CN104630294A - 一种循环使用培养液提高微藻油脂产量的方法 - Google Patents

一种循环使用培养液提高微藻油脂产量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种循环使用培养液提高微藻油脂产量的方法，该方法包括如下步骤：(1)配制微藻培养基；(2)向微藻培养基中接入微藻种子液，培养至微藻生长的稳定期，得到微藻混合物；(3)将微藻混合物离心处理，分别收集微藻和培养液，向培养液中加入吸附剂，搅拌处理，然后过滤去除吸附剂，收集上清液；(4)将步骤(3)得到的上清液作为溶剂配制微藻循环培养基，得到循环培养基，将该循环培养基作为下一次培养的培养基；(5)重复步骤(2)～(4)。该方法循环利用微藻培养基，不仅能够节约培养的成本，还能减少废水排放，实现节能减排，并且每次循环培养，微藻的生物量、产油量与新鲜培养基相比有一定提高。

Description

一种循环使用培养液提高微藻油脂产量的方法
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体涉及一种循环使用培养液提高微藻油脂产量的方法。
背景技术
微藻是一类可光合自养的微生物，含有丰富的蛋白质、多不饱和脂肪酸、色素等营养物质。同时，因其具有生长速度快、单位体积脂肪酸产量高等优点，在生物饲料、生物制药、保健品及生物燃料等诸多领域都有广泛的应用前景。在微藻大规模培养中需要使用大量的培养液，也即需要使用大量的水，这些培养液提供微藻生长所必须的营养成分。但微藻收获后，大量剩余的培养液如果直接丢弃，既造成水资源浪费，也会造成水体污染，不利于环保。所以微藻培养液的循环使用很有必要，一方面可以节约水资源，另一方面，可以减少污水排放，减少对环境的影响。
但是，微藻培养收获后的上层清液直接用于微藻的循环培养，可能会不利于微藻的生长，因为在微藻生长过程中可能会产生有害物质，这些有害物质存在于上层清液中，不经处理直接用于微藻再一次培养，可能会抑制微藻生长。因此，寻找一种有效经济环保的微藻培养液循环使用方法，很有意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提供一种微藻培养液循环使用的方法，这种方法不仅能提高微藻培养液循环利用的次数，还能提高微藻的生物量和产油量。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种微藻培养液循环使用的方法，该方法包括如下步骤：
(1)配制微藻标准培养基；
(2)向步骤(1)的微藻标准培养基中接入微藻种子液，然后培养至微藻生长的稳定期，得到微藻混合物；
(3)将步骤(2)得到的微藻混合物离心处理，分别收集微藻和培养液，向培养液中加入吸附剂，搅拌处理，然后过滤去除吸附剂，收集上清液；
(4)将步骤(3)得到的上清液作为溶剂配制微藻循环培养基，将该循环培养基作为下一次微藻培养的培养基；
(5)重复步骤(2)～(4)。
其中，步骤(1)和步骤(4)中，所述的微藻标准培养基为TAP培养基，。
其中，步骤(2)中，所述的微藻为淡水小球藻。
其中，步骤(3)中，所述的吸附剂为硅藻土、沸石中的一种或两种的混合物，优选的吸附剂为硅藻土。
其中，步骤(3)中，吸附剂与培养液的比例为0.5～5g：100mL，优选为2g：100mL。
其中，步骤(3)中，所述的搅拌处理，搅拌时间为2～8h，搅拌速度为50-120转/分钟，优选为100转/分钟。
步骤(4)中，循环培养基中加入的各营养成分的含量是微藻标准培养基的3/4，。
其中，步骤(5)中，步骤(2)～(4)重复次数为3次。
这种加入沸石和硅藻土处理后的循环培养基能提高微藻油脂产量的机理在于，每次向循环培养基中加入的营养物质只有标准微藻培养基中含有营养物质的3/4，导致循环培养基中氮素缺乏，从而对微藻的生长环境造成氮素不足的胁迫，因此促进微藻油脂积累。另一方面，加入的吸附剂能够去除培养液中的生长抑制物质，降低培养基中抑制物对微藻生长的抑制作用，使微藻的生物量能维持在较高的水平，最终提高了微藻油脂产量。
