JPS6394998A - γ−グルタミルトランスペプチダ−ゼ定量用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、生体液中のγ−グルクミルトランスペプチダ
ーゼ活性の定量用試薬に関するものである。

（従来の技術） γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（以下γ−ＧＴＰ
と略記する。）は、生体内の各組織に広く分布し、γ−
グルタミルペプチドの代謝に関与する酵素である。臨床
検査の領域において、γ−ＧＴＰ活性は肝硬変、アルコ
ール性肝炎、肝癌。

閉塞性黄度などの肝疾患の診断及び病態把握の手段とし
て日常的に広く測定されている重要な項目の１つである
。

γ−ＧＴＰ活性の定量用試薬としては２合成基質である
γ−グルタミルアミドをγ−グルタミル供与体として用
い、γ−ＧＴＰＯ作用によって遊離するアミン類を定量
する試薬が一般に用いられている。代表的なものとして
は、γ−グルタミルーｐ−ニトロアニリドを基質とする
試薬、γ−グルタミルーα−ナフチルアミドを基質とす
る試薬が知られている。前者の基質の場合、γ−ＧＴＰ
Ｏ作用によって遊離するｐ−ニトロアニリンを直接比色
定量する試薬、このｐ−ニトロアニリンをｐ−ジメチル
アミノシンナムアルデヒドなどのアルデヒド系化合物に
よって赤色系色素に導いて比色する試薬が用いられてい
る。また、γ−グルタミルーα−ナフチルアミドを基質
とする試薬では。

γ−ＧＴＰの作用によって遊離するナフチルアミンをジ
アゾニウム塩として比色定量する試薬、又は３−メチル
−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾンと酸化縮合させて
赤紫色色素に導いて比色定量する試薬が採用されている
。

一方、共役酵素を用いてγ−ＧＴＰ活性を定量する試薬
も提案されている。その１つは、基質としてγ−グルタ
ミルー置換メチルアミド化合物を用い、γ−ＧＴＰの作
用によって生成する置換メチルアミン化合物にアミンオ
キシダーゼを作用させ、酵素反応の進行に伴う溶存酸素
の消費量あるいは過酸化水素又はアンモニアの生成量を
常法に従って定量するというものである（特開昭５８−
９６９８号公報参照）。また、特開昭６０−３４２００
号公報には、基質として天然基質に近いγ−グルタミル
ーし一グルタミン酸を用い、γ−ＧＴＰＯ作用によって
遊離するし一グルタミン酸にＬ−グルタミン酸オキシダ
ーゼを作用させ２反応に伴う溶存酸素の消費量あるいは
過酸化水素、アンモニア又はα−ケトグルタル酸の生成
量を常法に従って定量する試薬が提案されている。

（発明が解決しようとする問題点） しかしながら、前記の合成基質を用いるγ−ＧＴＰ定量
用試薬は、Ｔ−グルタミル−ｐ−ニトロアニリドなどの
溶解性が、これら化合物の安定なｐＨ域及びｒ−ＧＴＰ
反応の至適ｐＨ付近で極めて悪く、充分量の基質を使用
し難いこと、これら合成基質が不安定なこと、ビリルビ
ンや溶血（ヘモグロビン）などの影響を受は易い波長域
に吸収変化があるため、正確な定量が困難であることな
どの欠点を有している。さらに、γ−グルタミルーα−
ナフチルアミドを基質とする定量用試薬は。

上記問題点の他に、操作が煩雑であるなどの欠点も有し
ている。

これらの欠点を克服するため種々の改善策（例えば、界
面活性剤の使用、置換基質の使用、シクロデキストリン
の添加など）が提案されているが。

未だ日常検査法に広く適用するに充分なほどには解決さ
れていない。

一方、アミンオキシダーゼやＬ−グルタミン酸オキシダ
ーゼを用いる酵素的定量用試薬は、これら酵素の比較的
低い基質特異性及び測定波長域の吸光度が、血中や尿中
に予め共存するビリルビンやヘモグロビンなどにより強
く影響を受けるなど。

