JPS6328589B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は植物組織培養物を増殖（生育）する
方法及び装置並びにそれらを二次代謝産物の製造
に使用する方法及び装置に関する。親植物から単
離された植物細胞は適当な培地中または培地上で
生育または増殖が誘発されることによつて植物カ
ルス組織の生育が維持されることは既知である。
カルスはそれらが置かれる物理的及び化学的環境
に応じて分化された植物細胞、そして最終的には
完全な植物へと増殖、生育することができる、未
だ実質上未分化、非特異化植物細胞の集合体であ
る。 植物組織培養物を生育させる二つの方法が普通
実施されている。細胞は栄養水溶液中の懸濁体と
して生育されるか、或は寒天ゼリーのような栄養
基質上で生育される。前者の方は細胞の環境を厳
重に調整することができる利点があり、特に細胞
を未分化状態で且つ急速に増殖できる状態に維持
するのに適している。上述のもう一つの方法は細
胞を生育させる環境を厳重に調整できず、毒性の
代謝産物が基質中に蓄積する欠点がある。後者の
条件下で生育した培養物はカルス組織の凝集片を
形成し、これはやがて分化及び生育鈍化の徴候を
示す。 植物代謝産物の一次代謝産物はタンパク及び炭
水化物である。しかし、これらのカテゴリのいず
れにも入らない多くの重要な植物産物があり、こ
れらは便宜上二次代謝産物と呼ぶこととする。 長年に亙つて植物組織培養物から二次代謝物を
回収する試みが行われてきた。植物二次代謝産物
には非常に広範囲に亙る生薬、精油、及びレジン
が含まれ、これらは製薬業、香料工業及び調味料
工業において非常に大きな重要性をもつ。しか
し、植物細胞の懸濁体からこのような代謝産物を
抽出する試みは１種または２種の植物の場合以外
はこれまで不成功に終わつている。大抵の植物は
少なくともこれまで使用された培養条件下では有
用な二次代謝産物を生産することができる組織培
養物を生じないように思われてきた。さて、我々
は栄養培地と接触した基質上に支持されたカルス
とし植物組織培養物を生育させるときは、懸濁体
で生育された培養物に比して二次代謝産物の生産
が増進されることを見出した。我々は更に、カル
ス組織を基質に対して実質上静止状態に維持し、
循環する栄養水溶液と接触させるときは植物組織
培養物が調整された栄養条件下で効率的に生育さ
れ、二次代謝産物の収率が増大することを見出し
た。 概説すれば、この発明は基質に対して実質上静
止状態にあるカルス組織を基質上で生育させ、該
カルスを空気を吹込んだ栄養溶液の流れと接触さ
せ、培地及び／または該栄養溶液から代謝産物を
回収することからなる植物代謝産物の製法を提供
するにある。 この発明の一面によれば、実質上水平な床上に
植物カルス細胞の生育しつつある培養物を支持
し、前記床へ前記培養物に対する栄養水溶液を連
続的に或は断続的に供給し、前記水溶液を床の上
または床中に貫流して流して、培養物を栄養水溶
液及び空気と接触させ、床から栄養溶液を連続的
または断続的に取出すことからなる、植物組織培
養物の生育方法が提供される。 この発明の第２の面によれば、閉じた容器、前
記容器中に設けられた生育しつつあるカルス培養
物を支持するための水透過性床、前記床へ栄養溶
液を供給するための栄養溶液導入口及び前記床か
ら溶液を取出すための手段を備えてなる滅菌系か
らなる植物組織培養物の生育用装置が提供され
る。 工業的製造に適したものとしては、塔に粒状ま
たは繊維状基質及び該基質上で生育されるカルス
細胞を充填する。空気を吹込んだ栄養溶液を塔に
通し、例えば栄養溶液を塔中を流下させ、空気を
塔中に泡出昇流させる。 例えばポリアミド繊維のような不活性繊維基質
上に支持したアルギン酸塩を塔に充填すると有効
な基質が得られることが判明した。 粒状基質はまた、基質内でカルスの生育が可能
で同時にカルスと空気を吹込んだ栄養溶液との接
触が可能な多孔質及び／または中空のものであつ
てもよい。好適には基質はタワシに使用するよう
な不活性（例えばポリアミド）繊維の束またはワ
イヤメツシユ、好適にはゴルフ用のボールのよう
な硬くてまたは中空の穿孔した球体または連続気
泡構造をもつポリマフオームであることができ
