JP3003045B2 - 粒子状抗菌物質の製造方法および得られた抗菌物質 - Google Patents

粒子状抗菌物質の製造方法および得られた抗菌物質

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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ラクトペルオキシダーゼ酵素、酸素ドナー
および必要に応じて用いられる酸化可能な基質からなる
抗菌系（system）を出発材料にして粒子状抗菌生成物の
製造するための方法に関する。本発明はまたその方法を
実施することによって得られる粒子状生成物、並びに製
薬、衛生、消毒および予防の分野におけるその適用法を
提供するものである。
〔従来の技術〕
ラクトペルオキシダーゼ酵素／酸素ドナー／酸化可能
な基質の抗菌系（以下、「LP系」という。）はその抗菌
性の故に知られている。この系は哺乳動物の主要な分泌
物（乳、唾液、涙等）に含まれそして粘膜の保護と同様
にそれらの保護を確実にしている。しかしながら、小さ
な寸法の粒子の形体であるこのLP系は水性媒質に非常に
溶解でき、それにより浸潤雰囲気中または水和物に接触
したとき、与えられた領域にその作用を集中するために
その拡散を制限することが不可能であった。更に、その
回収には非常に複雑な分離技術が必要であった。
〔発明が解決しようとする課題〕
本発明は、LP系から出発して、そのタンパク質成分が
水性媒質に不溶性でありそしてそれらの易動性および拡
散性がその適用目的に応じて調整できる粒子状生成物を
提供することを目的とするものである。
本発明の主要な目的は、LP系の変性またはLP系の１つ
またはそれ以上の酵素の化学的な変換を行うことなしに
前述した粒子状生成物を得ることにある。
本発明の別の目的は、企図される適用目的に適合され
た補足的な特性（荷電等）を粒子状生成物に与えること
ができることにある。
〔課題を解決するための手段〕
本発明による製造方法は前述のLP系を利用しており、
そこにおいて、酸素ドナーは過酸化物、またはその１つ
が酵素（グルコースオキシダーゼ、キサンチン・オキシ
ダーゼ等）であってもよい反応性物質、或は微生物（乳
酸菌、乳酸連鎖球菌等）のいずれかであり得る。このLP
系は、必ずしも必要ではないが、企図される適用目的に
よって酸化可能な基質（チオシアン酸塩、ヨードまたは
ブロムの塩等）を含み得る。この基質は、十分な量の酸
化可能な基質を既に含んでいる媒質に適用する場合には
必要でない。本発明の製造方法は、 各粒子が親水性の多糖類のポリマーにより構成された
核と、水酸基の作用または誘導体の作用によって前記核
に化学的に結合された第１の脂質の層と、第２の燐脂質
の層とからなる粒子状媒介物に、少なくともLP系のラク
トペルオキシダーゼ酵素を結合し、それにより酵素の分
子が第２の燐脂質の層および／または第１の脂質の層に
挿入され、 前記粒子状媒介物および該粒子状媒介物と一体になっ
ていないLP系の分子を非水性媒質中でコンディショニン
グすること を特徴とするものである。
酸素ドナーが活性物質としてオキシダーゼ酵素を含む
場合、該オキシダーゼ酵素分子はまた粒子状媒介物に適
切に結合される。
かくして、本発明の方法は、水性媒質に不溶性であり
そしてその寸法および密度が多糖類の核を適宜に選定す
ることによって調節され得る粒子状媒介物に、１つまた
はそれ以上の酵素が結合された粒子状抗菌生成物を導
く。注目すべきことは、担体が生体適合性があり摂取可
能な構成要素（特に、残留物なしに物質代謝可能な）か
らなることであり、そしてそれは医療および食物への適
用形態において生成物を利用することが可能になる。
脂質および燐脂質層への酵素の結合が常態での使用に
おいて安定しており、生成物がそれらを喪失する傾向に
はないことは実験的に立証されている。媒介物の表面に
置かれそして変性されることのないこれらの酵素は、LP
系の周知の抗菌作用を導く、酸素ドナーによる基質の酸
