JPH06500570A - 生分解性粒状ベクター及び合成法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 生分解性粒状物ベクター及び合成法 技術分野 本発明は、生物学的活性を有する分子を輸送するのに有用である生分解性粒状物 ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）に関する。

更に本発明はこのベクターの合成法及び活性原体（ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ）のベ クターへのカプセル化法に関する。

背景の技術 そのようなベクターは、活性化合物を、生物学的又は生化学的系内に導入し又は 該内で反応させるのに使用される方法の１つを構成する。確かにベクターは、そ のような化合物をカプセル化する際に、それを、正常なその異化作用剤から保護 すること及びそれを、ベクターがそれを遊離する活性部位に運搬することを可能 にしなければならない。

リン脂質二重層で取り囲まれた水性空胞からなるリポソームはこの目的に使用さ れてきた。しかしながら、そのような輸送系は、リポソームの壊れやすさ、その 不均質性、及びその工業的規模での製造の複雑性のために多くの制限をもつ。更 にその輸送能力は限定される。

他の解決策は、ＰＣＴ第ＦＲ／８９００２２９号に記述されている如き超分子バ イオベクター（又はＳＭＢＶ）を使用することにある。

そのようなベクターは、共有結合により核に結合している第１の脂質層で及び両 親媒性化合物の第２の外側ラメラ又は層で取り囲まれた架橋多糖類の中心核を含 んでなる。

これらのバイオベクターは非常に安定で且つ容易に親油化及び殺菌でき、またそ の構造は天然のベクターに非常に類似している。

これらのバイオベクターは、３つの領域、即ち極性の核、脂質コロナ及び両親媒 性外側ラメラの特性に従って、異なる化学的性質の活性原体をカプセル化するこ とができる。

しかしながら、これらのベクターはある不完全さを示す。確かにカプセル化しう る活性原体の量は比較的低量である。更に活性原体はバイオベクターの対応する 領域の合成時点でカプセル化しなければならず、特に核にカプセル化する活性原 体に対しては次の層の合成中に致命的な変化を受ける危険がある。

斯くして活性原体の構造的完全性を保存することを可能にする方法に従って、活 性原体を定量的収率で負荷することができ、しかも完全には生分解性且つ生体適 合性のままである粒状物ベクターの普及は望ましい。

発明の説明 上記々述は、本発明の主題が、 一イオン性リガンドがグラフトされている架橋された多糖類又はオリゴ糖類マト リックスからなる核、 一共有結合により核に結合している第１の半透過性脂質層、−疎水性相互作用に より第１の脂質層に結合している第２の両親媒性化合物層、 を含んでなることで特徴づけられる生分解性粒状物ベクターである理由である。

そのようなベクターは、活性原体の多糖類核内へのカプセル化を最適化しつる。

これらの性質は、多数の酵素的に加水分解しつるイオン性リガンドを、架橋した マトリックス上にグラフトすることによって得られる。斯（してかなりのイオン 性特性の付与された核に、続いて従来法の粒状物ベクターで観察されたものより もかなり優れたカプセル化性を与える。そしてそれはこれらのリガンドの及びマ トリックスの成分の適当な選択により完全に生分解性にさせることができる。

イオン性グラフト化は、安定性だけでなく、多糖類マトリックスの大きさにとっ て不利であってはならない。これらのリガンドは斯（して好ましくは天然に生体 に存在し且つ酵素的に加水分解しうる結合によって結合した生物学的分子から選 択されよう。

本発明の観点の１つによれば、マトリックスにグラフトされるリガンドは酸性化 合物である。これらの酸性リガンドは特にコハク酸、リン酸、クエン酸、グリシ ン、アラニン、グルタミン酸又はアスパルチン酸から選択することができる。

コハク酸は生体の天然成分であり、クレブス（Ｋｒｅｂｓ）サイクルに関与する 。これはジカルボン酸であって、多糖類マトリックスの水酸基と、生体内におけ るサタンニルエステラーゼの至る所での存在のために容易に生分解性しうるエス テル結合を形成しうる。斯くして多糖類マトリックスとのエステル官能基に含ま れない酸官能基は存在したままでイオン交換性を付与する。

ホスフェートも、究極的に生体に通常の官能基である。それは主にリガンド、糖 及びヌクレオチドとの会合で見出される。

モノヒドロキシ又はモノアミノ酸例えばクエン酸、短鎖アミノ酸及び酸性アミノ 酸もマトリックス上にグラフト化させることができる。

続（満足しつるカプセル化を可能にするのに十分なリガンドのカプセル化度を有 する核が存在することは有利である。このグラフト化度は糖単位当り１荷電に近 （なければならない。

例えば粒状物ベクターは、コハク酸を１．５グルコース残基当り凡そ１荷電に相 当する程度でグラフトし、或いはリン酸を１．５グルコース残基当り凡そ１荷電 に相当する程度でグラフトして得られる。

本発明の他の観点によれば、粒状物ベクターは、マトリックスにグラフトされる リガンドが酸性化合物を介してマトリックス上に固定される塩基性化合物である ということで特徴づけられる。

塩基性リガンドの生分解性グラフトを得るためには、本申請者は多糖類マトリッ クス及び塩基性化合物間に特にコハク酸が使用できることを発見した。コハク酸 の酸性官能基の１つは多糖類マトリックスと生分解性エステル官能基を生成する ために使用され、他の酸性官能基は塩基性化合物とエステル又はアミド官能基を 生成するために使用される。

好ましくはマトリックスにグラフトされる塩基性リガンドは、アシル化によりマ トリックスに固定された酸性化合物とアミド又はエステル結合を形成しつる官能 基を含む２官能性化合物である。

アシル化できる官能基は例えばヒドロキシル或いは第１級又は第２級アミン官能 基である。

アシル化できない他の塩基性官能基は例えば第３級又は第４級アミン官能基であ る。

塩基性リガンドは、特にコリン、ヒドロキシコリン、２−（ジメチルアミノ）エ タノール及び２−（ジメチルアミノ）エチルアミンから選択することができる。

３グルコース残基当り１荷電に相当するイオン性グラフト化度が観察できる。

それ自体生分解性の多糖類マトリックスは、デキストラン、殿粉、セルロース、 オリゴ糖及びその誘導体から選択される化学的に架橋した多糖類からなることで あってよい。

それは特に生分解性の多糖類例えば殿粉を２官能性試剤例えばエピクロルヒドリ ンで架橋することによって製造することができる。エピクロルヒドリン／グルコ ースの比を尾以下に保つ場合、得られるゲルはアミラーゼによって加水分解され る性質を保持する。しかしながら加水分解の動力学はこの比が増大し、尾に近ず いた時に低下した。この架橋した殿粉マトリックスの酵素による加水分解生成物 の分析は１０よりも大きい大きさの加水分解できないグルコースオリゴマーを明 示しなかった。

そのような架橋した殿粉マトリックスの投与は斯くして体から排除できないグル コース重合体を生成しない筈である。

生分解性のオリゴ糖又は多糖を、オキシ塩化燐又は燐酸の誘導体との直接的な反 応によって架橋することも可能である。本申請者は、ホスホジエステル結合の生 成によってホスホリル化多糖類の得られることを発見した。この場合、マトリッ クスは生成したホスフェートの酸性官能基を介して直接負の荷電を有するように 誘導される。

多糖類又はオリゴ糖類マトリックスを蛋白質又はペプチドのような化合物で架橋 することも可能である。使用しうる蛋白質の中では、ケラチン、コラーゲン、エ ラスターゼ、その誘導体及びその同族体を言及することが必要である。

本発明による粒状物ベクターの核は、架橋状態に、イオン性リガンドの性質に、 及びグラフト化度に依存しである孔性を有する。

本発明による粒状物ベクターの第１の半透過性脂質層は好ましくは種々の程度で 固定された天然の脂肪酸からなる。確かに、この脂質層の密度は制御されたアシ ル化により調節することができる。アシル化反応の制御は、反応物の化学量論量 を調節することにより又は反応の動力学を調節することにより行なうことができ る。低密度の脂質層は部分的にだけ疎水性の粒子を形成する。それからは、その 粒子が特に部分的水和性を有するということが結論される。しかしながら周囲に 配置された脂肪酸の存在は粒子を水性媒体中に自由に分散せしめず、弱（アシル 化された核は凝集が疎水性型の結合による凝集物の形で観察される。

