JPH0683675B2 - アルブチンの製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は植物のカルスまたは腫瘍組織を用いて効率よく
アルブチンを製造する方法に関する。

［従来の技術］ 従来アルブチンの製造方法には合成法（米国特許320138
5）とウルウワシ（Arctostaphylos uva-ursi）やコケモ
モ（Vaccinium vitis−idaea）などの天然植物から抽出
する方法が知られていた。また最近、植物の細胞培養に
よりアルブチンを製造する方法も公表された（特開昭61
−124391、特開昭62−44174）。

［発明が解決しようとする問題点］ 合成法は、(1)グルコースのアセチル化、(2)ハイドロキ
ノンモノベンジルエーテルの縮合、(3)脱アセチル化、
(4)接触還元による脱ベンジル化の４工程からなり非常
に繁雑であること、また抽出法については、天然のウワ
ウルシやコケモモのアルブチン含有量が、それぞれ乾燥
重量の5.0〜7.5％、4.0〜7.0％と少ないうえに抽出の際
に大量の鉛を使用する。鉛を使用する方法は直接人体に
摂取されたり、接触するような医薬、農薬、化粧料添加
物などに使用するための物質あるいはその原料を製造す
る方法としては、重金属である鉛混入の危険があり、か
つ使用済の重金属を含む廃液の処理、廃棄などにも難点
があり不適当である。

植物の細胞培養によるアルブチンの製造は一段階の反応
であるが、培地１当りのアルブチン収量は0.7gあるい
はその改良にあっても1.5gにとどまっていた。

［問題点を解決するための手段］ 上記の事情に鑑み、本発明者らはアルブチンを高収率で
得る組織培養方法について鋭意研究を重ねた結果、植物
のカルス又は腫瘍組織の液体培地にアルブチンの基質で
あるハイドロキノンの他に比較的高濃度の糖を添加する
ことにより、上記目的が達成できることを見出し、この
知見に基づいて本発明を完成するに至った。すなわち本
発明は一定期間培養した植物培養細胞に15％以下の糖を
添加することを特徴とするアルブチンの製造方法を提供
するものである。

以下、本発明を詳細に説明する。

まずニチニチソウの芽生え（幼植物）の根、胚軸、子
葉、成熟植物の根、茎、葉、葉柄、花、花粉などの細胞
群又は組織片を出発原料として、これを通常の方法に
て、オーキシンやサイトカイニンを添加した培地で培養
すればカルスが誘導される。この場合、材料としていず
れの植物の器官の細胞群、組織を使用しても難易の差は
あるがカルスは誘導される。使用する培地はムラシゲと
スクーグ（Murashige-Skoog）培地に寒天をまぜたもの
が通常用いられるが、これに限らずリンスマイヤーとス
クーグ（Linsmaier-Skoog）、ホワイト（White）、ガン
ボルグ（Ganborg）、ニッチ（Nitsch）、ヘラー（Helle
r）、シェンクとヒルデブラント（Schenk-Hildebran
t）、ニッチとニッチ（Nitsch-Nitsch）、コーレンバッ
ハとシュミット（Kohlenbach-Schmidt）などのいずれの
培地を用いてもよい。勿論、寒天を含まない液体培地で
もカルスは誘導できる。また一般にカルス誘導に際して
はオーキシンが必要とされるが、2,4−ジクロロフェノ
キシ酢酸（2,4−Ｄ）、α−ナフタリン酢酸（NAA）、2,
4,5−トリフロロフェノキシ酢酸（2,4,5−Ｔ）、インド
ール酢酸（IAA）などいずれを添加してもよい。またサ
イトカイニンもゼアチン、６−ベンジルアデニン、カイ
ネチン、リボシルゼアチン、イソベンテニルアデニンな
どいずれを添加してもよい。添加するオーキシンの濃度
は、10^-7Ｍから10^-5Ｍの範囲であり、サイトカイニンの
濃度も10^-8から10^-4の範囲である。この様にして誘導し
たカルスは上記培地に寒天を加えない液体培地に植え継
ぎ振とう培養を行なう。もちろん寒天を含む培地でもカ
ルスは分裂生長する。液体振とう培養では通気のために
回転式振とう培養機か往復式振とう培養機で常に振とう
する。回転数は50rpmから150rpmの範囲であればいずれ
でもよいが、110rpm程度が望ましい。培養中、光は照射
してもしなくてもよい。培養温度は20℃から30℃である
が、そのうちでも26℃程度が望ましい。カルスは週一回
新しい培地に植え継ぎ継代培養する。アルブチンを得る
ためにはこの培地に基質であるハイドロキノンと糖を添
加する。糖の濃度は、15％（w/v培地）以下、好ましく
は１％から10％、さらに好ましくは５％から９％が望ま
しい。

