる。このデータは、さらにORF5が、p24δおよびp27δ
と同じ大きさのポリペプチドであって、これらのウイル
スポリペプチドと同様の免疫反応性エピトープを有す
る、2つのポリペプチドをコードすることを示す。従っ
て、これらのデータを組み合わせると、ORF5がウイルス
ポリペプチドp24δおよびp27δをコードすること、およ
びこれらのポリペプチドが、HDV感染肝臓における核デ
ルタ抗原の成分であることが示される。
原の成分であるという直接的な証拠が不足していた。上
に与えたデータは、ORF5がコードした産物が、HDV特異
的な抗体に対する核デルタ抗原と競合することを示して
いる。このデータは、さらにORF5が、p24δおよびp27δ
と同じ大きさのポリペプチドであって、これらのウイル
スポリペプチドと同様の免疫反応性エピトープを有す
る、2つのポリペプチドをコードすることを示す。従っ
て、これらのデータを組み合わせると、ORF5がウイルス
ポリペプチドp24δおよびp27δをコードすること、およ
びこれらのポリペプチドが、HDV感染肝臓における核デ
ルタ抗原の成分であることが示される。
【0151】D.5.ハイブリッド粒子HDV免疫原 同一の譲受人に譲渡された米国特許出願第650,323号(1
984年4月12日出願)をここに参照文献として採用す
る。この出願には、B型肝炎の表面抗原(HBsAg)に対す
るコドンを有する読取り枠中のプレサーフェイス(pre-
S)コーディング部分への外来免疫原の挿入物を含んでい
るHBsAgのハイブリッド粒子の構築が記載されている。
そこに記述されているプラスミドpDC101は、pBR322誘導
体のBamHI部位にクローン化されたGAPDH調節発現カセッ
ト中に、pre-S領域の55コドンを含む、pre-S/HBsAg遺伝
子の1部分を含んでいる。参照文献として採用した出願
には、pDC101のpre-S領域に存在する唯一のEcoRI部位
に、gD(糖タンパクD)抗原部位のような、所望の免疫
原を挿入し、ハイブリッドプラスミドpDC103を与えるこ
とが記載されている。同様に、本発明によれば、HDVゲ
ノムに由来する所望のエピトープ、特にORF5でコードさ
れたエピトープが適切なEcoRIリンカーを用いて提供さ
れ、そしてpDC101のEcoRI部位中の正しい読取り枠に挿
入するか、あるいはpDC103ハイブリッド中のgDコドンを
置換するために用い得る。pDC103は、ATCCに供託されて
いる(受託番号No.20726)。
984年4月12日出願)をここに参照文献として採用す
る。この出願には、B型肝炎の表面抗原(HBsAg)に対す
るコドンを有する読取り枠中のプレサーフェイス(pre-
S)コーディング部分への外来免疫原の挿入物を含んでい
るHBsAgのハイブリッド粒子の構築が記載されている。
そこに記述されているプラスミドpDC101は、pBR322誘導
体のBamHI部位にクローン化されたGAPDH調節発現カセッ
ト中に、pre-S領域の55コドンを含む、pre-S/HBsAg遺伝
子の1部分を含んでいる。参照文献として採用した出願
には、pDC101のpre-S領域に存在する唯一のEcoRI部位
に、gD(糖タンパクD)抗原部位のような、所望の免疫
原を挿入し、ハイブリッドプラスミドpDC103を与えるこ
とが記載されている。同様に、本発明によれば、HDVゲ
ノムに由来する所望のエピトープ、特にORF5でコードさ
れたエピトープが適切なEcoRIリンカーを用いて提供さ
れ、そしてpDC101のEcoRI部位中の正しい読取り枠に挿
入するか、あるいはpDC103ハイブリッド中のgDコドンを
置換するために用い得る。pDC103は、ATCCに供託されて
いる(受託番号No.20726)。
【0152】ハイブリッド粒子の免疫原は、このように
HBsAgおよびHDVに対する融合されたコード配列を用いて
調製され、そしてHDVエピトープに対する増幅された免
疫原性を提供する。
HBsAgおよびHDVに対する融合されたコード配列を用いて
調製され、そしてHDVエピトープに対する増幅された免
疫原性を提供する。
【0153】D.6.ORF5がコードしたポリペプチドに
対する抗体の生産 ORF5がコードしたポリペプチドに対する抗体は、酵母株
AB110 (pYAG-δp1)中で発現され、部分的に精製され
た、ORF5がコードしたポリペプチドを用いて、動物に免