好適な具体例において、本発明による粒子物ベクターは、第２の脂質層がリン脂 質又はセラミドからなることで特徴づけることができる。

この時粒状物は再び完全に分散せしめられる。しかしながらアシル化された核の 重量とリン脂質の重量との、最大の分散液を達成するための最適な割合は、完全 に疎水性の核の場合よりも第１の半透過性層を有する核の場合に大きい。

二重リン脂質ラメラはアシル化された核の周囲に形成させることができ、内部ラ メラは第１の脂質層の脂肪酸によって互いに入りこみ合っている。

本発明による粒状物ベクターは、生物学的活性を有する分子が核中に含まれるこ とで特徴づけることができる。

確かに本発明によるベクターは、核の孔性を利用して活性原体をカプセル化しつ る。この核は好ましくはｌＱｎｍ〜１０μｍの寸法を有する。

活性原体は半透過性層を通してイオン性多糖類核に入ることができる。

次いでそれはその電荷及び多糖類マトリックスの電荷間のクーロン結合の確立に よって安定化され、核内に維持される。

本発明による粒状物ベクターに含まれる生物学的活性を有する分子は好ましくは １００ダルトン〜５００キロダルトンの分子量を有する。

本発明の他の目的は、 ａ）生分解性の親水性重合体又はオリゴマーを架橋することによってマトリック スを製造し、 ｂ）イオン性リガンドを、酵素的に加水分解しうる結合によりマトリックス上に 固定してベクターの核を得、Ｃ）この核を超粉砕に供してｌＱｎｍ〜１０μｍの 寸法にし、ｄ）核を乾燥し、 ｅ）脂質化合物を、核の表面の反応性官能基に化学的に結合させて第１の層を生 成させ、 ｆ）両親媒性化合物を第１の層と疎水性接触により導入して第２の層を形成させ る、 １つ又はそれ以上の上述の特性を有する粒状物ベクターの合成法である。

親水性重合体、特に多糖類の架橋は同業者には公知の方法である。しかしながら 生分解性を保持し、好ましくは１０よりも大きい加水分解されないグルコースオ リゴマーからなる酵素による加水分解生成物を生成しないマトリックスを得るに は条件を整えなければならない。

イオン性リガンドは、得られる核上にイオン性特性を付与するのに十分な程度で 与えられねばならない。

コハク酸の場合、コハク酸のグラフトに対する最良の結果はコノ−り酸モノクロ ライドを用いることによって得られる。この反応物の新規な合成法は、次の方程 式 ％式％ に従うコハク酸ジクロライドと遊離のコノ１り酸との間の交叉塩素化反応を用い ることによって開発された。

この反応は行うのが容易であり、純粋で結晶性のモノクロライドを好収率で生成 する。

すでに言及した他の反応物に関して、この反応物の利点は、１）製造が非常に容 易なこと、 ２）特にヒドロキシルとの、非常に大きい化学的反応性、３）水への溶解性、 ４）有毒な反応副生物又は残渣のないこと、である。

本申請者は、この反応物の使用がコノ＼り酸を好収率で且つ非常に穏和な反応条 件（０℃、ｐＨ６，５）下に多糖類（ＰＳ）マトリックス上にグラフトさせうる ことを発見した。１．５グルコース残基当り１荷電に相当するイオン性グラフト 化度が特に達成できる。

ＰＳ−ＯＨ＋　ＣＩＣ０−（ＣＨ２）２−Ｃｏｏｎ　ＰＳ−０−Ｃｏ−（Ｃ１１ ２）２−Ｃ００１０℃、ｐＨ６，５ この反応は、例えば無水コノ）り酸を用いる通常の技術で観察されるものと対比 して多糖類マトリックス上にグラフト化されたリガンドを規則的に分布させるこ とが可能である。

ホスフェートのＰＳマトリックス上への結合は通常オキシ塩化燐（ＰＯＣｌ２） の、２Ｎ　ＮａＯＨの存在下における多糖類マトリックスとの反応を含む。しか しながらこの記述した反応条件の場合、６つのグルコース残基当り１つより大き い負荷電を与えるイオン性グラフト化度を得ることは可能でなかった。本申請者 は、この反応の効率が低温で行うことにより、また反応中の温度及びｐＨの反応 条件を制御することによりかなり改善できることを示した。斯くして１．５グル コース残基当り１荷電に相当するグラフト化が達成される。

他の観点において、本発明は段階ａ）及びｂ）がオキシ塩化燐の架橋能力のため に同時に行いうることでも特徴づけられる。確かにオキシ塩化燐は、反応条件の 適当な制御により架橋と負荷電の導入を同時に行うことを可能にする２つの多糖 類間にホスホジエステル結合を形成する能力をもつ。

塩基性リガンドをマトリックス上にグラフトさせたい場合、塩基性リガンドの最 適な調製法は以下の通りである。

塩基性リガンドの生分解性グラフトを得るためには、多糖類マトリックスと塩基 性リガンドとの間の中介化合物としてコハク酸を用いることができる。

この反応はコハク酸ジクロリドを２官能性化合物と化学量論的に反応させること によって行われる。反応性酸クロリド官能基及び塩基性の第３級又は第４級アミ ン官能基を有する結合生成物が得られる。

ＣＩＣ０（０１２）２−ＣＯＣＩ　＋　ＮＯ３−（ＣＨ２）２−Ｎ（ＣＨ３）２ →ＣＩＣ０−（Ｃ１１２）　２−ＣＯＮＦＩ−（ＣＨ２）　２−Ｎ（ＣＨ３）　 ２ 塩基性官能基は、反応物を水に溶解させることを可能にし且つイオン交換性を提 供する。酸クロライド官能基は、グルコシドマトリックスのヒドロキシルにグラ フト反応を行うことを可能にする。

これらの反応物を用いると、１５グルコース残基当り１つの、又は更に３グルコ ース残基当り１つの陽荷電に相当するイオン性グラフト化度を達成することがで きた。

上述の反応はモノヒドロキシ又はモノアミノ酸をグルコースマトリックスにグラ フトさせるためにも使用しつる。

すべての場合、多糖類マトリックスのイオン性グラフト化度は可変であり、特に カプセル化すべき化合物の種類に依存して調節されよう。グラフト化度が上述し た方法で得られる如き上述したものよりも低いベクターは使用可能である。

特に３グルコース残基当り１荷電程度のイオン性グラフト化度が使用されよう。

イオン性の核は、中性の多糖類マトリックスに対して使用されるものと類似の技 術例えば高圧押出し又は超音波法により超粉砕することができる。粒子の大きさ は、架橋特性及びコアのイオン性の状態に依存するゲルの硬さの状態及び超粉砕 条件を制御することによって調節しうる。

核の乾燥により、できるだけその凝集を回避しなければならない。これは特に段 階ｄ）を炭酸水素アンモニウムの存在下に行うことによって達成できる。

確かに凍結乾燥又は噴霧乾燥による乾燥操作中、脱水すべき懸濁液に炭酸水素ア ンモニウムを添加することによって凝集の程度を減することが可能である。この 高水溶性の化合物は、粒子間においであるイオン性力を効果的に維持し、それら が互いに近づ（のを防ぎ、斯（してその可能な凝集を防止する。この場合、揮発 性である炭酸水素アンモニウムは乾燥中に除去され、続く操作を妨害しない。炭 酸水素アンモニウムの使用は、炭酸水素塩の不存在下よりも非常に低い密度で特 徴づけられる粒状物粉末を与えることができる。本申請者は凝集現象の低下が粒 子のアシル化度及び粒子の疎水性の増大時に明白となることを発見した。

半透過性脂質層の合成は、多糖類の溶媒でない非プロトン性媒体中における多糖 類核のアシル化によって行われる位置選択的合成反応である。

本申請者は、この反応に有用な溶媒の中で、超臨界状態のＣＯ□を用いて段階ｅ ）を行うことができるということを発見した。

超臨界状態でのＣｏ２の使用は、この化合物が無毒性であり、反応雰囲気の圧力 を減することによって反応の終了時に完全に除去しうるからかなりの改良を提供 する。

更に本申請者は、脂質層の密度が制御されたアシル化によって減ぜられることを 見出した。アシル化反応の制御は反応物の化学量論量を制御し又は反応の動力学 を制御することによって行いつる。

更に本申請者は、特に非常に小さい（＜１０１００ｎ多糖類の核の場合、脂質グ ラフトの均質性は、再水和及び乾燥段階ｅ）により分離された２回又はそれ以上 の連続的なアシル化段階によって改善することができる。