本発明で用いられる糖としては単糖類、二糖類、三糖
類、四糖類、多糖類、糖アルコール、デオキシ糖、グリ
カール、アルドン酸、ウロン酸、糖酸、グリコセエン、
アンヒドロ糖、アミノ糖又はチオ糖等が挙げられる。下
記にそれらをより具体的に示す。

単糖類としては、グリコールアルデヒド等のジオース、
Ｄ−グリセリンアルデヒド、Ｌ−グリセリンアルデヒ
ド、ジヒドロキシアセトン等のトリオース、Ｄ−エリト
ロース、Ｌ−エリトロース、Ｄ−トレオース、Ｌ−トレ
オース、Ｄ−エリトルロース、Ｌ−エリトルロース等の
テトロース、Ｄ−アラビノース、Ｌ−アラビノース、Ｄ
−キシロース、Ｄ−リボース、Ｌ−キシルロース、Ｄ−
リブロース等のペントース、Ｄ−グルコース、Ｄ−マン
ノース、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−ガラクトース、Ｄ−フ
ルクトース、Ｌ−ソルボース、Ｄ−タガトース等のヘキ
ソース、アルドヘプソース、ヘプツロース等のヘプトー
ス、オクトース、ノノース、デコース等が挙げられ、二
糖類としては、トレハロース、サッカロース、マルトー
ス、セロビオース、ゲンチオビオース、ラクトース等が
挙げられ、三糖類としては、ラフィノース、ゲンチアノ
ース、メレチトース、マルトトリオース、セロトリオー
ス、マンニノトリオース等が挙げられ、四糖類として
は、スタキオース等が挙げられ、糖アルコールとして
は、エリトリット、アラビット、アドニット、キシリッ
ト等のペンチット、Ｄ−ソルビット、Ｄ−マンニット、
Ｌ−イジット、ズルシット等のヘキシット等が挙げら
れ、デオキシ糖としては、２−デオキシ−Ｄ−リボー
ス、Ｌ−ラムノース、Ｄ−フコース、Ｌ−フコース、Ｄ
−キノボース、ジギトキソース、チベロース、アベコー
ス、パラトース、コリトース、アスカリロース等が挙げ
られ、グリカールとしては、グリカールがＤ−グルカー
ル、Ｄ−ガラクタール等が挙げられ、アルドン酸として
は、グルコン酸等が挙げられ、ウロン酸としては、グル
クロン酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸等が挙げら
れ、糖酸としては、Ｄ−グルコ糖酸等が挙げられ、グリ
コセエンとしては、メチル−5,6−グルコセエニド、1,2
−Ｄ−グルコセエンテトラ酢酸エステル等が挙げられ、
アンヒドロ糖としては、α−グルコンサン、レボグルコ
ンサン、3,6−アンヒドロ−Ｄ−グルコピラノース、キ
トース等が挙げられ、アミノ糖としては、グルコサミ
ン、ガラクトサミン等が挙げられ、チオ糖としては、グ
ルコチオース、チオメチルリボース等が挙げられる。

これらの中から一種又は二種以上が任意に選択され、用
いられる。

ハイドロキノンと糖は、新しく植え継いでから細胞の生
重量が50g/から300g/にまで増殖する期間内のいず
れの時期に添加してもよいが、好ましくは100g/から2
00g/の間が好ましい。糖は一回添加すればよいが、ハ
イドロキノンは一回の投与量があまり多いと細胞に対し
毒性を示すので10mM以下、好ましくは5mM以下のハイド
ロキノンを複数回に渡って投与するのがよい。アルブチ
ンは細胞内に蓄積されるが、大量に生産させると細胞は
いずれ死んでしまい、一部のアルブチンは細胞中に出て
くる。従って培養後、細胞及び培地より公知の方法でア
ルブチンを抽出する。

［実施例］ つぎに実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本
発明はこれら実施例にのみ限定されるものではない。

実施例１ オーキシン類として2,4−Ｄを2.2×10^-6Ｍ含み寒天を含
まないリンスマイヤーとスクーグの培地180mlずつを500
ml三角フラスコに分注したものを45本オートクレーブで
滅菌した。使用した培養細胞は、常法によりニチニチソ
ウの茎より誘導したカルスを３年以上継代培養したもの
である。

７日間培養した細胞懸濁液20ml（生重量で2gの培養細胞
を含む）を滅菌した培地に植え込み、光無照射下、回転
式振とう培養装置（いわしや生物科学製）を用いて110r
pmで振とう培養を行なった。培養温度は26℃とした。