疫性を与えることにより生産される。発現条件、および
酵母ORF5産物に対する部分的な精製方法は、前述の方法
である。それにより導かれたポリクローナル抗体は、ア
フィニティークロマトグラフィー、すなわち親のプラス
ミドpAB24の発現産物を含んでいるアフィニティーカラ
ムに、この抗血清を通過させることによって、ORF5がコ
ードしたポリペプチドに対する抗体から精製し得る。OR
F5産物に対する抗体は、その流出液中に存在するはずで
ある。アフィニティーカラムの調製技術は、当該技術分
野における普通の業者に既知である。
対する抗体の生産 ORF5がコードしたポリペプチドに対する抗体は、酵母株
AB110 (pYAG-δp1)中で発現され、部分的に精製され
た、ORF5がコードしたポリペプチドを用いて、動物に免
疫性を与えることにより生産される。発現条件、および
酵母ORF5産物に対する部分的な精製方法は、前述の方法
である。それにより導かれたポリクローナル抗体は、ア
フィニティークロマトグラフィー、すなわち親のプラス
ミドpAB24の発現産物を含んでいるアフィニティーカラ
ムに、この抗血清を通過させることによって、ORF5がコ
ードしたポリペプチドに対する抗体から精製し得る。OR
F5産物に対する抗体は、その流出液中に存在するはずで
ある。アフィニティーカラムの調製技術は、当該技術分
野における普通の業者に既知である。
【0154】
【発明の効果】ここに開示された本発明は、以下のよう
な産業上の用途を有する。HDVゲノムのヌクレオチド配
列に関する情報は、HDV感染の診断に有用なヌクレオチ
ドプローブの設計に使用し得る;これらのプローブは、
さらに診断のキットに使用し得る。このヌクレオチド配
列の情報は、ペプチドおよびポリペプチドの合成にも使
用し得る。これらのペプチドおよびポリペプチドは、以
下のような用途を有する。ORF5配列から合成されたペプ
チドおよびポリペプチドは、特にHDV抗体の存在によっ
て影響されるようなHDV感染を診断することに有用であ
る。なぜなら、ORF5がHDVδ抗原を含むポリペプチドを
コードするからである。さらに、ORF5配列の発現産物
は、HDVに対するワクチンの生産、およびポリクローナ
ルとモノクローナルの両方のHDV抗体の調製に有用であ
る。ORF5産物に対するHDV抗体は、抗原自身の存在に基
づくHDV抗原の診断に使用し得る。これらの抗体は、HDV
に対する診断キットの基礎を形成し得る。さらに、これ
らの抗体はHDVに対するワクチンとして使用し得る。
な産業上の用途を有する。HDVゲノムのヌクレオチド配
列に関する情報は、HDV感染の診断に有用なヌクレオチ
ドプローブの設計に使用し得る;これらのプローブは、
さらに診断のキットに使用し得る。このヌクレオチド配
列の情報は、ペプチドおよびポリペプチドの合成にも使
用し得る。これらのペプチドおよびポリペプチドは、以
下のような用途を有する。ORF5配列から合成されたペプ
チドおよびポリペプチドは、特にHDV抗体の存在によっ
て影響されるようなHDV感染を診断することに有用であ
る。なぜなら、ORF5がHDVδ抗原を含むポリペプチドを
コードするからである。さらに、ORF5配列の発現産物
は、HDVに対するワクチンの生産、およびポリクローナ
ルとモノクローナルの両方のHDV抗体の調製に有用であ
る。ORF5産物に対するHDV抗体は、抗原自身の存在に基
づくHDV抗原の診断に使用し得る。これらの抗体は、HDV
に対する診断キットの基礎を形成し得る。さらに、これ
らの抗体はHDVに対するワクチンとして使用し得る。
【0155】他のORF配列から合成されたペプチドまた
はポリペプチドも、HDVがコードした成分に対する抗体
の生産に使用し得る。これらの抗体は、ORF配列産物と
同様に、ウイルスの複製サイクル、およびウイルス成分
との細胞内相互作用の測定に有用である。この知識は、
またHDVに対するワクチンの商業的開発に有用である。
はポリペプチドも、HDVがコードした成分に対する抗体
の生産に使用し得る。これらの抗体は、ORF配列産物と
同様に、ウイルスの複製サイクル、およびウイルス成分
との細胞内相互作用の測定に有用である。この知識は、
またHDVに対するワクチンの商業的開発に有用である。
【図1】HDVの1本鎖RNAゲノムの図、およびその構造決
定に用いられる重複するcDNAのクローンの位置を示す図