化反応に触媒作用を与えるために、酵素の活性を維持す
る。この活性は、成分のより低い易動性によって、減衰
された反応速度と共に完全にまたは、ほとんどの場合、
ほぼ完全に維持される。
しかしながら、予期せぬ方法では、このインビトロ動
力学（in vitro kinetics）は、第１の脂質の層が形成
されたときにただちに多糖類の核の表面に１つのグラフ
ト重合体がイオン反応を行う場合、影響されるようには
思えない。かくして、第１の脂質の層に与えられる基礎
的なイオン特性は、減衰された反応速度を変移するラク
トペルオキシダーゼの酵素の活性に好適な影響を有する
ように思える。この影響を説明することは現在のところ
困難であり、オルトフェニレンジアミン（酸化可能な基
質からなる）を用いたクロリメトリック（chlorimetri
c）法によって測定され、これらの測定のための酸素ド
ナーは過酸化物である。
本発明の方法は、ラクトフェリンLFによって増強され
たLP系を製造するためにも使用でき、ラクトフェリンLF
もまた粒子状媒介物に結合される。同じ方法で、添加剤
がLP系について調整され、そして特にスーパーオキシダ
ーゼ（superoxydismutase）酵素SODが媒質中で保護機能
を有するとき、この酵素もまた粒子状媒介物に結合され
る。
好ましくは、各酵素は各粒子が１つの酵素を担持する
ような手段で粒子状媒介物に個別に結合され、かくして
作成された粒子状生成物は互いに混合されてLP系のその
他の生成物と混合される。
ある種の適用形態においては、適用場所以外の場所で
の活性の喪失を回避するために化合物の活性を下げるこ
とが望ましい。この場合、本方法にとって可能な一実施
形態によれば、結合した後に、粒子状媒介物の粒子はポ
リオロサイド（polyoloside）またはコロイド物質の表
面層で被覆される。非水性媒質の場合、この表面層は異
なった反応物質を分離する。このことは生成物の使用よ
りも随分前に混合させることができ、その活性はポリオ
ロサイドの表面層の水和および溶解によって使用時に開
始される。この層による被覆は慣用の液浸や吹付けによ
って実施され得る。
別の実施形態によれば、粒子に荷電を与えるために、
荷電された両親媒性物質の分子を粒子状媒介物の第２の
燐脂質の層に挿入し得る。かくして、該粒子を表面に、
または懸濁液のその他の粒子と、或は可溶性の分子とさ
えも凝集または付着させることを効果的に行う、または
逆に邪魔することが可能である。
結合されるべき１つまたはそれ以上の酵素を粒子状媒
介物に結合するための方法は、フランス国特許出願番号
第88.07110号に記載されたものであってもよい。この結
合は、特に、 最初に、アシル化された核を形成するために、多糖類
の非溶媒である非プロトン性溶媒中で多糖類の核のまわ
りに脂質の層をグラフト重合し、 次いで、アシル化された核の存在下で、第２の層の燐
脂質の一部および結合されるべき１つまたはそれ以上の
酵素を配置し、そして燐脂質の転移温度にほぼ等しい温
度でそれらを水和する ことによって達成される。
基礎的なイオン特性を有する脂質層の場合、この層の
多糖類の核へのグラフト重合は、多糖類の核を脂肪酸の
塩化物と小さな割合でのジカルボン酸の無水物との混合
物、特に無水コハク酸と反応させることで行われる。
実際には、第２の燐脂質の層が付着できるように脂質
特性を十分に保持するために、無水ジカルボン酸が脂肪
酸塩化物（ステアリン酸塩化物等）に対して40％以下の
小さな割合で混合される。
多糖類の核は適用形態の機能に応じてそれぞれ選定さ
れる。その不溶度はその化学的特性（セルロース、アミ
ロペクチンのような澱粉のある種の変種等）により、或
はまた合成網状体（synthetic reticulation）（デキス
トリン、β−アミローゼ）により得られることは当然で
ある。所望の寸法は適当に粉砕して篩分けすることによ
って得られる。網状の核の場合、それらの密度は、重合
中に網状化の程度を変化させることにより調節される。
