JPS63253031A - ス−パ−オキサイドジスムタ−ゼ結合リピツドマイクロスフエア−および該リピツドマイクロスフエア−を含有する脂肪乳剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はリピッドマイクロスフェアーおよび該リピッド
マイクロスフェアーを含有する脂肪乳剤に係り、詳細に
はスーパーオキサイドジスムターゼ結合リピッドマイク
ロスフェアーおよびスーパーオキサイドジスムターゼを
有効に含有する脂肪乳剤に関する。

［従来の技術とその問題点］ 活性酸素であるスーパーオキサイド（０２）を不均化反
応（ｄｉ、ｓｕｍｕｔａｔｉｏｎ）で消失せしめるスー
パーオキサイドジスムターゼ（以下、ＳＯＤと略記する
。）なる酵素は古くから知られており、このＳＯＤ自体
は活性酸素に起因する好ましくない疾病に有効に作用す
る薬剤となり得ることが種々示唆されている０例えば炎
症に対する活性酸素の関与は早くから認められており、
この炎症に関与する活性酸素を不均化するものとしてウ
シ血液ＳＯＤは抗すュウマチ剤として既に外国において
市販されているものである。加えて、リュウマチの治療
のみならず精製ＳＯＤの投与で難治疾患として知られて
いるベーチェッ）　（Ｂｅｈｃｅｔ）病の治療の例も報
告され、更には癌治療期の併用で制癌剤等による副作用
ならびに放射線の照射による副作用を低下させるものと
いわれている。

したがって、ＳＯＤ自体は種々の疾患に対する非常に有
効な薬物となり得る性質を有するものではあるが、血中
での半減期が約６分といわれる程失活化の時間が速く、
いまだＳＯＤ自体を有効に投与し得る製剤化検討は十分
になされていないのが現状である。

ところで、フランスの生化学者ミケルソン（Ａ、Ｍ。

旧ｃｈｅｌｓｏｎ）はウシＳＯＤをリボゾームに封入し
たりボゾーマルＳＯＤ（ｌｉｐｏｓｏｍａｌ　５ＯＤ）
を提案しており、リボゾーマル化した結果、ＳＯＤが血
中においてその失活化から保護されるとともに細胞膜と
融合しＳＯＤがそのまま細胞内に入るため効果的である
と報告している。しかしながら彼は、そのリポゾーム成
分の詳細についてはなんら明らかにしているものではな
く、はたしてＳＯＤ自体が失活することなく疾患部位、
例えば炎症部位に高濃度で輸送され、その場において有
効に作用するかは不明なものである。

したがってＳＯＤ本来の生理活性を考えた場合には、Ｓ
ＯＤを疾患部位にのみ高濃度で移送し得る製剤化が熱望
されているものである。

最近、薬剤の生体内動態を研究する一分野として、生物
薬剤学が脚光を浴びてきており、生理活性物質を効率良
く疾患部位に移送するため種々の工夫をこらしたドラッ
グ・デリバリ−〇システム（Ｄｒｕｇ　Ｄｅｒｉｖｅｒ
ｙ　Ｓｙｓｔｅｍ：薬物送達システム：以下ＤＯＳと略
記する。）の開発に力が注がれて来ている。このＤＯＳ
の理論のなかには前記したミケルソンがＳＯＤで提案し
たりボゾームや、高分子化合物を薬物のキャリアとして
用いる方法が包含される他、例えば経皮吸収システムな
どの簡易な手段も広＜　　ＤＤＳとしてのａｍに分類さ
れるという広い概念である。

ところで、最近に至り本発明者らは、このＤＯＳの理論
を更に押し進め、ターゲツティング（Ｔａｒｇｅｔ−ｉ
　ｎｇ）療法と称する治療システムを提案して来ている
。すなわち、在る種の薬物を脂肪乳剤（Ｌｉｐｉｄｅｍ
ｕｌｓｉｏｎ）の脂肪微細粒子（脂肪小球子：リピッド
マイクロスフェアー、以下ＬＭＳと略記、）中に溶解し
て投与してやると、このＬＭＳがりポゾームと同様に網
内系や炎症細胞内に良好に取り込まれ、ＬＭＳがドラッ
グキャリアとなって薬物が特定の部位に選択的に移行し
くターゲツティング効果）、そこで集中的に薬効が発揮
されるという性質を応用したものであり、優れたＤＯＳ
として各方面から注目されているものである。

そのうえ、ＬＭＳは現在の薬物キャリアのなかでは安全
性、生物学的崩壊性、応用範囲の広さ、ターゲツティン
グ効果、工業的生産性など何れの面からみても実用性の
高い療法と評価されており、したがって、前記した優れ
た生理活性を有するＳＯＤについてもこのＬＭＳ中に封
入してやれば有効な投与製剤となり得るものと考えられ
る。

