NL8402392A

NL8402392A - Deoxyribonucleinezuur; microorganismen; diagnostisch middel voor sigma infectie en gebruik daarvan.

Info

Publication number: NL8402392A
Application number: NL8402392A
Authority: NL
Original assignee: Tno
Priority date: 1984-07-31
Filing date: 1984-07-31
Publication date: 1986-02-17
Also published as: NL192267C; EP0234050A1; JPS62179389A; NL192267B; US4959462A; JPH0824581B2; EP0234050B1

Description

^. s * . * ► · r VQ 6364

Titel: Deoxyribonucleinezuur; microorganismenj diagnostisch middel voor <S infectie en gebruik daarvan

Het delta (5) agens is een overdraagbaar pathogeen voor mensen, dat individuen met type B virale hepatitis in hetzij de acute fase, hetzij de chronische dragertoestand superinfacteert. Sedert zijn ontdekking door Eizetto et al, Gut 18,997-1003 (1977) is nog geen zeker-5 heid over zijn identiteit verkregen.

* · ·*

De hypothese dat het δ agens een variant van het hepatitis B virus (HBV) is, lijkt verworpen te moeten worden op basis van uitgebreide overdrachtsonderzoeken bij de chimpansee van geselecteerde inocula, welke nog wel overdraagbaar HBV bevatten maar geen δ. infectie 10 geven. De hypothese, dat het δ agens een van HBV verschillend nondefec-tief infectieus virus is moet worden verworpen op grond van de vast- ’ stelling dat voor δ infectie de aanwezigheid van oppervlakte-antigeen van HBV (HBsAg) vereist is. Epidemiologische gegevens bij de mens en overdrachtsonderzoeken bij de chimpansee hebben de helperfunctie 15 van HBV in δ infectie aangetopnd. Met behulp van immunofluorescentie heeft men het δ -antigeen/anti systeem kunnen opsporen en identificeren, waarbij werd vastgesteld dat er geen immunologische relatie met de bekende antigeen/antilichaam (Ag/Ab) systemen van HBV (respectievelijk oppervlakte(s), kem(c) en envelop (e) antigeen) bestaat. Bij experi-20 mentele δ infectie in de chimpansee bleek de aanwezigheid van δ-Ag echter steeds samen te gaan met een discrete subpopulatie van HBsAg deeltjes. Deze deeltjes hebben een grootte van 35 S. 37 mm en zijn samengesteld uit het δ-Ag en een daarmee verbonden RNA met laag mole-cuulgewicht in een kapsel van HBsAg. Hoewel de deeltjes op zichzelf 25 niet uniek zijn voor δ infectie, kon de aanwezigheid van het met het δ-Ag verbonden kleine RNA alleen worden aangetroffen in serum uit de acute fase van de infectie, zowel bij de mens als bij de chimpansee.

De hoeveelheid RNA bleek evenredig aan de relatieve δ-Ag concentratie in het serum te zijn, terwijl een specifieke immunoprecipitatie met 30 anti-HBsAg mogelijk bleek.

8402392 X ? '* -2-

De veronderstelde helperfuncties van HBV bij δ infectie (d.w.z. replicatie en inkapseling) en de gering grootte van het RNA hebben geleid tot de hypothese, dat het δ agens een uniek defectief agens is, dat voor zijn vermenigvuldiging een of meer helperfuncties (voor re- i 5 plicatie en expressie) van HBV nodig heeft, en dat het δ -RNA met zijn subvirale grootte alleen de genetische informatie voor het δ anti-geen codeert. De bij superinfectie van met HBV-geinfecteerde chimpansees mét het δ agens waargenomen onderdrukking van circulerende HBV-merkers (HBV-DNA) vormt een aanwijzing dat het agens de replicatie 10 van hetlJaelper HBV verstoort. De inkapseling van het δ agens met HBsAg kan een andere helper functie van HBV zijn, waardoor het agens ontvankelijke hepatocyten kan benaderen.

