JPH0824581B2 - 新規ＤＮＡ、それを含む微生物、それを含むδ感染の診断薬およびその用途 - Google Patents
新規ＤＮＡ、それを含む微生物、それを含むδ感染の診断薬およびその用途Info
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- JPH0824581B2 JPH0824581B2 JP61019144A JP1914486A JPH0824581B2 JP H0824581 B2 JPH0824581 B2 JP H0824581B2 JP 61019144 A JP61019144 A JP 61019144A JP 1914486 A JP1914486 A JP 1914486A JP H0824581 B2 JPH0824581 B2 JP H0824581B2
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- rna
- antigen
- delta
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- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/705—Specific hybridization probes for herpetoviridae, e.g. herpes simplex, varicella zoster
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
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- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
- G01N33/5765—Hepatitis delta antigen
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規なDNA、それを含む微生物およびそれ
を含むδ感染の診断薬に関する。
を含むδ感染の診断薬に関する。
δ因子（delta（δ）agent）はヒトに伝染しうる病原
であり、急性の段階（acute phase）かまたは慢性の保
菌者の状態かにあるＢ型ウィルス肝炎をわずらう個人に
重感染する。リゼット（Rizetto）ら（「ガット（Gu
t）、18、997〜1003（1977年）」参照）によってそれが
発見されて以来、その正体についての何らの確証もえら
れていない。
であり、急性の段階（acute phase）かまたは慢性の保
菌者の状態かにあるＢ型ウィルス肝炎をわずらう個人に
重感染する。リゼット（Rizetto）ら（「ガット（Gu
t）、18、997〜1003（1977年）」参照）によってそれが
発見されて以来、その正体についての何らの確証もえら
れていない。
δ因子はＢ型肝炎ウィルス（HBV）の変異体であると
いう仮説は、チンパンジーにおける伝染しうるHBVを含
んではいるがδ感染（δ infection）させない選択さ
れた接種材料の広範囲にわたる伝染の研究にもとづき明
らかに放棄されるべきである。δ因子はHBVとは異なる
検出できない（non-detective）伝染性のウィルスであ
るという仮説は、δ感染がHBVの表面抗原（HBsAg）の存
在を必要とするという発見にもとづき放棄されなければ
ならない。ヒトにおける疫学的データおよびチンパンジ
ーにおける伝染の研究によってδ伝染におけるHBVのヘ
ルパー機能が確立されている。免疫蛍光を用いてδ−抗
原／アンチシステム（antisystem）が検出され同定され
ているがHBVの知られた抗原／抗体（Ag/Ab）系（すなわ
ちそれぞれ表面（ｓ）抗原、コア（ｃ）抗原およびエン
ヴェロープ（ｅ）抗原）に対して何ら免疫学的関係も明
らかにされていない。しかしながらチンパンジーにおけ
る実験的な感染において、δ−抗原の存在がHBsAg粒子
の不連続なサブポピュレーション（discretesub-popula
tion）とつねに関連していることが見出された。これら
の粒子はその大きさが35〜37nmであり、δ−抗原、およ
びそれと連合した（associated）HBsAgで被包された低
分子量のRNAからできている。粒子それ自体はδ感染に
独自のものではないが、抗原と連合した低分子量のRNA
は、ヒトおよびチンパンジーの両方において感染の急性
の段階に採り出された血清中においてのみ観察された。
RNAの量は血清中の相対的なδ−抗原濃度に比例するこ
とが見出されたが、一方、抗HBsAgとの特異的な免疫沈
降が可能であることが見出された。
いう仮説は、チンパンジーにおける伝染しうるHBVを含
んではいるがδ感染（δ infection）させない選択さ
れた接種材料の広範囲にわたる伝染の研究にもとづき明
らかに放棄されるべきである。δ因子はHBVとは異なる
検出できない（non-detective）伝染性のウィルスであ
るという仮説は、δ感染がHBVの表面抗原（HBsAg）の存
在を必要とするという発見にもとづき放棄されなければ
ならない。ヒトにおける疫学的データおよびチンパンジ
ーにおける伝染の研究によってδ伝染におけるHBVのヘ
ルパー機能が確立されている。免疫蛍光を用いてδ−抗
原／アンチシステム（antisystem）が検出され同定され
ているがHBVの知られた抗原／抗体（Ag/Ab）系（すなわ
ちそれぞれ表面（ｓ）抗原、コア（ｃ）抗原およびエン