しかしながらＬＭＳ自体は製剤上の特徴でもあるが脂肪
相を界面活性剤が取り込むという構造のために、油脂と
相溶性を示す油溶性（脂溶性）薬物でなければ封入し得
す、水溶性の薬物には応用しにくいという欠点を有して
いる。そのため、脂溶性の低い薬物にはその薬物に脂溶
性官能基を導入するか、あるいはＬＭＳを構成する大豆
油等の油脂にエイコサペンタエン酸又はエイシンなどの
薬物溶解性の高い物質を混入することが行われ、それに
より　ＬＭＳ内部に薬物をある程度封入することができ
る手段を講じている。それであってもＳＯＤをＬＭＳ製
剤とする場合には、ＳＯＤ自体が分子量の高い蛋白であ
るためＬＭＳ内部に封入しにくいという問題点を有する
ものである。

そこで本発明者らはＳＯＤをＬＭＳの表面にある種の架
橋結合を介して外的に共有結合してやれば、得られたＬ
ＭＳはキャリアとしてのＬにＳのターゲツテング効果の
外に、ＳＯＤがＬＭＳと結合することにより　ＳＯＤ自
体の活性の半減期が増大し、そのうえ細胞親和性が増し
、その結果、ＬＭＳと結合したＳＯＤが疾患部位に高濃
度で移送され、そこでＬＭＳとの結合が解離されたＳＯ
Ｄが所望の効果を発揮することを新規に見い出し、さら
に該ＬＭＳを含有する脂肪乳剤がＳＯＤを投与するため
の優れた製剤となり得ることを見い出し、本発明を完成
したのである。

［発明の構成］ すなわち本発明は； スーパーオキサイドジスムターゼをリビツドマイクロス
フェアーの表面に外的に結合し、前記スーパーオキサイ
ドジスムターゼとリピツドマイクロスフェアーの結合が
、−Ｓ−または−ＳＳ−共有結合を介して架橋結合した
： ことを特徴とするスーパーオキサイドジスムターゼ結合
リビッドマイクロスフェア−（以下、ＬＭＳ−ＳＯＤと
記す場合もある。）、に関する。

さらに本発明は該スーパーオキサイドジスムターゼ結合
リピッドマイクロスフェアーを含有する脂肪乳剤にも関
するものである。

［作用］ 本発明においてスーパーオキサイドジスムターゼ（ＳＯ
Ｄ）をその表面に外的に結合するリピッドマイクロスフ
ェア−（ＬＭＳ）としては、油脂および乳化剤からなる
脂肪微細粒子であり、この場合の油脂としては、従来か
らいわゆる脂肪乳剤の調製に際し通常用いられている製
薬学的に許容される油脂類が包含され、大豆油、綿実油
、菜種油、サフラワー油などの植物油：通常ＭＣＴと称
されている炭素原子数８ないし１２の中鎖脂肪酸（例え
ば、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸など）のトリ
グリセリド；および炭素原子数６ないし１８の脂肪酸（
例えば、カプロン酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パル
ミチン酸、リノール酸、ステアリン酸など）のジ−もし
くはモノグリセリドから選択される少なくとも１種であ
り、これらは単独であるいは２種以上組合わせて使用す
ることができる。これらの中で特に、大豆油、バナセー
ト８１゜（日未油脂株式会社製、ＭＣＴの混合物）が好
適に使用される。

また乳化剤としては、生理学的に許容されるリン脂質お
よび非イオン系界面活性剤から選択される少なくとも１
種が使用され、このようなリン脂質としては、卵黄リン
脂質、大豆リン脂質、ホスファチジルコリン、ホスファ
チジルエタノールアミン等が挙げられる。また、非イオ
ン系界面活性剤としては、例えばポリオキシアルキレン
共重合体、硬化ヒマシ油ポリオキシアルキレン誘導体が
包含される。

一方、本発明で使用されるＳＯＤとしては、ヒト、ウシ
、ラット等の動物、植物および細菌など由来ｃ７）Ｆｅ
−ＳＯＤ、　Ｍｎ−３ＯＤ、　Ｃｕ、−Ｚｎ−ＳＯＤの
他、遺伝子組変えによって得たＳＯＤなどが挙げられる
。

本発明におけるスーパーオキザイドジスムターゼ結合す
ビッドマイクロスフェアーにあっては、その結合はＬＭ
Ｓに使用される乳化剤、ならびにＳＯＤ中での反応性窒
素原子との間でその鎖中に−８−または−ＳＳ−結合を
介して架橋結合したものであるが、該架橋結合としては
次式； ％式％ （ＡおよびＢは同一または異なり結合残基を示す、） で示される架橋結合である。

