JPH04131091A - フェノール類配糖体の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はフェノール類配糖体の製造方法、特に植物のカ
ルス又は腫瘍組織を用いる製造方法の改良に関する。

［従来の技術］ 近年、各種フェノール頚配糖体の生体に及ぼす作用が明
らかとなりつつあり、例えばアルブチンには極めて優れ
た肌の美白効果があるところから化粧品等への応用が行
なわれている。

このため、フェノール類配糖体の効率的な製造方法が各
種摸索されており、例えばアルブチンの製造方法として
は合成法（米国特許３２０１３８５）が開発されている
。

しかしながら、この合成法は（１）グルコースのアセチ
ル化、（２）ハイドロキノンモノベンジルエーテルの縮
合、（３）脱アセチル化、（４）接触還元による脱ベン
ジル化の４工程からなり、非常に作業が煩雑であるとい
う欠点を有していた。

また、ウワウルシ（Ａｒｃｔｏｓｔａｐｈｙｌｏｓ　ｕ
ｖａ−ｕｒｓｉＳｐｒｅｎｇｅｌ）やコケモモ（Ｖａｃ
ｃｉｎｉｕｎ　ｖｉｔｉｓ−ｉｄａｅａ）等の天然植物
からアルブチンを抽出する方法も開発されている。

しかしながら、天然植物からアルブチン等を抽出する方
法は、天然のウワウルシやコケモモのアルブチン含有量
が、それぞれ乾燥重量の５．０〜７゜５％、４．０〜７
．０％と少ないため、効率的な製造を行なうことが困難
である。

しかも、アルブチン抽出の際に大量の鉛を使用するため
、医薬あるいは化粧料添加物等、直接人体に摂取された
り接触するような用途に用いるアルブチン原料の製造方
法としては適当でない。すなわち、アルブチン製造段階
で重金属である鉛混入の危険があり、かつ使用済みの重
金属を含む廃液の処理、廃棄などにも難点があり、工業
的製造にはなお各種の問題が残されていた。

これに対し、最近、植物の培養細胞によりアルブチン等
のフェノール類配糖体を製造する方法が注目を集めてい
る。

このような植物組織培養法によるフェノール類配糖体の
製造例としては、アルブチン（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ　１５：１２２５−１２２９（１９７６）、特開
昭６１−１２４３９１等）、アルキルハイドロキノン配
糖体（特開昭６２−１８１７９５）　、サリチル酸配糖
体（Ｉｎ　Ｐｒｏｃ、　５ｔｈ　Ｉｎｔｌ、　Ｃｏｎｇ
、　Ｐｌａｎｔ　Ｔｉ５ｓｕｅ　＆　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１
ｔｕｒｅ　ｐ、３８３−３８４　（１９８２）Ｌペンタ
クロロフェノール配糖体（Ｚ、　Ｐｆｌａｎｚｅｎｐｈ
ｙｓｉｏｌ、　１１３：；’０ｌ−２１１（１９８４）
）、ニスキュレチン配糖体（Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｔ
ｉ５ｓｕｅ　Ｏｒｇａｎ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　３：３−９
（１９８４））、ウンベリフェロン（Ｉｎ　Ｐｒｏｃ、
５ｔｈ　　Ｉｎｔｌ、Ｃｏｎｇ、Ｐｌａｎｔ　Ｔｉ５ｓ
ｕｅ　＆　Ｃｅ１ｌ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　ｐ、３８３−
３８４（１９８２））等が知られている。

この様な植物組織培養法によるフェノール類配糖体の製
造方法は、基質を加えると一段階で反応が生じ工程が非
常に単純である他、高熱あるいは重金属を使用する必要
もない等、フェノール類の工業的生産を行なう上で各種
の利点を有している。

更に本発明者らは、これまでにアルブチンを含めたフェ
ノール類配糖体の収量を増加きせる技術として糖の添加
法（特開昭６３−２５１０９２）、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１
１　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　ｐ、５５１−５５５（１９
９０））、低濃度ハイドロキノンの連続添加法（特開平
１−２６９４９８）、等を発表してきた。