この多糖類の核の寸法は10-8mと10-5mの間で変化でき、
医薬用の場合には、ある程度の拡散を可能にするために
（例えば、皮膚のような障壁を通過するために）、小さ
な寸法であるのが望ましく、一方、活性を集中するため
にそして、ある種の場合、物理的手段（濾過、遠心分
離、デカンテーション等）による酵素の回収を可能にす
るために、大きな寸法であるのが望ましい。湿った核の
場合、その乾燥は第１の層を固定する前に行われ、その
乾燥は、例えば、凝集物の形成を避けるために重合およ
び粉砕の後に微粒子化することにより行われ得る。
第１の脂質の層は、非溶媒（多糖類の核に対して）で
ある媒質、特にジクロロメタン中でグラフト重合され、
核によって構成された化合物と酸塩化物または酸無水物
（特に、ステアリン酸の）と触媒として作用する第３級
アミン（例えば、トリエチルアミン）とは、各核のまわ
りにアシル化反応を発生するような手段でこの媒質中に
拡散される。この層の厚さは反応の化学量論および持続
時間を適合することによって調節され得る。好ましく
は、これらの条件は非常に薄い層、特に、第２の層と酵
素の結合を確実にするのに十分な１分子の厚さの層を得
るように適合される。更に、結合の品質および酵素の活
性の保存は、前記層がこの数よりも大きいときに凝固し
てしまうのを避けるために、14と22の間の数からなる連
鎖長の長鎖脂肪酸をグラフト重合することによって保持
される。特に、炭素数18の脂肪酸（ステアリン酸）は優
れた結果を与える。既に指摘したように、基礎的なイオ
ン特性は媒質中に少量の無水コハク酸を加えることによ
ってこの第１の層に与えられる。
第２の燐脂質の層は大豆レシチン、卵レシチン、乳レ
シチンのような動物の燐脂質または植物の植物性オリジ
ン（origin）から作成されるのが好ましい。この第２の
層は、燐脂質の転移温度に保持された水に、アシル化さ
れた核、燐脂質および結合されるべき酵素を混合して攪
拌することにより作成される。該層の形成のための持続
時間は30から60分間程度である。化学量論は、燐脂質の
単層（１分子の厚さの層）を得るために、アシル化され
た核の寸法の関数として適合される。この層は二重の役
目、すなわち、 同質の均一な（mannerin）水性媒質に粒子を拡散でき
（単一の第１の層、厳密には疎水性の層のみがある場合
は異なる）、そして 酵素（またはその他の構成要素）の結合を改善する 役目を有する。
本発明はまた新規な生成物、前述の方法を実施するこ
とによって得られる粒子状抗菌生成物に関するものであ
る。この生成物はラクトペルオキシダーゼ酵素、酸素ド
ナーおよび必要に応じて用いられる酸化可能な基質から
なり、そして、LP系の少なくともラクトペルオキシダー
ゼ酵素が粒子状担体または媒介物に結合され、その各粒
子が親水性の多糖類のポリマーで形成された核と、ヒド
ロキシ官能基またはその誘導体官能基によって前記核に
化学的に結合された第１の脂質の層と、第２の燐脂質の
層とからなり、酵素の分子が第２の燐脂質の層および／
または第１の脂質の層に挿入されていることを特徴とす
るものである。
本発明はまた前述した生成物の適用形態における組成
物、特に、 皮膚、粘膜または消化管の治療のための医薬組成物、 製品または材料の細菌除去のための組成物、 防腐歯磨粉 にも及ぶものである。
本発明による粒子状生成物は、それらの適用形態に適
合させる特性、 有効な抗菌性 生体適合性および生体模倣特性（細胞膜との相互作用
を可能にしそして、組織であっても、表面における酵素
の活性を維持する細胞膜を備えた第２の層に類似す
る）、 制限された拡散および優れた安定性 と組み合わされる。
〔実 施 例〕
以下、本発明の方法および得られた粒子状生成物の性
能を例示する実施例について説明する。
実施例 １ この実施例は、低い拡散速度を現出するように、相対
的に大きな粒子（10-6から３・10-6m）粒子状抗菌生成
物の製造を示している。
多糖類の核の作成 １の球形フラスコ中で、150gのβ−アミローゼ型の