その中でも特に次の（ａ）　、　（ｂ）　；（ａ）　　
−Ｃ：０−（ＣＨ２）２−ＳＳ−ＣＨ２ＣＯ−−ＣＯ−
（ＣＨ２）２−ＳＳ−（ＣＨ２）２ＣＯ−で示される架
橋結合が好ましい。

上記した架橋結合の形成は、例えばＬＭＳの乳化剤に結
合する一Ｇｏ−Ａ−５ＲとＳＯＤに結合する一Ｃｏ−Ｂ
−３Ｒ（Ｒは反応性脱離基を示す、）との縮合により行
なわれる。

この場合に使用される架橋剤としては、種々の蛋白架橋
剤、例えばトサクシイミジル−３−（２−ピリジルジチ
オ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ−サクシイミジル
−９−アセチルチオアセテ−）　（ＳＡＴＡ）、Ｎ−サ
クシイミジル−４−（ｐ−マレインイミドフェニル）フ
チレート（ＳＭＰＢ）、厘−マレイミドベンゾイル−Ｎ
−ヒドロキシサクシイミドエステル等が挙げられる。

これらの架橋剤は、所望の架橋結合を形成するために任
意の組合せで使用することができるが、架橋結合として
、前記（ａ）における次式；％式％） を形成させるためには５ｐｏｐをＳＯＤおよびＬにＳの
架橋形成剤として用い、また架橋結合として次式；％式
％ を形成させるためには、ＳＯＤの架橋形成剤として５Ａ
ＴＡ、　ＬＭＳの架橋形成剤として５ＰＤＰを選択する
ことになる。

また前記（ｂ）におけるそれぞれの架橋結合を形成させ
るためにはＳＯＤの架橋形成剤として５ＡＴＡ、ＬＭＳ
の架橋形成剤としてＳＭＰＢ、またはｍ−マレイミドベ
ンゾイル−Ｎ−ヒドロキシサクシイミドエステルを選択
することになる。

なお、上記の５ＡＴＡは、Ｓ−アセチルチオ酢酸および
Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドを原料として脱水条件下
で反応させることにより得ることができ、他の架橋剤に
ついても市販のものを使用することが出来る。

以下に本発明の架橋方法について更に詳細に説明すると
、先ず、ＬＭＳについては乳化剤としてのリン脂質であ
るホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）あるいはこ
れより誘導されるジパルミトイルホスファチジルエタノ
ールアミン（ＤＰＰＥ）を用い、このＰＥあるいはＤＰ
ＰＨに架橋剤である５ｐｏｐまたはＳＭＢＰを結合させ
、結合物である（２−ピリジルジチオ）プロピオニル−
ホスファチジルエタノールアミン（ＰＤＰ−ＰＥ）ある
いは（ｐ−マレインイミドフェニル）ブチオニル−ホス
ファチジルエタノールアミン（ＭＢＰ−ＰＥ）を製造す
る０次いで、これらのＦＤＰ−ＰＥあるいはＭＢＰ−Ｐ
Ｅを用い油脂と必要に応じて乳化補助剤、安定化剤等な
どの添加物とを混合し、加熱して溶液とし、通常のホモ
ジナイザーにより均質化することにより、脂肪乳剤中に
均質に分散するＬＭＳに架橋剤の残基が結合したＬＭＳ
−ＦＤＰあるいはＬＭＳ−ＭＢＰを製造する。

一方、　　ＬＭＳに外的に結合させるＳＯＤの場合には
蛋白架橋剤である５ｐｏｐあるいは５ＡＴＡｔ−９ＯＤ
と反応させ、　ＳＯＤに（２−ピリジルジチオ）プロピ
ネート基あるいはアセチルチオアセチレート基を導入す
る。導入、にあたっては、ＳＡ　ＴＡあるいは５ＰＤＰ
をＳＯＤに対し等モル以上すなわち、本発明のＬＭＳに
外的に結合するＳＯＤのモル比によりｌないし２０モル
好ましくは２ないし６倍モルを用い、好ましくは室温で
反応させる０次いで５ＡＴＡを用いた場合には、反応生
成物をカラムクロマトグラフィーに付し、ＳＯＤのアセ
チルチオアセチレ−１・化物、すなわち５ＯＤ−ＡＴＡ
とする。この生成物、５ＯＤ−ＡＴＡを脱アセチル化し
てチオアセテート化合物、すなわち５ＯＤ−ＴＡとする
。なお、脱アセチル化は、常法で行なわれ、例えば塩酸
ヒドロキシルアミン、ヘベス（Ｈｅｐｅｓ）バッフγ−
１ＥＤＴＡなどを用い中性下、室温で反応させることに
よりなされる。かくして一方の架橋用反応物であるＳＯ
Ｄのチオアセテート化物、すなわち５ＯＤ−ＴＡが得ら
れるのである。