ヴェロープ（ｅ）抗原）に対して何ら免疫学的関係も明
らかにされていない。しかしながらチンパンジーにおけ
る実験的な感染において、δ−抗原の存在がHBsAg粒子
の不連続なサブポピュレーション（discretesub-popula
tion）とつねに関連していることが見出された。これら
の粒子はその大きさが35〜37nmであり、δ−抗原、およ
びそれと連合した（associated）HBsAgで被包された低
分子量のRNAからできている。粒子それ自体はδ感染に
独自のものではないが、抗原と連合した低分子量のRNA
は、ヒトおよびチンパンジーの両方において感染の急性
の段階に採り出された血清中においてのみ観察された。
RNAの量は血清中の相対的なδ−抗原濃度に比例するこ
とが見出されたが、一方、抗HBsAgとの特異的な免疫沈
降が可能であることが見出された。
δ−抗原（すなわち複製および被包）におけるHBVの
仮定されたヘルパー機能およびRNAの大きさが小さいこ
とから、δ因子はその増殖のために複製および発現（ex
pression）のための１またはそれ以上のHBVヘルパー機
能を必要とする独自の欠損因子（defectve agent）であ
り、δ RNAはそのウィルス以下の大きさでδ−抗原のた
めの遺伝情報のみをコードしているという仮説が導き出
された。HBVの感染されたチンパンジーの重感染のあい
だに観察される循環しているHBVマーカー（HBV/DNA）の
δ因子による抑制は、δ因子がヘルパーHBVの複製を妨
げることを暗示している。HBsAgでのδ因子の被包は異
なるHBVヘルパー機能であり、それによってδ因子が感
受性の肝細胞に近づくことがてきる。
仮定されたヘルパー機能およびRNAの大きさが小さいこ
とから、δ因子はその増殖のために複製および発現（ex
pression）のための１またはそれ以上のHBVヘルパー機
能を必要とする独自の欠損因子（defectve agent）であ
り、δ RNAはそのウィルス以下の大きさでδ−抗原のた
めの遺伝情報のみをコードしているという仮説が導き出
された。HBVの感染されたチンパンジーの重感染のあい
だに観察される循環しているHBVマーカー（HBV/DNA）の
δ因子による抑制は、δ因子がヘルパーHBVの複製を妨
げることを暗示している。HBsAgでのδ因子の被包は異
なるHBVヘルパー機能であり、それによってδ因子が感
受性の肝細胞に近づくことがてきる。
この仮説から出発して、δ−抗原に連合するRNAに応
用された組みかえDNA技術を用いることによって、δ抗
原血症（δ antigenemia）すなわちたとえば血液中にRN
A/DNAレベルδ抗原が存在することに対する新規な診断
薬を提供するための試みが好結果で行なわれ、それによ
ってδ−抗原の現在の免疫学的分析の不利、すなわち高
い抗力値（antititers）の存在による現在の固相でのラ
ジオイムノ分析の障害を防ぐことができる。準備の仕事
は、実験的に感染されたチンパンジーの急性段階の血清
からδ−抗原に連合するRNAを単離すること、モレキュ
ラークローニング（molecular cloning）および部分的
なコピーDNA（copy DNA（cDNA）配列の分析からなって
いた。電子顕微鏡を用いた構造分析およびアガロースゲ
ル電気泳動によるRNAの大きさの決定（約５×105ダルト
ン）によって、δ−RNAは直線状の一本鎖分子であり変
性からもとの状態に戻ると（upon renaturation）強度
の分子内での塩基対形成を示すという結論が導かれた。
この性質を用いることによってδ‐RNAのモレキュラー
クローニングを実現することが可能であり、それによっ
て全ゲノムの約1/3の部分cDNAクローンを生じさせるこ
とができた。このcDNAクローンをプローブとして用いる
ことによって本発明者らはδ−抗原に連合するRNAがHBV
変異体の産物であるという仮説をしりぞけることができ
た。というのはHBsAg抗原血症のチンパンジーの血清か
ら採られたHBV DNAを含むサザーンブロッティングおよ
びノーザンブロッティングでクロスハイブリダイゼーシ
ョンが起こらなかったからである。本発明者らはまたδ
−抗原に連合するRNAが宿主の独自の成分でありδ−抗
原で人工的にコートされHBsAgによって被包されるとい
う仮説をもしりぞけることができた。というのはHBsAg
抗原血症になる前の同じチンパンジーの全肝臓RNAまた
は染色体DNAのどちらともハイブリダイゼーションは起
こらなかったからである。えられた部分的なcDNAのヌク
レオチド分析、およびタンパク質の生合成のための仮想
のオープン解読フレーム（open reading frame）を運ぶ
プローブだけがハイブリダイゼーションを示すことが見
出されたばあいにδ‐RNAおよび鎖特異的な（strand-sp
ecific）DNAプローブを用いたハイブリダイゼーション
実験によって、δ‐RNAに相補的なRNAがδ−抗原をコー
ドするであろうネガティブストランド（negative stran
d）ウィルスであるという最終的な結論が導かれた。
用された組みかえDNA技術を用いることによって、δ抗
原血症（δ antigenemia）すなわちたとえば血液中にRN
A/DNAレベルδ抗原が存在することに対する新規な診断
薬を提供するための試みが好結果で行なわれ、それによ
ってδ−抗原の現在の免疫学的分析の不利、すなわち高
い抗力値（antititers）の存在による現在の固相でのラ
ジオイムノ分析の障害を防ぐことができる。準備の仕事