臨床検査の現場で日常的に使用するには信頼性に欠ける
という欠点を有している。

また、これら従来技術では、いずれも活性既知の標準物
質を用いなければならないという、操作上の煩雑さも有
している。

それゆえに、γ−ＧＴＰの本来の基質に類似したペプチ
ド化合物を基質として用い、操作が簡便で、かつ連続的
反応経過から直接γ−ＧＴＰ活性を求めることのできる
γ−ＧＴＰ定量用試薬の開発が強く望まれている。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは、このような要求を満足するγ−ＧＴＰ定
量用試薬を提供することを目的として種々検討した結果
、γ−グルタミルジペプチドを基質として用い、共役酵
素としてアミノ酸脱水素酵素を用いた定量用試薬が、上
記の目的を達成し。

操作が簡便で、かつ日常検査に使用するのに充分な精度
を有する定量用試薬であることを見い出し。

本発明を完成するに到った。

すなわち１本発明は、アミノ酸脱水素酵素とγ−ＧＴＰ
に特異的に作用する基質とからなるγ−ＧＴＰ定量用試
薬を要旨とするものである。

本発明のｒ−ＧＴＰ定量用試薬は、アミノ酸脱水素酵素
、γ−グルタミルジペプチド、受容体。

ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）〔以
下ＮＡＤ（Ｐ）”と略記する。〕を主成分とし。

その他に通常、促進剤、賦活剤などの添加剤なるものも
含ませることもできる。添加剤としては。

例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウムなどの塩類やト
リトンｘ−ｔｏｏなどの界面活性剤などを。

また、防腐剤としては９例えば、アジ化ナトリウムなど
の公知のものを支障なく使用することができる。

本発明に用いられるアミノ酸脱水素酵素としては０例え
ば、ロイシン脱水素酵素、アラニン脱水素酵素、グルタ
ミン酸脱水素酵素、フェニルアラニン脱水素酵素、グリ
シン脱水素酵素、バリン脱水素酵素、セリン脱水素酵素
があげられ、中でも。

前３者が好ましい。また、γ−ＧＴＰに特異的に作用す
る基質としては９例えば、γ−グルタミルジペプチドで
あるγ−グルタミルーし一ロイシン。

γ−グルタミルーし一アラニン、γ−グルタミルーＬ−
グルタミン酸、Ｔ−グルタミル−し−フェニルアラニン
、γ−グルタミルーグリシン、γ−グルタミルーし一バ
リン、γ−グルタミルーし一セリンなどを用いることが
できる。さらに、受容体としては１種々のアミノ酸やジ
ペプチドなどを用いることができるが、中でも、グリシ
ルグリジンやグリシルアラニンを使用するのが好ましい
。

本発明に用いられるロイシン脱水素酵素としては、その
給源が特に限定されるものではなく、バチルス・スフエ
リカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｐｈａｅｒｉｃｕｓ）な
どの微生物由来のものなど９種々の起源のものを使用す
ることができる。中でも、安定性、保存性に冨む好熱性
細菌１例えば、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ−餅旦旦）
やクロストリジウム・サーモアセティカム（ＣｌｏＳｔ
ｒｉｄｉｕｍ　ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃｕｍ）由来の
ロイシン脱水素酵素が望ましい。

また、アラニン脱水素酵素も、その給源が特に限定され
るものではなく、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）　、バチルス・スフエリカス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｐｈａｅｒｉｃｕｓ）などの微
生物由来のものなど１種々の起源のものを使用すること
ができる。

中でも、安定性、保存性に冨む好熱性細菌２例えば、バ
チルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌ−１ｕｓ
　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｔｌｕｓ）由来のアラ
ニン脱水素酵素が望ましい。

さらに、グルタミン酸脱水素酵素も、その給源が特に限
定されるものではなく、プロテウス・インコンスタンス
（Ｐｒｏｔｅｕｓ　１ｎｃｏｎｓｔａｎｓ）などの細菌
、カビ、酵母などの微生物、あるいは植物など。