一方、５ｐｏｐを用いた場合には、得られた反応生成物
を上記と同様カラムクロマトグラフィーに付し、ＳＯＤ
の（２−ピリジル）ジチオプロピネート化合物、すなわ
ち５ＯＤ−ＦＤＰとし、この生成物における（２−ピリ
ジル）チオ基を還元的に脱離し、同様の架橋用反応物で
あるＳＯＤのチオプロピネート化物、すなわち５ＯＤ−
ＴＰが得られる。

なお、還元はジチオスレイトール等の還元剤を用いる還
元で行なわれるが、本発明にあっては次のステップにお
けるＳＯＤのＬＭＳへの結合率を考慮した場合、該還元
手段を回避した方が良く、特に上記の５ＡＴＡを使用し
た方が好ましいことが判明した。しかしながら５ＰＤＰ
の使用を除外するものではないことは言うまでもない。

しかるのち、上記でそれぞれ得たＬＭＳ架橋用反応物で
あるＬＭＳ−ＰＤＰ、　ＬＭＳ−ＭＰＢ　、あるいはＬ
ＭＳ−ＭＢと、ＬＭＳの表面に外的に結合するべきＳＯ
Ｄの架橋用反応物である５ＯＤ−ＴＡあるいは５ＯＤ−
ＴＰの両者をカップリングし、架橋結合を形成すること
により本発明のスーパーオキサイドジスムターゼ結合リ
ピッドマイクロスフェアーおよび該リピッドマイクロス
フェアーを含有する脂肪乳剤を製造することが出来る。

なお、カップリングにあたっては、両者をおだやかな条
件下、例えば室温でゆるやかに攪拌することにより行な
われる。

以上の本発明の製造方法を式で示すと、以下の通りにま
とめることができる。

（１）架橋剤５ＡＴＡを用いる場合： （ＳＡＴＡ） Ｓｏｎ−ＮＨＣ：ＯＣＨ５ＣＯＣＨ→　５ＯＤ−ＮＨＣ
：０ＣＩＬ２Ｓｔ（（ＳＯＤ　−ＴＡ　） （２）架橋剤５ＰＤＰを用いる場合： （ＳＰＤＰ） （ＳＯＤ−ＴＰ） ２、　　ＬＭＳ　　　　　　　　・　　　ＬＭＳ−ＰＤ
Ｐ　　　　２（ＰＥおよび５ＰＤＰを用いた場合） （ＳＰＤＰ） （１）上記１の（１）で得た５ＯＤ−ＴＡおよび２で得
たしＭＳ−ＦＤＰを使用する場合： →　ＬＭＳ−ＮＨ−（：０−（ＣＩ（）　−５−９−Ｃ
：Ｈ２−ＣＯ−Ｎ）ｉ−ＳＯＤ（２）同様上記１の（２
）で得た５ＯＤ−ＴＰを用いる場合には； ＬＭＳ−ＮＨ−ＣＯ−（０Ｍ２）２−９−Ｓ−（ＣＨ２
）２−ＣＯ−ＮＨ−９ＯＤが生成する。

なお、他の架橋結合を有するものもこれに類した製法で
得ることができる。

ところで、上記の製法におけるＬＭＳの製法は、脂肪乳
剤中に分散された状態でのリピッドマイクロスフェアー
の製法として把握されるが、リピッドマイクロスフェア
ーのみを分取するには適当な孔径を有する透析膜（例え
ばメンブランフィルタ−等）を用い濾取することにより
行なうことができる。しかしながら、本発明のＬＭＳに
あってはこれが脂肪乳剤中に分散した状態で目的の治療
に使用することができるものである。

したがって、本発明はまた上記の如くして得たスーパー
オキサイドジスムターゼ結合リピッドマイクロスフェア
ーを含有する脂肪乳剤に関するものでもある。

この場合の脂肪乳剤は、前記したＬＭＳ−ＦＤＰの製法
における記載の如く、ＰＥ−ＰＤＰ、　ＰＥ−ＭＰＢあ
るいはＰＨ−ＭＢを用い、油脂と必要に応じて乳化補助
剤、安定化剤等の添加物とを混合し、加熱して溶液とし
、通常のホモジナイザー等の手段により得ることができ
るが、その詳細を記すと以下の如く製造される。

