JPS6328400A

JPS6328400A - 尿素の測定用試薬及び測定方法

Info

Publication number: JPS6328400A
Application number: JP17070786A
Authority: JP
Inventors: Tomoko Kamei; 智子亀井; Masao Kageyama; 影山　雅夫
Original assignee: Unitika Ltd
Current assignee: Unitika Ltd
Priority date: 1986-07-18
Filing date: 1986-07-18
Publication date: 1988-02-06

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は２体液中の尿素を測定するための測定用試薬及
び測定方法に関するものである。

（従来の技術）尿素は、アミノ酸の脱アミノによって生じたアンモニア
とＣＯｚから主として肝臓で尿素サイクルによって合成
され、臣ｎ床検査の領域において。

体液、すなわち血中、尿中の尿素は腎障害を鋭敏に反映
するため、非タンパク窒素同様、腎障害の診断に日常的
に測定されている重要な項目の一つである。

従来から、尿素含有量を測定するには、以下に示す種々
の原理に基づく方法及び試薬が用いられている。その測
定原理は、大きく２大別することができる。

（１）尿素とジアセチルモノオキシムを強酸性下で加熱
し、酸化・縮合させて呈色した橙黄色を測定するジアセ
チルモノオキ、ジム法。

（２）ウレアーゼ反応によって生じるアンモニアを定量
する方法。

（１）の方法は、呈色が光に対し敏感で退色が早く、検
量線がＳ字状になるという欠点をもつ。

また、加熱操作を必要とするため、ルーチン法には不向
きである。そこで、これらの欠点を伴わない方法として
、ウレアーゼを用いるウレアーゼ反応によって生じたア
ンモニアを種々の方法で測定する方法が開発されている
。

このアンモニア測定法としては５ネスラー法。

コンウェイ法、インドフェノール法、ｕｖ法の４種があ
る。ネスラー法は１通気法によってアンモニアを酢酸中
に捕捉するために手間がかかり、コンウェイ法は、特殊
装置を必要とし２時間かががるなどの欠点を有している
ため、ルーチン法に不向きである。インドフェノール法
は、アルカリ性の試薬を使う必要があるため、危険を伴
う方法である。そのため、近年になって、穏やかな条件
下で反応が進む酵素法の利点を利用し、グルタメートデ
ヒドロゲナーゼ（以後ＧＬＤＨと略記する。）を用いて
、３４０ｎｍにおける吸光度変化でアンモニアの量を測
定するＵＶ法が開発されている（基礎臨床化学　３５３
〜３７８頁、　１９８０年）。

この体液中の尿素窒素を反応中間体としてアンモニアを
経るウレアーゼ・ＧＬＤＨ法で測定する場合、一般健常
者の体液２例えば血清中には内因性アンモニアと呼ばれ
ているアンモニアが１１０〜１３０μｇ／ｄ！（１８〜
２４μＭ）、尿中には４１〜８２ｗ／ａ　（２４〜４８
ｍＭ）含まれていて、この内因性アンモニアによる正誤
差の割合は。

血清の場合は０．４〜０．９％、尿の場合は７〜１４％
となっており、測定値に信頼性が欠ける欠点があった。

この問題を解決するためには、どのような測定法であろ
うと、尿素測定に先立って内因性のアンモニアを除く必
要がある。例えば、ウレアーゼ・ＧＬＤＨ法の内因性ア
ンモニアの消去方法として、ＧＬＤＨとニコチンアミド
アデニンジヌクレオチドフォスフェート還元型（以後Ｎ
ＡＤＰＨと略記する。）とからなる試薬を検体中に加え
。

内因性アンモニアをＮＡＤＰＨの減少にかえて一旦消去
したのち、ウレアーゼを加え、生成したアンモニアをさ
らにＮＡＤＰＨの減少で測定する２段階の操作で内因性
アンモニアを除去することが提案されている（協和メデ
ックス社デタミナー使用説明書集　３５〜３６頁、　１
９８４年）。