は、実験的に感染されたチンパンジーの急性段階の血清
からδ−抗原に連合するRNAを単離すること、モレキュ
ラークローニング（molecular cloning）および部分的
なコピーDNA（copy DNA（cDNA）配列の分析からなって
いた。電子顕微鏡を用いた構造分析およびアガロースゲ
ル電気泳動によるRNAの大きさの決定（約５×105ダルト
ン）によって、δ−RNAは直線状の一本鎖分子であり変
性からもとの状態に戻ると（upon renaturation）強度
の分子内での塩基対形成を示すという結論が導かれた。
この性質を用いることによってδ‐RNAのモレキュラー
クローニングを実現することが可能であり、それによっ
て全ゲノムの約1/3の部分cDNAクローンを生じさせるこ
とができた。このcDNAクローンをプローブとして用いる
ことによって本発明者らはδ−抗原に連合するRNAがHBV
変異体の産物であるという仮説をしりぞけることができ
た。というのはHBsAg抗原血症のチンパンジーの血清か
ら採られたHBV DNAを含むサザーンブロッティングおよ
びノーザンブロッティングでクロスハイブリダイゼーシ
ョンが起こらなかったからである。本発明者らはまたδ
−抗原に連合するRNAが宿主の独自の成分でありδ−抗
原で人工的にコートされHBsAgによって被包されるとい
う仮説をもしりぞけることができた。というのはHBsAg
抗原血症になる前の同じチンパンジーの全肝臓RNAまた
は染色体DNAのどちらともハイブリダイゼーションは起
こらなかったからである。えられた部分的なcDNAのヌク
レオチド分析、およびタンパク質の生合成のための仮想
のオープン解読フレーム（open reading frame）を運ぶ
プローブだけがハイブリダイゼーションを示すことが見
出されたばあいにδ‐RNAおよび鎖特異的な（strand-sp
ecific）DNAプローブを用いたハイブリダイゼーション
実験によって、δ‐RNAに相補的なRNAがδ−抗原をコー
ドするであろうネガティブストランド（negative stran
d）ウィルスであるという最終的な結論が導かれた。
それゆえ本発明は、δ感染の臨床診断に用いることが
でき前述した免疫学的分析につきまという不利を免れた
プローブを提供する。
でき前述した免疫学的分析につきまという不利を免れた
プローブを提供する。
この目的のために本発明は、δ−RNAとの選択的なハ
イブリダイゼーションが可能であり、第１図に示される
塩基配列を有するDNAまたは該DNAと少なくとも60％相同
なDNAを提供する。
イブリダイゼーションが可能であり、第１図に示される
塩基配列を有するDNAまたは該DNAと少なくとも60％相同
なDNAを提供する。
特定の実施態様において本発明は、前記DNAおよびベ
クターDNAからなるDNAを提供する。適当な例はベクター
DNAおよびcDNAからなるプラスミドである。本発明は、
そのようなDNAを含む大腸菌のような微生物を含む。
クターDNAからなるDNAを提供する。適当な例はベクター
DNAおよびcDNAからなるプラスミドである。本発明は、
そのようなDNAを含む大腸菌のような微生物を含む。
本発明はさらにδ感染を診断するための診断薬を提供
し、それは検出しうる標識をそなえた本発明によるDNA
を含む。そのような標識はそれ自体知られている。特に
適しているのは放射性標識32pである。
し、それは検出しうる標識をそなえた本発明によるDNA
を含む。そのような標識はそれ自体知られている。特に
適しているのは放射性標識32pである。
本発明は以下の試験によってさらに詳しく記載される
であろう。
であろう。
δ−抗原に連合するRNAの起源 感受性のチンパンジー（パン・トログロダイテス（Pa
n troglodytes））をＢ型肝炎ウイルスに感染させ、感
染をHBsAgの血清学的マーカーである抗HBsAg、アラニン
アミノトランスフェラーゼ（ALT）、アスペルテートア
ミノトランスフェラーゼ（AST）、ビリルビン、δ−グ
ルタメートトランスペプチダーゼ（GGTP）を用いて追跡
した。血清学的マーカーおよびHBV DNAで決定されるよ
うにHBV感染の急性の段階のあいだに、肝臓内の循環し
ているδ−抗原を示す慢性HBsAg保菌チンパンジーの急
性段階の血清に由来するδ因子を静脈内投与することに
よって動物を重感染させた。
n troglodytes））をＢ型肝炎ウイルスに感染させ、感
染をHBsAgの血清学的マーカーである抗HBsAg、アラニン
アミノトランスフェラーゼ（ALT）、アスペルテートア
ミノトランスフェラーゼ（AST）、ビリルビン、δ−グ
ルタメートトランスペプチダーゼ（GGTP）を用いて追跡
した。血清学的マーカーおよびHBV DNAで決定されるよ
うにHBV感染の急性の段階のあいだに、肝臓内の循環し
ているδ−抗原を示す慢性HBsAg保菌チンパンジーの急
性段階の血清に由来するδ因子を静脈内投与することに
よって動物を重感染させた。
核酸の単離 δ因子に感染されたチンパンジーからの一連の試料
を、リゼットらの「プロシーディングス オブ ザ ナ
ショナル アカデミー オブ サイエンスイズ オブ
ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ 77、61
24〜6128（1980年）」に記載されているように、0.01M
リン酸塩（pH7.9）中の20％（w/w）シュクロース/0.85
％NaClのクッション（cushion）4ml上に各血清試料を層
にして置き（1ayering）ベックマン（Beckmann）SW41ロ