Uitgaande van deze hypothese is getracht en gelukt om met behulp van DNA recombinant technologie, toegepast op het met δ -antigeen 15 verbonden RNA, een nieuw diagnostisch middel voor δ antigenemie, d.w.z. de aanwezigheid van δ-antigeen in bijvoorbeeld het bloed, op het RNA/ , DNA niveau te Verschaffen, dat de nadelen vermijdt van de bestaande immunologische analyses voor δ-antigeen, te weten verstoring van de bestaande vaste-fase radioimmunoanalyses door de aanwezigheid van 20 hoge anti-δ titers. Het voorbereidende werk omvatte isolatie van het met het δ-Ag verbonden RNA uit acute fase serum van experimenteel geïnfecteerde chimpansees, moleculaire klonering, en partiële kopie DNA (cDNA) sequentie-analyse. Struktuur-analyse met behulp van elektronenmicroscopie en bepaling van de grootte van het RNA met behulp 25 van agarosegelelectroforese (ongeveer 5 x lO^dalton) leidden tot de conclusie, dat het δ-RNA een lineair enkelstrengig molekuul is, dat bij renaturering een sterke mate van intramoleculaire base-paar-vorming vertoont.'Door van deze eigenschap gebruik te maken kon een moleculaire klonering van het δ-RNA worden gerealiseerd, waarbij een 30 partiële cDNA kloon werd verkregen die ongeveer éénderde van de lengte van het totale genoom besloeg. Door deze cDNA kloon als "probe" te gebruiken kon de hypothese dat het met ' δ-Ag verbonden RNA het produkt van een HBV variant is, worden verworpen omdat geen kruishybridisatie plaats vond met Southern en Northern blots die uit het serum van een 35 chimpansee tijdens HBsAg antigenemie afkomstig HBV-DNA bevatten.

« 8402392 * f* 4 -3-

Ook kon de hypothese worden verworpen, dat het met 6-Ag verbonden RNA een unieke component van de gastheer is, welke kunstmatig met 6-Ag bekleed en door HBsAg ingekapseld wordt, en wel omdat geen hybridisatie optrad met hetzij chromosomaal DNA hetzij totale lever RNA van dezelfde 5 chimpansee vóór HBsAg antigenemie. Nucleotidensequentie analyse van het verkregen partiële CDN& en hybridisatie-experimenten met 6-RNA en streng-specifieke DNA probes, waarbij alleen de probe met het hypothetische open leesraam voor eiwitbiosynthese tot hybridisatie voerde, leidden tot de uiteindelijke conclusie, dat het δ agens een negatieve 10 streng virus is waarin een aan het δ -RNA complementair RNA de codering van δ -Ag verzorgt.

Aldus is door de uitvinding een δ probe ter beschikking gekomen, die gebruikt kan worden voor de klinische diagnose van δ infectie en vrij is van de eerder vermelde, aan immunologische analyses verbonden 15 nadelen.

De uitvinding verschaft daartoe een deoxyribonucleïnezuur (DNA), omvattende DNA met tenminste 60% homologie ten opzichte van een gedeelte van δ-rüonucleïnezuur (δ-RNA) en het vermogen van selectieve hybridisatie met δ-RNA.

20 Volgens een voorkeursuitvoeringsvorm verschaft de uitvinding een dergelijk DNA, omvattende kopie DNA(cDNA) van een gedeelte van δ-RNA, welke cDNA het vermogen van selectieve hybridisatie met δ-RNA bezit.

Meer in het bijzonder verschaft de uitvinding een dergelijk DNA, omvattende DNA met de in fig. 1 getoonde basenvolgorde, een 25 daarmee voor tenminste 60% homoloog DNA, of een gedeelte daarvan met het vermogen van selectieve hybridisatie met δ-RNA.

In een bepaalde uitvoeringsvorm verschaft de uitvinding een dergelijk DNA, dat bovendien vector DNA omvat. Een geschikt voorbeeld daarvan vormt een uit vector DNA en cDNA samengesteld plasmide. De 30 uitvinding omvat micro-organismen, zoals Escherichia coli, die een dergelijk DNA bevatten.

Verder verschaft de uitvinding een diagnostisch middel voor het vaststellen van δ infectie, omvattende een van een detecteerbaar label voorzien DNA volgens de uitvinding. Dergelijke detecteerbare labels 32 35 zijn op zichzelf bekend. Zeer geschikt is het radiolabel P.

8402392 -4- ' ? ·«

Tenslotte omvat de uitvinding ook hét gebruik van een diagnostisch middel volgens de uitvinding voor het vaststellen van 6 infectie. Hierbij wordt op een op zichzelf bekende wijze gebruik gemaakt van het vermogen van selectieve hybridisatie van de gelabelde probe volgens de 5 uitvinding met δ-RNA.