すなわち、前記の如くして得たＰＨ−ＰＤＰ、　ＰＥ−
ＭＰＢあるいはＰＥ−ＭＢを用い、油脂と必要に応じて
乳化補助剤、安定化剤等の添加物とを混合し、加熱しテ
均−溶液とし、次いでホモジナイザーで処理し、粗乳化
液を調製し、しかる後これを加圧型ホモジナイザー、例
えばマントン−ゴーリン型ホモジナイザーにより均質化
することにより、本発明の乳剤を得ることができる。

なお、この場合に使用する安定化剤としては、コレステ
ロール、トコフェロール、アルブミン又はその脂肪酸ア
ミド誘導体、多糖類またはその脂肪酸エステル誘導体等
が使用され、乳化補助剤としては、例えば炭素数１０な
いし２０程度の脂肪酸（例えば、ステアリン酸、バルミ
チン酸、リノール酸、リルン醜なと）およびその塩（例
えばナトリウム、カリウム塩など）が挙げられる。

これらの配合量は０．１ないし３．０＄（ｗ／マ）の範
囲で所望の量が使用される。

かくして本発明の脂肪乳剤が得られるが、得られる脂肪
乳剤の平均粒径は０．５ミクロン以下であった。

［実施例］ 以下に、本発明を実施例にて更に詳細に説明する。

実施例１　：　　ＳＯＤ架橋用反応物の製法（Ａ）　　
ＳＯＤ　　ＳＡＴ　　　　　　：　ＳＯ［１−ＡＴＡの
　法ＳＯ０５ｍｇ（８０ｇ　Ｍ）の０．０５モルＰＥバ
ー、ｐ　７　ｙ　−（５０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４−Ｎａ２
ＨＰＯ４、ｆ　ＥＤＴＡの組成でｐＨ７，５テある。）
２１の溶液に、５ＡＴＡのそれぞれ８０，１６０．３２
０　、８４０および１．２８０１ＬＨ（ＳＯＤと５ＡＴ
Ａの比はそれぞれ１：１　、１：２　、１＋４　、　ｌ
：８および１：１８に相昌する。）の各２０１Ｌｌジメ
チルホルムアミド溶液を加え、室温下に１０分間攪拌を
行ない、インキュベーションを行なった６次いで反応液
にｐＨ７，８の３００＋ｗＭ　）リスー塩酸バッファー
からなる反応停止液０．５１を加え反応を停止し、セフ
ァデックスＧ２５のカラムに付し、前記と同一のＰＥバ
ッファー３．５１で溶出することにより未反応の低分子
物質を除去し、目的とする５ＯＤ−ＡＴＡ含有溶液３．
５１を得た。

この溶液における５ＯＤ−ＡＴＡのＳＯＤ活性測定を以
下のとおり行なった。

すなわち、セファデックスＧ２５処理後（注：この方ラ
ム処理により反応に使用したＳＯＤがほぼ定量的に溶出
されることが確認された。）の溶液３．５ｍｌに　１．
５１の蒸留水を加え全量５１とし、これを３００倍希釈
し、その０．１１をサンプリングしＳＯＤ活性測定に供
した。

活性はチトクロムＣ酸化反応の阻害率で表わし、チトク
ロムＣ酸化速度は５５０ｎ曹における吸光度の増加率Δ
Ａ５ｏｏ／ｌ１ｌｎにて測定した。

なお、標準のＳＯＤ活性の対照として、上記の処理にお
いてＳＡ　ＴＡを加えないＳＯＤ　５ｍｇの０．０５モ
ルＰＥバッファー溶液２１を同様処理し得た溶液を、そ
のＳＯＤの活性保持率１０ｏｚとし、それを基準とした
各サンプルの活性保持率を求めた。

また、ブランクの値はΔＡ５ｏｏ／ｗｉｎ　＝　０．０
２５であった。

結果を次表１にまとめる。

表　　１ 以上の結果から判明するように、ＳＯＤと５ＡＴＡの結
合においてＳＡ　ＴＡをそれぞれ１８倍モルまでの量で
ＳＯＤに結合させたとしても、ＳＯＤ活性はなんら失活
していないことが理解される。

（Ｂ）　５ｏｎ−ＡＴＡの　アセチルヒ：　５ＯＤ−Ｔ
Ａの上記（Ａ）で得たセファデックスＧ２５の処理溶液
３．５ｍｌのそれぞれに１．５１の蒸留水を加えた全量
５１溶液を用い、このうちの１ｍｌ　（注：この　１１
溶液中には当初使用したＳＯＤが１ｍｇ含有されている
ことになる。）を採り、この溶液にヘベスバッファー（
０゜５Ｍの塩酸ヒドロキシルアミン、０．５ｙのへペス
、２５ｄのＥＤＴＡの組成で、１０８−水酸化ナトリウ
ムでｐＨ７，０に調整したもの、　）　０．ｔｍＸを加
え、室温で３０分間攪拌を行ない脱アセチル化し、目的
とする５ＯＤ−ＴＡを含有する溶液１．１ｓ＋１を得た
。