種々の起源のものを使用することができる。

本発明の試薬の各成分の濃度としては、γ−グルタミル
ジペプチドを３〜３００ｍＭ　（例えば、γ−グルタミ
ルーし一ロイシンの場合、３〜１５０ｍＭ、γ−グルタ
ミルーＬ−アラニンの場合、１０〜３００ｍＭ、　　γ
−グルタミルーし一グルタミン酸の場合、３〜３００ｍ
Ｍ）、受容体を３〜５００ｍＭ、ＮＡＤ（Ｐ）＋を０．
１〜２０ｍＭ、塩類を５〜５００ｍＭ、界面活性剤を０
．０１〜２％、アジ化ナトリウムを０．５〜５０ｍＭ、
アミノ酸脱水素酵素を０．１〜１００ユニット７ｍｌと
なるように使用すればよく、γ−グルタミルジペプチド
を７．５〜２５０ｍＭ　（例えば、γ−グルタミルーし
一ロイシンの場合、７．５〜１００ｍＭ、　　γ−グル
タミルーし一アラニンの場合、１５〜２５０ｍＭ。

Ｔ−グルタミル−し−グルタミン酸の場合、７．５〜２
５０ｍＭ）、受容体を５〜３５０ｍＭ、ＮＡＤ（Ｐ）”
を０．２〜１５ｍＭ、塩類を１０〜３５０ｍ　Ｍ　、界
面活性剤を０．０２〜１．５％、アジ化ナトリウムを１
．０〜３０ｍＭ、アミノ酸脱水素酵素を０．２〜５０ユ
ニット／ｍβとなるように使用することが好ましい。

本発明の試薬の測定原理を次に示す。

γ−グルタミルー受容体＋Ｌ−アミノ酸　−−−一−・
　ｉｌｌα−ケト酸十アンモニア十還元型ＮＡＤ（Ｐ）
”　　　−一・　（２）（２）下ＮＡＤ（Ｐ）Ｈと略記
する。）このように、γ−ＧＴＰ活性はＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
の３４０ｎｍにおける吸光度増加を測定することにより
求めることができる。

さらに、（２）式で生成するＮＡＤ（Ｐ）Ｈを、ジアホ
ラーゼ、フエナジンメトサルフエイトあるいは１−メト
キシフエナンジンメトサルフエイトの中から選ばれる１
種を介して、ジホルマザンに導く方法を採用することも
できる。

本発明の試薬を用いて血清や尿などの生体液中のγ−Ｇ
ＴＰ活性を測定するときの反応温度としては１通常の酵
素反応の２０〜４５°Ｃを使用すればよい。

（実施例） 次に１本発明を実施例により具体的に説明する。

実施例１ γ−グルタミルーし一ロイシン（バツケム社より購入）
２０ｍＭ、グリシルグリシン７５ｍＭ（ｐＨ８，５）、
ＮＡＤ　（ベーリンガー・マンハイム山之内株式会社よ
り購入）６ｍＭ、　ロイシン脱水素酵素〔バチルス属（
坦氏月↓邦−杼よ）由来、東洋紡績株式会社より購入〕
５ユニッ）　／　ｍ　１とからなるγ−ＧＴＰ定量用試
薬を調製した。

次に、上記で＃Ａ製した試薬３．０　ｍ　ｌを光路長１
ｃｍのセルに入れ、コントロール血清０．０５ｍ６を添
加し、セル室を３７℃の恒温に保った分光光度計にて３
４　Ｏｎ’ｍの吸光度変化により試料中のγ−ＧＴＰ活
性を求めた。

なお、試料として１種々のγ−ＧＴＰ活性を有するコン
トロール血清を用いた。

その結果を第１図に示す。

第１図は９本発明の試薬の定量性を示すもので。

縦軸には１分間当りの３４０ｎｍにおける吸光度変化量
を、横軸には血清サンプルの希釈率を示しており、良好
な直線性を有する試薬であることがわかった。

実施例２ 実施例１と同様のγ−ＧＴＰ定量用試薬を調製した。

次に、試料として４０ユニツト／ｌ及び１００ユニツト
／ｌのγ−ＧＴＰ活性を含んだコントロール血清を用い
、上記の試薬で各々５０回γ−ＧＴＰ活性を測定した。

その結果、測定平均値は３９．７ユニツト／βと１０１
．１ユニツト／Ｉｔであり、標準偏差は各々１．０ユニ
ツト／ｌと１．３ユニツト／ｌであることがわかった。

このことから、測定の正確性を示すＣ，Ｖ、値〔（標準
偏差÷測定平均値）Ｘ１００（％）〕は、各々２．５２
％と１．２９％であり１本発明の試薬が実用に供するの
に充分な正確性を有していることがわかった。