る。このような多孔質または中空基質（支持体）
はアルギン酸塩または寒天のような物質で該支持
体を含浸することによつてカルス組織により一層
容易に侵入し得るものとなる。 例えば、アルギン酸ナトリウムのような水溶性
アルギン酸塩の水溶液中に上記基質を浸漬し、次
いで該基質上に不溶性アルギン酸塩を沈積させる
ことができる植物非毒性水溶性塩、例えばカルシ
ウムまたはマグネシウムの水溶性塩、例えば塩化
カルシウムの溶液と該基質を接触させる。基質
は、基質を浸漬する水溶性アルギン酸塩溶液中に
細胞を懸濁させることによつて前記細胞の培養物
で接種できる。 栄養溶液を循環させる反応器中の、すなわち槽
中の栄養溶液に上述の粒状基質上に支持されたカ
ルス組織を懸濁して維持してなる、攪拌した空気
を吹込んだ系、または流動液系を維持することが
特に好ましい。 この発明による装置は貯槽から床または塔へ栄
養溶液を循環するための手段及び床または塔から
取出した栄養溶液を貯槽へ戻すための手段を備え
る。好ましくは装置は新鮮な栄養を系へ導入する
ための手段、二次代謝産物を取出し、清浄化し回
収するための手段を備える。栄養溶液の循環は蠕
動ポンプにより行うのが便宜である。 例えば多通路ポンプの２通路を使用して反応器
床または塔へ、及び反応器床及び塔から液をポン
プ輸送できる。しかし、基質と貯槽中の液体の頂
部液位とを異なる高さに保ち、前記２者の低い方
から高い方へはポンプ輸送による流れを確立し、
逆方向へはオーバフローすなわち定位置液位排出
口を経て重力流を確立することによつて一方の方
向への流れは重力によるものが好ましい。最も好
都合なのは貯槽を基質より高レベルとし、液は貯
槽から実質上垂直な、または上方に向かつて傾斜
した排出管であつてその上端は貯槽中の液の体積
を調節するために調整でき、従つて基質と接触す
る液の割合を調整できる排出管を経て流すのが最
も好都合である。 基質は水透過性で、好ましくは生物学的に不活
性な材料から造られているものが望ましい。基質
は容易に滅菌できるためにオートクレーブ処理に
耐える材料でできていることが好ましい。固定床
を使用する場合には基質は例えばアルミナまたは
砂のような粒状材料または焼結ガラスのような多
孔質材料からなるものであることができる。或は
基質粒子が相互に他の一部をなす系を使用する場
合には基質はガラス繊維、セルロース繊維または
有機合成繊維のような繊維質材料または穿孔され
た中空プラスチツク球であつてもよい。 カルス組織が床に侵入するのに充分なほど多孔
質でない床上でカルスを生育する場合には床は実
質上水平であるのが好ましい。この理由は生育中
のカルスは床にくつつく能力が比較的少なく、床
の傾斜が余り切り立つた（例えば約30゜以上のよ
うな）角度であると滑り落ちたり、ころげ落ちた
りしないで床上に保つことが容易にはできないか
らである。しかし床を水平に対して例えば2゜〜
10゜のような非常に小さい角度で傾斜させると液
の流れが平等でないために床が液で充満すること
がなく、或は液切りをよくすることができるから
時に利点がある。 栄養溶液は供給原料導入口を経て床を浸漬また
は床に噴霧でき、床中に浸漬された管を経て吸引
により取出してもよく、或は床の所定レベルに設
けられた排出口を経てオーバフローさせてもよ
い。或は床を穿孔された、或は焼結した板上に支
持するか或は前記板から造り、該板を通して栄養
溶液を排出導管に流出除去してもよい。後者の場
合には床の下の導管を通して栄養溶液の流れを往
復運動させることによつて床に下方から注水して
も、或は栄養液を溢流させてから溢流を液切りし
てもよい。 床の大きさについての理論的制限はないが、固
定床での大規模運転では汚染を局限し隔離し滅菌
を容易となすために並列及び／または直列に配列
された比較的小さい単位を使用するのが一般に便
宜である。例えば多数の床を並列に備え、１個の
貯槽から導入マニホルドを経て液を供給し、液を
床から排出マニホルドへ流下、溢流またはポンプ
輸送により排出できる。或はまた多数の床をカス
ケード式に配列し、栄養溶液を重力により系に細
流状で流下させてもよい。例えばカスケードに沿
つて床を互い違いの方向に僅かに頃けることによ
つて各床の下縁端から次の下の床の上縁端上に流