この溶液における５ＯＤ−ＴＡのＳＯＤ活性を前記（Ａ
）の方法に準じ求めた。活性は、同様チトクロムＣ酸化
反応の阻害率で表わし、ＳＯＤ活性保持率をＳＯＤのみ
を処理したＳＯＤ活性を１００　＄として、各サンプル
毎に求めた。

結果を次表２に示す。

表　　２ 以上の結果から判明するように、前記（Ａ）で得たＳＯ
Ｄ活性をそのまま保持する５ＯＤ−ＡＴＡを脱アセチル
化反応し５ＯＤ−ＴＡとし、ＳＯＤにチオアセチレート
基を導入した場合もＳＯＤ活性はなんら失活していない
ことが理解される。

上記の方法により、本発明のスーパーオキサイドジスム
ターゼ結合リピッドマイクロスフェアーを構成する一方
の架橋用反応物である５ＯＤ−ＴＡを得ることができる
。なお、架橋剤として５ＰＤＰを用いる場合も同様の操
作に準じて架橋用反応物であるＳＯＤにチオプロピネー
ト基が導入された５ＯＤ−ＴＰを、なんらＳＯＤ活性が
失活されることなく製造することができる。

かくして得られた架橋用反応物は、　ＳＯＤ　１モルに
対してＳＡ　ＴＡをそれぞれ１．２．４．８および　１
６モル比で結合させた場合の操作であるが、この場合Ｓ
Ａ　ＴＡの反応モル比に応じＳｏｏ　１分子あたりＳＨ
基（チオアセチレート基に相当する。）がどの程度導入
されたかを検討した。

（Ｃ）゛の　けるＳ）ｌ　　−の・ Ｅｌ１ｍａｎ法に準じ、その操作の一部を改変して行な
った。

（ｉ）　　　システィンのＳＨ基の測定に基づく検量線
のの作成 システィンのそれぞれ０．１００　、２００　、２５０
．４００　、５００　オＪ：び１，０００ｐＭ　（７）
ＰＥＰＥバー／７７−（前記のＰＥバー２フアー、反応
停止液およびヘベスバツフア−を２４０：４０：２８の
比で混合したもの、）を各０，３１取り、これに　２．
７１の同様のＰＥＰＥバッファーを加えて２５℃にて１
０分間インキュベートした。これに０．０１Ｍ　ＤＴＮ
Ｂ溶液（５，５’〜ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）
　３９．１３＋＋ｇを０．０５Ｍ　　Ｋ２ＨＰＯ４−Ｋ
Ｈ２ＰＯ，のｐＨ７，０バツフアー１０ｓ＋１に溶解し
て調整、〕を２５ＪＬｌ加え、さらに同温にて５分間イ
ンキュベートし、その溶液の４１２ｎｍにおける吸光度
を測定した。

その結果、良好な直線性の検量線を得ることができた。

この検量線を用い、各５ＡＴＡのモル比の反応により得
た５ＯＤ−ＴＡのＳＨ基の基数の測定を以下のとおり行
なった。

（ｉｉ）　　前記（Ａ）および（Ｂ）の操作に従ってＳ
ＯＯと５ＡＴＡの各モル比に応じて得た５ＯＤ−ＴＡを
含有する１、Ｉｎ＋、！溶液に、前記（ｉ）と同様のＰ
ＥＰＥバッファー１．９ｍｌ　を加え全量を３１とし、
２５℃で１ｏ分間インキュベートする０次いで（ｉ）と
同様に２５鉢１の０．０１Ｎ　ＤＴＮＢ溶液を加え２５
℃で５分間インキュベートし、その溶液の４１２Ｊ１！
ｌにおける吸光度を測定した。得られた吸光度より、前
記（ｉ）で得た検量線を用い、５ＯＤ−ＴＡのＳＯｏ　
１分子あたりのＳＨＩの基数を計算した。

ＳＯＤとＳＡ　ＴＡの各反応モル比に応じたＳＨＩ　（
チオアセチレート基）の導入数の結果は次表３の如くま
められる。

以上の結果から判断すると１本発明のスーパーオキサイ
ドジスムターゼ結合リピッドマイクロスフェアーを得る
場合のＳＯｏ側の架橋用反応物を得るにあたっては、　
ＳＯｏ　１モル当り結合させるべき５ＡＴＡのモル数を
それぞれ増加して行なった場合、それに応じて導入され
るＳＨ基（チオアセチレート基）が増加することが判明
する。