（発明が解決しようとする問題点）この操作では１食生活に起因する内因性アンモニアの個
人的な相違によって、ＮＡＤＰＨが第一段の反応で消費
され、減少する程度がまちまちであるため、しばしば第
二段の酵素反応にＮ　Ａ　Ｄ　ＰＨの残量が不充分にな
る問題がある。そのため。

ＮＡＤＰＨを増加させることや、ＮＡＤＰＨ再生酵素系
を備えた方法が提冨されているが、前者は測定に用いる
分光光度計のダイナミックレンジ上困難であり、後者は
再生酵素系をウレアーゼ反応させる際に失活させておく
よい方法がないなどの点から実用化に問題があり、現状
は、内因性アンモニアの影響を受けつつも２分析者の技
術力によって測定を行っているのが実情であり、内因性
アンモニアの影響を受けない尿素の測定用試薬及び測定
方法の開発が望まれている。

（問題点を解決するための手段）本発明者らは、このような現状に鑑み、内因性アンモニ
アの影響を受けない尿素の測定用試薬及び測定方法を提
供することを目的として鋭意検討した結果、内因性アン
モニア消去系に補酵素に対する酵素反応の特異性の差が
利用できることを見い出し１本発明に到達したものであ
る。

すなわち１本発明は、ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチドフォスフェート還元型（Ｎ　Ａ　ＤＰＨ）に特異
的に作用するオキシドレダクターゼ（デアミネーテイン
グ）及びウレアーゼからなる尿素の測定用試薬において
、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（以３
　Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｈと略記する。）に特異的に作用するオ
キシドレダクターゼ（デアミネーテイング）及びニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤｆ（）
からなる試薬と、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ド還元型（ＮＡＤＨ）に特異的に作用するオキシドレダ
クターゼ及び電子受容体からなる試薬とから構成されて
いることを特徴とする内因性アンモニア消去能を有する
尿素の測定用試薬及びウレアーゼ反応によって体液中の
尿素から生じたアンモニアをニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチドフォスフェート還元型（ＮＡＤＰＨ）の吸
光度変化で測定するに際し、予めニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）に特異的に作用す
るオキシドレダクターゼ（デアミネーテイング）及びニ
コチン７ミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ
）からなる試薬で体液中に存在する内因性アンモニアを
消去し１次いでニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
還元型（Ｎ、ＡＤＨ）に特異的に作用するオキシドレダ
クターゼ及び電子受容体からなる試薬で体液中に残存す
るニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡ
ＤＨ）を酸化型に変換することを特徴どする尿素の測定
方法を要旨とするものである。

本発明に用いるウレアーゼとしては、酵素番号ＥＣ３・
５・１・５に属するものであればいかなるものでもよく
、動、植物、微生物起源のいずれの起源のものでもよい
。例えば、植物由来のものとしては、なた豆由来のもの
がある（ベーリンガーマンハイム山之内社製カタログＴ
ｈ７３７３３０゜東洋紡社製カタログ寛ｕｐＨ−２０１
）、また。

ＮＡＤＰＨに特異的に作用するオキシドレダクターゼ（
デアミネーティング）は、酵素番号ＥＣＩ・４・工に属
し、ＮＡＤＰＨに特異的なものであればいかなるもので
もよく１例えば、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｓρ
、）由来のグルタメイトデヒドロゲナーゼ（東洋紡社製
）を用いることができる。また、ＮＡＤＨに特異的に作
用するオキシドレダクターゼ（デアミネーティング）は
、酵素番号ＥＣ１・４・１に属し、ＮＡＤＨに特異的な
ものであればいかなるものでもよく、セリンデバイドロ
ゲナーゼ〔以後Ｓｅｒ、ＤＨと略記する；パセリの葉よ
りクレトビツチ等の方法に従い精製した。クレトビツチ
等、イズ　アカード　ナーク　Ｓ、Ｓ、Ｓ、Ｒ。