De uitvinding zal aan de hand van het onderstaande experimentele gedeelte nader worden toegelicht. In figuur 1 wordt de basenvolgorde van een gedeelte van het partiële δ-cDNA getoond; in figuur 2 worden de codons en bijbehorende aminozuren getoond; in figuur 3 worden de 10 immunologische, serologische en biochemische gebeurtenissen in een bepaalde chimpansee na inenting met het δ agens getoond.

Bron voor het met δ antigeen verbonden SNA

Ontvankelijke chimpansees (Pan troglodytes) werden geïnfecteerd met hepatitis B virus en de infecties werden gevolgd m.b.v. serologische 15 merkers voor HBsAg, anti HBsAg, ala ine aminotransferase(ALT), asper-taat aminotransferase (AST), bilirubine, γ-glutamaat transpeptidase (GGTP). Tijdens de acute fase van HBV infectie,zoals vastgesteld door de serologische merkerseiBV-DNA, werden de dieren superinfecteerd door intraveneuze toediening van δ agens, afkomstig van het acute fase serum 20 van een chronische HBsAg-drager chimpansee, met δ antigeen in de lever en de bloedsomloop.

Isolatie van nuclelnezuren

Monsterreeksen van met δ agens geïnfecteerde chimpansees werden geanalyseerd op het met δ antigeen verbonden RNA door van elkaserummon-25 ster een laag uit te spreiden op een 4 ml. kussen uit 20% (w/w) sucrose in 0,01 M fosfaat, pH 7,9 / 0,85% NaCl en 5 uur bij 4°C ultracsntri-fugatie bij 200.000 x g in een Beekman SW 41 rotor, zoals beschreven door Rizetto et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77,6124-6128 (1980). Korrelvormige deeltjes werden voor het nuclelnezuur-gehalte geëxtraheerd 30 door ze opnieuw te suspenderen in 0,2 M NaCl/0,01 M natrium EDTA /2% Na Dod SC>4/0,05MTris-HCl, pH 8,0/1 mg/ml. proteinase K (Sigma) en 1-2 uur incubatie op 37°C. Na extractie met gelijke volumehoeveelheden fenol en chloroform, werd de waterfase met ethanol neergeslagen. Nader onderzoek omvatte het gebruik van electronenmicroscopie en gelelectroforese,.

35 waarbij nuclelnezuren werdei geanalyseerd door 0,6 - 1,5% horizontale agarosegelelectroforese onder zowel native als denaturerende omstandigheden .

8402392 » *= % -5-

Moleculaire klonering van cDN& #

De van acute fase serum deeltjes afkomstige, met ethanol neergeslagen nucleïnezuren, werden direct gebruikt voor cDNA synthese, volgens de door Ohno et al in Nucl. Acids Res, 11, 6185-6202 (1983) beschreven procedure, met dit verschil dat de monsters tevoren gedurende vigf minu- 5 ten in water op 70 °C werden verwarmd en in vast kooldioxide-ethanol werden afgekoeld. Vervolgens werd met behulp van AMV reverse transcriptase DNA gesynthetiseerd, dat complementair was aan het met δ antigeen verbonden RNA, op de door Efstratiados et al in Cell 7, 279-288 (1976) beschreven wijze, met deze uitzondering dat de toevoeging van een exogene 10 primer achterwege werd gelaten. Het enkelstrengig cDNA werd gebruikt als primer-template voor de synthese van de tweede streng m.b.v. het Klenow fragment van DNA polymerase. Op de door Dijkema et al in Nucl. Acids Res.

12, 1227-1242 (1984) beschreven wijze volgden digestie met Si nuclease, grootte-bepaling van dubbelstrengig cDNA, staartvotming van dubbel- 15 strengig cDNA/vector, en transformatie van competente E-coli.