凝集現象は、確かに小さい粒子の場合に排除するのがより困難である。

残存の凝集は粒子表面の不均質なアシル化をもたらし、多糖類核表面にアシル化 された部分とされてない部分が存在するようになる。

そのような粒子を水中に懸濁させた時、脂質部分は互いに付着して、アシル化さ れてない部分を再び露呈させる。

この場合第２のアシル化サイクルは、第１のサイクル中にアシル化されてなかっ た多糖類核の表面部分をアシル化することができる。

本発明の好適な観点の１つにおいて、粒状物ベクターの合成法は、段階ｅ）後及 び段階ｆ）後に生物学的活性を有する物質を核に含有させることで特徴づけられ る。

オリジナルな特許に記述されているＳＭＢＶの欠点の１つは、カプセル化後にア シル化反応を行う場合カプセル化された生成物を脂肪酸で誘導体化しつる可能性 である。

本申請者は、活性原体を、半透過性層を通してイオン性多糖類コアに入り込ませ 且つ斯くして活性原体の誘導体化を回避することができることを発見した。活性 原体が一度半透過性脂質層を通過すると、それはその電荷及び多糖類マトリック スの電荷間のクーロン結合の確立によって安定化され、核内に保持される。

更に実際的に定量的なカプセル化収率は、活性原体混合物（ｓ　ｉ　ｃ）を段階 ｅ）の終りに得られるアシル化された核と共に漸次水和することにある方法を用 いて達成できる。水和には、水、緩衝液、又は水／低級アルコール混合物を用い る。

カプセル化は、得られた活性原体の飽和濃度により及び水和によって誘導される 粒子の内部４分への液体の流れにより有利に行える。

生物学的活性を有する物質が非イオン性化合物である場合、本発明による方法は 、物質を核中に内包する前にイオン性電荷を該物質上に逆にグラフトさせること で特徴づけられる。

確かに本申請者は、極性の非イオン性活性原体が、これにイオン性電荷を逆にグ ラフトさせることによって核の内部にカプセル化できることを発見した。更に本 申請者はこの逆のグラフト化が、特に活性原体のヒドロキシルのコハク酸モノク ロリドとの反応により行いうることを発見した。斯くして負荷電を有する活性原 体のモノサクシネートが生成される。元の活性原体はサクシニルエステラーゼの 作用によって再生される。

Ｒｏｌｌ　＋　Ｃ１−ＣＯ−（ＣＨｔ）ｚ（：ＯＯＨ→Ｒ−０−ＣＯ−（Ｃ１ｌ ｚ）　ｚ−ＣＯＯＨ本発明による方法の用途の１つにおいて、本方法は段階ｆ） が段階ｅ）の終りに得られるアシル化された核の分散により、即ち核を活性原体 と一緒に随時トリグリセリド及びリン脂質を含む脂質媒体中に含有させることに より、次いでリパーゼで処理することにより段階ｆ）が行われることで特徴づけ ることができる。半透過性脂質層を有するコアの疎水性特性は、それをトリグリ セリドのような脂質環境に分散させつるに十分である。これらの分散液は安定化 された水／油乳化液と対比しつる。

本発明の方法の用途の他の例において、本方法は非常に小さい大きさく＜５０ｎ ｍ）の核の場合、段階ｆ）は段階ｅ）の終りに得られるアシル化された核を分散 させることにより、即ち核を活性原体と一緒に、但し該原体のモル濃度を臨界ミ セル濃度より大きい水性の透析しつる洗剤溶液中に分散させることによって行い つるということで特徴づけられる。

本申請者は、得られる懸濁液を、両親媒性化合物例えばリン脂質又はコレステロ ールと同一の洗剤溶液中で混合し、そして洗剤をＣＭＣ以下のモル濃度にもって 行（ために懸濁液の迅速な希釈によってＳＭＢＶを得、続いて厳しい透析段階に より洗剤が除去できることを発見した。

本申請者は、特に安定な方法でリン脂質層を、半透過性液体コロナを有する核の 周囲に確立しうることを示した。

このリン脂質の、アシル化された核との組合せ物は、対応するＳＭＢＶのクロマ トグラフィーによる分析及びコアに共有結合でグラフトされた又はリン脂質と組 合せられた蛍光マーカーのクロマトグラフィーでの展開において完全に重ね合わ せられることにより明らかにされる。

本申請者は、アシル化された核が更に油状化合物の組成物中に、特に乳化液中に 導入しうることを示した。斯くして得られる系は水／油／水のトリプル乳化液に 同等である。

更に本申請者は、油状部分が短鎖トリグリセリド、リン脂質及びアシル化された 核の混合物からなる油／水乳化液のリパーゼによる処理が、トリグリセリドの酵 素による加水分解及び透析後に、リン脂質で囲まれたアシル化された核からなる ＳＭＢＶの製造に至ることを発見した。

本発明による粒状物ベクターは、上述の特許に記述されている如く、いずれかの 種類の活性化学分子を導入するために用いることができる。

活性原体は例えば核中に導入される製薬学的及び／又は化粧品活性原体例えばケ ラチンであってよい。

次の実施例は本発明をいずれの具合にもその範囲を限定することなしに例示する ことを意図し、且つ本発明によるベクター中に導入することのできるある種の分 子を明示する。

実施例１−生分解性多糖類マトリックスの製造アミロペクチン［ロケット（Ｒｏ ｑｕｅｔｔｅ、Ｌｉ１ｌｅ、　Ｆｒａｎｃｅ）　］　５　Ｑ　Ｑ　ｇを、５１の 反応器中２Ｎ　ＮａＯＨｌｉ’に容解した。溶液は非常に均一であり、０．１当 量／グルコース残基に相当するエピクロルヒドリン［フル力（Ｆｌｕｋａ、　５ ｗ１ｔｚｅｒｌａｎｄ）　１２８　ｇを導入した。この添加が終った後、調製物 を更に１時間均一にし、次いで８時間放置した。次いで重合した殿粉の調製物を ２Ｎ酢酸の添加によってｐＨ７にもっていき、次いでらせん状の微粉砕器を用い て粗く分散させた。得られたゲルをブフナーで濾過し、次いですべての塩及び反 応副生物が除去されるまで蒸留水で数回洗浄した。凍結乾燥後に架橋したゲル４ ５０ｇ　（９０％）を得た。

実施例２−架橋した殿粉ゲルの酵素による分解実施例１による架橋した殿粉１ｇ をｐＨ６，９のホスフェート緩衝液５０ｍ１中に分散させ、バシルス（Ｂａｃｉ ｌｌｕｓ）　［シグマ社（ｓｉｇｍａ）コアミラーゼ２００単位と一緒にした。

この反応混合物を２０℃で１時間撹拌し、次いで９０℃に２分間加熱することに よって反応を停止させた。

反応混合物は透明になり、反応生成物を、完全に水性の移動相及び屈折率での検 出を用いるＣ１８カラムでのＨＰＬＣにより分析した。得られた結果を架橋され てない殿粉で得られたものと比較した。それは１０よりも大きい大きさのオリゴ マーのないことを示した。

実施例３−コハク酸のグラフトされたイオン性多糖類マトリックスの製造 ａ）コハク酸モノクロリドＣ１−Ｃｏ−（ＣＨｔ）　、−ｃｏｏｔｌの製造コハ ク酸５０ｇを、０℃に維持したＴＨＦ及びＤＭＦ　（９０／１０）の無水溶液５ Ｑｍｌに分散させた。化学量論量のコノ１り酸ジクロリドの化学量論量（６６ｇ ）を撹拌しながら漸次添加した。反応は熱の発生を伴い、従って温度を０℃以下 に保つために反応混合物を厳密に冷却した（ｓｉｃ）。次いで懸濁液中のコ／Ｘ り酸が完全に溶解するまで反応を継続した。コハク酸モノクロリドの漸次の沈殿 がコノ１り酸の溶解と同時に観察された。

反応の終了後、モノクロリドは無水の石油エーテル（１００ｍ４）の添加によっ て完全に沈殿し、これをブフナーでの濾過により反応混合物から分離した。沈殿 を無水石油エーテル１００ｍ１で洗浄し、デシケータ−中において減圧下に乾燥 した後、純粋なモノクロリド８０ｇを得た（収率７０％）。

ｂ）コハク酸モノクロリドの特性 元素分析 計算値　実験値（ｓｉｃ） Ｃ３５％　３６　％ ■　３．６％　３．４％ ０　３５　％　３６．５％ Ｃ１２６％　２４．１％ 赤外スペクトル：　３２００　ｃ　ｍ”　（ＳＸＯＨ）、１８００ｃｍ−’　（ Ｓ）（ＣＯＣＩ）。