下させるか、床が穿孔板を備え、該穿孔板を通し
て液を下側の床に滴下させてもよい。 固定床系を通る栄養溶液の流速は培養物を外乱
または駆逐するほど急速にすべきではないが、カ
ルスに実質上恒量の栄養を供給し有害な代謝産物
の蓄積を防止するのに充分な流速とすべきであ
る。床中の栄養溶液の深さは細胞と空気との充分
な接触を果すためにカルス組織を完全に浸漬はし
ないが、カルス組織と栄養溶液とが接触しカルス
組織をぬらすのに充分な深さとするのが好まし
い。 他の実施態様によれば、カルス組織を空気と栄
養溶液との移動する混合物の粒状または粒状中空
または多孔質基質上または基質中に支持または懸
濁してもよい。このような系は基質内で外乱を受
けないでカルス組織の生育が可能となり、基質粒
子の相対的移動により組織の過度の生育を防止
し、組織の生成物をすりむいて空気及び栄養溶液
流への系の透過性を維持する。 この発明の方法の重要な利点は培養物へ供給さ
れる栄養の種類の調整された変化を可能となす。
このことは懸濁体培養の通常の条件下で生育した
時には通常産生されない、培養物による代謝産物
の産出を誘起させるのに価値あるものであること
が判明した。 代表例を述べると、細胞はまず慣用の懸濁体培
養技法によつて生育されて健康な細胞密度の最適
な生殖を促進させ、基質を次に細胞と共に接種し
てこの発明による培養が開始される。 好ましくは培養物を非特定化されない細胞の最
適の生育を促進するのに適した溶液に健全な生育
が確立されるまで供給し、次いで栄養液の組成を
徐々に変えて所望の代謝産物の生産に最適とな
す。例えば所望の代謝産物の先駆物またはオーキ
シン、シトキニン及びジベレリンのような発育改
変剤を栄養溶液に添加し、及び／または栄養液中
の選定された栄養の濃度または発育改変剤の濃度
を競合生物学上の物質生産への道を禁止するため
に減少させてもよい。 空気の供給は種々の仕方で調節できる。一般に
カルス培養は完全に嫌気性の条件下では行うこと
ができない。屡々、カルスと大気とを若干接触さ
せることによつて、或は栄養溶液を通して空気を
泡出させることによつて、或は栄養とカルスとを
接触させる前に栄養に大気から若干の空気を吸収
させることによつてさえ充分な通気が達成され
る。代謝産物の生産は培養物へ空気の供給を制限
することによつて好都合に行われる。 受光は植物組織培養物の発育に顕著な作用をも
たらす。培養物を含有する容器を生育中の細胞が
受光可能であるように透明となすべきである。通
常培養は白光に模造した合成光中で生育される
が、特定の代謝産物の生産を有利となすために選
定された波長による照明、または暗黒中での生育
または照明のくり返えしでの生育が場合により好
ましいことがある。好適には培養物の温度を調節
する手段が備えられる。この温度調節は生育速度
及び代謝産物の収量に影響を与える。 この発明は多数の植物代謝産物の生産に有用で
あることを見出した。例えばある種のカプシカム
種（Capsicum species）、例えばカプシカム・フ
ルテセンズ（Capsicum frutescens）またはカプ
シカム・アンニウム（Capsicum annuum）の細
胞はこの発明の方法により生育でき、トウガラシ
の風味の主要な活性化合物であるカプサイシノイ
ドの著量の収量を誘発する。同じ細胞でも懸濁培
養ではカプサイシノイドを生じない。従つてこの
発明の他の実施態様によれば、カプシカム
（Capsicum）のカプサイシノイズ生産種からのカ
ルス組織の培養物を形成し、該培養物を空気及び
栄養物水溶液と接触した基質上に支持することか
らなるカプサイシノイドの生産（製造）方法が提
供される。ここに「カプサイシノイド」とは特に
カプサイシン化合物それ自体、ジヒドロカプサイ
シン、ノル−ジヒドロカプサイシン、ホモ−カプ
サイシン、ホモ−ジヒドロカプサイシンを含めた
市販のカプサイシンの種々の成分を含むために使
用される。 好ましくは、カプサイシノイドの製造（生産）
を刺激するためにひとたび健全な生育が確立され
たらバニリン及びフエニルアラニンのような先駆
体が栄養溶液に添加され、競合タンパクの合成が
栄養溶液の硝酸塩及び／または炭水化物含量を
徐々に減少することによつて阻止される。我々は