である。
定に用いられる重複するcDNAのクローンの位置を示す図
である。
【図2】完全なHDV RNAゲノムに対応する2本鎖cDNAの
完全なヌクレオチド配列を示す図である。
完全なヌクレオチド配列を示す図である。
【図3】ORF5のRNAに等価なcDNAの配列、導かれたアミ
ノ酸配列、および他のクローンから決定されたヌクレオ
チドの異質性を示す図である。
ノ酸配列、および他のクローンから決定されたヌクレオ
チドの異質性を示す図である。
【図4】該ウイルスのヌクレオチド配列を得るのに有用
なクローンδ1の配列を示す図である。
なクローンδ1の配列を示す図である。
【図5】ウイルスRNAへのプローブのハイブリダイゼー
ションを示す電気泳動写真である。
ションを示す電気泳動写真である。
【図6】免疫反応性HDVペプチドのE. coliによる生産を
説明するゲルを示す電気泳動写真である。
説明するゲルを示す電気泳動写真である。
【図7】HDVゲノムのORFの位置、およびその相補鎖の位
置を示す図である。
置を示す図である。
【図8】SODに融合したORF1、ORF2、ORF6およびORF7の
発現産物、およびORF5の非融合発現産物のHDV抗血清を
用いたイムノブロットを示す電気泳動写真である。
発現産物、およびORF5の非融合発現産物のHDV抗血清を
用いたイムノブロットを示す電気泳動写真である。
【図9】いくつかの遺伝的性質を含む、pAB24の制限地
図を示す図である。
図を示す図である。
【図10】Aは、HDV粒子中および感染肝臓溶解産物中
に存在する抗原と比較して、E. coliで発現される非融
合ORF5産物のHDV抗血清を用いたイムノブロットを示す
電気泳動写真であり、Bは、HDV粒子中に存在するp24δ
およびp27δと、酵母中で発現されるORF5産物との間のH
DV抗体に対する競合を表すイムノブロットを示す電気泳
動写真であり、そしてCは、HDV感染肝臓中に存在するp
24δおよびp27δと、酵母および細菌中で発現されるORF
5産物との間のHDV抗体に対する競合を表すイムノブロッ
トを示す電気泳動写真である。
に存在する抗原と比較して、E. coliで発現される非融
合ORF5産物のHDV抗血清を用いたイムノブロットを示す
電気泳動写真であり、Bは、HDV粒子中に存在するp24δ
およびp27δと、酵母中で発現されるORF5産物との間のH
DV抗体に対する競合を表すイムノブロットを示す電気泳
動写真であり、そしてCは、HDV感染肝臓中に存在するp
24δおよびp27δと、酵母および細菌中で発現されるORF
5産物との間のHDV抗体に対する競合を表すイムノブロッ
トを示す電気泳動写真である。
【図11】酵母で発現されるORF5産物がHDV抗体に対し
て肝臓HDVδ抗原と競合することを示す、間接イムノペ
ルオキシダーゼ染色法により染色された肝臓切片を示す
顕微鏡写真である。
て肝臓HDVδ抗原と競合することを示す、間接イムノペ
ルオキシダーゼ染色法により染色された肝臓切片を示す
顕微鏡写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 カン−シェン ワン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94608 オークランド,シャタック アベニュー 6420 (72)発明者 キイ−リム チョー アメリカ合衆国 カリフォルニア 94530 エル セリット,ファーン ストリート 5700 (72)発明者 アミー ジョアン ウェイナー アメリカ合衆国 カリフォルニア 94702 バークレー,アクトン 1416 (72)発明者 レイシー ラスコ オバービー アメリカ合衆国 カリフォルニア 94507 アラモ,チェリー ヒルズ コート 28
Claims (3)
- 【請求項1】 HDV感染を治療または予防するための
ワクチンであって、以下のアミノ酸配列を有するポリペ
プチドp1を含む、ワクチン。 【化1】 - 【請求項2】 前記ポリペプチドが、以下のアミノ酸配
列を有するp24δである、請求項1に記載のワクチン。 【化2】 - 【請求項3】 前記ポリペプチドが、以下のアミノ酸配
列を有するp27δである、請求項1に記載のワクチン。 【化3】
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US87533786A | 1986-06-17 | 1986-06-17 | |