コハク酸モノクロリドの、Ｎ−フェニルサクシンアミック酸（ＣＪｓ）−ＮＨ− ＣＯ−（ＣＨ２）　２−Ｃ０ＯＨの生成による特性コハク酸モノクロリド１００ ｍｇを無水アセトニトリル２ｍｌに溶解した。アニリン１．５当量（１０２ｍｇ ）を室温で添加し、反応混合物を３０分間撹拌し続けた。次いで０．００５Ｍ硫 酸１００ｍＪを添加し、溶液をエチルエーテル（３Ｘ　３）で抽出した。エーテ ル相を一緒にし、中性まで水洗し、次いで無水ＭｇＳＯ４で乾燥した。次いでこ のエーテルを濾過し、減圧下に蒸発させて、Ｎ−フェニルサクシンアミック酸９ ０ｍｇを得た。

クロマトグラフィーによる分析を、２５４ｎｍでのＵＶ検知器を用いる９μｍＣ ８，３，６ｃｍｘ４．６ｍｍ内径のカラムで行った。カラムを５ｍＭＴＦＡ移動 相及び５ｍＭＴＦＡ／アセトニトリル（３０／７０）移動相聞での直線的グラジ ェントにより展開した。このクロマトグラムは１３．５のに′で特徴づけられる 単一ピークの存在を示した。アニリン又はコハク酸のジアニリン誘導体の流出に 相当するピークは観察されなかった。

赤外スペクトルニ３３００ｃｍ−’　（ｓＸＯＨ）、１７７０　ｃｍ−’　（Ｓ ）（ＣＯＯＨ）、１６５０ｃｍ−’　（ＳＸＣＯＮ）。

元素分析 計算値　実験値（ｓｉｃ） Ｃ６２，５％　６４　％ Ｎ　７．３％　６．９％ Ｈ５，２％　５゜７％ Ｃ）コハク酸の、架橋した殿粉マトリックス上へのグラフト実施例１に従って製 造した架橋殿粉１００ｇを２ＭＮａＣ１溶液中に分散させ、０℃まで冷却した。

次いでこの穏やかに撹拌し且つｐＨ６，５及び０℃以下に保った分散液に、粉末 形のコハク酸モノクロリド（８５，３ｇ）を漸次添加した。次いで反応混合物を ２ＮＨＣ１の添加によってｐＨ２まで酸性にし、１時間撹拌した。得られたイオ ン性ゲルをブフナーでの濾過によって反応混合物から分離し、中性になるまで蒸 留水で数回洗浄した。凍結乾燥後、イオン性ゲル１１０ｇ　（収率７８％）を得 た。イオン性グラフト化度は、指示薬としてフェノールフタレンを用い、ゲルを ０，１ＭＮａＯＨ溶液で滴定することによって測定した。２．５グルコース残基 当り１負電荷が得られた。

実施例４−燐酸をグラフトした多糖類マトリックスの製造実施例１に従って得た 架橋殿粉１ｇをｐＨ１３，６の２ＭＮａＣ１溶液中に分散させ、０℃まで冷却し た。ｐＨを１３．５且つ温度を０℃に保ちながらオキシ塩化燐（１１４ｍＡ、１ ０４　ｇ）を漸次滴加した。添加の終了後、反応混合物を放置して室温に戻しつ つ更に２時間撹拌した。

次いで混合物を２ＮＨＣ１の添加によってｐＨ２まで酸性にし、１時間撹拌し、 ブフナーで濾過し、蒸留水で中性になるまで洗浄した。凍結乾燥後、イオン性ゲ ル１００ｇ　（収率９０％）を得た。得られたグラフト化度はフェノールフタレ ンを指示薬とする０、ＩＮ水酸化ナトリウム溶液での滴定により決定した。１． ５グルコース残基当り１負電荷が見出された。

実施例５−　Ｎ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］サクシナモイルをグラフト した多糖類マトリックスの製造ａ）Ｎ−［２−（ジメチルアミノ）エチルコサク シナモイルアミック酸Ｃ１−Ｃｏ−（ＣＨ２）　２−Ｃｏ−ＮＨ−（Ｃｌ１２） 　２−Ｎ（ＣＨ３）　２の製造コハク酸ジクロリド１５．４ｇを無水アセトニト リル１００ｍＡに溶解し、溶液を０℃で撹拌しつづけた。次いで無水アセトニト リル１００ｍ１中２−（ジメチルアミノ）エチルアミン１０ｇの溶液を滴下した 。

添加の終了後に温度を０℃に保ちながら反応混合物を３０分間撹拌した。

次いで結合した生成物が丸底反応フラスコ中に沈殿した。すべての生成物が沈殿 した時、これをブフナーでの濾過により反応混合物から分離し、冷アセトニトリ ルで数回洗浄し、次いでデシケータ−中で減圧下に乾燥し、純粋な生成物１８ｇ （収率８４％）を得た。

元素分析 計算値　実験値（ｓｉｃ） Ｃ４６，７％　４８　％ Ｎ　１３．６％　１２．５％ Ｈ６，８％　７４６％ ｂ）Ｎ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］サクシンアミック酸の、グルコシド マトリックスへのグラフト化 実施例１による架橋殿粉１ｇを、ｐＨ６，５及び０℃で撹拌し続けつつ２ＭＮａ Ｃ１１１中に分散させた。次いでＮ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］サクシ ナモイルクロリド（ｓ　ｉ　ｃ）６３．４ｇを漸次添加した。すべての酸クロリ ドを添加した時、混合物を０℃で更に２時間撹拌した。得られたイオン性ゲルを ブフナーで濾過し、蒸留水で洗浄し、凍結乾燥して塩基性マトリックス１０５ｇ 　（収率８３％）を得た。得られたグラフト化度は、ゲル中に存在する窒素含量 の分析で決定した（３．６％）。このグラフト化度は４グルコース残基当り１陽 電荷に相ａ）コハク酸をグラフトした粒子 実施例３に従って得られたイオン性ゲル１００ｇを蒸留水４１に分散させ、圧力 １０００バール及び流速８０１／時でラニー（Ｒａｎｎｉｅ）ホモゲナイザ−（ １２Ｓ１型）を用いることにより１時間ホモゲナイズした。

得られた粒子の大きさの分析は、クールター（Ｃｏｕｌｔｅｒ）　Ｎ　４ナノサ イザーを用いて行い、粒子の９０％が５Ｑｎｍより小さい直径を有することを示 した。

次いで非常に小さい大きさの粒子を凍結乾燥により又は炭酸水素アンモニウム（ ５０ｇ／ｆ）の存在下における噴霧により乾燥した。乾燥後、粒子を水中へ分散 させて再びナノサイザーにより粒子の大きさを監視した。得られた結果は、乾燥 前に得られた結果と同一であった。イオン性グラフト化度も同一であった。

ｂ）燐酸をグラフトした粒子 実施例４に従って得たホスホリル化ゲル１００ｇを蒸留水１０１中に分散させ、 ラニー１２−５１Ｈ型ホモゲナイザーを用いてホモゲナイズした。このホモゲナ イズ圧は９００バール及び流速は８０ｊ！／時であった。

この結果クールターＮ４ＭＤ型ナノサイザーで測定した大きさが２０ｎｍ付近に 最大分布のある酸性の架橋多糖類のナノ粒子の液体分散液を得た。次いでこのナ ノ粒子を、炭酸アンモニウム５０　ｇ／　ｌの存在下に凍結乾燥により乾燥した 。