澱粉を140mlのエピクロロヒドリン・ナトリウム（sodiu
m epochlorohydrin）と混合し、５分間強力に攪拌し、8
0℃に加熱し、80℃で10時間重合を行わせた。網状化さ
れたゲルが得られ、それを洗浄して２の水に懸濁状態
にし、次いで機械的に粉砕し（螺旋粉砕機で）、そして
10-6と３・10-6mの間の大きさの粒子となるように遠心
分離機で篩分けた。
生成物は吹付けによって乾燥され、網状化の程度を僅
少上げることによって相対的に可撓性の楕円体の粒子が
得られた。
第１の脂質の層のグラフト重合 100gの前述の粒子を１のジクロロメタンに拡散し
た。次いで25gのトリエチルアミンと60gのステアリン酸
塩化物を媒質に加えた。この混合物を37℃で24時間ゆっ
くりと攪拌した。この粒子をデカンテーションし、そし
てエタノールで洗浄した。
ローウェリー（Lauwery）法による分析では、核のヒ
ドロキシ官能基から誘導されたエステル官能基によっ
て、核に対して２％の酸の重量比率を有するステアリン
酸（C18）が核に結合していることが判明した。この比
率は１分子の厚さの層特色である。得られた粒子は、全
アシル化の特性を反映する強い疎水特性を有している。
ラクトペルオキシダーゼの結合と第２の層の形成 イオン交換クロマトグラフィによってラクトペルオキ
シダーゼから牛の乳清を抽出した。この95％以上の純度
を有するラクトペルオキシダーゼは非常に乾燥させかつ
安定化させるために凍結乾燥される。
この実施例において、LP系はラクトペルオキシダーゼ
と、酸化可能な基質としてのチオシアン酸カリウムと、
酸素ドナーとしてのグルコースオキシダーゼ系からな
り、ラクトペルオキシダーゼだけが粒子状媒介物に結合
される。
１フラスコに2gの前もって用意されたアシル化され
た多糖類の核と、0.2gの凍結乾燥されたラクトペルオキ
シダーゼと、0.2gの水素添加レシチン（動物性オリジ
ン：水素添加工程を受けた鶏卵）とを入れた。乾燥下で
混合し、400mlの蒸留水を小さく攪拌しながら加えた。
この懸濁液を37℃（レシチンの転移温度）で30分間定温
放置した。
懸濁液の一部を遠心分離して媒質の粒子とラクトペル
オキシダーゼの酵素の活性とを分離し、かくしてオルト
フェニレンジアミン法によって結合状態を分析した。媒
介物との非結合の酵素の割合（残部は溶液中）は0.5％
（非常に低ロスである）でありそして酵素の活性は自由
状態におけるラクトペルオキシダーゼの酵素の活性の量
の60％に等しいことが判明した。これらの結果は完全に
満足できるものでありそしてラクトペルオキシダーゼが
媒介物によって変性も遮蔽もされていない（活性につい
ての減衰は、特に、易動性の低下およびそのための運動
性の減衰から派生する）ことを示している。
懸濁液のその他の部分は凍結乾燥されそしてLP系のそ
の他の成分：チオシアン酸カリウム（商業的に入手可能
な簡素粉末）およびグルコース−オキシダーゼ系（商業
的にまた入手可能でありそして粉末の形態の）と、次の
重量パーセントで混合される。
44.20％のラクトペルオキシダーゼを帯びる粒子状媒
介物 11.06％のチオシアン酸カリウム 44.20％のグルコース 0.44％のオキシダーゼ かくして用意された粒状の生成物はリステリア属のバ
クテリアへのその抗菌作用を試験するために水化した後
に使用された。管理培養との比較計数は、抗菌作用が非
常に有効であることが示された（固体群の管理が維持さ
れている間、37℃で４時間定温放置後にリステリア属が
総て破壊された）。
実施例 ２ 多糖類の核は実施例１と同様である。
同じ方法によってアシル化が行われたが、より少ない
量、48g、のステアリン酸塩化物を用いる一方、第１の
脂質の層の下方に酸性イオン特性を与えるために4gの無
水コハク酸を追加して行われた。
本実施例で得られる脂肪酸の割合は1.6％であり、そ
の単層はコハク酸のモノエステルで占められた位置を有
する脂肪酸によって構成された。
第２の燐脂質の層およびラクトペルオキシダーゼの結
合は実施例と１と同様にして実施された。