«

Uitzoeken van recombinante clonen E.coli transformanten,waarin sequenties van het met δ antigeen verbonden RNA aanwezig waren, werden uitgezocht door in situ kplonie-hybridisatie volgens Grunstein et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 20 3961-3965 (1975), waarbij als probe RNA werd gebruikt, dat afkomstig 32

was uit hetzij acute fase serum deeltjes hetzij controle lever. P-RNA

fragmenten werden bereid door partiële hydrolyse van het RNA in 25 mM

glycine-NaOB, pH 9,0, 5 mM MgCl·^ gedurende 3 uur bij 37°C (zie de eerder genoemde publicatie van Ohno et al) en 32 25 daaropvolgende labeling met γ- P/ATP en polynucleotide kinase Na incubatie gedurende 30 minuten bij 37°C werden de gelabelde RNA-fragmenten geëxtraheerd met fenol/chloroform en neergeslagen metoethanol. Hybridisatie in 50% formamide en wassen werden op de door de eerdergenoemde publicatie van Dijkema et al beschreven wijze uitgevoerd.

30 Southern en Northern blotting DNA/RNA monsters werden gefractioneerd door electroforese onder niet-denaturerende of denaturerende (formaldehyde) omstandigheden in 0,6 - 1,5% agarosegeis. Gefractioneerde monsters werden voor niet-denaturerende en denaturerende gels respectievelijk overgebracht op hetzij 35 Schleicher en Schuil (BA 85), hetzij Gene Screen nitrocellulose filters.

8402392 -6- t ' > ^

De omstandigheden voor hybridisatie en wassen waren conform de voorschriften van de leveranciers.

Op de door Maxam et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 560-564 (1977) beschreven wijze werd een DNA sequentie-analyse uitgevoerd.

5 Resultaten

Overdracht van het δ agens op ontvankelijke chimpansees.

In figuur 3 worden de immunologische, serologische en biochemische gebeurtenissen getoond, die in een van de chimpansees (no. 15) plaats-10 vonden na inenting met het 6 agens. Boven in de figuur.wordt de aanwezigheid (t) of afwezigheid (-) van HBV - DNA respectievelijk met δ-anti-geen verbonden RNA, zoals geschat door agarosegelelectroforese, aangegeven. Het middelste gedeelte van de figuur toont in grafiekvorm de aanwezigheid van de serologische merkers ALT (zwarte driehoeken), AST 15 (witte driehoeken), bilirubine (witte rondjes) en GGTP (witte vierkantjes) . Het onderste gedeelte van de figuur toont in grafiekvorm de titer van het serum HBsAg (zwarte bolletjes) en het anti-HBsAg (witte .bolletjes), uitgedrukt als de verhouding van positief tot negatief P/N.

20 Op het moment van de superinfectie met het δ agens vertoonde het dier antigenemie als gevolg van HBsAg, blijkend uit circuleren!HBsAg - en HBV-DNA. Superinfectie leidde tot een voorbijgaande antigenemie, welke tot uiting kwam in verhoogde ALT-AST niveaus 3 weken na de inenting. Hoewel gedurende deze periode de hoeveelheid circuleren! HBsAg na-25 genoeg constant bleef, was het gehalte aan HBV-DNA reeds - 2 weken na de inenting uitgesproken minder geworden. Met δ antigeen verbonden RNA werd reeds 2 weken na de inenting gedetecteerd en bereikte na 3 weken een optimum, hetgeen samenviel met de ALT-AST merkers. Na 4 weken kon in het serum geen met δ antigeen verbonden RNA meer worden gedetecteerd en 30 7 weken na de inenting veranderden de sera van het dier in anti-HBsAg.

Moleculaire klonering

Omdat de structuuranalyse (electronenmicroscopie) van het met δ antigeen verbonden RNA een enkelstrengige lineaire aard liet zien, werd eerst de aanwezigheid van een poly (A)staart onderzocht. De aan-35 wezigheid van een poly (A) staart kon echter noch door binding van het RNA aan oligo (dT)-cellulose kolommen noch door "priming" van de cDNA synthese met oligo (dT)^2_jgworden aangetoond.

8402392 -7- t Λ? *

Omdat het ΕΝΑ onder natisre omstandigheden een struktuur vormt met een sterke:rinteme basepaarvorming, werd aangenomen dat het bestaande vrije 3 '-uiteinde als primer -zou kunnen dienst doen voor de synthese van het eigen cDNA. Het op deze wijze bereide cDNA werd volgens standaardtechnie-5 ken gekloneerd en de beschikbare hoeveelheid vergroot door vermenigvuldiging van hybridevectoren in E.coli. Door differentiële hybridisatie 32 met P-gelabeled RNA, verkregen uit hetzij het acute faseserum, hetzij een kontrolelever, werden recombinantklonen uitgezocht. Eén transformant reageerde alleen positief met de RNA probe uit het acute faseserum.