ーター（rotor）中で４℃において５時間200000×ｇで
超遠心分離することによってδ−抗原に連合するRNAに
ついて分析した。0.2M NaCl/0.01MナトリウムEDTA/2％
Na Dod SO4/0.05MトリスHCl（pH8.0）1mg/mlのプロテイ
ナーゼＫ（シグマ社製）中に再び懸濁し37℃で１〜２時
間インキュベートすることによって核酸含量のために粒
子を抽出した。等容量のフェノールおよびクロロホルム
で抽出したのち水層をエタノールで沈澱させた。さらに
電子顕微鏡およびゲル電気泳動を用いて調べ、核酸を自
然の状態および変性した状態の両方で0.6〜1.5％水平ア
ガロースゲル電気泳動によって分析した。
を、リゼットらの「プロシーディングス オブ ザ ナ
ショナル アカデミー オブ サイエンスイズ オブ
ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ 77、61
24〜6128（1980年）」に記載されているように、0.01M
リン酸塩（pH7.9）中の20％（w/w）シュクロース/0.85
％NaClのクッション（cushion）4ml上に各血清試料を層
にして置き（1ayering）ベックマン（Beckmann）SW41ロ
ーター（rotor）中で４℃において５時間200000×ｇで
超遠心分離することによってδ−抗原に連合するRNAに
ついて分析した。0.2M NaCl/0.01MナトリウムEDTA/2％
Na Dod SO4/0.05MトリスHCl（pH8.0）1mg/mlのプロテイ
ナーゼＫ（シグマ社製）中に再び懸濁し37℃で１〜２時
間インキュベートすることによって核酸含量のために粒
子を抽出した。等容量のフェノールおよびクロロホルム
で抽出したのち水層をエタノールで沈澱させた。さらに
電子顕微鏡およびゲル電気泳動を用いて調べ、核酸を自
然の状態および変性した状態の両方で0.6〜1.5％水平ア
ガロースゲル電気泳動によって分析した。
cDNAのモレキュラークローニング 試料を前もって70℃で５分間水中で加熱し固体の二酸
化炭素−エタノール中で冷却したほかはオーノ（Ohno）
らの「ニュークレイック アシッズ リサーチ（Nucl.A
cids Res.）11、6185〜6202（1983年）」に記載された
手順によって、急性段階の血清粒子に由来したエタノー
ルで沈澱した核酸を直接cDNAの合成のために用いた。つ
ぎに外来のプライマーを加えなかったほかはエフストラ
ティアドス（Efstratiadeos）らの「セル（Cell）７、2
79〜288（1976年）」に記載されているようにして、AMV
逆転写酵素を用いδ−抗原に連合するRNAに相補的なDNA
を合成した。DNAポリメラーゼのクレノー断片を用いた
第２の鎖の合成のために一本鎖cDNAをプライマーの鋳型
として用いた。つづいてディエケマ（Dijkema）らの
「ニュークレイック アシッズ リサーチ12、1227〜12
42（1984年）」に記載されているようにしてS1ヌクレア
ーゼでの消化（digestion）、二本鎖cDNAのサイジング
（sizing）、二本鎖DNA/ベクターのテーリング（tailin
g）およびコンピテント大腸菌の形質転換を行なった。
化炭素−エタノール中で冷却したほかはオーノ（Ohno）
らの「ニュークレイック アシッズ リサーチ（Nucl.A
cids Res.）11、6185〜6202（1983年）」に記載された
手順によって、急性段階の血清粒子に由来したエタノー
ルで沈澱した核酸を直接cDNAの合成のために用いた。つ
ぎに外来のプライマーを加えなかったほかはエフストラ
ティアドス（Efstratiadeos）らの「セル（Cell）７、2
79〜288（1976年）」に記載されているようにして、AMV
逆転写酵素を用いδ−抗原に連合するRNAに相補的なDNA
を合成した。DNAポリメラーゼのクレノー断片を用いた
第２の鎖の合成のために一本鎖cDNAをプライマーの鋳型
として用いた。つづいてディエケマ（Dijkema）らの
「ニュークレイック アシッズ リサーチ12、1227〜12
42（1984年）」に記載されているようにしてS1ヌクレア
ーゼでの消化（digestion）、二本鎖cDNAのサイジング
（sizing）、二本鎖DNA/ベクターのテーリング（tailin
g）およびコンピテント大腸菌の形質転換を行なった。
組みかえ型クローンのスクリーニング 急性の段階の血清粒子かまたはコントロールの肝臓か
に由来するRNAをプローブとして用い、グルンシュタイ
ン（Grunstein）らの「プロシーディングス オブ ザ
ナショナル アカデミー オブ サイエンスイズ オ
ブ ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ 7
2、3961〜3965（1975年）」に記載された方法にしたが
ってその場でコロニーハイブリダイゼーションによりδ
−抗原に連合するRNAの配列を含む大腸菌形質転換体を
スクリーニングした。24mMグリシン−NaOH（pH9.0）、5
mM MgCl2中で37℃において３時間（オーノらの「ニュー
クレイックアシッズ リサーチ11、6185〜6202（1983
年）」参照）RNAを部分的に加水分解しひきつづきδ−
32P/ATPおよびT4ポリヌクレオチドキナーゼで標識する
ことによって32P-RNA断片を調製した。37℃で30分間イ
ンキュベートしたのち、標識されたRNA断片をフェノー
ル／クロロホルムで抽出しエタノールで沈澱させた。デ