イソカプリン酸を先駆体として栄養培地に添加す
る時にカプサイシンの特に高収率が得られること
を見出した。イソカプリン酸カリウムまたはナト
リウムのような水溶性塩も使用できる。 この発明はまたヤマノイモ属（genus
Dioscorea）のヤマノイモ（yam）のジオスゲニ
ン生産菌株から得られる組織培養によりジオスゲ
ニンの製造を増進するのに使用できる。ジオスゲ
ニンある種の商業的に価値あるステロイドの合成
用に工業的に広く使用できる。 この発明により製造できる他の代謝産物にはバ
ラ油の成分であるＬ−DOPA、阿片アルカロイ
ド及びマンダラの誘導体のような種々のアルカロ
イドが含まれる。特にクロカス・サテイブス
（crocus sativus）の培養物からサフロンの製造
は好首尾に行われた。 代謝産物はそれらの排出される程度に依存し
て、循環溶液から懸濁死細胞を別することによ
り、または循環溶液を蒸発、選択吸着、沈殿、透
析、逆滲透、溶媒抽出または他の任意の便宜な分
離方法によりこの発明方法で生育した培養物から
回収するか、或は培養物を集収し、所望の生産物
を抽出することによりこの発明の方法による培養
物から回収される。多くの場合、代謝産物はカル
スから、細胞を該細胞の滲透圧収縮を増進するの
に充分な濃度の非毒性、非イオン性化合物の水溶
液と接触させることを包含する原形質離解処理
（これは代謝産物の排出を伴う）により除去され
る。 この発明は所望の代謝産物が栄養培地中に排出
される系に対して特に有用であり、このような場
合に栄養培地が循環されている間に栄養培地から
連続的に、または断続的に代謝物質を回収するの
を好ましとする。このことは栄養溶液中に代謝産
物が過度に蓄積することにより惹起されるフイー
ドバツクメカニズムにより所望の物質代謝の通路
の阻害を減少させる。 カルス培養の生育用の適当な栄養溶液は業界に
おいて周知である。代表例は「フイジコロガ・プ
ランタラム（physicologa Plantarum）第15巻
473〜497頁にマラシゲ（Marashige）−スクーグ
（Skoog）により記述されている。このような溶
液はココナツト乳のような天然植物液の添加によ
り、またはイーストまたは麦芽抽出物により補強
される。 植物組織培養物の生育はもちろん培地及びその
栄養培地の汚染を避けるために滅菌状態で行わな
ければならない。 この発明で使用する装置を第１図を参照して説
明する。この装置はボーデン社（Borden）によ
り「セイフ・グロウ・ウオーター・マツト
（SAFE GROW water mat）」の商品名により
市販されるタイプの繊維の床２を備えたガラス容
器１からなる。容器１は蓋３により閉じられ、蓋
３は２個のゴムガスケツト４を備え、これらのガ
スケツトを貫通して鋼導入管５及び床２まで延び
る鋼排出管６が備えられる。循環導管７は排出管
６を蠕動ポンプ８を経て貯槽９と連結する。供給
導管１０は貯槽９を蠕動ポンプ１１を経て導入管
５と連結する。貯槽９は自己封止式ゴムガスケツ
ト１２を備え、これを経て貯槽の中味が取出され
たり、或は新鮮な栄養が皮下注射器により導入さ
れる。ポンプ８及び１１は多行路蠕動ポンプの別
の行路であるのが便宜である。 使用に際して装置を充分に滅菌した後で、貯槽
９は栄養溶液が装入され、この栄養溶液はポンプ
１１により供給導管１０を経て導入管５に輸送さ
れる。この栄養溶液は床２の上に床２が栄養溶液
で飽和するまで滴下される。余分の溶液は排出管
６を通つて床２から吸引除去され、ポンプ８によ
り循環導管７を経て貯槽９に輸送される。 この発明の方法を実施する装置の他の実施態様
を第２図に示す。この装置は実質上第１図のもの
と同じであるが、ポンプ１１が省略され、貯槽９
が床２の上に設置され、供給導管１０が実質上垂
直管で、その上端部は貯槽９の底部に設けられた
ガスケツト１３を通つて貯槽９中に突出し、その
下端は容器１の蓋３を貫通して容器１中に突出し
導入管５を構成する点で異なる。 この装置の使用に際しては、貯槽９からの栄養
溶液は供給導管１０を経て床２にオーバーフロー
し、ポンプ８により循環導管７を経て連続的に再
循環される。供給導管の高さにより貯槽９中の液
体の最高液位を上げたり下げたりすることによつ
