JPS63251092A

JPS63251092A - アルブチンの製造方法

Info

Publication number: JPS63251092A
Application number: JP8527787A
Authority: JP
Inventors: Mineyuki Yokoyama; 峰幸横山; Shinji Inomata; 慎二猪股; Susumu Seto; 瀬戸　進; Mitsuo Yanagi; 柳　光男
Original assignee: Shiseido Co Ltd
Current assignee: Shiseido Co Ltd
Priority date: 1987-04-07
Filing date: 1987-04-07
Publication date: 1988-10-18
Anticipated expiration: 2009-10-26
Also published as: JPH0683675B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は植物のカルスまたは腫瘍組織を用いて効率よく
アルブチンを製造する方法に関する。

［従来の技術１従来アルブチンの製造方法には合成法（米国特許３２０
１３８５）とウルウワシ（Ａｒｃｔｏｓｔａｐｈｙｌｏ
ｓ　　ｕｖａ−ｕｒｓｉ）やコケモモ（Ｖａｃｃｉｎｉ
ｕｍ　　ｖｉｔｉｓ−ｉｄａｅａ）などの天然植物から
抽出する方法が知られていた。また最近、植物の細胞培
養によりアルブチンを製造する方法も公表された（特開
昭６１−１２４３９Ｌ特開昭６２−４４１７４　）。

［発明が解決しようとする問題点］合成法は、（１）グルコースのアセチル化、（２）ハイ
ドロキノンモノベンジルエーテルの縮合、（３）脱アセ
チル化、（４）接触還元による脱ベンジル化の４工程か
らなり非常に繁雑であること、また抽出法については、
天然のウワウルシやコケモモのアルブチン含有量が、そ
れぞれ乾燥重量の５．０〜７．５％、４．０〜７．０％
と少ないうえに抽出の際に大量の鉛を使用する。鉛を使
用する方法は直接人体に摂取されたり、接触するような
医薬、農薬、化粧料添加物などに使用するための物質あ
るいはその原料を製造する方法としては、重金属である
↑ａ混入の危険があり、かつ使用済の重金属を含む廃液
の処理、廃棄などにも難点があり不適当てある。

植物の細胞培養によるアルブチンの製造は、一段階の反
応であるが、培地１店当りのアルブチン収贋は０．７ｇ
あるいはその改良にあっても１．５ｇにとどまっていた
。

［問題点を解決するための手段］上記の事情に鑑み、本発明者らはアルブチンを高収率で
得る組織培養方法について鋭意研究を重ねた結果、植物
のカルス又は腫瘍組織の液体培地にアルブチンの基質で
あるハイドロキノンの他に比較的高濃度の糖を添加する
ことにより、上記目的が達成できることを見出し、この
知見に基づいて本発明を完成するに至った。すなわち本
発明は、一定期間培養（７た植物培養細胞に１５％以下
の糖を添加することを特徴とするアルブチンの製造方法
を提供するものである。

以下、本発明の詳細な説明する。

まずニチニチソウの芽生え（幼植物）の根、胚軸、ｒ葉
、成熟植物の根、茎、葉、葉柄、花、花粉などの細胞群
又は組織片を出発原料として、これを通常の方法にて、
オー・キシンやサイトカイニンを添加した培地で培養す
ればカルスが透導される。