セル　パイオル　３１巻　２９５〜３０１頁、　１９６
６年：にｒｅｔｏｖｉｅｈ、　ｖ、ｓ、＆　５ｔｅｐａ
ｎｏｖｉｃｈ、　Ｋ、Ｍ。

（１９６６）、　Ｉｚｕ　Ａｋａｄ、　Ｎａｕｋ、　Ｓ
、Ｓ、Ｓ、Ｒ，Ｓｅｔ、　Ｂｉｏｌ。

３１．２９５〜３０１’］　、アラニンデバイドロゲナ
ーゼ〔以後Ａｌａ、ＤＨと略記する；ソグマ社製。

バチルス　ズブチルス（り且す」ｙと」ユｕｂｔｉｌｉ
ｓ）由来〕、ロイシンデバイドロゲナーゼ〔以後Ｌｅｕ
。

ＤＨと略記する；東洋紡社製、バチルス属（Ｂａｃｉｌ
−１ｕ　Ｓ　ｓ　ｐ、　）由来〕を用いることが゛でき
る。さらに。

Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｈζこ特異的に作用するオキシドレダクタ
ーゼは、酵素番号ＥＣＩ・６に属し一、Ｎ、ＡＤＨに特
異的なものであればいかなるものでもよく１例えば、バ
チルス　ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌ−１ｕｓ
　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のジア
ホラーゼ（ユニチカ社製）を用いることができる。

本発明の尿素の測定試薬は、内因性アンモニアを消去す
る試薬を第一試薬とし、内因性アンモニア消去後に残存
するＮＡＤＨを酸化型にする試薬を第二試薬とし、さら
に１検体中の尿素を分解して、アンモニア経由でＮＡＤ
ＰＨの吸光度変化を生せしめる試薬を第三試薬とするこ
とが望ましい。

第一試薬は、ＮＡＤＨに特異的に作用するオキシドレダ
クターゼ（デアミネーテイング）１例えば。

Ｓｓｒ、　ＤＨ，Ｌｅｕ、　ＤＨ又はＡｌａ、ＤＨなど
と。

その基質であるヒドロキシピルビン酸、オギソ・イソ吉
草酸又はピルビン酸などと、ＮＡＤＨ等が主成分であり
、その他シこ、通常安定化剤等の添加剤なるものを含ま
せることができる。添加剤としては５例えば、エチレン
ジアミン四酢酸ナトリウム（以後ＥＤＴＡと略記する。

）、塩化カリウム（以後ＫＣｐと略記する。）。Ｎ−ア
セチルシスティン（以後ＮＡＣと略記する。）、ポリビ
ニールアルコール（以後ＰＶＡと略記する。）、牛血清
等を支障なく使用することができる。

第二試薬は、ＮＡＤＨに特異的に作用するオキシドレダ
クターゼ、例えば、ジアホラーゼ等と電子受容体を主成
分とする。電子受容体としては。

例えば、溶存酸素、リボ酸２色素等が利用でき１色素と
しては、２・６−シクロロフエノルインドフエノール（
以後ＤＣＩＰと略記する。）、ニトロブルーテトラゾリ
ウム（以後ＢＴと略記する。）。

ｐ−インドニトロテトラゾリウムバイオレット（以後Ｉ
ＮＴと略記する。）等があげられ、バチルス　ステアロ
サーモフィラス由来のジアホラーゼを用いた場合は、Ｎ
ＡＤＨに特異的な反応を行うため、ＤＣＩＰが最も望ま
しい。

第三試薬は、ウレアーゼ、ＮＡＤＰＨに特異的に作用す
るオキシドレダクターゼ（デアミネーティング）１例え
ば、ＧＬＤＨ等と、その基質であるα−ケトグルタミン
酸等と、ＮＡＤＰＨを主成分とするものであり、その他
に、第一試薬のところで列記した添加剤を支障なく使用
することができる。

第一試薬、第二試薬４第三試薬の主成分及び添加剤など
は、ｐＨ６，０〜１０．０の緩衝液に溶解するのが望ま
しく、その緩衝液としては、リン酸緩衝液、トリシン、
トリス−塩酸、ビシン、ホウ酸など２通常の使用範囲が
ｐＨ６゜０〜１０．０のものであればいかなるものでも
よい。