植え込んで７日目（細胞生重量142g/）にハイドロキ
ノン（三井石油化学製）88mgを8mlの水溶液とし無菌的
に細胞懸濁液に添加した。更に無菌の50％シュークロー
スをフラスコ５本ずつに、それぞれ0ml、4ml、8ml、12m
l、16ml、20ml、24ml、28ml、32mlと、容量を調整する
ため、32mlになるように無菌水を加えた。ハイドロキノ
ンとシュークロースを添加後３日間培養し、再び88mgハ
イドロキノンを8mlの水に溶かし、全てのフラスコに添
加した。２日後さらに同量のハイドロキノンを添加し、
さらに１日後、66mgハイドロキノンを溶かした6ml溶液
を加え、もう２日間培養した。培養終了後、細胞懸濁液
ごとヒスコトロン（日音速理科器械製作所製）で５分間
ホモジェナイズし、沸騰湯浴上で２時間湯煎を行なっ
た。これを遠心分離により上澄液をストックし、沈殿物
についてもう一度同じ条件で湯煎を行なった。

２回の抽出液を東洋ろ紙製No.2のろ紙を使い吸引濾過に
より残渣を除いた。その後エバポレーターで濃縮乾固
し、該固形物をクロロホルム、メタノール、水（30:10:
1）の混合液20mlに溶かし、これをシリカゲルカラム（W
akogel C−300 和光純薬製）にかけた。シリカゲルは1
50gを上記の混合液に懸濁し、前もってカラムにつめ平
衡化しておいたものである。

上記混合液で溶出を行ない、10mlずつの各フラクション
の一部をTLC（Kieselgel 60F254、Merck製）で分析した
（展開液は上記混合液）。対照としてアルブチン（U.S.
Bio社製）を同時に展開した。

アルブチンのスポットが見られるフラクションを集め濃
縮乾固した。該固形物を少量のメタノールで溶かした
後、クロロホルムを順次滴下していき再結晶化をおこな
った。それぞれの結晶アルブチンの収量を表１に示し
た。

なお、同様の条件で50％シュークロース溶液28mlを植え
継ぎから２日目（生重量20g/l）に添加した場合には、
アルブチンの生産量は450mg/l培養液に減少してしま
い、７日目添加と比較しては無論、シュークロースを添
加しない場合と比較してもアルブチンの生産量が低く、
むしろ逆効果となる。

実施例２ 実施例１と同じ条件でニチニチソウの培養を行ない７日
目（細胞生重量128g/l）にハイドロキノン（三井石油化
学製）88mgを溶かした8ml水溶液と50％グルコースを28m
l（対培地グルコース濃度5.8w/v％）、無菌的に５本の
細胞懸濁液に添加した。対照として同量のハイドロキノ
ンのみを加えたものも５本作成した。10本のフラスコを
３日間培養した後、実験区、対照区共に100mM HQを8ml
添加し、さらに２日後もう一度100mM HQを8mlずつ添加
した。３日後、細胞懸濁液を実施例１と同じようにホモ
ジェナイズ、アルブチン抽出をおこなった。

ハイドロキノンとグルコースを添加した区から616±49m
g、ハイドロキノンのみを添加した区からは169±12mgの
アルブチンを回収した。

実施例３ 実施例１と同じ条件でニチニチソウの培養をおこない７
日目（細胞生重量131g/）の細胞を使用した。糖とし
てソルビトールを用いた他は実施例２と同じ処理を行な
った。実験終了後、実施例１と同じ方法でアルブチンを
抽出した。

アルブチンの収量はハイドロキノンとソルビトールを添
加した区で590±32mg、ハイドロキノンのみを添加した
区で172±10mgであった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 柳 光男 神奈川県横浜市港北区新羽町1050番地 株 式会社資生堂研究所内 (56)参考文献 特開 昭61−124391（ＪＰ，Ａ)