ィエケマらの「ニュークレイック アシッズ リサーチ
12、1227〜1242（1984年）」に記載されているようにし
て50％ホルムアミド中でのハイブリダイゼーションおよ
び洗浄を行なった。
に由来するRNAをプローブとして用い、グルンシュタイ
ン（Grunstein）らの「プロシーディングス オブ ザ
ナショナル アカデミー オブ サイエンスイズ オ
ブ ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ 7
2、3961〜3965（1975年）」に記載された方法にしたが
ってその場でコロニーハイブリダイゼーションによりδ
−抗原に連合するRNAの配列を含む大腸菌形質転換体を
スクリーニングした。24mMグリシン−NaOH（pH9.0）、5
mM MgCl2中で37℃において３時間（オーノらの「ニュー
クレイックアシッズ リサーチ11、6185〜6202（1983
年）」参照）RNAを部分的に加水分解しひきつづきδ−
32P/ATPおよびT4ポリヌクレオチドキナーゼで標識する
ことによって32P-RNA断片を調製した。37℃で30分間イ
ンキュベートしたのち、標識されたRNA断片をフェノー
ル／クロロホルムで抽出しエタノールで沈澱させた。デ
ィエケマらの「ニュークレイック アシッズ リサーチ
12、1227〜1242（1984年）」に記載されているようにし
て50％ホルムアミド中でのハイブリダイゼーションおよ
び洗浄を行なった。
サザーンブロッティングおよびノーザンブロッティ
ング 0.6〜1.5％アガロースゲル中での変性されていないま
たは変性された（ホルムアルデヒド）条件下で電気泳動
を行なうことによってDNA/RNA試料を分画した。分画さ
れた試料を変性されていないゲルおよび変性されたゲル
に対してそれぞれシュライヒャー アンド シュル（Sc
hleicher and Sohull）（BA 85）かまたはジーン スク
リーン ヒトロセルロース フィルタ−（Gene Screen
nitrocellulose filters）に移した。ハイブリダイゼー
ションおよび洗浄の条件は供給者の詳記（suppliers' s
pecificiation）にしたがった。
ング 0.6〜1.5％アガロースゲル中での変性されていないま
たは変性された（ホルムアルデヒド）条件下で電気泳動
を行なうことによってDNA/RNA試料を分画した。分画さ
れた試料を変性されていないゲルおよび変性されたゲル
に対してそれぞれシュライヒャー アンド シュル（Sc
hleicher and Sohull）（BA 85）かまたはジーン スク
リーン ヒトロセルロース フィルタ−（Gene Screen
nitrocellulose filters）に移した。ハイブリダイゼー
ションおよび洗浄の条件は供給者の詳記（suppliers' s
pecificiation）にしたがった。
DNAの塩基配列決定はマクサム（Maxam）らの「プロシ
ーディングス オブ ザ ナショナル アカデミー オ
ブ サイエンスイズ オブ ザ ユナイテッド ステイ
ツ オブ アメリカ74、560〜564（1977年）」に記載さ
れたようにして行なった。
ーディングス オブ ザ ナショナル アカデミー オ
ブ サイエンスイズ オブ ザ ユナイテッド ステイ
ツ オブ アメリカ74、560〜564（1977年）」に記載さ
れたようにして行なった。
以上についての試験結果はつぎのようであった。
感受性のチンパンジーへのδ因子の伝染 第３図は、δ因子を接種後のチンパンジーの１匹にお
こった免疫学的、血清学的および生物学的な結果を示
す。アガロースゲル電気泳動でアッセイしたHBV DNAお
よびδ−抗原に連合するRNAの存在（＋）または不存在
（−）を一番上に示す。第３図の中央の図は、血清学的
マーカーであるALT、AST、ビリルビンおよびGGTPの存在
を図式的に示す。第３図の最下部の図は、陰性に対する
陽性の比（P/N）としてあらわした血清HBsAgおよび抗HB
sAgの力値（titer）を図式的に示す。
こった免疫学的、血清学的および生物学的な結果を示
す。アガロースゲル電気泳動でアッセイしたHBV DNAお
よびδ−抗原に連合するRNAの存在（＋）または不存在
（−）を一番上に示す。第３図の中央の図は、血清学的
マーカーであるALT、AST、ビリルビンおよびGGTPの存在
を図式的に示す。第３図の最下部の図は、陰性に対する
陽性の比（P/N）としてあらわした血清HBsAgおよび抗HB
sAgの力値（titer）を図式的に示す。
δ因子で重感染したときには、循環するHBsAgおよびH
BV DNAによって示されるように動物はHBsAgによる抗原
血症を示した。重感染は、接種３週間後の上昇したALT-
ASTレベルによって特徴づけられる一時的な抗原血症と
いう結果になった。循環しているHBsAgの量はこの期間
のあいだ実質的に一定であるが、HBV DNAのレベルは接
種２週間後に著しく低下した。δ−抗原に連合するRNA
は接種２週間後に早くも検出され、接種３週間後には最
適に達し、それはALT-ASTマーカーと一致していた。接
種４週間後にはδ−抗原に連合するRNAはもはや検出す
ることができず、接種７週間後に動物の血清は抗HBsAg
に変わっていた。
BV DNAによって示されるように動物はHBsAgによる抗原
血症を示した。重感染は、接種３週間後の上昇したALT-
ASTレベルによって特徴づけられる一時的な抗原血症と
いう結果になった。循環しているHBsAgの量はこの期間