てその高さの位置は調節される。これにより容器
１中に存在する循環液の割合が決定される。 以下に実施例を挙げてこの発明を説明する。 実施例 １〜２ 第１図に示した装置を使用してカプシカム・ア
ンニウム（Capsicum annuum）のカルスを、生
長因子を添加しないで500ルツクスの人工照明下
でマラシゲースクーグ（Marashige and
Skoog）栄養溶液中で培養した（実施例１）。比
較のために栄養溶液中に窒素を添加しない以外は
前記と同じ条件下で生育した（実施例２）。放射
性フエニルアラニン及びバニリンを栄養溶液に添
加した。培地と培養物を硝酸銀とホウ酸とを使用
してシリカゲル板上薄膜クロマトグラフにより分
析した。サンプルを最初等重量割合のクロロホル
ムとエチルアセテートからなる溶液で溶離し、第
２番目にクロロホルム95重量部、メタノール５重
量部及び氷酢酸１重量部からなる溶媒で直角に溶
離した。カプサイシン、ジヒドロカプサイシン及
び桂皮酸によるスポツトが同定された。カプサイ
シンとジヒドロカプサイシンとの計量数を合計
し、下表にカプサイシンとして示す： 【表】 同じ条件下で懸濁培養の場合にはカプサイシン
生産物は認められなかつた。寒天ゼリ上で生育し
た静止カルスは非常に少量のカプサイシンを生産
したのにすぎなかつた。この発明により生育した
カルスは代謝産物の生産に有効であることをサン
プルは説明し、またこれらのサンプルは栄養から
窒素を除くことによつてタンパクの産生が抑制さ
れ放射能で標織された先駆体（バニリン及びフエ
ニルアラニン）が所望の代謝産物（カプサイシ
ン）に増大した効率で転化されたことを示す。 実施例 ３ 20cm×2.5cmのカラス塔を粗大なポリアミド繊
維の束からなるタワシ状物で充填した。これらの
トロイド状タワシ状物をまずアルギン酸ナトリウ
ム溶液中でカプシカム・アンニウム（Capsicum
annuum）細胞の懸濁液中に浸漬することによつ
て接種した。次いでタワシ状物を塩化カルシウム
水溶液と接触させることによつて繊維上にアルギ
ン酸カルシウムを沈殿させた。 マラシゲ−スクウグ栄養溶液50mlを25℃で絶え
ず人工照明しながら５日間上記塔中を循環させ
た。この期間中塔に空気を吹込んで貫流させた。 栄養液にイソカプリン酸５mgを添加し、栄養液
の循環を２週間続けた。大気と接触の際に栄養液
によつて吸収された空気以外には塔に空気を供給
しなかつた。 栄養液をクロロホルムで抽出すればカプサイシ
ノイド350mgが得られた。 実施例 ４ クロカス・サテイブス（Crocus sativus）のカ
ルスの培養物を、オーキシン及びキニンを添加し
て補強したマラシゲ−スクーグ栄養液を使用して
実施例１で使用した装置中で生育した。栄養液は
サフロンの特色である黄色を呈した。ガスクロマ
トグラフ分析によりサフロンの活性な主成分であ
るクロシンの著量の産生物が単離された。

【図面の簡単な説明】

第１図はこの発明の方法を実施する装置の概略
縦断面図で、第２図はこの発明の方法を実施する
他の態様の装置の概略縦断面図である。図中： １……容器、２……床、３……蓋、４……ガス
ケツト、５……導入管、６……排出管、７……循
環導管、８，１１……ポンプ、１０……供給導
管、１２……ガスケツト、１３……ガスケツト。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 植物代謝産物を製造するに当たり、基質上に
   実質上静止状態で存在するカルスを生産させ、空
   気を吹込んだ栄養溶液の流れを前記カルスと接触
   させ、培地と栄養溶液との一方または両方から代
   謝産物を回収することからなる、植物代謝産物を
   製造する方法。 ２ カルス組織を不活性繊維の束または不活性ワ
   イヤの束または連続気泡構造をもつポリマフオー
   ムのような多孔質または中空基質上で増殖させる
   特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ カルス培養物を最初迅速増殖を促進する培地
   中で増殖させ、栄養培地から次いで増殖を維持す
   るのに必要な少なくとも１種の物質を減少させる
   特許請求の範囲第１項または第２項記載の方法。