実施例７−半透過性脂質層の製造 実施例６（ａ）に従って得た５０ｎｍの粒子１０ｇをジクロルメタン３０ｍ１に 分散させた。バルミトイルクロリド０．８ｇを添加した。次いで炭酸カリウム保 護管を付けた還流凝縮器を反応フラスコに取り付け、反応混合物を終夜還流温度 で激しく撹拌した。ジクロルメタンをロータリーエバポレーターで蒸発させ、残 渣をエタノールで数回洗浄し、次いで真空下に乾燥した。この結果アシル化され た粒子１０．３ｇ（収率１００％）を得た。粒子のけん死後に測定したグラフト 化された脂肪酸は５％であった。同一のアンル化条件の場合、炭酸水素アンモニ ウムなしに乾燥する以外同一の粒子上にグラフトされた脂肪酸の程度は３％で実 施例６（ｂ）に従って得られた２０ｎｍの粒子１０ｇをジクロルメタン３０ｍ１ に分散させた。次いでバルミトイルクロリド１．７ｇを添加した。炭酸カリウム 保護具を備えた還流凝縮器を反応フラスコに取り付け、反応混合物を還流温度で 終夜激しく撹拌した。次いでジクロルメタンをロータリーエバポレーターで蒸発 させ、残渣をエタノールで数回洗浄し、真空乾燥した。この結果アシル化された 粒子１０．３ｇ（収率９８％）を得た。粒子のけん死後に測定したグラフトされ た脂肪酸の程度は５％であった。同一のアシル化条件の場合、炭酸水素アンモニ ウムを用いずに乾燥する以外同一の粒子上にグラフトされた脂肪酸の程度は３％ であった。

得られたアシル化粒子Ｌｏｇを激しく撹拌しながら水１１中に再懸濁させた。− 変分散液を均質にし、粒子を実施例６に従って炭酸水素アンモニウムの存在下に 再び乾燥した。

この粒子をジクロルメタン３０ｍＡに分散させ、上述の方法に従って再アシル化 した。洗浄後、測定した脂肪酸の程度が６％の粒子９．５ｇ（収率９４％）を得 た。

すでに記述したすべての段階（水和、凍結乾燥及び再アシル化）を含んでなる３ 回目の反応サイクルは、脂肪酸度６．５％のアシル化粒子９ｇ（全収率８８％） を与えた。

実施例９−脂質層の特性化 Ａ１−白色ＳＭＢＶの製造 実施例８に従って製造した２００ｍのアシル化したホスフェート・コア１０ｍｇ を、５ＱｍＭオクチルグルコピラノシドＯＧＰ　（フル力）１ｍｌ中に分散させ た。これを超音波条件下に、５０ｍＭ　ＯＧＰ　１ｍｌに分散させた精製卵黄レ シチン（シグマ社）及びコレステロール（シグマ社）の８０／２０溶液５ｍｇと 混合した。この調製物を超音波下に粗＜１０ｍＭまで希釈し、次いで４８時間強 力に透析させた。

Ａ２−ローダミンでラベルした蛍光性ＳＭＢＷの製造ａ−ローダミンで標識した 蛍光性アシル化コアの製造実施例８に従って製造した２０ｎｍのアシル化ホスフ ェート・コア５０ｍｇをｐＨ１０の１００ｍＭ炭酸水素ナトリウム（シグマ社） １ｍｌに分散させた。次いでジメチルホルムアミド（ＳＤＳ）に溶解したローダ ミンＢイソチオシアネート（シグマ社）０．５ｍｇ、即ちアシル化核の重量に関 してローダミン１％を添加した。室温で１２時間撹拌後、数回エタノールで洗浄 を行い、未反応のローダミンを除去した。次いでアシル化したコアを凍結乾燥に より乾燥した。

ｂ−リン脂質ラメラの確立 ＊蛍光性コアから 蛍光性のアシル化したコア１００ｍｇを、５０ｍＭオクチルグルコピラノシド○ ＧＰ（フル力）２ｍＡ’中に分散させた。この懸濁液に、５０ｍＭ　ＯＧＰ　１ ｍＡ’に分散させた精製卵黄レシチン（シグマ社）及びコレステロール（シグマ 社）の８０／２０混合物５　ｍ　ｇ　ｓ即ちアシル化した核の重量に関してリン 脂質混合物５０％を導入した。この溶液を超音波下に粗＜１０ｍＭまで希釈し、 次いで４８時間強力に透析した。他の２つの調製物も、それぞれリン脂質混合物 ２０ｍｇ及び３０ｍｇ、即ちリン脂質２００及び３００％を用いて製造した。

＊蛍光リン脂質から 非蛍光性のアシル化コアを用い且つローダミンで標識したリン脂質［モレキュラ ー・プローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅ）　］　１％を精製卵黄レシチ ン／コレステロール混合物中に導入することによる以外同一の方法で精製した。

Ｃ−参照蛍光性リポソームの製造 ローダミンで標識したリン脂質１％を含む卵黄レシチン／コレステロール（８０ ／２０）５ｍｇを５０ｍＭ　ＯＧＰ　１ｍｌに分散させた。この溶液を超音波下 に粗＜１０ｍＭまで希釈し、次いで４８時間強力に透析した。

Ｂｌ　−ＳＭＢＶの大きさの分析 白色ＳＭＢＶの大きさの分析をクールターＮ４ナノサイザーにより行った。これ は粒子の９９％が２０ｎｍ（±２ｎｍ）の直径を有することを示した。

この測定値は４°Ｃで３ケ月間貯蔵後も変化しなかった。

Ｂ２−ゲル透過法によるＨＰＬＣ分析 ＳＭＢＶは溶媒としての１０ｍＭトリス／１２０ｍＭＮａＣｌ中ＴＳＫ　Ｇ　６ ０００ＰＷカラムに関して蛍光（励起２８０ｎｍ−放射５８０ｎｍ）により検出 した。

５０％リン脂質を有する蛍光性コアを含むＳＭＢＶの場合、７．５ｍ！！の溶出 容量に相当するピークが観察された。

５０％蛍光リン脂質を有するＳＭＢＶの分析により、正確に同一の溶出容量７． ５ｍｌを有するピークを得ることが可能になった。

蛍光性リポソームの分析は、ＳＭＢＶのピークと顕著に異なる溶出容量９．９ｍ ／のピークを明らかにした。

２００及び３００％リン脂質を有するＳＭＢＶの分析は、７．５ｍ４に１つ及び ９．９ｍＡ！に１つの２つのピークを明らかにした。９．９ｍｌのピークはリン 脂質の百分率と共に増加する強度を示した。

結果は、リン脂質がアシル化コアに確かに付いているということを明確に示した 。更にそれは、両親媒性層を確立するのに最適なリン脂質が存在すること、及び それ以上では過剰なリン脂質に相当するリポソームが観察されることを示した。

更にＳＭＢＶのクロマトグラフィーの傾向は数週間後でも未変化であり、一方リ ポソームのそれは数日後に変化したことは特記されることであり、これはＳＭＢ Ｖの安定性がより大きいことを示すように見えた。

実施例１０−サクシニル化したイオン性核を含み且つ半透過性脂質層を有するＳ ＭＢＶへのブチロシンの負荷ブチロシン（ｂｕｔｉｒｏｓｉｎ）はアミノグリコ シド族の抗生物質である。

それはグリコシド結合によりアミン含有糖に結合したアミノシクリトールからな る分子である。斯くしてそれは水にだけ溶解する非常に極性で塩基性の生成物で ある。その分子量は５５６である。

大きさ５０ｎｍのアシル化した酸性核を先ず実施例７に従って調製した。アシル 化した核１ｇを乾燥状態でブチロシン塩基［パーク−デービス（Ｐａｒｋ−Ｄａ ｖｉｓ）　］　１　ｇと混合した。次いでこの混合物を蒸留水の添加により非常 にゆつ（りと水和した。混合物を一定に且つ５０℃で撹拌した。次いで混合物を 室温に戻しながら水１０ｍ１を添加し、混合物を更に２時間撹拌した。

次いで得られた懸濁液を凍結乾燥した。この乾燥残渣をエタノール５ｍｌ中に分 散させ、一枚膜リポソーム（蒸留水５０ｍ１中精製卵黄レシチン１．５　ｇ）の 懸濁液に滴下した。浴中で％時間超音波に供した後、懸濁液を限外濾過しく排除 点７５００ダルトン）、限外濾過液中に存在する遊離のブチロシンをＨＰＬＣで 定量的に決定した。結果は限外濾過液中にブチロシン５０ｍｇが存在することを 示した。これは導入収量が９５％及びアシル化コアの重量に関してブチロシンの 導入率９５重量％であることに相当した。

実施例１１−ホスホリル化したイオン性核を含み且つ半透過性脂質層ヲ有スるＳ ＭＢＶへのブチロシンの負荷第１段階において、２０ｎｍの大きさを有するアシ ル化した酸性核を実施例８に従って製造した。次いでアシル化核５０ｍｇを、蒸 留水１ｍｌで希釈したブチロシン塩基（バーク−デービス）２５ｍｇと混合した 。この混合物を室温で終夜一定に撹拌しつづけた。