のあいだ実質的に一定であるが、HBV DNAのレベルは接
種２週間後に著しく低下した。δ−抗原に連合するRNA
は接種２週間後に早くも検出され、接種３週間後には最
適に達し、それはALT-ASTマーカーと一致していた。接
種４週間後にはδ−抗原に連合するRNAはもはや検出す
ることができず、接種７週間後に動物の血清は抗HBsAg
に変わっていた。
モレキュラークローニング 電子顕微鏡によるδ−抗原に連合するRNAの構造分析
によって一本鎖の直線状の性質が明らかにされたので、
まずポリＡのテール（tail）の存在を調べた。しかしな
がら、RNAをオリゴ（dT）セルロースカラムに結合する
ことによってもオリゴ（dT）12-18でcDNAの合成を開始
することによってもポリＡテールの存在を示すことがで
きなかった。自然の条件下ではRNAは高い内部塩基対を
有する構造を形成するであろうので、存在するフリーの
３′末端が自身のcDNAの合成のためのプライマーとして
働くかもしれないと仮定された。こういう風にして調製
されたcDNAは標準的な技術によってクローニングされ、
大腸菌中のハイブリッドベクターの増殖によって増幅さ
れた。組みかえ体クローンを、急性の段階の血清かまた
はコントロールの肝臓に由来する32Pで標識されたRNAと
のディファレンシャル（differential）ハイブリダイゼ
ーションによってスクリーニングした。１つの組みかえ
体のみが急性の血清からのRNAプローブと陽性の反応を
示した。ｐδ‐１と称されるこのクローンは、チンパン
ジーNo.15における急性の段階のあいだ中に単離された
分画されたRNA試料のノーザンブロッティングをスクリ
ーニングするためにひきつづきプローブとして用いた。
δ−抗原に連合するRNAを含むことおよび1750ヌクレオ
チドの推測される（一本）鎖の長さと一致する移動の位
置を前もって示した試料とのみハイブリダイゼーション
がおこることが見出された。ノーザンブロッティングに
おいて、全肝臓RNA、HBsAg抗原血症に先だって抽出され
た染色体DNA、またはチンパンジーNo.15のHBsAg抗原血
症のあいだに抽出された全血清DNAとはハイブリダイゼ
ーションは観察されなかった。
によって一本鎖の直線状の性質が明らかにされたので、
まずポリＡのテール（tail）の存在を調べた。しかしな
がら、RNAをオリゴ（dT）セルロースカラムに結合する
ことによってもオリゴ（dT）12-18でcDNAの合成を開始
することによってもポリＡテールの存在を示すことがで
きなかった。自然の条件下ではRNAは高い内部塩基対を
有する構造を形成するであろうので、存在するフリーの
３′末端が自身のcDNAの合成のためのプライマーとして
働くかもしれないと仮定された。こういう風にして調製
されたcDNAは標準的な技術によってクローニングされ、
大腸菌中のハイブリッドベクターの増殖によって増幅さ
れた。組みかえ体クローンを、急性の段階の血清かまた
はコントロールの肝臓に由来する32Pで標識されたRNAと
のディファレンシャル（differential）ハイブリダイゼ
ーションによってスクリーニングした。１つの組みかえ
体のみが急性の血清からのRNAプローブと陽性の反応を
示した。ｐδ‐１と称されるこのクローンは、チンパン
ジーNo.15における急性の段階のあいだ中に単離された
分画されたRNA試料のノーザンブロッティングをスクリ
ーニングするためにひきつづきプローブとして用いた。
δ−抗原に連合するRNAを含むことおよび1750ヌクレオ
チドの推測される（一本）鎖の長さと一致する移動の位
置を前もって示した試料とのみハイブリダイゼーション
がおこることが見出された。ノーザンブロッティングに
おいて、全肝臓RNA、HBsAg抗原血症に先だって抽出され
た染色体DNA、またはチンパンジーNo.15のHBsAg抗原血
症のあいだに抽出された全血清DNAとはハイブリダイゼ
ーションは観察されなかった。
ｐδ‐１のヌクレオチド配列 制限酵素Pst Iで切断されたδ−cDNAおよびpBR322に
応用したdG/dKテーリングの技術を用いたので、挿入さ
れた断片をPst Iとともにインキュベートすることによ
って再び取り除くことができた。ｐδ‐１の挿入された
長さは520塩基対であると推定された。そのヌクレオチ
ド配列は部分的に決定され第１図に示した。翻訳終止コ
ドン（TAA、TGAおよびTAG）の存在について３つの可能
なフレームを調べた。ただ１つのフレームだけが、cDNA
の末端の70塩基前にあらわれる終止コドン（TGA）の前
に評価しうる長さのストレッチ（stretch）を示した。
この仮定的な遺伝子の一部の翻訳産物を第２図に示す。
応用したdG/dKテーリングの技術を用いたので、挿入さ
れた断片をPst Iとともにインキュベートすることによ
って再び取り除くことができた。ｐδ‐１の挿入された
長さは520塩基対であると推定された。そのヌクレオチ
ド配列は部分的に決定され第１図に示した。翻訳終止コ
ドン（TAA、TGAおよびTAG）の存在について３つの可能
なフレームを調べた。ただ１つのフレームだけが、cDNA
の末端の70塩基前にあらわれる終止コドン（TGA）の前
に評価しうる長さのストレッチ（stretch）を示した。
この仮定的な遺伝子の一部の翻訳産物を第２図に示す。
δ−抗原に連合するRNAの鎖特異性 ｐδ−１のどちらの鎖がδ−抗原に連合するRNAに等
価（equivalent）であるかを同定するために鎖特異的DN
Aのプローブをつくった。この目的のためにｐδ−１を