実施例２：ＬにＳ架橋用反応物の製法 （Ａ）　　旺ユ吐Ｊ１１ １０ｇＭのジパルミトイルホスファチジルエタノールア
ミン（ＤＰＰＥ）のクロロホルム−メタノール（９：１
）混合溶液に、１２ＩＬ１１１のＳＰ［ｌＰおよび２０
１Ｌｌ’ｌのトリエチルアミンを加え、２時間室温で攪
拌して。

ＤＰＰＥと５ｐｏｐとの結合物であるＰＥ−ＦＤＰを得
た。

（Ｂ）　　ＬＨ上ヱ吠二１丑 上記（Ａ）で得たＰＨ−ＰＤＰ　８０■ｇをクロロホル
ム１ｇに溶解させる３次いでこの溶液に精製大豆リン脂
質４．８ｇおよびグリセリン１０ｇを加えて加温し、ク
ロロホルムを除去させる。さらに日周大豆油４０ｇを加
え、加温しながら激しく攪拌、分散後、適当量の蒸留水
を加えてホモジナイザーで攪拌し、粗乳化液を調製する
。この粗乳化液をマントン−ゴーリン型ホモジナイザー
により高圧乳化させた後、蒸留水を加えて２００１とす
ると、ＰＥにＰＤＰが結合したＰＥ−ＰＤＰを０．０４
　％含有する脂肪乳剤が得られた。

氷晶はこのまま次の５ＯＤ−ＴＡとの架橋反応に付した
。

ＬＭＳ−ＮＨ−ＣＯ−（Ｃ１２）２−Ｓ−Ｓ−ＯＨ２−
Ｃ：０−ＮＨ−ＳＯＤ実施例１においてＳＯＤ：５ＡＴ
Ａを１：５のモル比で反応させて得た５ＯＤ−ＴＡ　１
ｍｇを含有するＰＥＰＥバッファー０．５ｍｌ溶液に、
上記実施例２で得たＰＥ−ＰＤＰを０．０４　％含有す
る脂肪乳剤０．５１を加え、室温にて２時間インキュベ
ートすると、ＳＯＤとリピッドマイクロスフェアーが−
ＳＳ−共有結合を介して架橋結合した、標記のリピッド
マイクロスフェアーを含有する脂肪乳剤１１が得られる
。

なお、５ＯＤ−ＴＰを用いた場合も同様ＳＯＤを結合し
たリピッドマイクロスフェアー含有脂肪乳剤を得ること
が出来た。

以上説明した様に、本発明方法を用いることにより、ス
ーパーオキサイドジスムターゼをリピッドマイクロスフ
ェアーの表面に、−５−Ｓ−共有結合を介して外的に架
橋結合した、スーパーオキサイドジスムターゼ結合リピ
ッドマイクロスフェアー（ＬＭＳ−ＳＯＤ）ならびに該
リピッドマイクロスフェアーを含有する脂肪乳剤を得る
ことができる。

かくして得られるＬＭＳ−ＳＯＤのＳＯＤの結合率、安
定性試験について検討した。それらの結果は以下のとお
りであった。

Ｉ　　：　　ＬＭＳ−９ＯＤに　け　　ＳＯＤの　　゛
前記実施例３で得たＬＭＳ−ＳＯＤを含有する脂肪乳剤
におけるＳＯＤの結合率を測定する。

測定は高速液体クロマトグラフィー（島原製作所製、Ｌ
Ｃ−８Ａ、５ＰＤ−６０，ＣＲ３Ａ）で行なった。

測定条件： カラム：　　ＴＳＫゲルＧ２０００Ｓ讐モービル：　　
０．０２Ｍ　ＫＨ２ＰＯ４吸光度：２７０ｎｍ 流　　　速　：　　１．Ｑｍｌ／ｗｉｎＩｎｊ−ｖａｔ
　：　２０　ｇ　１ 結合率（１）は、加えた５ＯＤ−ＴＡのチャート上の面
積（Ａｒｔ）に対するＬＭＳ−ＳＯＤ中に存在する遊離
ＳＯＤのチャート上の面積（Ａｒ２）の差の比率で、下
記式％式％ その結果、ＳＯＤのＬＭＳに対する結合率は７５ｚであ
った。

■　：交ＸＪｌ＝ス瀞 前記実施例３で得たＬＭＳ−ＳＯＤを含有する脂肪乳剤
中の粒子径の経時的安定性を、室温下で１週間測定した
。経時的に放置した脂肪乳剤中の粒子径の変化は次表４
のとおりであった。