［発明が解決しようとする課題］ 従来技術の問題点 しかしながら、上記の研究をもってしても、なお植物組
織培養法を用いるフェノール類配糖体の製造において、
その生成量を十分に確保することはでさなかった。それ
は植物培養細胞を用いる場合、どのような培養ステージ
の細胞を用いたときにもっとも効率よくフェノール類配
糖体が生成されるかが判らなかったからである。

発明の目的 本発明は前記従来技術の課題に鑑みなされたものであり
、その目的は植物Ｍ！ｌ培養法を用いて効率的にフェノ
ール類配糖体を製造することのできるフェノール類配糖
体の製造方法を提供することにある。

前記目的を達成すべく、本発明者らが鋭意研究を重ねた
結果、植物のカルス又は腫瘍組織は、培養の各ステージ
で、その配糖化能力が著しく異なることを見い出し、更
に配糖化能力に適した細胞を用いればこれまでよりも安
定して、収率も大幅に高まることを見い出し、本発明を
完成するに至った。

［課題を解決するための手段］ すなわち請求項１記戦の発明は、植物のカルス又は腫瘍
ＭＩＨの植物培養培地中で、培養細胞を細胞分裂が終了
するまで培養し、その培養物をフェノール類の入った新
鮮培地中に移し、培養物よりフェノール類配糖体を分離
採取することを特徴とするフェノール類配糖体の製造方
法であり、請求項２記載の発明は、植物細胞がニチニチ
ソウの細胞である請求項１記載のフェノール類配糖体の
製造方法である。

以下本発明の構成をざらに詳細に説明する。

本発明に使用する植物細胞の植物としてはその細胞がフ
ェノール類存在下での培養でフェノール類配糖体生産能
を有するものであればいずれの植物でもよく、例を挙げ
るとニチニチソウ、ダツラが好適に用いられる。

また、本発明に使用する植物細胞の細胞とは植物の芽ば
え（幼植物）の根、胚軸、子葉、成熟植物の根、茎、葉
、葉柄、花、花粉などの細胞群又は組織片を出発原料と
して、これを通常の方法にて、オーキシンやサイトカイ
ニンを添加した培地で培養したカルスやＡｇｒｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｉｉ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓやＡｇｒｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ　ｖｈｉｚｏｅｎｅｓなどを用いて常
法により誘導された腫瘍組織等が挙げられる。

この場合、難易の差はあるが、材料としていずれの植物
の器官の細胞群、組織を使用してもカルスは誘導される
。

このようにして誘導された植物細胞はムラシゲ−スクー
グ（Ｍｕｒａｓｈ　ｉｎｅ−Ｓｋｏｏｇ）培地に寒天を
まぜたものを始め、リンスマイヤー−スクーグ（Ｌｉｎ
ｓｍａ　ｉｅｒ−Ｓｋｏｏｇ）、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ
）、ガンボルグ（Ｇａｎｂｏｒｇ）、ニッチ（旧ｔｓｃ
ｈ）、ヘラ−（Ｈｅ　ｌ　１ｅｒ）、シエンクーヒルデ
プラント（Ｓｃｈｅｎｋ−Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｔ）、ニ
ッチ−ニッチ（Ｎｉｔｓｃｈ−旧ｔｓｃｈ）、コーレン
バッハーシュミット（Ｋｏｈｌｅｎｂａｃｈ　Ｓｃｈ＋
１ｄｔ）等の任意の、植物の細胞培養に通常使用される
培地に植え継ぎ植培養用の培養槽を用いて培養を行なう
。無論、寒天を含まない液体培地でもカルスは誘導され
る。

培養槽の形式は通気撹拌型、エアーリフト型、回転式円
筒型等いずれの形式であっても良いが、その中でも通気
撹拌型が好ましい。

一般にカルス誘導に際してはオーキシンが必要とされる
が、２，４−ジクロロフェノキシ酸（２，４−Ｄ）　　
α−ナフタリン酢酸（ＮＡＡ）　　２，４．５−１リフ
ロロフエノキシ酢酸（２，４，５−Ｔ）　　インドール
酸酢　（ＩＡＡ）などを用いることも可能である。