得られた懸濁液を、終夜モル濃度５ＱｍＭまでオクチル−ｄ−グルコピラノシド （ｓ　ｉ　ｃ）（ＯＧＰ）（フル力）の存在下に分散さ也リン脂質の溶液（５０ ｍＭ　ＯＧＰ　１０ｍ／に分散させた精製卵黄レシチン／コレステロール（８０ ／２０ｗ／ｗ）の混合物５０ｍｇ）に滴下した。

浴中で１０分間超音波に供した後、この溶液を超音波下番二〇〇Ｐ中５ｍＭのモ ル濃度まで粗く希釈し、次いで限外濾過した（排除点；３０．０００ダルトン） 。ナノサイザー（クールターＮ４ＳＤ型）で行った大きさの分析は、ＳＭＢＶの ９９％が２０ｎｍ（±２ｎｍ）の直径を有することを示した。

濾液中に存在する遊離のブチロシンを微生物学的に定量分析した。抗生物質の濃 度を、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）　（ＡＴＣＣ６６３３）の 生長禁止の面積を測定することによって決定した。結果は限外濾過中に遊離のブ チロシン２．５ｍｇの存在することを示した。これはブチロシンの導入収率９０ ％及びアシル化コアに関するブチロシンの導入率４５重量％に相当した。

西洋ワサビのペルオキシダーゼの負荷 西洋ワサビのペルオキシダーゼは分子量４０００ダルトンを有する塩基性の酵素 である。実施例７に従って製造したアシル化酸性核を使用した。このアシル化核 １ｇを乾燥状態でペルオキシダーゼ（フル力）１．５ｇと混合した。混合物を撹 拌し、蒸留水の添加によって非常にゆつ（りと水和した。温度を４０℃に保った 。次いで蒸留水１０ｍＡ’を添加し、混合物を更に２時間撹拌した。更にオクチ ルグルコシド４００ｍｇ及び精製した卵黄レシチン１．５ｇの懸濁液１０ｍ１を 添加し、得られる混合物を、温度を３０℃以下に保ちながら浴中で％時間超音波 に供した。

得られた懸濁液を蒸留水に対して４℃で２４時間透析し、オクチルグルコシドを 除去した。次いで調製物を、排除点１００，０００ダルトンの膜を用いて限外濾 過した。遊離のペルオキシダーゼを、ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）法 により及び酵素的な定量法により限外濾過液中で定量的に決定した。２つの方法 による結果は遊離のペルオキシダーゼ４５ｍｇの存在、即ちカプセル化収率９７ ％及びアシル化核の重量に関する負荷率１４５％を示した。

実施例１３−大きさ５０ｎｍのアシル化塩基性核の製造塩基性核は実施例５に従 ってＮ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］サクシンアミツク酸をグラフトさせ ることによって製造した。塩基性ＰＳマトリックス２００ｇを蒸留水２１中に分 散させ、ラニー・ホモゲナイザーにより高圧（８００バール）で超粉砕して大き さ５０ｎｍの粒子を得た。これらの粒子を炭酸水素アンモニウム（５０ｇ／ｌ） の存在下に微粉霧して乾燥粉末１３０ｇを得、これをジクロルメタン４００ｍ１ 中に懸濁させた。次いでオレイルクロライド１６ｇを添加し、混合物を室温で２ ４時間撹拌させた。次いで得られたアシル化粒子を遠心分離によって反応混合物 から分離し、ジクロルメタン、次いでエタノールで洗浄した。最終のエタノール 懸濁液を冷却しながら真空下に蒸発させてアシル化された塩基性の核１２５ｇを 得た。脂肪酸のグラフト化率は粒子のけん死後の遊離のオレイン酸を定量的に決 定することによって測定した。グラフト化率４．５％が見出された。

実施例１４−ヌクレオチド：アデノシン５′−モノホスフェート（ＡＭＰ）の負 荷 ＡＭＰは分子量３４７の酸性分子である。斯くして負荷は塩基性核に対して行っ た。

実施例１３に従って製造した塩基性核５０ｍｇを蒸留水１ｍＡ’に希釈したＡＭ Ｐ　（フル力）１０ｍｇと混合した。導入は室温で３時間撹拌しながら行った。

得られた懸濁液を最終モル濃度５０ｍＭまでオクチル−ｄ−グルコピラノシド（ ｓ　ｉ　ｃ）（ＯＧＰ）の存在下に分散させ、リン脂質の溶液（５０ｍＭ　ＯＧ Ｐ　１０ｍ／に分散させた精製卵黄レシチン／コレステロール（８０／２０ｗ／ ｗ）混合物５０ｍｇ）に滴下した。

浴中で１０分間超音波に供した後、溶液をＯＧＰ中５ｍＭのモル濃度まで超音波 下に粗く希釈し、次いで限外濾過（排除点：３０．０００ダルトン）に供した。

ナノサイザー（クールターＮ４ＳＤ型）で行った大きさの分析は、ＳＭＢＶの９ ９％が５Ｑｎｍ（±３ｎｍ）の直径を有することを示した。

遊離のＡＭＰを分光学的に定量的に決定した。得られた結果はＡＭＰｏ、５ｍｇ の存在、即ち導入収率９５％及びアシル化核の重量に関して負荷率１９％を示し た。

スタチオース（Ｓｔａｃｈｙｏｓｅ）は構造式Ｇａ　１−　［１→６］　−Ｇａ 　ｌ　−［１→６］　−Ｇ　Ｉ　ｃ　−［１→２］−Ｆｒｕの四糖類である。こ れは電荷がなく、非常に極性のある化合物である。スタチオースの構造は、従っ てＳＭＢＶの極性の又は親油性の部分にカプセル化され得ない。今回本申請者は 、酵素的に加水分解しうるエステル官能基によりスタチオースのヒドロキシルに 結合する酸性のイオン性官能基をスタチオース分子にグラフトさせることによっ てカプセル化を行った。

ａ）スタチオースの酸性誘導体の製造 スタチオース１ｇを、０℃及びｐＨ６，５で撹拌しながら水溶液５ｍｌに溶解し た。実施例３に従って製造したコハク酸モノクロリド１３５ｍｇをこの溶解に漸 次添加した。添加の終了後、混合物を室温に戻しながら更に２時間撹拌した。反 応混合物を０２５ゲル透過カラムの上部に適用し、蒸留水で流出させた。オリゴ 糖を含む画分［デュポア（Ｄｕｂｏｉｓ）法で試験］を一緒にし、凍結乾燥して 、改変スタチオース０．８５　ｇを得た。イオン性グラフト化度は、０．ＩＮ水 酸化ナトリウム溶液での滴定により測定して、４．２糖当り１イオン性荷電、即 ちスタチオース分子当り凡そ１つの荷電に相当した。

ｂ）改変スタチオースの負荷 実施例１０に従って製造したアシル化した塩基性核５０ｍｇを乾燥状態で改変ス タチオースと良く混合した。この混合物を室温で３時間一定に撹拌しながら蒸留 水１ｍＡ’と非常にゆっくりと水和させた。得られた懸濁液を、オクチルグルコ ピラノシドＯＧＰ　（フル力）の存在下に最終モル濃度５ＱｍＭまで分散させた 。次いでこれをリン脂質の調製物（５０ｍＭ　ＯＧＰ　１０ｍ１中精製した卵黄 レンチン／コレステロール（８０／２０）の５０ｍｇ）に滴下した。浴中で１０ 分間超音波に供した後、調製物を１０ｍＭまで超音波下に粗く希釈し、次いで超 音波にかけ（ｓ　ｉ　ｃ）　、遊離のスタチオースをデュボア法で定量的に決定 した。

結果は限外濾過液中にスタチオース２．５ｍｇ、即ちカプセル化収率９０％及び アシル化核の重量に関して負荷率４５％を示した。大きさの分析はクールターＮ ４型ナノサイザーを用いて行い、粒子の９８％が５０ｎｍ　（ｓ　ｉ　ｃ）（± ３ｎｍ）の直径を有することを示した。

実施例１６−アシル化核の、トリグリセリド溶液中分散液からのＳＭＢＶの製造 実施例７に従って製造した多糖類核（５０ｎｍ）１５ｍｇを、精製した卵黄レシ チン３０ｍｇ及びトリブチリン２５０ｍｇの混合物中に分散させた。この混合物 をｐＨ７，２の０．１トリス−マレエート緩衝液１０ｍ１中に入れ、次いで懸濁 液をボーテックス（Ｖｏｒｔｅｘ）を用い且つ磁気撹拌によりホモゲナイズした 。全体を３７℃の水浴上に置き、リノクーゼ（■型、Ｃ，シリンドレ（ｃｙｌｉ ｎｄｒａｅ）　（ｓ　ｉ　ｃ）　、シグマ）２５ｍｇを添加した。遊離した酪酸 を、ｐＨを７．２に維持するｐＨスタット（ｓｔａｔ）を用いることにより０． ＯＩＭＮａＯＨを添加して中和した。