この場−合、材料としていずれの植物の器官の細胞群、
組織を使用しても難易の差はあるがカルスは誘導される
。使用する培地はムラシゲとスクーグ（Ｍｕｒａｓｈ　
ｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ）培地に寒天をよ・ぜたものか通常
用いられるが、これに限らずリンスマ、イヤーとスクー
グ（Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ−Ｓｋｏｏｇ）　、ホワイｈ　
（Ｗｈｉｔｅ）　、ガンボルグ（Ｇａｎｂｏｒｇ）　、
、ニッチ（Ｎｉｔｓｃｈ）、ヘラ−（Ｈｅｌｌｅｒ）　
、、シエンクとヒルデブランド（Ｓｅｈｅｎｋ−Ｈｉｌ
ｄｅｂｒａｎｔ）　、＝　ッチとニッチ（１１ｉｔｓｅ
ｈ−Ｎｉｔｓｃｈ）　、コーレンバッハとシュミット（
Ｋｏｈ　ｌｅｎｂａｃｈ−Ｓｃｈｍ　ｉｄｔ　）などの
いずれの培地を用いてもよい。勿論、寒天を含まない液
体培地でｂカルスは透導できる。また一般にカルス誘導
に「７してはオーキシンが必要とされるが、２，４−ジ
クロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）　、α−ナフタリ
ン酢酸（ＮＡＡ）　、２＋４＋５−トリフロロフェノキ
シ酢酸（２゜４．５−Ｔ）　、インドール酢酸（ＩＡＡ
）などいずれを添加してもよい。士なサイトカイニンも
ゼアチン、６−ペンジルアテ゛ニン、カイネチン、リボ
シルゼアデン、イソペンテニルアデニンなどいずれを添
加してもよい。添加するオーキシンの濃度は、１０−７
Ｍから１０づＭの範囲であり、サイトカイニンの濃度も
１０−６から１０−４の範囲である。この様にして誘導
したカルスは上記培地に寒天を加えない液体培地に植え
継ぎ振とう培養を行なう。もちろん寒天を含む培地でも
カルスは分裂生長する。液体振どう培養では通気のため
に回転式振どう培養機か往復式振どう培養機で常に振と
うする。回転数ば５０ｒｐｍから１５０ｒｐｍの範囲で
あればいずれでもよいが、１１０ｒｐｍ程度が望ましい
。培養中、光は照射してもしなくてもよい。培養温度は
２０℃から３０℃であるが、そのうちでも２６℃程度が
望ましい。カルスζよ週−同所しい培地に植え継ぎ継代
培養する。

アルブチンを得るためにはこの培地に基質であるハイド
ロキノンと糖を添加する。糖の濃度は１５％以下、好手
しくは１％から１０％、更に好ましくは５％から９％が
７士しい。

本発明で用いられる糖としては単糖類、三糖類、三糖類
、四糖類、多糖類、糖アルコール、デオキシ糖、グリカ
ール、アルドン酸、ウロン酸、糖酸、グリコセエン、ア
ンヒドロ糖、アミノ糖又はチオ糖等が挙げられる。下記
にそれらをより具体的に示す。

単糖類としては、グリコールアルデヒド等のジオース、
Ｄ−グリセリンアルデヒド、Ｌ−グリセリンアルデヒド
、ジヒドロキシアセトン等のトリオース、Ｄ−エリトロ
ース、Ｌ−エリト・ロース、Ｄ−トレハース、Ｌ−トレ
オース、Ｄ−エリトルロース、Ｌ−エリトルロース等の
テトロース、Ｄ−アラビノース、Ｌ−アラビノース、Ｄ
−キシロース、Ｄ−リボース、１．−キシルロース、Ｄ
−リブロース等のペント−ス、Ｄ−グルコース、Ｄ−マ
ンノース、Ｄ−ガラクトース、１．−ガラクトース、Ｄ
−フルクトース、Ｌ−ソルボース、Ｄ−タガトース等の
ヘキソース、アルドヘプソース、ヘプツロース等のヘプ
ト−ス、オクトース、ノノース、デコース等が挙げられ
、三糖類としては、トレハロース、サッカロース、マル
ト−・・ス、セロビオース、ゲンチオビオース、ラクト
ース筈が挙げられ、三糖類としては、ラフィノース、ゲ
ンチアノース、メレチトース、マルトトリオース、セロ
トリオース、マン二ノトリオース等が挙げられ、四糖類
としては、スタキオース等が挙げられ、糖アルコールと
しては、エリトリット、アラビット、アドニット、キシ
リット等のペンチット、Ｄ−ソルビット、Ｄ−マンニッ
ト、Ｌ−イジット、ズルシット等のへキシット等が挙げ
られ、デオキシ糖としては、２−デオキシ−Ｄ−リポー
ス、Ｌ−ラムノース、Ｄ−フコース、Ｌ−フコース、Ｄ
−キノボース、ジギトキソース、チベロース、アベコー
ス、パラトース、コリトース、°アスカリロース等が挙
げられ、グリカールをしては、グリカールがＤ−グルカ
ール、Ｄ−ガラクタール等が挙げられ、アルドン酸とし
ては、グルコン酸等が挙げられ、ウロン酸としては、グ
ルクロン酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸等が挙げら
れ、糖酸としては、Ｄ−グルコ糖酸等が挙げられ、グリ
コセエンとしては、メチル−５，６−グルコセエニド、
１．２−Ｄ−グルコセエンテトラ酢酸エステル等が挙げ
られ、アンヒドロ糖としでは、α−グルコンサン、レボ
グルコンサン、３，６−アンピドローＤ−グルコピラノ
ース、キトース等が挙げられ、アミノ糖としては、グル
コサミン、ガラクトサミン等が挙げられ、チオ糖として
は、グルコチオース、チオメチルリボース等が挙げられ
る。

