JPS6324518B2

JPS6324518B2 -

Info

Publication number: JPS6324518B2
Application number: JP56033454A
Authority: JP
Inventors: Akira Endo
Original assignee: Mitsubishi Kasei Corp
Current assignee: Mitsubishi Kasei Corp
Priority date: 1981-03-09
Filing date: 1981-03-09
Publication date: 1988-05-20
Also published as: JPS57146793A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は血中コレステロール低下作用を有する
新規生理活性物質に関する。本発明者らは、土壤より分離した微生物の培養
液についてラツト肝のコレステロール合成系を
用いたスクリーニングにより発見された新規物質
をコニンギン酸（Koningic acid）と命名した。本発明において用いうる微生物はトリコデルマ
属に属するコニンギン酸生産菌であるが、コニン
ギン酸生産能を有するトリコデルマ属に属する微
生物であれば変種変異株を問わず使用しうる。本発明に係るコニンギン酸生産株はトリコデル
マ、コニンギM3947（Trichoderma Koningii
M3947）株であつて、本菌株は、通産省工業技術
院微生物工業技術研究所に寄託されている。その
微生物受託番号は微工研菌寄第5904号である。本発明者らにより昭和54年箱根芦ノ湖畔で採集
された土壤より分離されたコニンギン酸生産菌の
菌学的諸性状は以下の通りである。生産菌の生育と顕微鏡下での観察ポテトテキストロース寒天培地上（26℃）の発
育は速く、拡散する。コロニーは、はじめ気菌糸
少なく無色、しだいに気生菌糸を生じ白色とな
る。分生子形成に従つて白色〜淡緑色となる。分生子柄は気生菌糸より生じ輪生状に分枝す
る。各側枝は下方のものほど伸びて分枝をくりか
えす。先端はフイアライドとなる。巾は主軸で
2.3〜4.6μm、無色。フイアライドは分生子柄に３〜４個輪生する。
時として１個側性あるいは２回対生する。びん
形、まつすぐあるいはわずかに湾曲する。その先
端は長頚状。大きさに差が多く5.6〜21.6×2.3〜
3.3μm無色。分生子はフイアロ型分生子、楕円形、4.6〜5.6
×3.3〜4μm、平滑、淡緑色を呈す。フイアライ
ド先端に粘塊状にかたまる。緑色〜暗緑色。有性生殖器官は観察されない。厚膜胞子は栄養菌糸の示端及び中間部に単生又
は鎖状に形成される。形は球形、楕円形、又は樽
形、大きさは6.5〜11.5μ×6.5〜10μ。コニンギン酸生産株は、分生子柄の分枝の株
式、フイアライドのつき方、フイアライド、分生
子の形態、大きさなどの諸形質においてリフアイ
（Rifai）（1969）のモノグラフページ31〜34に記
載されている。トリコデルマコニンギ（Trichoderma
Koningil）のそれらとよく合致する。よつてコニンギン酸生産株の分類学上の帰属は
トリコデルマコニンギ（Trichoderma
Koningil）と判明した。トリコデルマコニンギは多くの点でトリコデ
ルマオウレオビリデイと類似しているが、１
分生子の形態、２コロニー裏面の色調によつて
後者の種から区別されている。以下に本菌株（Ｍ 3947）とトリコデルマコニ
ンギ類似種トリコデルマオウレオビリデイとの類
似点識別形質を列挙する。