本発明の尿素の測定用試薬の各成分の濃度は１一般には
次のような濃度が好ましい。例えば、第一試薬に用いる
Ｓｅｒ、ＤＨを１．０〜１００ユニツト／　ｍ　ｌ　、
又はＬｅｕ、ＤＨを１．０〜５００ユニット／　ｍ　ｌ
　、第二試薬に用いるジアホラーゼを１．０〜１００ユ
ニツ）　／　ｍ　！！　、第三試薬に用いるＧＬＤＨを
１．０〜１００ユニツト／　ｍ　７！、第三試薬に用い
るウレアーゼを０．１〜１０ユニツト／　ｍ　ｌ　。

第一試薬に用いるＮＡＤＨを０．０１〜１０ｍＭ。

第二試薬に用いるＤＣＩＰをｌＸｌ０−３〜１×１０−
”ｍＭ、第三試薬に用いるＮＡＤＰＨを０．０１〜５ｍ
Ｍ、第三試薬に用いるα−ケトグルタミン酸を１〜１０
０　ｍ　Ｍ、第一試薬に用いるヒドロキシピルビン酸を
１〜１００ｍＭ、オキソイソ吉草酸を１〜１００ｍＭ又
はピルビン酸を１〜１００ｍ　Ｍ　、添加剤としてＮＡ
Ｃを０．１〜２％、ＢＳＡを０．０５〜１％、ＥＤＴＡ
を０．１〜１０ｍＭ。

ＫＣＩを１ｍＭ”１Ｍ使用すればよい。より好ましくは
、　　Ｓ、ｅｒ、　ＤＨを２〜５０ユニツト／　ｍ　ｌ
　。

ジアホラーゼを２〜５０ユニツト／ｍＪ、ＧＬＤＨを２
〜５０ユニツト／　ｍ　ｌ　、　　ウレアーゼを０．２
〜５ユニット／ｍｊ！、ＮＡＤＨを０．１〜１０ｍＭ。

ＤＣＩＰを２Ｘ　Ｉ　Ｑ−”〜７　Ｘ　Ｉ　Ｏ−’ｍＭ
、　ＮＡＤＰＨを０．１〜１　ｍ　Ｍ　、　　α−ケト
グルタミン酸を５〜２０ｍ〜１．ヒドロキシピルビン酸
を５〜２０ｍＭ、オキソイソ吉草酸を５〜２０ｍＭ又は
ピルビン酸を５〜２０ｍＭ、添加剤としてＮＡＣを０．
１〜１％、ＢＳＡを０．０５〜０．５％、ＥＤＴＡを０
．５〜５ｍＭ、ＫＣＩを１０〜５００ｍＭ使用すればよ
い。

次に１本発明の測定方法について説明すると。

通常第一試薬で次に示す■の反応を行い、第二試薬で■
の反応を行い、第三試薬で■の反応を行うことが好まし
い。

■内因性アンモニアの除去反応の例 −一−−セリン＋Ｈ２０＋ＮＡＤ” ロイシン＋Ｈ２０＋ＮＡＤ“ ■残存ＮＡＤＨの除去反応の例（Ｃ）　　ＤＣＩＰ十ＮＡＤＨｆｄｌ　　ＤＣＩＰ十ＮＡＤＨ ■尿素由来のアンモニアの測定の例（ｅ）　　尿素＋Ｈ２０ −ｔ−Ｈ−□　グ）ｌクミン酸十　Ｈ２Ｏ＋ＮＡＤＰ”
ｔｅｌの反応系で１分子の尿素を２分子のアンモニアに
分解し、（ｆ）の反応でｔｅｌの反応で生じたアンモニ
アを測定する。

以上の■〜■の反応系を組み合わせることにより、内因
性のアンモニアの影響を受けることなく。

体液中の尿素を測定することができる。これらの反応は
、順次第一試薬、第二試薬、第三試薬を加えることによ
って行うことができ、そのときの反応温度は、いずれも
が酵素反応であることから。