これらの中から一種又は二種以上が任意に選択され、用
いられる。

ハイドロキノンと糖は、新しく植え継いでから細胞の生
重量が５０ｇ／　Ｑ、から３００ｇ／　ｌに士で増殖す
る期間内のいずれの時期に添加してもよいが、好ましく
は１００ｇ／　ｌから２００ｇ／　ｌの間が好ましい。

糖は一回添加すればよいが、ハイドロキノンは一回の投
与量があまり多いと細胞に対し毒性を示すので１０ｍＭ
以下、好ましくは５ｎＭ以下のハイドロキノンを複数回
に渡って投与するのがよい。アルブチンは細胞内に蓄積
きれるが、大量に生産きせると細胞はいずれ死んでしま
い、一部のアルブチンは培養中に出てくる。従って培養
後、細胞及び培地より公知の方法でアルブチンを抽出す
る。

Ｃ実施例コつぎに実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本
発明はこれら実施例にのみ限定されるものではない。

実施例１オーキシン類として２．４−Ｄを２．２Ｘ１０−６Ｍ含
み寒天を含まないリンスマイヤーとスクーグの培地１８
０＋ｎＬずつを５００ｍＱ−三角フラスコに分注したも
のを４５本オートクレーブで滅菌した。使用した培養細
胞は、常法によりニチニチソウの茎より誘導したカルス
を３年以上継代培養したものである。

７日間培養した細胞懸濁液２０ｍｔ　（生重量で２ｇの
培養細胞を含む）を滅菌した培地に植え込み、光無照射
下、回転式振どう培養装置（いわしや生物科学製）を用
いて１１０ｒｐｍで振どう培養を行なった。培養温度は
２６℃とした。

植え込んで７日目（細胞生重量１４２ｇ／　Ｑ、　）に
ハイドロキノン（三井石油化学製）　８８ｍｇを８ｍｌ
の水溶液とし無菌的に細胞懸濁液に添加した。更に無菌
の５０％シュークロースをフラスコ５本ずつに、それぞ
れＯｍｔ、　４ｔｔｄＬ、　５ｖ（Ｌ１１２ｒｎＬ　１
６ｍＭ、　２０ｍＬ。

２４ｍ（Ｌ　、　２８ｍＬ　、　３２ｍＭ−と、容量を
調整するため、３２ｍＭ−になるように無菌水を加えた
。ハイドロキノンとシュークロースを添加後３日間培養
し、再び８８Ｂハイドロキノンを８　ｍＬの水に溶かし
、全てのフラスコに添加した。２日後さらに同量のハイ
ドロキノンを添加し、ざらに１日後、６６ｍｇハイドロ
キノンを溶かした６　ｍＬ溶液を加え、もう２日間培養
した。培養終了後、細胞懸濁液ごとビスコトロン（日音
速理科器械製作所製）で５分間示モジエナイズし、沸騰
湯浴上で２時間湯煎を行なった。これを遠心分離により
上澄液をストックし、沈殿物についてもう一度同じ条件
で湯煎を行なった。