また、サイトカイニン、ゼアチン、６−ベンジルアデニ
ン、カイネチン、リボシルゼアチン、イソペンテニルア
デニンなどのいずれを添加することも可能である。

オーキシンを添加する場合の濃度は１０−７Ｍから１０
−５Ｍの範囲であり、サイトカイニンを用いる場合の濃
度は１０″８Ｍから１０−４Ｍの範囲である。

この様にして誘導したカルスは上記培地に寒天を加えな
い液体培地を植え継ぎ、振どう培養を行う。腫瘍組織も
同様に振どう培養ができるが、その場合、一般に植物ホ
ルモンは必要ない。もちろん寒天を含む培地でもカルス
又は、腫瘍組織は分裂成長する。

液体振どう培養では通気のために回転式振とう培養機か
往復大振どう培養機で常時振どうを継続する。回転数は
５０ｒｐＨ＋から１５０ｒｐＩ１１の範囲が好ましく、
特に１１０ｒｐｍ程度が好ましい。

培養中、光は照射してもしなくてもよい。光を照射する
場合、光の照射条件は通常１０００ルクスから１０００
０ルクスである。

また、培養温度は２０℃から３０℃が好適であるが、そ
のうちでも特に２０〜２６℃が望ましい。

カルス又は、腫瘍組織（以下、まとめて培養細胞という
）は週−刷新しい培地に植え継ぎ継代培養する。

本発明においてフェノール類配糖体を得るには一定期間
培養した細胞に基質であるフェノール類を添加するが、
そのフェノール類は、最終目的物であるフェノール類配
糖体に応じて任意に選択される。

例えばモノフェノール類としては、フェノール（Ｐｈｅ
ｎｏｌ）、パラ−ハイドロキシ安息香酸（ｐ−Ｈｙｄｒ
ｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ　ａｃｉｄ）、オルト−ハイドロ
キシフェニール酢酸（ｏ−Ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ
ａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ）、メタ−ハイドロキシフェニ
ール酢酸（ｍ−Ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｃｅｔｉ
ｃ　ａｃｉｄ）、バラーハイドロキシフェニール＃酸（
ｐ−Ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｃｅｔｉｃ　ａｃｉ
ｄ）、パラ−ハイドロキシアセトフェノン（ｐ−Ｈｙｄ
ｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ）、オルト−フマル
酸（ｏ−Ｃｏｕｍａｒｉｃ　ａｃｉｄ）、パラ−フマル
酸（ｐ−Ｃｏｕ＋ａａｒｉｃ　ａｃｉｄ）、２，４−ジ
クロロフェノール（２，４−Ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎ
ｏｌ）などがあげられる。

また、ジフェノール類としては、カテコール（Ｃａｔｅ
ｃｈｏｌ）、オルト−メトキシフェノール（ｏ−Ｍｅｔ
ｈｏｘｙｐｈｅｎｏｌ　　グアイアコール）、パラ−メ
トキシフェノール（ｐ−Ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｏｌ）
、バニリン酸（Ｖａｎｉｌｌｉｃ　ａｃｉｄ）、フェル
リン酸（Ｆｅｒｕｌｉｃ　ａｃｉｄ）、カフェイン酸（
Ｃａｆｆｅｉｃ　ａｃｉｄ）、クロロゲン酸（Ｃｈｌｏ
ｒｏｇｅｎｉｃ　ａｃｉｄ）、レゾルシノール（Ｒｅｓ
ｏｒｃｉｎｏｌ）、３．５−ジヒドロキシ安思香酸（３
，５−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ　ａｃｉｄ）
、２，６−ジヒドロキシ安息香酸（２，６−Ｄｉｈｙｄ
ｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ　ａｃｉｄ）、３゜４−ジヒド
ロキシ安思香酸（３、４−Ｄ　１ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎ
ｚ。