本実施例では、その分析結果は、媒介物に結合されて
いない酵素の割合が僅かに少なく（0.35％）そして特
に、酵素の活性が自由状態における同等な量の酵素の活
性の100％に等しいものであることを示していた。それ
故、これらの試験は、第１の層の部分的なイオン化によ
ってラクトペルオキシダーゼの酵素の活性に対する活性
効果を表していると考えられる。
粒子状抗菌生成物は上述した粒子およびLP系のその他
の成分から前述したようにして製造される。
実施例 ３ 実施例１で製造したラクトペルオキシダーゼを詰め込
まれたバイオ媒介物（biovector）の懸濁液を凍結乾燥
する前に回収した。そこに媒介物の重量の２倍の重量の
マンニトールを加えた。マンニトールを溶解するために
この混合物を攪拌して混合しそしてこの懸濁液を低温
（35℃）で霧化した。
マンニトールを覆う皮膜で第２の層が覆われた粒子が
得られた。この粒子は酵素の効果を遮蔽される一方、こ
の非常に水に溶け易い皮膜が水和によって溶解すること
はない。
この粒子状抗菌生成物は次いで前述したようにその他
の成分と調合される。その非水性媒質における安定性は
非常に良好であり、長期間の保管後でも活性の損失はな
かった。
本発明は一定の好適な特色および実施例について説明
したが、本発明は、本発明の主旨から逸脱することなし
に多くの変化および変形を行うことができ、そして、本
発明は、本発明の主旨および請求の範囲内にある変化、
変形および付随のいずれかおよびすべてを含むことを意
図するものであることを理解されるべきである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/44 Ｃ１２Ｎ 11/10 Ｃ１２Ｎ 11/10 Ａ６１Ｋ 37/50 (72)発明者 ミシェル・デグレ フランス共和国11170 アルゾンヌ・モ ントリョー・“ドメーヌ・ドゥ・ラ・タ ピオ”（番地無し) (56)参考文献 特表 平４−500662（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) A61K 63/00 A61K 9/50 - 9/51 A61K 37/50

Claims (16)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】抗菌LP系の物理化学的特性を修正しそして
    水性媒質に不溶性の粒子形状の抗菌LP系を提供するため
    に、ラクトペルオキシダーゼ酵素／過酸化物、反応性物
    質または微生物である酸素ドナー／酸化可能な基質から
    なる抗菌LP系を用いて粒子状抗菌物質を作るための方法
    であって、 各々の粒子が親水性の多糖類のポリマーで形成された核
    と、該核にヒドロキシ官能基またはその誘導体によって
    化学的に結合された第１の脂質の層と、第２の燐脂質の
    層とからそれぞれ構成された粒子状媒介物に、少なくと
    もLP系のラクトペルオキシダーゼ酵素をその分子が第２
    の燐脂質の層および／または第１の脂質の層に挿入され
    るように結合することと、 粒子状媒介物および該粒子状媒介物と一体になっていな
    いLP系の分子を非水性媒質中で一体化することと から構成されることを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】前記酸素ドナーは活性物質としてオキシダ
    ーゼ酵素を含み、そして該オキシダーゼ酵素分子を粒子
    状媒介物に結合することを特徴とする請求項１記載の製
    造方法。
  3. 【請求項３】ラクトフェリンLFによって増強されたLP系
    を製造するために、ラクトフェリンLFを粒子状媒介物に
    結合することを特徴とする請求項１記載の製造方法。
  4. 【請求項４】ラクトフェリンLFによって増強されたLP系
    を製造するために、非水性媒質の保護剤としてスーパー
    オキシダーゼ酵素SODを含み、該スーパーオキシダーゼ