２回の抽出液を東洋ろ紙製Ｎｏ、２のろ紙を使い吸引濾
過により残渣を除いた。その後エバポレーターで濃縮乾
固し、該固形物をクロロホルム、メタノール、水（３０
：１０：　１　）の混合液２０７＋１σに溶かし、これ
をシリカゲルカラム（Ｗａｋｏｇｅｌ　Ｃ−３００和光
純薬製）にかけた。シリカゲルは１５０ｇを上記の混合
液に懸濁し、前もってカラムにつめ平衡化しておいたも
のである。

上記混合液で溶出を行ない、１０ｍηずつの各フラクシ
ヨンの一部をＴ　Ｌ　Ｃ（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ　　６０
　Ｆ　２５４、Ｍｅｒｅｋ製）で分析したＣ展開液は上
記混合液）。

対照としてアルブチン（ｊＬｓ、Ｂｉｏ社製）を同時に
展開した。

アルブチンのスポットが見られるフラクションを集め濃
縮乾固した。該固形物を少里のメタノールで溶かした後
、クロロポルムを順次滴下してぃざ百結晶化をおこなっ
た。それぞれの結晶アルブチンの収量を表１に示した。

表　１実施例２実施例１と同じ条件でニチニチソウの培養を行ない７日
目（細胞生型ｆｆｉ　１２８ｇ／　Ｑ−）にハイドロキ
ノン（三井石油化学製）　８８ｍｇを溶かした８　ｍＱ
−水溶液と５０％グルコースを２８ｄ、無菌的に５本の
細胞懸濁液に添加した。対照として同量のハイドロキノ
ンのみを加えたものも５本作成した。１０本のフラスコ
を；３日間培養した後、実験区、対照区共にＬ　ＯＯｍ
　ｔイＨＱを８　ｍＱ、添加し、さらに２日後もう一度
１００ｍＭＨＱを８　ｍＱ−ずつ添加した。３日後、細
胞懸濁液を実施例１と同じようにホモジエナイズ、アル
ブチン抽出をおこなった。

ハイドロキノンとグルコースを添加した区から６１６±
４９Ｂ、ハイドロキノンのみを添加した区からは１６９
±１２ｍｇのアルブチンを回収した。

実施例３実施例１と同じ条件でニチニチソウの培養をおこない７
日目（ＩＮ（胞生重ｆｉ１３１ｇ、Ｌ）の細胞を使用し
た。糖としてソルビトールを用いた他心よ実施例２と同
じ処理を行なった。実験終了後、実施例１と同じ方法で
アルブチンを抽出した。