実施例３ 実施例１と同様のｒ−ＧＴＰ定量用試薬を調製した。

次に、試料として、ビリルビン（デート社製。

国際試薬株式会社より購入）Ｏ〜２０■／ｄ！、ヘモグ
ロビン（ヘモグロビンコントロール、ヘモコンＮ１日本
商事株式会社より購入）０〜５００■７ｄｌを含む４０
ユニツト／βのγ−〇ＴＰ活性の血清を調製した。

この試料を用い、上記の試薬でγ−ＧＴＰ活性を測定し
た。

その結果、ビリルビン２０■／ｊ、ヘモグロビン５００
ｍｇ／／ｊまでγ−ＧＴＰ活性測定値に影響を与えない
ことがわかり９合成基質を用いた試薬や従来の酵素法に
よる試薬で認められた両物質による正の誤差が認められ
ず２本発明の試薬の有用性が確認された。

実施例４ グリシルグリシンの代わりにグルシルアラニン（ｐ　Ｈ
８，５、１００ｍＭ）を用いた以外は、実施例１と同様
にしてｒ−ＧＴＰ定量用試薬を調製し。

実施例１と同様にしてγ−ＧＴＰ活性を求めた。

その結果を第２図に示す。

第２図は、第１図と同様に本発明の試薬の定量性を示す
もので、実用に供するのに充分な測定範囲を有する試薬
であることがわかった。

実施例５ γ−グルタミルーし一アラニン（バッケム社より購入）
５０ｍＭ、グリシルグリシン１００ｍＭ　（ｐＨ８，５
）、ＮＡＤ５ｍＭ、アラニン脱水素酵素〔イ＜チルス・
ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）由
来、シグマ社より購入〕　６ユニツト／　ｍ　ｌからな
るγ−ＧＴＰ定量用試薬を調製した。

次に、実施例１と同様にしてγ−ＧＴＰ活性を求めた。

その結果を第３図に示す。

第３図は、第１図と同様に本発明の試薬の定量性を示す
もので、実用に供するのに充分な測定範囲の性能をもつ
試薬であることがわかった。

実施例６ Ｔ−グルタミル−し−グルタミン酸（バッケム社より購
入）２０ｍＭ、グリシルグリシン７５ｍＭ　ＣｐＨ８，
５）、ＮＡＤＰ官ヘーリンガー・マンハイム山之内株式
会社より購入）１．５ｍＭ、グルタミン酸脱水素酵素〔
プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｓｐ、）由来、東洋紡
績株式会社より購入〕　５ユニット／ｍＲからなるγ−
ＧＴＰ定量用試薬を調製した。

次に、実施例１と同様にしてｒ−ＧＴＰ活性を求めた。

その結果を第４図に示す。

第４図は、第１図と同様に本発明の試薬の定量性を示す
もので、実用に供せる性能の試薬であることがわかった
。

（発明の効果） 本発明の試薬は、アミノ酸脱水素酵素とγ−ＧＴＰに特
異的に作用する基質を用いた。従来にない新規な定量用
試薬であって、従来の合成基質を用いた試薬における基
質に関する問題点を克服し。

また、従来の試薬で認められたビリルビンやヘモグロビ
ンなどの血中共存物質の影響も受けず、さらに、煩雑な
操作を必要とせず、操作性がよいものとなった。その上
９本発明の試薬は２日常検査に供しえる再現性も有して
いる。

このように１本発明の試薬は、臨床検査分野への寄与に
多大なものがある。

【図面の簡単な説明】

第１図〜第４図は２本発明の試薬の定量性を示すもので
あり、縦軸には１分間当りの３４０　ｎｍにおける吸光
度変化量を、横軸には血清サンプルの希釈率を示してい
る。 特許出願人　　ユニチカ株式会社 矛４．１２ 千駁希

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）アミノ酸脱水素酵素とＴ−グルタミルトランスペ
   プチダーゼに特異的に作用する基質とからなるγ−グル
   タミルトランスペプチダーゼ定量用試薬。