ｉｃ　ａｃｉｄ　　ブロトカテク酸）　ハイドロキノン
（Ｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｎｅ）、２．５−ジヒドロキシ
安息香−（２，５−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ
　ａｃｉｄ）などがあげらオる。

また、クマリン類として、スコボレチン（Ｓｃｏｐｌｅ
ｔｉｎ）、スコボリン（Ｓｃｏｐｏｌｉｎ）　、ランベ
リフコロン（Ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ）　、ｘスク
リン（Ｅｓｃｕｌｉｎ）等や、フラボノイド類としてフ
ラボン（Ｆｌａｖ。

ｅ）、ケルセチン（Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ）　、ミリセチ
ン（Ｍｒｉｃｅｔｉｎ）　、ケンベロ−ル（Ｋａｅｍｐ
ｆｅｒｏｌ）　、ルヲン（Ｒｕｔｉｎ）　、などを用い
ることができる。

本発明において特徴的なことの一つは、図−１から明ら
かなように、配糖化に適した培養細胞σステージを発見
した事、すなわち植物細胞をそＣ細胞分裂が終了するま
で培養した細胞に非常に局い配糖化能力があること。更
にはその培養細胞を新鮮培地に移し、同時に基質である
フェノール類を添加することにより、効率的にフェノー
ル類氏糖体を製造することができるものである。

フェノール類配糖体は細胞内に蓄積されるが、大量に生
産させると細胞はいずれ死んでしまい、一部のフェノー
ル類配糖体は＠養液中に出てくる。したがって、培養後
細胞及び培地より公知の方法でフェノール顕配糖体を抽
出すればよい。

［発明の効果］ 以上説明したように、本発明にかかるフェノール類配糖
体の製造方法によれば、フェノール類配糖体の製造に用
いる培養細胞の培養期間をコントロールすることとした
ので、効率的にフェノール類配糖体を製造することが可
能となる。

［実施例］ 次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし
本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

１１星ニ オーキシン類として２．４−Ｄを２．２Ｘ１０−もＭ含
み寒天を含まないリンスマイヤーとスクーグの培地１８
０ｉｌずつを、５００Ｉ１１三角フラスコに分注したも
のをオートクレーブで滅菌した。

そして、７日間培養したニチニチソウ（Ｃａｔｈａｒａ
ｊｎｔｈｕｓ　ｒｏｓｅｕｓ）細胞懸濁液２０＋ｎｌ　
（生重量で２ｇの培養細胞を含む）を滅菌した培地に植
え込み、光無照射下、回転式振とう培養装置（いわしゃ
生物科学製）を用いて１１０ｒｐ膳で振どう培養を行っ
た。

なお、培養温度は２６℃とした。

そして植え込んで３日目（３３，２ｇを細胞生重量／ｌ
）、４日目（６４，６ｇ　１８Ｉ！生重量／ｌ）、５日
目（８７，５ｇ１ｌｌ胞生重量）、６日目（１３１ｇ細
胞生重量／ｌ）、７日目（１４６ｇ細胞生重量／１）、
８日目（１８５ｇ　Ｉｆ胞生重量）の培養１ｌＩｉ胞を
９８のナイロンメツシュでフィルトレージョンし、２０
鳳ｌの上記と同じリンスマイヤーとスクーグの培地が入
フた１００ｍ１フラスコに約２．８ｇずつを植えた。ハ
イドロキノン（三井石油化学製）２２０謙ｇを１０ｍ１
の水溶液とし、無菌的に細胞懸濁液に０　、２ｙｒ　ｌ
づつ加えた。ハイドロキノンは最初に添加した日から毎
日１回づつ、計４回添加した。