有益效果：
1、本发明微藻培养收获后，将剩余上清液利用沸石或硅藻土吸附其中的有害物质，再将其作为下一次培养的溶剂，减少废水排放，有利于环保。
2、本发明有效利用了微藻培养基中未被利用的营养物质，且每次循环只补充3/4的营养成分，降低微藻培养的成本，每次循环培养减少使用新鲜水作为培养水体，从而降低微藻培养的成本。
3、本发明可以显著提高微藻油脂产量，经过每次循环后，养分积累且不平衡的胁迫效应(如氮素相对缺乏)致使油脂积累，同时吸附剂去除生长抑制物质导致生物量不降低。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
以下实施例中所用的微藻为淡水小球藻Chlorella sorokinina LS-2，菌种保藏登记号为CGMCC 8710。
以下实施例中所用的TAP培养基(每升)配方如下：400.00mg NH4Cl，50.00mgCaCl2·2H2O，100.00mg MgSO4·7H2O，98.80mgNa2HPO4，61.73mg KH2PO4，50.00mgNa2EDTA·2H2O，22.00mg ZnSO4·7H2O，11.40mg H3BO3，5.10mg MnCl2·4H2O，5.00mgFeSO4·7H2O，1.60mg CoCl2·6H2O，1.16mg CuSO4·5H2O，1.10mg(NH4)6Mo7O24·4H2O，2420.00mg Tris Base，1ml Glacial Acetic Acid。
以下实施例中微藻的油脂通过以下方法得到：向所得的微藻干品中加入5ml浓盐酸(质量浓度36％-38％)，混匀，70℃水浴中放置20min，加入5ml无水乙醇，静置冷却后再向体系中加入5mL乙醚，振荡1min，4000rpm离心2min，获得上层乙醚相和下层沉淀，将上层乙醚相移出，向下层沉淀中加入5mL的乙醚，振荡1min，4000rpm离心2min，再将上层乙醚相移出，合并所有上层乙醚相，减压浓缩脱除溶剂，获得藻油并称重。微藻油脂含量(％)＝油脂重量/微藻干品重量*100。
以下实施例中微藻干品的重量指用于提油的微藻藻粉质量，通过微藻细胞在680nm下的吸光度可以判断微藻的生长状况，待微藻生长至稳定期，将藻细胞摇匀，取20～200ml藻液8000rpm离心3min，去除上清液，将所获得的藻泥在70℃下干燥12h，获得微藻干品，换算成每L藻液中微藻干品质量，表示为微藻生物量(g/L)。
以下实施例中微藻产油量(g/L)＝微藻生物量(g/L)x油脂含量(％)。
实施例1：
配制TAP培养基，按100mL/瓶分装到250mL的锥形瓶中，灭菌。按照接种量为4％接入新鲜的稳定期采收的淡水小球藻Chlorella sorokinina LS-2，培养至稳定期(约7天)，培养条件设为温度26℃、光照强度3000lux，光暗周期14h/10h。
将微藻培养物离心处理，分别收集微藻泥和上清液，再对上清液做如下处理：1号锥形瓶的上清液不做任何处理，直接作为溶剂配制循环培养基，加入上清液中的各培养基的组分均减为标准TAP培养基的3/4；2号锥形瓶的上清液中按100mL:2g比例加入硅藻土，在100转/分钟条件下搅拌6h，再经离心除去硅藻土，将其作为溶剂配制循环培养基，加入上清液中的各培养基的组分均减为标准TAP培养基的3/4；3号锥形瓶的上清液中按100mL:2g比例加入沸石，在100转/分钟条件下搅拌6h，再经离心去除沸石，将其作为溶剂配制循环培养基，加入上清液中的各培养基的组分均减为标准TAP培养基的3/4；4号锥形瓶的上清液中按100mL:2g比例加入硅藻土，在100转/分钟条件下搅拌6h，再经离心去除硅藻土，将其作为溶剂配制循环培养基，加入上清液中的各培养基的组分均减为标准TAP培养基的1/2；分别向上述1-4号锥形瓶中接入4％新鲜的稳定期采收的淡水小球藻。重复上述实验步骤2次，即循环培养3次，加上初次的完全新鲜TAP培养基培养，共培养4次。