制限酵素Bgl II（ｐδ−１のδ−cDNA部分においてただ
１つの切断位置を有する）で消化し、対応する末端をγ
‐32PATPおよびT4ポリヌクレオチドキナーゼで標識し
た。標識されたハイブリッドベクターをつぎに制限酵素
Ava Iかまたは制限酵素TaqIで消化し、標識された断片
を５％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、単離し、チ
ンパンジーNo.15の急性段階の血清から単離されたRNA試
料とのハイブリダイゼーションのために用いた。BglII
−Ava Iプローブのみがδ−抗原に連合するRNAと陽性の
ハイブリダイゼーションを示すことが見出され、このこ
とはその相補的な鎖がRNAに等価であることを示してい
た。
価（equivalent）であるかを同定するために鎖特異的DN
Aのプローブをつくった。この目的のためにｐδ−１を
制限酵素Bgl II（ｐδ−１のδ−cDNA部分においてただ
１つの切断位置を有する）で消化し、対応する末端をγ
‐32PATPおよびT4ポリヌクレオチドキナーゼで標識し
た。標識されたハイブリッドベクターをつぎに制限酵素
Ava Iかまたは制限酵素TaqIで消化し、標識された断片
を５％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、単離し、チ
ンパンジーNo.15の急性段階の血清から単離されたRNA試
料とのハイブリダイゼーションのために用いた。BglII
−Ava Iプローブのみがδ−抗原に連合するRNAと陽性の
ハイブリダイゼーションを示すことが見出され、このこ
とはその相補的な鎖がRNAに等価であることを示してい
た。
プラスミドｐδ‐１を含む大腸菌JA221株はセントラ
ール ビューロー フォール シメルカルチャー（Cent
raal Bureau voor Schimmelcultures）（CBS）（オラン
ダ、バールン（Baarn））にCBS 101.86の寄託番号で19
86年１月６日に寄託された。
ール ビューロー フォール シメルカルチャー（Cent
raal Bureau voor Schimmelcultures）（CBS）（オラン
ダ、バールン（Baarn））にCBS 101.86の寄託番号で19
86年１月６日に寄託された。
臨床的応用 δ因子に感染されていると本発明らが知らなかった６
人の患者の血清１〜2mlを「アイソレーション オブ
ニュークレイック アシッズ（Isolation of nucleic a
cids）」の表題のもとに記載された手順にしたがってRN
Aを単離するために処理した。放射性にされたδ配列をR
NAプレパレーションとハイブリダイゼーションにしたの
ち、６人の患者のうち３人の血清中に粒子が存在するこ
とが見出された。この結果は、δ−抗原の存在の免疫学
的分析を用いることによってえられた結果に対応してい
た。
人の患者の血清１〜2mlを「アイソレーション オブ
ニュークレイック アシッズ（Isolation of nucleic a
cids）」の表題のもとに記載された手順にしたがってRN
Aを単離するために処理した。放射性にされたδ配列をR
NAプレパレーションとハイブリダイゼーションにしたの
ち、６人の患者のうち３人の血清中に粒子が存在するこ
とが見出された。この結果は、δ−抗原の存在の免疫学
的分析を用いることによってえられた結果に対応してい
た。
第１図は本発明のｐδ−１の部分的に決定されたヌクレ
オチド配列をあらわす図、第２図は本発明のｐδ−１の
部分的に決定されたヌクレオチド配列に対する１つのフ
レームで翻訳されたアミノ酸配列をあらわす図、第３図
はチンパンジーにδ因子を接種したあとのHBV DNAおよ
びδ−抗原に連合するRNAの存在または不存在、血清学
的マーカーであるALT、AST、ビリルビンおよびGGTPの
量、および血清HBsAgおよび抗HBsAgの力価を示すグラフ
である。
オチド配列をあらわす図、第２図は本発明のｐδ−１の
部分的に決定されたヌクレオチド配列に対する１つのフ
レームで翻訳されたアミノ酸配列をあらわす図、第３図
はチンパンジーにδ因子を接種したあとのHBV DNAおよ
びδ−抗原に連合するRNAの存在または不存在、血清学
的マーカーであるALT、AST、ビリルビンおよびGGTPの
量、および血清HBsAgおよび抗HBsAgの力価を示すグラフ
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｌ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (56)参考文献 特開 昭60−192598（ＪＰ，Ａ) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．80，Ｐ．3618−3622 （1983)
Claims (5)
- 【請求項１】δ‐RNAとの選択的なハイブリダイゼーシ
ョンが可能であり、第１図に示される塩基配列を有する
DNA、または該DNAと少なくとも60％相同なDNAを含むDN
A。 - 【請求項２】ベクターDNA、ならびにδ−RNAとの選択的
なハイブリダイゼーションが可能であり、第１図に示さ
れる塩基配列を有するDNAもしくは該DNAと少なくとも60
％相同なDNAからなるDNA。 - 【請求項３】ベクターDNAならびにδ‐RNAとの選択的な
ハイブリダイゼーションが可能であり、第１図に示され
る塩基配列を有するDNAもしくは該DNAと少なくとも60％