【表】コニンギン酸生産株を通常のかびの培養法とし
て公知の方法により好気的に培養物中に生産せし
められる。例えばコニンギン酸生産菌は、コーンミール寒天培地、麦芽寒天培地、ツアペ
ツクドツクス寒天培地、サブロー寒天培地、ある
いはポテトデキストロース寒天培地に継代培養さ
れ、コニンギン酸生産のためにこの寒天培地の発
育菌糸体を直接生産培地に接種して培養し生成蓄
積せしめることが出来る。生産培地としては固状、あるいは液状でもよい
が、液状の培地が、より便宜に使用される。生産培地の炭素源としては、たとえばグルコー
ス、スターチ、グリセリン、デキストリン、シユ
ークロース、水あめ、糖蜜、ラクトース、マルト
ースなどが挙げられる。これらの炭素源の中でもグルコース、スターチ
はコニンギン酸生産に好ましい炭素源である。生産培地の窒素源としては公知の微生物培養の
ための窒素源すべてが利用できる。例えば、ペプ
トン、肉エキス、麦芽エキス、酵母、酵母エキ
ス、大豆粉、落花生粉、綿実かす、コーンスチー
プリカー、米ぬか、無機窒素源等を利用できる。
これらの窒素源のうちでも麦芽エキス、ペプトン
がコニンギン酸生産に適する窒素源である。無機塩としては、たとえば炭酸カルシウム、硫
酸マグネシウム、リン酸カリウム、塩化ナトリウ
ムなどが挙げられ、さらに菌の発育を助けコニン
ギン酸の生産を促進する有機または無機の化合物
などを適宜添加してよい。培養法としては、液体培養法とくに深部培養法
が適している。培養は好気的条件下で行なわれ、
培養のPHは５〜９、さらに好ましくは６〜８であ
り、温度は、20〜40℃、さらに好ましくは25〜35
℃が最適であり、培養時間は24〜480時間さらに
好ましくは、24〜300時間で行なわれる。コニンギン酸の生理活性はラツト肝切片での
¹⁴C―ラベル付酢酸又はメバロン酸を37℃、60分
間反応せしめ、けん化後¹⁴Cのとり込まれたコレ
ステロールを、ジギトニン沈殿として分離し、シ
ンチレーシヨンカウンターで生成したコレステロ
ール量を測定した。コニンギン酸の定量は反応開始時に被検液を加
え、上記と同様に処理し生成したコレステロール
量を測定することによりコニンギン酸を定量する
ことができる。（ブリツカーら：ジヤーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー、（J.Biol.
Chem.）247巻、4914頁、1972年）本物質の抽出精製は、後記実施例で示すごと
く、有機溶媒可溶酸性物質の公知の方法によつて
抽出精製することができる。たとえば酸性下でエ
ーテル、酢酸エチル、クロロホルム、ベンゼン等
により抽出したのち、重曹水に転溶し、再び酸性
下で酢酸エチル、クロロホルムベンゼン等にて抽
出し、濃縮乾固した。乾固物をシリカゲル等によ
るカラムクロマトグラフイーによつて精製し活性
分画をベンゼン―ヘキサン等で結晶化し、再結晶
をくり返し、活性物質を単離した。本物質の理化学的性質はコニンギン酸として前
記した通りであるが、分子式、C₁₅H₂₀O₅
（MW280）、融点46―48.5℃の白色結晶で、メタ
ノール、エタノール、プロパノール等の低級アル
コール、アセトン・クロロホルム、酢酸エチル、
ベンゼン等に可溶でヘキサン、石油エーテル等に
は不溶である。本物質は、酸性物質で重曹水にとけるコニンギ
ン酸の元素分析値は炭素60.29％、水素6.26％、
酸素33.45％である。比施光度は〔α〕²⁵ _D：24.1（Ｃ＝１エタノー
ル）である。質量分析により分子量280℃で、分
子式はC₁₅H₂₀O₅である。第１図，第２図に本物質の紫外部吸収スペクト
ルおよび赤外部吸収スペクトルを示す。また第３
図は重水素化クロロホルム中、テトラメチルシラ
ンを内部標準として加えた100MHzのプロトン核
磁気共鳴スペクトルを示し、さらに第４図に重水
素化クロロホルム中の ¹³C核磁気共鳴スペクトル
を示す。コニンギン酸の定量法として、ラツト肝を用い
た放線性酢酸、又はメバロン酸のコレステロール
へのとり込み率を測定するバイオアツセイ法の他
に高速液体クロマトグラフイーがより便宜的に使
用される。高速液体クロマトグラフイーの条件としてシリ
カーCDS（Fine SIL C₁₈―５日本分光）4.6mmφ×
250mmのカラム、アセトニトリル：１％リン酸、
水、（１：１）の移動相、１ml／分の流速で行う
と、UV254nmの検出器（レンジ0.16）で保持時
間8.1分にコニンギン酸のピークを検出すること
ができる。コニンギン酸1μgは、レンジ0.16で、チヤート
スピード１cm／分のときUV吸収ピークの高さは
約2.7mmである。コニンギン酸のマウス経口による急性毒性
（LD₅₀）は100mg／Kg以上である。コニンギン酸の動物を用いた血中コレステロー
ル低下効果は一群５匹のウイスター系雄性ラツト
に界面活性剤ローム＆ハース社製“トライトン
WR―1339”400mg／Kg静注し、同時にコニンギ
ン酸100mg／Kgを経口投与し18時間後に放血致死
させ、さきに述べた方法により血中コレステロー
ルを測定した。その結果、上記界面活性剤のみを静注した場合
に比べてコニンギン酸を投与した場合は血中コレ
ステロールが21％低下した。以上のごとく、コニンギン酸は血中コレステロ
ール値を低下させる作用を有し、例えば抗脂血
剤、抗動脈硬化剤として医薬に使用することがで
きる。コニンギン酸は、薬学的に許容される塩類、例
えばナトリウム塩、カルシウム塩、カリウム塩、
アンモニウム塩等として使用できることはいうま
でもない。次に実施例をもつてさらに詳細に本発明を説明
するが、これら実施例によつて本発明が限定され
るものではない。実施例１生産培地の検討下記の如く６種の生産用液体培地20mlを100ml
の三角フラスコ中で200rpm25℃７日間回転培養
機で培養したのち培養液をラツト肝切片でラベ
ル付酢酸の不けん化物へのとり込み率を測定し、
その阻害％を示した。結果はMC培地、Ｐ培地での活性物質の生産性
は高いことを示している。％inhibition 培地〓10μl 〓1μl GS 79 MC 93 93 Ｍ 32 Ｐ 92 92 SM 18 Ｄ 92 ５〓コレステロール合成系に添加した培養
液の量各培地組成（各％） GS 培地 MC 培地グルコース 3.5 グルコース 3.5 ポテトスターチ 1.0 ポテトスターチ 1.0 SBM 2.0 麦芽エキス 3.0 肉エキス 0.5 ペプトン 0.5 ペプトン 0.5 CSL 0.3 NaCl 0.2 KH₂PO₄ 0.1 KH₂PO₄ 0.05 MgSO₄・7H₂O 0.05 MgSO₄・7H₂O 0.05 PH5.6に調整 PH5.8に調整Ｍ培地Ｐ培地グリセリン 7.0 グルコース 2.0 グルコース 3.0 ペプトン 0.1 SBM 3.0 麦芽エキス 3.0 ペプトン 0.8 PH無調整 NaNO₃ 0.2 MgSO₄・7H₂O 0.1 PH無調整 SM 培地Ｄ培地グルコース 2.0 グルコース 2.0 ペプトン 2.0 ペプトン 0.5 CSL 0.3 酵母エキス 0.3 PH無調整 KH₂PO₄ 0.3 MgSO₄・7H₂O 0.1 PH無調整実施例２ジヤ培養によるコニンギン酸の生成と抽出精製前記のＰ培地で種培養５日間行い、30ジヤに
15のＰ培地を仕込み、Ｐ培地100mlを500mlヘソ
付三角フラスコで５日間培養した培養物450ml
（３％）を種として25℃280rpm0.5UUM、で培養
した。コニンギン酸は、高速液体クロマトグラフイー
によつて定量した。コニンギン酸の生成量は培養開始后、24時間目
より、増加し９〜11日目に最高に達す。13日目に
培養を打切り紙により菌体を別し得られた培
養液10を濃塩酸でPH3.0とし等容の酢酸エチ
ルエステルにて１回抽出し酢酸エチルエステル層
を亡硝で脱水后、濃縮乾固した。乾固物を200ml
の酢酸エチルに溶かし５％重曹水200mlで１回100
mlで２回抽出、再び塩酸酸性（PH３）とし200ml
の酢酸エチルで１回、100mlの酢酸エチルで３回
抽出し亡硝で脱水后エバポレーターで濃縮乾固し
た。乾固物5.6ｇを得、和光純薬製シリカゲルＣ―
200を100ｇを用いたカラムでベンゼン―塩化メチ
レン（１：１）で４、さらにつづいて塩化メチ
レン３で展開すると、コニンギン酸を含む、粗
精製フラクシヨン2.1ｇを得る。ベンゼン―ヘキサンによつて結晶化しコニンギ
ン酸1.8ｇを白色結晶として得た。