２０〜４５℃で行うことができる。また２反応時間とし
ては、第一試薬は内因性アンモニアの除去にかかわるも
のであり、測定するサンプルが血液の場合には内因性ア
ンモニアが少ないため、１０〜３０秒でよく、尿の場合
は内因性アンモニアが多いため、３０秒〜１分で行えば
よい。第二試薬は、内因性アンモニア除去後に残存する
ＮＡＤＨを３４０ｎｍに吸光度をもたないＮＡＤに変換
する反応であり、測定サンプルの由来にかかわらず。

３０秒〜１分で反応を完結することができる。第三試薬
は尿素由来のアンモニアの測定に関わるものであり、レ
イト法で測定する場合は３０秒〜１分、エンドポイント
法で測定する場合は１〜２分でよい。

（実施例）次に１本発明を実施例により具体的に説明する。

実施例１Ｓｅｒ、ＤＨ５ユニット／ｍ２．ヒドロキシピルビン酸
５ｍＭ、ＮＡＤＨ５ｍＭ、ＮＡＣｏ、２％を１００ｍＭ
ビシン緩衝液（ｐＨ８，５）に溶かした第一試薬を調製
し２次いで、ジアホラーゼＩＯＵ／ｍｊｌ！、ＤＣＩＰ
４Ｘ１０−３ｍＭ、ＢＳＡｏ、１４■／　ｍ　ｌをトリ
ス−塩酸緩衝液に溶かした第二試薬を調製し、最後に、
ウレアーゼ１．６５Ｕ／ｍｆｆ。

ＧＬＤＨ１５，９Ｕ／ｍ！！、ｃｔ−ケトグルタミン酸
３０ｍＭ、ＮＡＤＰ８０．７８ｍＭ、ＥＤＴＡ３ｍＭ、
ＫＣｆｆ３００ｍＭ、ＢＳＡｏ、３％、ＮＡＣＯ，６％
を１００ｍＭビシン緩衝液に熔かした第三試薬を一周製
した。

次に、この試薬を用いて体液中の尿素の測定を３７℃で
以下のごとく行った。すなわち、上記第一試薬０．８　
ｍ　ｅを光路長１ｃＩ１１のセルに入れ、２分間保温（
３７℃）した後、２５■／ｌの尿素標準液に３５ｍＭの
アンモニアを加えた試料を０．４ｍ！添加し、３分間保
温（３７℃）後、第二試薬Ｑ１０　ｍ　Ｉ！を添加した
。さらに、３分間保温（３７℃）した後、第三試薬０．
８　ｍ　ｌを添加し、セル室を同じく３７℃の恒温に保
った分光光度計にて。

３４０ｎｍの吸光度変化よりアンモニアの量を測定して
、試料中の尿素を求めた。

その結果、第三試薬を添加した直後の標準液の初期吸光
度（ＯＤ３４゜）は１．８であり、５分後には１．０５
になった。０．７４の吸光度変化から尿素量を求めると
、約３５．５■／ｌであり、内因性アンモニアの影響を
受けることなく、尿素量を正確に測定することができた
。

実施例２実施例１のＳｅｔ、ＤＨのかわりに、　　Ｌｅｕ、　Ｄ
Ｈを１００Ｕ／ｍＡ用い、ヒドロキシピルビン酸のかわ
りに、オキソイソ吉草酸を５ｍＭ用いて第一試薬を調製
した以外は実施例１と同様にして検討した。ただし、　
（ｂｌの反応は、Ｌｅｕ、ＤＨのアンモニアに対するミ
ハエリメンテン定数が高いため。

保温時間を１０分間で行った。

その結果、第三試薬を添加した直後の標準液の初期吸光
度（ＯＤ３．。）は１．７５であり、５分後には１．０
２になった。０．７３の吸光度変化から尿素量を求める
と、約３．３■／ｌであった。

実施例１と同様、内因性アンモニアの影響を受けること
なく、尿素量を正確に測定することができた。

実施例３人の尿を２００倍希釈したものを測定サンプルとする以
外は実施例１と同様にして、尿中の尿素の測定を行った
。

その結果、第−試薬及び第二試薬による反応終了後、第
三試薬を添加した直後の初期吸光度（ＯＤ３４゜）は１
．８５であった。そして１反応１分後の吸光度は０．８
２であり、さらに１反応時間を５分まで延長しても、こ
の吸光度にほとんど変化がみられなかった。