    酵素SODを粒子状媒介物に結合することを特徴とする請
    求項１記載の製造方法。
  5. 【請求項５】第１の脂質の層にイオン特性を与えるため
    に第１の脂質の層が形成されるときにただちに１つのグ
    ラフト重合体が多糖類の核の表面にイオン反応を行うこ
    とを特徴とする請求項１記載の製造方法。
  6. 【請求項６】粒子に荷電を与えるために粒子状媒介物の
    第２の燐脂質の層に荷電された両親媒性物質の分子を挿
    入することを特徴とする請求項１記載の製造方法。
  7. 【請求項７】アシル化の核（acylic nucleus）を形成
    し、第２の層の燐脂質並びにLP系の構成要素の１つまた
    はそれ以上の成分を前記アシル化された核の存在下に置
    き、そして燐脂質の転移温度付近の温度でそれらを水和
    するために、多糖類にとっては非溶解性である中性媒質
    中で多糖類の核に脂質の層をグラフト重合することによ
    って粒子状媒介物への結合を遂行することを特徴とする
    請求項５記載の製造方法。
  8. 【請求項８】多糖類の核を少量の脂肪酸塩化物および無
    水ジカルボン酸の混合物と反応させることによって脂質
    の層およびそのイオン官能基を糖類の核にグラフト重合
    することを含むことを特徴とする請求項７記載の製造方
    法。
  9. 【請求項９】結合した後に、ポリオロサイド（polyolos
    ide）またはコロイド物質の表面層によって粒子状媒介
    物の粒子を被覆することを特徴とする請求項１記載の製
    造方法。
  10. 【請求項１０】核は澱粉、デキストリン（dextran）お
    よびセルロースからなる群から選定された多糖類のポリ
    マーから作成されることを特徴とする請求項１記載の製
    造方法。
  11. 【請求項１１】第１の脂質の層は第三アミンを触媒とし
    た塩化物または無水の酸の反応によって作成され、これ
    らの化合物は糖類の核と同時にジクロロメタンに拡散さ
    れて反応することを特徴とする請求項１記載の製造方
    法。
  12. 【請求項１２】第１の層を作成するために塩化物および
    炭素原子14と22の間の長鎖脂肪酸の無水物からなる群か
    ら選定された化合物を用いることを含んでいることを特
    徴とする請求項11記載の製造方法。
  13. 【請求項１３】第２の燐脂質の層は大豆レシチン、卵レ
    シチンまたは乳レシチンから選定された動物の燐脂質或
    は植物性オリジン（origin）から作成されることを特徴
    とする請求項１記載の製造方法。
  14. 【請求項１４】ラクトペルオキシダーゼ酵素と、反応性
    物質として酵素を含む酸素ドナーと、必要に応じて用い
    られる酸化可能な基質とからなる粒子状抗菌生成物であ
    って、 少なくともラクトペルオキシダーゼ酵素は、各々が親水
    性の多糖類のポリマーにより構成された核と、ヒドロキ
    シ官能基またはその誘導体によって前記核に化学的に結
    合された第１の脂質の層と、第２の燐脂質の層とからな
    る粒子状媒介物に結合され、 前記ラクトペルオキシダーゼ酵素の分子は第２の燐脂質
    の層および／または第１の脂質の層に挿入される ことを特徴とする生成物。
  15. 【請求項１５】粒子状媒介物に結合されるものはラクト
    フェリンLFおよびスーパーオキシダーゼ酵素（superoxy
    dismutase）SODの化合物の少なくとも１つの分子からな
    ることを特徴とする請求項14記載の粒子状抗菌生成物。
  16. 【請求項１６】第１の脂質の層は基礎的な（subjacen
    t）イオン特性を有することを特徴とする請求項14記載
    の粒子状抗菌生成物。
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