为了保证不同批次间的实验结果具有可比性，除了维持相同的光温培养条件外，还将每次实验中4％微藻初始接种量严格标定为OD＝0.06(680nm下测得)。
每次培养后，取20mL藻液离心烘干测藻干重(即生物量)，另外80mL藻液中的微藻用于测产油量。检测结果如表1所示。
表1锥形瓶生物反应器中循环使用培养液对微藻生物量、油脂含量及产油量的影响
表1显示了锥形瓶中(100mL培养基)所得出的新鲜培养基培养与3次循环培养的藻干重、产油量以及油脂含量。可以看出，新鲜培养基培养淡水小球藻的藻干重、产油量、油脂含量分别为1.44g/L、0.207g/L、14.37％。三次循环培养与新鲜培养基培养相比，无吸附剂的循环培养基上微藻生物量、油脂含量或者产油量的任一指标或其组合呈下降趋势，随着循环次数增加，这种下降趋势越明显，因而达不到循环培养促进油脂积累、减少废水排放的目的。但是循环培养基经过吸附剂处理后，微藻生物量、油脂含量、产油量的任一指标或其组合均明显高于无吸附剂的循环培养基，基本达到甚至超过(如前两次循环)新鲜培养基上油脂积累的效果，实现了循环培养促进油脂积累、减少废水排放的目的。第四组数据(4号瓶)是经过硅藻土处理，但培养基中只回补二分之一的标准营养成分，藻干重及产油量均不如新鲜培养基，但仍高于无吸附剂的循环培养基的效果。由此说明了循环培养基与吸附剂共同作用起到了促进油脂积累、减少废水排放的效果，二者缺一不可。
实施例2：
本实施例使用的方法与实施例1一致，所不同的是，本实施例使用的是垂袋生物反应器，培养体积为10L。
配制TAP培养基，按10L/袋分装到容量为20L的透明塑料袋中，将其两头以45度的角度悬吊在支撑架上。按照接种量为4％接入新鲜的稳定期采收的淡水小球藻Chlorella sorokinina LS-2，培养至稳定期(约7天)，培养条件设为温度26℃、光照强度3000lux，光暗周期14h/10h。
然后将微藻培养物离心处理，分别收集微藻泥和上清液，再对上清液做如下处理：1号垂袋的上清液不做任何处理，直接将其作为溶剂配制循环培养基，加入上清液中的各培养基的组分均减为标准TAP培养基的3/4；2号垂袋的上清液中按100mL:2g比例加入硅藻土，在100转/分钟条件下搅拌6h，再经3层800目尼龙滤网过滤除去硅藻土，经吸附剂处理的培养液，作为溶剂配制循环培养基，加入上清液中的各培养基的组分均减为标准TAP培养基的3/4；3号垂袋的上清液中按100mL:2g比例加入沸石，在100转/分钟条件下搅拌6h，再经3层800目尼龙滤网过滤除去沸石，经吸附剂处理的培养液，作为溶剂配制循环培养基，加入上清液中的各培养基的组分均减为标准TAP培养基的3/4；4号垂袋的上清液中按100mL:2g比例加入硅藻土，在100转/分钟条件下搅拌6h，再经3层800目尼龙滤网过滤除去硅藻土，经吸附剂处理的培养液，将其作为溶剂配制循环培养基，加入上清液中的各培养基的组分均减为标准TAP培养基的1/2。分别向上述1-4号垂袋中接入4％新鲜的稳定期采收的淡水小球藻。重复上述实验步骤2次，即循环培养3次，加上初次的完全新鲜TAP培养基培养，共培养4次。
为了保证不同批次间的实验结果具有可比性，除了维持相同的光温培养条件外，还将每次实验中4％微藻初始接种量严格标定为OD＝0.06(680nm下测得)。
每次培养后，取200mL藻液离心烘干测藻干重(即为生物量)，之后用于提取油脂，计算产油量。检测结果如表2所示。
总体上，垂袋上的结果与锥形瓶上的结果一致。即垂袋上三次循环培养效果中，与新鲜培养基对照相比，无吸附剂的循环培养基上微藻生物量、油脂含量或者产油量的任一指标或其组合呈下降趋势，随着循环次数增加，这种下降趋势越明显，因而达不到循环培养促进油脂积累、减少废水排放的目的。循环培养基经过吸附剂处理后，三次循环培养中微藻产油量均得到进一步提高，微藻的其它指标(生物量、油脂含量)也得到一定的改善。并且这些指标的任一个或其组合基本达到甚至明显超过新鲜培养基各项指标，实现了循环使用培养液促进油脂积累、减少废水排放的目的。第四组数据(4号袋)是经过硅藻土处理，但只回补二分之一的标准TAP营养成分，微藻生物量大部分情况下不如新鲜培养基，但产油量仍然高于新鲜培养基的效果。总之，垂袋反应器上的放大试验结果进一步说明了循环培养基与吸附剂的共同作用能够显著促进油脂积累并减少废水排放的效果。