【図面の簡単な説明】

第１図はコニンギン酸のメタノール中での紫外
部吸収スペクトルを示す。第２図はコニンギン酸
の赤外部吸収スペクトル（KBr）を示す。第３
図はコニンギン酸の100MHz・プロトン核磁気共
鳴スペクトル（重水素化クロロホルム、テトラメ
チルシランを内部基準とする。）を示し、第４図
はコニンギン酸の ¹³C核磁気共鳴スペクトル（重
水素化クロロホルムテトラメチルシランを内部基
準とする。）を示す。

Claims

【特許請求の範囲】１次の性状を有するコニンギン酸。１元素分析値Ｃ 60.29％Ｈ 6.26％Ｏ 33.45％２分子量 280（マススペクトルによる）３分子式 C₁₅H₂₀O₅ ４融点 46〜48.5℃ ５比施光度〔α〕²⁵ _D：＋24.1（Ｃ＝１エタノー
ル）６紫外部吸収スペクトル λ^MeOH _nax nm（ε）：213、（9600）第１図の通りである。７赤外部吸収スペクトル（臭化カリウム法）第２図の通りである。８プロトン核磁気共鳴スペクトル（重水素化クロロホルムテトラメチルシランを
内部基準とする）第３図の通りである。９ ¹³C核磁気共鳴スペクトル（重水素化クロロホルム）第４図の通りである。 10 溶剤に対する溶解性メタノール、エタノール、プロパノールアセ
トン、酢酸エチルエステル、クロロホルム、ベ
ンゼン、エーテルに可溶、ヘキサン、石油エー
テルに不溶、５％重曹水に可溶、２％塩酸又は
水に不溶。 11 酸性、中性、塩基性の区別酸性 12 物質の色白色 13 薄層クロマトグラフイートルエン―アセトン（１：１）又は、ジクロ
ルメタン―酢酸（19：１）を展開溶媒としたシ
リカゲル薄層クロマトグラフイー（メルク社
製、キーゼルゲル60F254）によりRf値0.48又
は0.42に紫外線ランプ及びヨードにより単一ス
ポツトを示す。２トリコデルマ（Trichoderma）属に属しコ
ニンギン酸の生産能を有する微生物を培養し、培
養液中に上記物質を生成蓄積せしめ、これを採取
することを特徴とするコニンギン酸の製法。３コニンギン酸及び／又はその薬学的に許容さ
れる塩類を有効成分とするコレステロール生合成
阻害剤。