３０分間培養後、懸濁液は透明になり、大きさの測定（クールターＮ４ＳＤ型、 クールトロニクス）は５Ｑｎｍの付近に中心のある大きさの分布を示した。次い で懸濁液を透析バッグ（排除１２．０００〜１４．　ＯＯＯ、スペクトレーバー （ｓｐｅｃｔｒａｐｏｒ）　）に移し、ｐＨ７，２の０．０１Ｍトリス−マレエ ート緩衝液１１中に入れ、終夜透析させた。透析ノくラグに含まれる溶液の気相 クロマトグラフィーによる分析はトリブチリン及び酪酸の存在しないことを示し た。

実施例１７−超臨界ＣＯ２中のアシル化核の製造実施例６に従って製造したイオ ン性多糖類核０．３ｇを、１５０バールまで試験したｌＱｍｊ！のサファイア反 応器中に入れた。オレオイルクロライド６０ｍｇを添加し、反応器を無水ＣＯ２ で１００バールまで加圧した。次いで反応混合物を撹拌下に１２時間４０℃に維 持した。次いでＣＯ２を放出させ、残渣を数回エタノールで洗浄し、真空下に低 温で乾燥した。この結果アシル化粒子０．２５　ｇを得た。粒子のけん死後に測 定した脂肪酸（ｓｉｃ）のグラフト化率は６％であった。

実施例１８−オキシ塩化燐を用いる多糖類の架橋による親水性マトリックスの製 造 水素化ホウ素ナトリウム１ｇを含む水４５ｍ４に溶解したデキストリン１０（フ ル力）（分子量１６２０）５０ｇを５００ｍ／の丸底フラスコ中に入れた。

この反応混合物を、最終還元糖が完全に還元されるまで室温で２時間撹拌し、多 糖類の塩基性媒体中での不本意なエノール化反応を防止した。

温度が一端Ｏ℃で安定化した時、オキシ塩化燐５４ｇ（０，１５Ｍ（ｓｉｃ）） を、激しく撹拌しながら添加した。同時に１０ＭＮａＯＨ５７ｍｌを添加して、 反応物の付加を同時に行った。

反応物の添加の終了後、反応混合物を更に１時間穏やかに撹拌し、次いで酢酸の 添加によってｐＨ７まで中和した。

このようにして得たゲルを、ら線形粉砕器を用いて粗く分散させ、ブフナーで濾 過し、次いで塩と副生物が除去されるまで数回蒸留水で洗浄した。

最終的にゲルをエタノールで沈殿させ、減圧下に乾燥して架橋したデキストリン （４０ｇ（収率８０％）を得た。

架橋ゲル１ｇの自動滴定機（タイトロプロセッサー・メトローム（Ｔｉｔｒｏｐ ｒｏｃｅｓｓｅｕｒ　Ｍｅｔｈｒｏｍ）　５８２）による滴定は、グラフトした ホスフェートの第１酸性度に相当する１、８ｍ当量／ｇ及び第２酸性度に相当す る１、２ｍ当量／ｇの中和容量を示した。これは架橋したゲル１ｇ当りホスホジ エステル官能基０．６ｍ当量の架橋度を示した。

実施例１９−大きさ２００ｎｍのカチオン性液を含むＳＭＢＶへのケラチンの導 入 ケラチンは皮膚表面の構造蛋白質である。これは平均分子量約１００゜０００及 び等電点５．０〜７．０の可溶性の部分的加水分解物の形で入手できる。

＊カチオン性多糖類マトリックスの製造トウモロコシ殿粉（ロケット（Ｒｏｑｕ ｅｔｔｅ、　Ｌｉ１ｌｅ、　Ｆｒａｎｃｅ））　２　ｋ　ｇを３０１の反応器中 の２Ｎ　ＮａＯＨ５１に溶解した。溶液が均一になった時、グリシジルトリメチ ルアンモニウムクロリド１ｋｇ、即ち０．５当量／グルコース残渣を水５００ｍ １に溶解して導入した。この調製物を更に２時間均質にし、次いで１０時間放置 し、最後に２Ｎ塩酸の添加によってｐＨ７に中和した。次いで遠心乾燥器を用い 、すべての塩及び反応副生物が除去されるまでゲルを蒸留水で数回洗浄した。

＊大きさ２００ｎｍの粒子の製造 上で製造したゲル１ｋｇを蒸留水４０１中に分散させ、ラニー・ラブ（Ｒａｎｎ ｉｅ　Ｌａｂ）　１２−５１型ホモゲナイザー（ＡＰＶラニー　（Ｃｏｐｅｎｈ ａｇｅｎ）　）により圧力５００バール及び流速１２０１／時で４時間ホモゲナ イズした。

得られた粒子の大きさの分析は、クールターＮ４型ナノサイザーを用いて行い、 分散液が平均の大きさ２００ｎｍに分布の中央をもつことを示した。

次いでこの粒子を炭酸水素アンモニウム（５０ｇ／ｌ）の存在下にＡＰＶラブ１ 型噴霧器により乾燥した。

＊周囲脂肪層の調製 乾燥した粒子２００ｇをジクロルメタン２．５１中に分散させた。バルミトイル クロリド３０ｇを添加した。この反応混合物を終夜撹拌した。

次いでジクロルメタンを濾別し、残渣をジクロルメタンで数回、次いでエタノー ルで洗浄し、最後に真空下に乾燥した。けん死後に測定したグラフトした脂肪酸 の程度は０，８％であった。

＊カチオン性多糖類粒子へのケラチンの負荷アシル化した多糖類核２００ｇを、 ゆつ（りと撹拌しながらケラチンの可溶性加水分解物（クロダ（Ｃｒｏｄａ）　 ）　４００　ｇ／　ｌを含む溶液１１で徐々に再水和し、次いで蒸留水２１を添 加した。８時間の終りに、ホモゲナイズした大豆のホスファチジルコリン（ナツ タ−マン（Ｎａｔｔｅｒｍａｎｎ、　Ｆｒａｎｃｅ）　）　１０　ｇを添加し、 混合物を１時間撹拌した。この懸濁液を蒸留水１Ｍ中に注入し、ラニー・ラブ１ ２−５１型ホモゲナイザ−（ＡＰＶラニー）により圧力３００バール及び流速１ ２０１／時で１時間ホモゲナイズした。

得られた懸濁液を、クールターＮ４型ナノサイザーにより分析して粒子の大きさ を決定した。懸濁液は１６０ｎｍ付近に分布の中央を有した。

懸濁液の限外濾過、続くブラッドフォード法による全蛋白質の定量は、限外濾過 流中におけるケラチン８０ｇの存在、即ちカプセル他収率８０％及びアシル化核 の重量に関して負荷量１６０％を示した。

実施例２０−ケラチンと共架橋した中央の殿粉核で特徴づけられるＳＭＢＶの製 造 可溶性殿粉（プロラボ（Ｐｒｏｌａｂｏ、　Ｐａｒｉｓ、　Ｆｒａｎｃｅ）　） 　２００　ｇ及びケラチンの可溶性加水分解物２０ｇを、５１の反応器中の２Ｎ 　ＮａＯＨ３１に分散させた。溶液が均一になった時、０．１当量／グルコース 残基に相当するエピクロルヒドリン９．７ｍｌを添加した。この調製物を２時間 ホモゲナイズして１０時間放置し、最後に２Ｎ酢酸の添加によってｐＨ７に中和 した。次いで遠心乾燥器を用い、すべての塩及び反応副生物が除去されるまでゲ ルを蒸留水で数回洗浄した。次いでこの多糖類ゲルを蒸留水４１に分散させ、ラ ニー・ミニ・ラブ・ホモゲナイザ−（ＡＰＶラニー）により圧力６００バール及 び流速１０１／時でホモゲナイズした。