US5399187A | 1987-05-22 | 1987-05-22 | |
US875,337 | 1987-05-22 | ||
US53,991 | 1987-05-22 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP62151041A Division JP2661044B2 (ja) | 1986-06-17 | 1987-06-17 | 肝炎δの診断薬およびワクチン |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH09309844A true JPH09309844A (ja) | 1997-12-02 |
JP2823551B2 JP2823551B2 (ja) | 1998-11-11 |
Family
ID=26732482
Family Applications (4)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP62151041A Expired - Lifetime JP2661044B2 (ja) | 1986-06-17 | 1987-06-17 | 肝炎δの診断薬およびワクチン |
JP7222521A Expired - Lifetime JP2810004B2 (ja) | 1986-06-17 | 1995-08-07 | 肝炎δの診断薬およびワクチン |
JP7222522A Expired - Lifetime JP2635018B2 (ja) | 1986-06-17 | 1995-08-07 | 肝炎δの診断薬およびワクチン |
JP9008974A Expired - Lifetime JP2823551B2 (ja) | 1986-06-17 | 1997-01-21 | 肝炎δのワクチン |
Family Applications Before (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP62151041A Expired - Lifetime JP2661044B2 (ja) | 1986-06-17 | 1987-06-17 | 肝炎δの診断薬およびワクチン |
JP7222521A Expired - Lifetime JP2810004B2 (ja) | 1986-06-17 | 1995-08-07 | 肝炎δの診断薬およびワクチン |
JP7222522A Expired - Lifetime JP2635018B2 (ja) | 1986-06-17 | 1995-08-07 | 肝炎δの診断薬およびワクチン |
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Country | Link |
---|---|
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EP (1) | EP0251575B2 (ja) |
JP (4) | JP2661044B2 (ja) |
CA (1) | CA1338800C (ja) |
DE (1) | DE3788902T3 (ja) |
ES (1) | ES2061500T5 (ja) |
HK (1) | HK102595A (ja) |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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IT1255660B (it) * | 1992-06-08 | 1995-11-09 | Sorin Biomedica Spa | Composizioni stabilizzate di hdag. |
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US7338759B1 (en) | 1997-03-04 | 2008-03-04 | Washington University | HCV variants |
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