アルブチンの収量はハイドロキノンとソルビトールを添
加した区で５９０±３２ｍｇ　、ハイドロキノンのムを
添加した区で１７２±１０ｍｇであった。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）植物のカルス又は腫瘍組織の組織培養培地中にハ
イドロキノンと１５％以下の糖を添加し、培養物よりア
ルブチンを分離採取することを特徴とする植物の組織培
養によるアルブチンの製造方法。
（２）植物がニチニチソウ（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ
　ｒｏｓｅｕｓＬ．）である特許請求の範囲第１項記載
のアルブチンの製造方法。
（３）糖が単糖類、二糖類、三糖類、四糖類、多糖類、
糖アルコール、デオキシ糖、グリカール、アルドン酸、
ウロン酸、糖酸、グリコセエン、アンヒドロ糖、アミノ
糖又はチオ糖である特許請求の範囲第１項記載のアルブ
チンの製造方法。
（４）単糖類がジオース、トリオース、テトロース、ペ
ントース、ヘキソース、ヘプトース、オクトース、ノノ
ース又はデコースである特許請求の範囲第３項記載のア
ルブチンの製造方法。
（５）ジオースがグリコールアルデヒドである特許請求
の範囲第４項記載のアルブチンの製造方法。
（６）トリオースがＤ−グリセリンアルデヒド、Ｌ−グ
リセリンアルデヒド又はジヒドロキシアセトンである特
許請求の範囲第４項記載のアルブチンの製造方法。
（７）テトロースがＤ−エリトロース、Ｌ−エリトロー
ス、Ｄ−トレオース、Ｌ−トレオース、Ｄ−エリトルロ
ース又はＬ−エリトルロースである特許請求の範囲第４
項記載のアルブチンの製造方法。
（８）ペントースがＤ−アラビノース、Ｌ−アラビノー
ス、Ｄ−キシロース、Ｄ−リボース、Ｌ−キシルロース
又はＤ−リブロースである特許請求の範囲第４項記載の
アルブチンの製造方法。
（９）ヘキソースがＤ−グルコース、Ｄ−マンノース、
Ｄ−ガラクトース、Ｌ−ガラクトース、Ｄ−フルクトー
ス、Ｌ−ソルボース又はＤ−タガトースである特許請求
の範囲第４項記載のアルブチンの製造方法。
（１０）ヘプトースがアルドヘプソース又はヘプツロー
スである特許請求の範囲第４項記載のアルブチンの製造
方法。
（１１）二糖類がトレハロース、サッカロース、マルト
ース、セロビオース、ゲンチオビオース又はラクトース
である特許請求の範囲第３項記載のアルブチンの製造方
法。
（１２）三糖類がラフィノース、ゲンチアノース、メレ
チトース、マルトトリオース、セロトリオース又はマン
ニノトリオースである特許請求の範囲第３項記載のアル
ブチンの製造方法。
（１３）四糖類がスタキオースである特許請求の範囲第
３項記載のアルブチンの製造方法。
（１４）糖アルコールがエリトリット、ペンチット、ヘ
キシットである特許請求の範囲第３項記載のアルブチン
の製造方法。
（１５）ペンチットがアラビット、アドニット又はキシ
リットである特許請求の範囲第１４項記載のアルブチン
の製造方法。
（１６）ヘキシットがＤ−ソルビット、Ｄ−マンニット
、Ｌ−イジット又はズルシットである特許請求の範囲第
１４項記載のアルブチンの製造方法。
（１７）デオキシ糖が２−デオキシ−Ｄ−リボース、Ｌ
−ラムノース、Ｄ−フコース、Ｌ−フコース、Ｄ−キシ
ボース、ジギトキソース、チベロース、アベコース、パ
ラトース、コリトース又はアスカリロースである特許請
求の範囲第３項記載のアルブチンの製造方法。
（１８）グリカールがＤ−グルカール又はＤ−ガラクタ
ールである特許請求の範囲第３項記載のアルブチンの製
造方法。
（１９）アルドン酸がグルコン酸である特許請求の範囲
第３項記載のアルブチンの製造方法。
（２０）ウロン酸がグルクロン酸、ガラクツロン酸又は
マンヌロン酸である特許請求の範囲第３項記載のアルブ
チンの製造方法。
（２１）糖酸がＤ−グルコ糖酸である特許請求の範囲第
３項記載のアルブチンの製造方法。
（２２）グリコセエンがメチル−５，６−グルコセエニ
ド又は１，２−Ｄ−グルコセエンテトラ酢酸エステルで
ある特許請求の範囲第３項記載のアルブチンの製造方法
。
（２３）アンヒドロ糖がα−グルコンサン、レボグルコ
ンサン、３，６−アンヒドロ−Ｄ−グルコピラノース又
はキトースである特許請求の範囲第３項記載のアルブチ
ンの製造方法。
（２４）アミノ糖がグルコサミン又はガラクトサミンで
ある特許請求の範囲第３項記載のアルブチンの製造方法
。
（２５）チオ糖がグルコチオース又はチオメチルリボー
スである特許請求の範囲第３項記載のアルブチンの製造
方法。