なお、測定は光透過式粒度分布計（堀場製作所製、ＣＡ
ＰＡ−５００）で行なった。

表　　４ 以上の結果から判断すると、本発明のスーパーオキサイ
ドジスムターゼ結合リピッドマイクロスフェアーは、良
好にＳＯＤを外的に結合するとともに、その安定性も優
れたものであることが理解される。

［発明の効果］ 以上の様に、本発明のスニバーオキサイドジスムターゼ
結合すビッドマイクロスフェアーは、その特有の生理活
性が期待されるＳＯＤを効率よく投与し得る製剤として
特に優れるものであって、したがって、本発明は医薬品
として価値は多大なものであるといえる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、スーパーオキサイドジスムターゼをリピッドマイク
   ロスフェアーの表面に外的に結合し、前記スーパーオキ
   サイドジスムターゼとリピッドマイクロスフェアーの結
   合が、−Ｓ−または−ＳＳ−共有結合を介して架橋結合
   した； ことを特徴とするスーパーオキサイドジスムターゼ結合
   リピッドマイクロスフェアー。 ２、前記リピッドマイクロスフェアーが、油脂および乳
   化剤よりなる特許請求の範囲第１項に記載のスーパーオ
   キサイドジスムターゼ結合リピッドマイクロスフェアー
   。 ３、油脂が、植物油、炭素原子数８ないし１２の中鎖脂
   肪酸のトリグリセリドおよび炭素原子数６ないし１８の
   脂肪酸のジ−もしくはモノグリセリドから選択される少
   なくとも１種であり、乳化剤がリン脂質および非イオン
   系界面活性剤から選択される少なくとも１種である特許
   請求の範囲第２項に記載のスーパーオキサイドジスムタ
   ーゼ結合リピッドマイクロスフェアー。 ４、架橋結合が、リピッドマイクロスフェアーおよびス
   ーパーオキサイドジスムターゼにそれぞれ存在するアミ
   ノ基を介し結合する、次式； −ＣＯ−Ａ−ＳＳ−Ｂ−ＣＯ− または −ＣＯ−Ａ−Ｓ−Ｂ−ＣＯ− （ＡおよびＢは同一または異なり結合残基を示す。） で示される架橋結合である特許請求の範囲第１項ないし
   第３項のいずれか１項に記載のスーパーオキサイドジス
   ムターゼ結合リピッドマイクロスフェアー。 ５、前記架橋結合が、−ＣＯ−（ＣＨ＿２）＿２−ＳＳ
   −ＣＨ＿２ＣＯ−または−ＣＯ−（ＣＨ＿２）＿２−Ｓ
   Ｓ−（ＣＨ＿２）＿２ＣＯ−である特許請求の範囲第４
   項に記載のスーパーオキサイドジスムターゼ結合リピッ
   ドマイクロスフェアー。 ６、（ａ）スーパーオキサイドジスムターゼ、 （ｂ）油脂、 （ｃ）乳化剤、および （ｄ）水 からなる脂肪乳剤であって； スーパーオキサイドジスムターゼをリピッドマイクロス
   フェアーの表面に外的に結合し、 前記スーパーオキサイドジスムターゼとリピッドマイク
   ロスフェアーの結合が、−Ｓ−または−ＳＳ−共有結合
   を介して架橋結合した； スーパーオキサイドジスムターゼ結合リピッドマイクロ
   スフェアーを含有することを特徴とする前記脂肪乳剤。 ７、油脂が、植物油、炭素原子数８ないし１２の中鎖脂
   肪酸のトリグリセリドおよび炭素原子数６ないし１８の
   脂肪酸のジ−もしくはモノグリセリドから選択される少
   なくとも１種であり、乳化剤がリン脂質および非イオン
   系界面活性剤から選択される少なくとも１種である特許
   請求の範囲第６項に記載の脂肪乳剤。 ８、架橋結合が、リピッドマイクロスフェアーおよびス
   ーパーオキサイドジスムターゼにそれぞれ存在するアミ
   ノ基を介し結合する、次式； −ＣＯ−Ａ−ＳＳ−Ｂ−ＣＯ− または −ＣＯ−Ａ−Ｓ−Ｂ−ＣＯ− （ＡおよびＢは同一または異なり結合残基を示す。） で示される架橋結合である特許請求の範囲第６項または
   第７項に記載の脂肪乳剤。 ９、前記架橋結合が、−ＣＯ−（ＣＨ＿２）＿２−ＳＳ
   −ＣＨ＿２ＣＯ−または−ＣＯ−（ＣＨ＿２）＿２−Ｓ
   Ｓ−（ＣＨ＿２）＿２ＣＯ−である特許請求の範囲第８
   項に記載の脂肪乳剤。