培養終了後、細胞懸濁液ごとポリトロン（Ｋｉｎｅｍａ
ｔｉｃａ製）で２０秒間ホモジナイズし、これを遠心機
（日立製）にかけた後、上澄液を高圧液体クロマトグラ
フィー（ＨＰＬＣ）で分析した。ＨＰＬＣＬｔＬＣ１０
０システム（横河電機製）を用い、カラムはカプセルバ
ックＣ＋ｓ（４ｓｏｍ径、資生堂製）、移動相は５％メ
チルアルコール、検出はＵｖ２３０で分析した。

実施例２ 実施例１と同様の実験を行った。ただし、実験開始日、
つまり新鮮培地交換とハイドロキノンの添加開始日は６
日目（１００ｇ細胞生重量／１）、７日目（１４８ｇ細
胞生重量／Ｉ）　、８日目（１８１ｇ細胞生重量／２）
、９日目（２３８ｇ細胞生重量／ｌ）　、１００日目２
７７　ｇ　／　ｌ　）である。

比較例１ 実施例１と同じ実験開始日を用いた。ただし培地は、新
鮮培地交換せず、ニチニチソウの培養細胞の培養に用い
ていたもの（Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ　ｉ＋ｅｄｉｕ園
）を用いた。

実施例１．２及び比較例１の結果を表−１に示す。

前記表−１から明らかなように本発明の製造方法は配糖
化に最も適した培養細胞のステージ、すなわち細胞分裂
が終了するまで培養した細胞を新鮮培地に移し、ハイド
ロキノンを添加し、配糖化しているので、新鮮培地交換
をしない比較例１に比ペアルブチン収量が有意に増加し
ていた。また図−１のＣｅ１ｌ　Ｎｕｍｂｅｒと実施例
２から明らかなように細胞分裂が終了するまで培養した
細胞が、より配糖化能が高いことが示唆される。

なお、ＨＰＬＣで検出されるピークがアルブチンである
ことは以下のような操作で結晶を得てＮＭＲで確認した
。

すなわち実験終了後の培養液を５分間ホモジェナイズし
、沸ｌ！湯浴上で２時間湯栓を行なった。

これを遠心分離にかけた後、その上澄液をストックし、
沈殿物についてもう一度同じ条件で湯栓を行なった。

２回の抽出液を東洋濾紙製Ｎｏ、２の濾紙を使い、吸引
濾過により残渣を除いた。その後、同波についてエバポ
レータで濃縮乾固し、該固形物をクロロホルム、メタノ
ール、水（３０：１０：１）の混合液２０１に溶がし、
これをシリカゲルカラム（νａｋｏｇｅｌ　Ｃ−３００
和光純薬製）にかけた。シリカゲルは１５０ｇを上記混
合液に懸濁し、前もってカラムにつめ平衡化しておいた
ものである。

上記混合液で溶出を行ない、１０腸１ずっの各フラクシ
ョンの一部を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣＫｉｅｓ
ｅｌｇｅｌ　６０Ｆ２５４．　Ｍｅｒｃｋ製）で分析し
た。ＣＭ開液は前記混合液） 対象としてアルブチン（Ｕ、Ｓ、Ｂｉｏ社製）で分析し
た。（展開液は前記混合液） アルブチンのヌボットが見られるフラクシヨンを集め濃
縮乾固し、該固形物を少量のメタノールで溶解した後、
クロロホルムを順次滴下していき再結晶化を行なった。

そして、結晶化アルブチンをＮＭＲにかけ、純Ｈ品ト１
７）　比較を行ない、結晶化アルブチンの同定を行なっ
た。

【図面の簡単な説明】

図−１は培養各ステージごとの培養細胞にょるアルブチ
ン生産量（配糖化能）を説明する図であり、新鮮培地交
換したものと、しないものとのアルブチン生産量を比較
した図である。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）植物のカルス又は腫瘍組織の植物培養培地中で、
   培養細胞を細胞分裂が終了するまで培養し、その培養物
   をフェノール類の入った新鮮培地中に移し、培養物より
   フェノール類配糖体を分離採取することを特徴とするフ
   ェノール類配糖体の製造方法。
2. （２）植物細胞がニチニチソウの細胞である請求項１記
   載のフェノール類配糖体の製造方法。