得られた粒子の大きさの分析は、クールターＮ４型ナノサイザーを用いて行い、 分散液が平均の大きさ２１０ｎｍに分布の中心のあることがわかった。

元素分析は窒素の割合が全重量の約１．１％、即ちケラチン／多糖類の共架橋収 率が９５％以上であることを示した。

次いでこれらの粒子を、炭酸水素アンモニウム（５０ｇ／Ａ’）の存在下に噴霧 又は凍結乾燥し、アシル化し、そして実施例１９に記述した方法に従って水素化 した大豆のホスファチジルコリンのラメラ中に分散させた。このように製造した 分散液は大きさ１９０ｎｍ付近に分布の中心蒸留水５１中セラミド（バイオ・ヨ ーロップ（Ｂｉｏ　Ｅｕｒｏｐｅ、　Ｔｏｕｌｏｕｓｅ。

Ｆｒａｎｃｅ）　）　２．５　ｇの懸濁液を、ラニー・ホモゲナイザーにより３ ００バール及び流速１０１／時で１５分間ホモゲナイズした。

実施例１９に従って製造したアシル化した多糖類核５０ｇを、３００バールの圧 力を維持しつつ上記懸濁液に漸次添加し、次いで３時間ホモゲナイズした。得ら れた分散液をクールターＮ４型ナノメーターで分析した。その平均の大きさは２ ３０ｎｍであった。

国際調査報告 ＦＲ９２００４９８ ＳＡ　６０３５０ フロントページの続き （７２）発明者　メニアリ、ジャオウアドフランス国３１４００ドウルーズ・シ ュマンドラサラドボンザン１３４ （７２）発明者　イオウアラレン、カリムフランス国３１５００　ドウルーズ・ リュデボテイエ６ （７２）発明者　ディング、リ フランス国３１４００ドウルーズ・リュデュガイトルーアン１４ （７２）発明者　セルビヤ、モニタ フランス国３１４００ドウルーズ・シュマンドペシュビュスケ１００ （７２）発明者　リューマジュ、バレリフランス国４７２２０アスタフォール・ リュデュベール７ （７２）発明者　デルリュー、パスカルフランス国３１４００ドウルーズ・シュ マンドラサラドポンザン１３６ （７２）発明者　アンベルティ、ローランフランス国３１４００ドウルーズ・ル ソルボンヌ・アベニューシュレジユリアン１２５

Claims (32)

【特許請求の範囲】
1. １．−イオン性リガンドのグラフトされた架橋多糖類又はオリゴ糖類からなる核 、 −共有結合により核に結合している第１の半透過性脂質層、−疎水性相互作用に より第１の脂質層に結合している第２の両親媒性化合物層、 を含んでなることで特徴づけられる生分解性粒状物ベクター。
2. ２．マトリックスにグラフトしたリガンドが酸性化合物である請求の範囲１の粒 状物ベクター。
3. ３．マトリックスにグラフトされる酸性リガンドがコハク酸、燐酸、クエン酸、 グリシン、アラニン、グルタミン酸、アスパルチン酸及びその誘導体から選択さ れる請求の範囲１及び２の１つの粒状物ベクター。
4. ４．コハク酸を、１．５グルコース残基当り１荷電までの範囲の程度でグラフト する請求の範囲３の粒状物ベクター。
5. ５．燐酸を、１．５グルコース残基当り１荷電までの範囲の程度でグラフトする 請求の範囲３の粒状物ベクター。
6. ６．マトリックスにグラフトされるリガンドが塩基性化合物である請求の範囲１ の粒状物ベクター。
7. ７．マトリックスにグラフトされるリガンドが酸性化合物を介してマトリックス に固定される塩基性化合物である請求の範囲６の粒状物ベクター。
8. ８．マトリックスにグラフトされるリガンドが、マトリックスに固定された酸性 化合物とアミド又はエステル結合を形成するアシル化しうる官能基を含む２官能 性化合物である請求の範囲６及び７の１つの粒状物ベクター。
9. ９．塩基性リガンドがコリン、ヒドロキシコリン、２−（ジメチルアミノ）エタ ノール及び２−（ジメチルアミノ）エチルアミンから選択される請求の範囲８の 粒状物ベクター。
10. １０．塩基性リガンドを１．５グルコース残基当り１荷電までの範囲の程度でグ ラフトする請求の範囲６〜９の１つの粒状物ベクター。
11. １１．マトリックスがデキストラン、殿粉、セルロース及びその誘導体から選択 される架橋した多糖類からなる請求の範囲１〜１０の１つの粒状物ベクター。
12. １２．マトリックスを蛋白質又はペプチドと共架橋する上記１〜１１の１つの粒 状物ベクター。
13. １３．蛋白質がケラチン、コラーゲン、エステラーゼ、それらの誘導体及び同族 体から選択される請求の範囲１２の粒状物ベクター。
14. １４．第１の半透過性脂質層が種々の程度で固定化された天然脂肪酸からなる請 求の範囲１〜１３の１つの粒状物ベクター。
15. １５．第２の脂質層がリン脂質からなる請求の範囲１〜１４の１つの粒状物ベク ター。
16. １６．第２の脂質層がセラミドからなる請求の範囲１〜１５の１つの粒状物ベク ター。
17. １７．第２の層か二重層リン脂質ラメラからなり、内側ラメラが第１の脂質層の 脂肪酸と入り込み合つている請求の範囲１〜１６の１つの粒状物ベクター。
18. １８．生物学的活性を有する分子を核中に包含させる請求の範囲１〜１７の１つ の粒状物ベクター。
19. １９．生物学的活性を有する分子が１００ダルトン〜５００キロダルトンの分子 量を有する請求の範囲１８の粒状物ベクター。
20. ２０．核が１０ｎｍ〜１０μｍの大きさを有する請求の範囲１〜１９の１つの粒 状物ベクター。
21. ２１．ａ）生分解性の親水性ポリマー又はオリゴマーを架橋することによつてマ トリックスを調製し、 ｂ）イオン性リガンドを、酵素的に加水分解しうる結合によりマトリックス上に 固定してベクターの核を得、ｃ）この核を超粉砕に供して１０ｎｍ〜１０μｍの 寸法にし、ｄ）核を乾燥し、 ｅ）脂質化合物を、核の表面の反応性官能基に化学的に結合させて第１の層を生 成させ、 ｆ）両親媒性化合物を第１の層と疎水性接触により導入して第２の層を形成させ る、 請求の範囲１〜２０の１つの粒状物ベクターの合成法。
22. ２２．段階ａ）及びｂ）を、燐酸又はその誘導体の１つ、特にオキシ塩化燐の１ つと反応させることによつて同時に行う請求の範囲２１の方法。
23. ２３．段階ｂ）において、コハク酸モノクロリドを次の反応式ＰＳ−ＯＨ＋Ｃｌ ＣＯ−（ＣＨ２）２−Ｃ００Ｈ→ＰＳ−Ｏ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−Ｃ００Ｈ＋Ｈ ｃ１（ｓｉｃ）［式中、ＰＳ−ＯＨはＯＨ官能基を有する架橋したマトリックス を表わす］ に従つて用いることにより、コハク酸をマトリックス上に固定する請求の範囲２ １の方法。
24. ２４．段階ａ）で導入される脂質化合物が脂肪酸である請求の範囲２１〜２３の １つの方法。
25. ２５．段階ｅ）後及び段階ｆ）前に、生物学的活性を有する物質を核に包含させ る請求の範囲２１〜２４の１つの方法。
26. ２６．段階ｄ）を炭酸水素アンモニウムの存在下に行う請求の範囲２１〜２５の １つの方法。
27. ２７．段階ｄ）及びｅ）を、水和段階を介在させて数回繰返す請求の範囲２１〜 ２６の１つの方法。
28. ２８．段階ｅ）を超臨界状態のＣＯ２中で行う請求の範囲２１〜２７の１つの方 法。
29. ２９．生物学的活性を有する物質の包含を、該物質を段階ｅ）の終りに得られた 核と混合し、そして続いて水和することによつて行う請求の範囲２５〜２８の１ つの方法。
30. ３０．生物学的活性を有する物質が非イオン性物質であり、そして該物質を核中 に包含させる前に反対にイオン性荷電をその上にグラフトさせる請求の範囲２５ 〜２９の１つの方法。
31. ３１．段階ｅ）の終了時に得られ且つ随時活性原体を含有するアシル化された核 を、トリグリセリド及びリン脂質を含む脂質媒体中に分散させ、次いでリパーゼ で処理することによつて段階ｆ）を行う請求の範囲２１〜３０の１つの方法。
32. ３２．段階ｆ）を洗剤透析法で行う請求の範囲２１〜３１の１つの方法。