相同なDNAを含む微生物。 - 【請求項４】検出しうる標識をそなえ、δ‐RNAとの選
択的なハイブリダイゼーションが可能であり、第１図に
示される塩基配列を有するDNAまたは該DNAと少なくとも
60％相同なDNAを含むδ感染の診断のための診断薬。 - 【請求項５】DNAが放射性標識32pをそなえている特許請
求の範囲第４項記載の診断薬。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL8402392A NL192267C (nl) | 1984-07-31 | 1984-07-31 | Deoxyribonucleïnezuur, micro-organisme, diagnostisch hulpmiddel voor het vaststellen van HDV infectie en gebruik daarvan. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62179389A JPS62179389A (ja) | 1987-08-06 |
| JPH0824581B2 true JPH0824581B2 (ja) | 1996-03-13 |
Family
ID=19844287
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61019144A Expired - Fee Related JPH0824581B2 (ja) | 1984-07-31 | 1986-01-30 | 新規ＤＮＡ、それを含む微生物、それを含むδ感染の診断薬およびその用途 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4959462A (ja) |
| EP (1) | EP0234050B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0824581B2 (ja) |
| NL (1) | NL192267C (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2061500T5 (es) * | 1986-06-17 | 2003-05-16 | Chiron Corp | Diagnosis y vacunas de la hepatitis delta, su preparacion y uso. |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3112338C2 (de) * | 1981-03-28 | 1995-02-23 | Klaus Von Der Helm | Verwendung von Hybridisierungssonden zum Nachweis von HAV |
| US4711955A (en) * | 1981-04-17 | 1987-12-08 | Yale University | Modified nucleotides and methods of preparing and using same |
| DE3479158D1 (en) * | 1983-03-04 | 1989-08-31 | Noctech Ltd | Diagnostic agent, a process for its preparation and its use in diagnostic methods |
| EP0131974A1 (en) * | 1983-06-08 | 1985-01-23 | Akzo N.V. | Determination of delta-antigens in body fluids |
| US4952561A (en) * | 1984-02-07 | 1990-08-28 | Merck & Co., Inc. | Cardiac atrial peptides |
-
1984
- 1984-07-31 NL NL8402392A patent/NL192267C/nl not_active IP Right Cessation
-
1986
- 1986-01-28 US US06/823,196 patent/US4959462A/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-01-29 EP EP86200122A patent/EP0234050B1/en not_active Expired
- 1986-01-30 JP JP61019144A patent/JPH0824581B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８０，Ｐ．３６１８−３６２２（１９８３） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62179389A (ja) | 1987-08-06 |
| EP0234050B1 (en) | 1991-03-27 |
| EP0234050A1 (en) | 1987-09-02 |
| NL8402392A (nl) | 1986-02-17 |
| NL192267C (nl) | 1997-04-03 |
| US4959462A (en) | 1990-09-25 |
| NL192267B (nl) | 1996-12-02 |
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