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ニチニチソウ（Catharanthus roseus L.）
   のカルスの組織培養培地中にハイドロキノンと、新しく
   植え継いでから細胞の生重量が50g/l培地〜300g/l培地
   に増殖する期間内に対培地15w/v％以下の糖を添加し、
   培養物よりアルブチンを分離採取することを特徴とする
   植物の組織培養によるアルブチンの製造方法。
2. 【請求項２】糖が単糖類、二糖類、三糖類、四糖類、多
   糖類、糖アルコール、デオキシ糖、グリカール、アルド
   ン酸、ウロン酸、糖酸、グリコセエン、アンヒドロ糖、
   アミノ糖又はチオ糖である特許請求の範囲第１項記載の
   アルブチンの製造方法。
3. 【請求項３】単糖類がジオース、トリオース、テトロー
   ス、ペントース、ヘキソース、ヘプトース、オクトー
   ス、ノノース又はデコースである特許請求の範囲第２項
   記載のアルブチンの製造方法。
4. 【請求項４】ジオースがグリコールアルデヒドである特
   許請求の範囲第３項記載のアルブチンの製造方法。
5. 【請求項５】トリオースがＤ−グリセリンアルデヒド、
   Ｌ−グリセリンアルデヒド又はジヒドロキシアセトンで
   ある特許請求の範囲第３項記載のアルブチンの製造方
   法。
6. 【請求項６】テトロースがＤ−エリトロース、Ｌ−エリ
   トロース、Ｄ−トレオース、Ｌ−トレオース、Ｄ−エリ
   トルロース又はＬ−エリトルロースである特許請求の範
   囲第３項記載のアルブチンの製造方法。
7. 【請求項７】ペントースがＤ−アラビノース、Ｌ−アラ
   ビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−リボース、Ｌ−キシル
   ロース又はＤ−リブロースである特許請求の範囲第３項
   記載のアルブチンの製造方法。
8. 【請求項８】ヘキソースがＤ−グルコース、Ｄ−マンノ
   ース、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−ガラクトース、Ｄ−フル
   クトース、Ｌ−ソルボース又はＤ−タガトースである特
   許請求の範囲第３項記載のアルブチンの製造方法。
9. 【請求項９】ヘプトースがアルドヘプソース又はヘプツ
   ロースである特許請求の範囲第３項記載のアルブチンの
   製造方法。
10. 【請求項１０】二糖類がトレハロース、サッカロース、
    マルトース、セロビオース、ゲンチオビオース又はラク
    トースである特許請求の範囲第２項記載のアルブチンの
    製造方法。
11. 【請求項１１】三糖類がラフィノース、ゲンチアノー
    ス、メレチトース、マルトトリオース、セロトリオース
    又はマンニノトリオースである特許請求の範囲第２項記
    載のアルブチンの製造方法。
12. 【請求項１２】四糖類がスタキオースである特許請求の
    範囲第２項記載のアルブチンの製造方法。
13. 【請求項１３】糖アルコールがエリトリット、ペンチッ
    ト、ヘキシットである特許請求の範囲第２項記載のアル
    ブチンの製造方法。
14. 【請求項１４】ペンチットがアラビット、アドニット又
    はキシリットである特許請求の範囲第13項記載のアルブ
    チンの製造方法。
15. 【請求項１５】ヘキシットがＤ−ソルビット、Ｄ−マン
    ニット、Ｌ−イジット又はズルシットである特許請求の
    範囲第13項記載のアルブチンの製造方法。
16. 【請求項１６】デオキシ糖が２−デオキシ−Ｄ−リボー
    ス、Ｌ−ラムノース、Ｄ−フコース、Ｌ−フコース、Ｄ
    −キシボース、ジギトキソース、チベロース、アベコー
    ス、パラトース、コリトース又はアスカリロースである
    特許請求の範囲第２項記載のアルブチンの製造方法。
17. 【請求項１７】グリカールがＤ−グリカール、又はＤ−
    ガラクタールである特許請求の範囲第２項記載のアルブ
    チンの製造方法。
18. 【請求項１８】アルドン酸がグルコン酸である特許請求
    の範囲第２項記載のアルブチンの製造方法。
19. 【請求項１９】ウロン酸がグルクロン酸、ガラクツロン
    酸又はマンヌロン酸である特許請求の範囲第２項記載の
    アルブチンの製造方法。
20. 【請求項２０】糖酸がＤ−グルコ糖酸である特許請求の
    範囲第２項記載のアルブチンの製造方法。
21. 【請求項２１】グルコセエンがメチル−5,6−グルコセ
    エニド又は1,2−Ｄ−グルコセエンテトラ酢酸エステル
    である特許請求の範囲第２項記載のアルブチンの製造方
    法。
22. 【請求項２２】アンヒドロ糖がα−グルコンサン、レボ
    グルコンサン、3,6−アンヒドロ−Ｄ−グルコピラノー
    ス又はキトースである特許請求の範囲第２項記載のアル
    ブチンの製造方法。
23. 【請求項２３】アミノ糖がグルコサミン又はガラクトサ
    ミンである特許請求の範囲第２項記載のアルブチンの製
    造方法。
24. 【請求項２４】チオ糖がグルコチオース又はチオメチル
    リボースである特許請求の範囲第２項記載のアルブチン
    の製造方法。