表2垂袋生物反应器中循环使用培养液对微藻生物量、产油量及油脂含量的影响
表2中10L垂袋培养所得出的数据，不仅证明了不同光生物反应器(垂袋培养与锥形瓶培养)可以获得相似的效果，同时说明了本发明提供的循环使用培养基提高微藻油脂产量方法在放大过程中也具有较好的稳定性以及效果增强趋势。
实施例3：
对循环使用培养基的成本下降做了初步分析。与标准TAP培养基比较，每立方培养基每次循环只回补3/4的营养成分，节约了1/4的营养成分，这1/4的营养成分为100.00g NH4Cl，50.00g CaCl2·2H2O，100.00g MgSO4·7H2O，98.80gNa2HPO4，61.73gKH2PO4，12.50g Na2EDTA·2H2O，5.50g ZnSO4·7H2O，2.85g H3BO3，1.275g MnCl2·4H2O，1.25g FeSO4·7H2O，0.4g CoCl2·6H2O，0.29g CuSO4·5H2O，0.275g(NH4)6Mo7O24·4H2O，605.00g Tris Base，0.25L Glacial Acetic Acid。其中Tris Base的价格为400元/500g,其他药品单价较低，暂不列入计算，所以节约的1/4的营养成分约为484元。
如果再算上排污处理费及用工，可以节省更多。

Claims (10)

1.一种循环使用培养液提高微藻油脂产量的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)配制微藻标准培养基；
(2)向步骤(1)的标准培养基中接入微藻种子液，培养至微藻生长的稳定期，得到微藻混合物；
(3)将步骤(2)得到的微藻混合物离心处理，分别收集微藻和培养液，向培养液中加入吸附剂，搅拌处理，然后过滤去除吸附剂，收集上清液；
(4)将步骤(3)得到的上清液作为溶剂配制微藻循环培养基，将该循环培养基作为下一次微藻培养的培养基；
(5)重复步骤(2)～(4)。
2.根据权利要求1所述的循环使用培养液提高微藻油脂产量的方法，其特征在于，步骤(1))中，所述的微藻标准培养基为TAP培养基。
3.根据权利要求1所述的循环使用培养液提高微藻油脂产量的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的微藻为淡水小球藻。
4.根据权利要求1所述的循环使用培养液提高微藻油脂产量的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的吸附剂为硅藻土和沸石中的任意一种或两种的混合物。
5.根据权利要求1所述的循环使用培养液提高微藻油脂产量的方法，其特征在于，步骤(3)中，吸附剂质量与培养液体积的比例为0.5～5g：100mL加入。
6.根据权利要求1所述的循环使用培养液提高微藻油脂产量的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的搅拌处理，搅拌时间为2～8h，搅拌速度为50～120转/分钟。
7.根据权利要求1所述的循环使用培养液提高微藻油脂产量的方法，其特征在于，步骤(4)中，循环培养基中加入各营养成分的含量是微藻标准培养基的3/4。
8.根据权利要求1所述的循环使用培养液提高微藻油脂产量的方法，其特征在于，步骤(5)中，步骤(2)～(4)重复次数为3次。
9.根据权利要求1所述的循环使用培养液提高微藻油脂产量的方法，其特征在于，反应过程中使用生物反应器。
10.根据权利要求1所述的循环使用培养液提高微藻油脂产量的方法，其特征在于，所述的生物反应器为锥形瓶光生物反应器或者垂袋光生物反应器。
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