この結果から、尿中の尿素濃度は１１３ｍＭであった。

比較例１ウレアーゼ・ＧＬＤＨ法による市販の尿素窒素測定）ｎ
床検査試薬を用いて、実施例３で用いたのと同一の人尿
２００倍希釈液サンプルの尿素窒素濃度を測定した。

すなわち、ＧＬＤＨｌ、６Ｕ／ｍｌ、ＮＡＤＰＨＯ，０
３２ｍＭ、α−ケトグルタミン酸０．０１Ｍを１００ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８，０）に溶解し。

この２．３　ｍ　ｌを３７゛Ｃで５分間保温した。この
試薬の吸光度（ＯＤｘ４ｏ）は０．２０５であった。こ
れに２人尿２００倍希釈液０．２　ｍ　（ｌを加えたと
ころ。

尿に含まれる内因性アンモニアに起因するＮＡＤＰＨの
消費がただちに起こり、５采添加１分後にＮＡ　Ｄ　Ｐ
　Ｈの減少に伴う吸光度（ＯＤ３４゜）減少がゆるやか
になり、０．１１２でほぼ一定値となった。

さらに、尿中の尿素窒素濃度を測定するため。

ウレアーゼを０．３Ｕ／ｍｌになるように加えたところ
、ウレアーゼ反応によって生じたアンモニアに起因する
Ｎ　Ａ　Ｄ’　Ｐ　Ｈの３４０ｎｍにおける吸光度変化
が起こったが、内因性アンモニアによってずでにＮＡＤ
ＰＨが消費されていたため、吸光度変化に直線性がみら
れず、測定ができなかった。

（発明の効果）本発明の尿素の測定用試薬及び測定方法は、補酵素（Ｎ
ＡＤＰＨ又はＮＡＤＨ）に対する酵素の基質特異性の相
違を利用して、従来の内因性アンモニア除去に関する問
題を大幅に克服したものである。すなわち、内因性アン
モニア消去系にはＮＡＤＨを補酵素とするもの、ウレア
ーゼ反応の結果、検体中の尿素から生じたアンモニアを
測定する酵素にはＮＡＤＰＨを補酵素とするものを用い
ているので、内因性アンモニアがＮ　Ａ　Ｄ　Ｐ　Ｈの
減少に全く関与することがなく、そのため、測定に供す
る光度計のダイナミックレンジを内因性のアンモニアの
多少に関わらず設定することができる。

また、測定精度が上がるとともに、内因性アンモニア量
の個人差による希釈率変化等の手間や、何段階もの希釈
が不必要となったため、大量サンプルの処理、測定のル
ーチン化が初めて可能となり。

臨床検査分野への寄与には多大なものがある。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドフォスフ
ェート還元型に特異的に作用するオキシドレダクターゼ
（デアミネーテイング）及びウレアーゼからなる尿素の
測定用試薬において、ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド還元型に特異的に作用するオキシドレダクターゼ
（デアミネーテイング）及びニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチド還元型からなる試薬と、ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチド還元型に特異的に作用するオキシ
ドレダクターゼ及び電子受容体からなる試薬とから構成
されていることを特徴とする内因性アンモニア消去能を
有する尿素の測定用試薬。
（２）ウレアーゼ反応によって体液中の尿素から生じた
アンモニアをニコチンアミドアデニンジヌクレオチドフ
ォスフェート還元型の吸光度変化で測定するに際し、予
めニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型に特異
的に作用するオキシドレダクターゼ（デアミネーテイン
グ）及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型
からなる試薬で体液中に存在する内因性アンモニアを消
去し、次いでニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還
元型に特異的に作用するオキシドレダクターゼ及び電子
受容体からなる試薬で体液中に残存するニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド還元型を酸化型に変換すること
を特徴とする尿素の測定方法。