10 Deze als p δ-l aangeduide kloon werd daarna als probe gebruikt voor het uitzoeken van een Northern blot van gefractioneerde RNA-monsters, die in de loop van de acute fase van antigenemie in chimpansee Nr. 15 waren geïsoleerd. Daarbij bleek dat hybridisatie alleen optrad met monsters waarvan eerder was aangetoond dat ze met δ antigeen verbonden RNA“bevat-15 ten, en de migratiepositie viel samen met de geschatte (enkelstrengige) lengte van 1750 nucleotiden. Er werd geen hybridisatie waargenomen met totale lever RNA, vóór EBsAg antigenemie geëxtraheerd chromosomaal DNA, of totaal serum DNA.dat gedurende de HBsAg antigenemie van chimpansee Nr. 15 was geëxtraheerd, in Northern en Southern blots.

20 Nucleotidesequentie van p δ-l

Doordat gebruik gemaakt was van de techniek van dG/dC-staartvorming, toegepast op met het restrictie-enzym PstI opengeknipt pBR322 en δ-cDNA, kon het ingevoegde fragment weer worden verwijderd door incubatie met PstI De ingevoegde lengte van p δ-l werd geschat op 25 520 baseparen. De nucleotidevolgorde werd gedeeltelijk vastgesteld en is in Fig. 1 afgebeeld. De drie mogelijke leesramen zijn onderzocht op het voorkomen van translatie terminatie codons (TAA, TGA en TAG).

Slechts één leesraam toonde een stuk van voldoende lengte voordat een stopcodon (TGA) verscheen, 70 baseparen voor het einde van het cDNA.

30 Het translatieprodukt van een deel van dit hypothetische gen wordt in Fig. 2 getoond.

Streng specificiteit van met δ antigeen verbonden RNA

van

Teneinde vast te stellen welke streng p δ-l equivalent was met het met δ-antigeen verbonden RNA zijn twee streng specifieke DNA 35 probes gemaakt. Hiertoe werd een digestie van p δ-l uitgevoerd met het restrictie-enzym BglII (dat slechts één knipplaats in het δ-cDNA deel van p δ-l bezit).en werden de corresponderende uiteinden gelabeled met 8402392 * -8- * 32 behulp van γ- -jPATPen T4 polynucleotide, kinase Daarna volgde digestie van de gelabelde hybridevector met hetzij het restrictie-enzym Aval hetzij het restrictie-enzym Taql, en de gelabelde fragmenten werden gescheiden op een 5% polyacrylamidegel, geïsoleerd, en gebruikt voor hy-5 bridisatie met uit het acute faseserum van chimpansee Nr. 15 geïsoleerde RNA monsters. Hierbij werd gevonden dat alleen de BglII-Aval probe een positieve hybridisatie vertoonde met het δ-Ag verbonden RNA, hetgeen aantoonde dat zijn complementaire streng equivalent was met het RNA.

8402392

Claims

1. Deoxyribonucleinezuur (DNA), omvattende DNA met ten minste 60% homologie ten opzichte van een gedeelte van (S-ribonucleine-zuur (δ-RNA) en het vermogen van selectieve hybridisatie met o-RNA.

2. DNA volgens conclusie 1, omvattende kopie DNA (cDNA) van 5 een gedeelte van δ-RNA, welk cDNA het vermogen van selectieve hybridisatie met δ-RNA bezit.

3. DNA volgens conclusie 1 of 2, omvattende DNA met de in Fig. 1 getoonde basenvolgorde, een daarmee voor ten minste 60% homoloog DNA, of een gedeelte daarvan met het vermogen van selectieve hybridisa- 10 tie met δ-RNA.

4. DNA volgens een van de conclusies 1-3, dat bovendien vector DNA omvat.

5. Microorganismen, die DNA volgens conclusie 4 bevatten.

6. Diagnostisch middel voor het vaststellen van δ infectie, 15 omvattende een van een detecteerbaar label voorzien DNA volgens een van de conclusies 1-3.

7. Diagnostisch middel volgens conclusie 6, waarin het DNA 32 is voorzien van het radiolabel -_P.

8. Gebruik van een diagnostisch middel volgens conclusie 6 20 of 7 voor het vaststellen van δ infectie. 8402392