JPS6283888A - ポリペプチド鎖伸長因子−２ｃＤＮＡとその利用法 - Google Patents
ポリペプチド鎖伸長因子−２ｃＤＮＡとその利用法Info
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- JPS6283888A JPS6283888A JP60219545A JP21954585A JPS6283888A JP S6283888 A JPS6283888 A JP S6283888A JP 60219545 A JP60219545 A JP 60219545A JP 21954585 A JP21954585 A JP 21954585A JP S6283888 A JPS6283888 A JP S6283888A
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- cdna
- polypeptide chain
- elongation factor
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、ポリペプチド鎖伸長因子−２ （以下Ｅ．
Ｆ − ２と略称する）のｃＤＮＡ及びその変異体並び
にこれらの培養細胞への応用に関する。
Ｆ − ２と略称する）のｃＤＮＡ及びその変異体並び
にこれらの培養細胞への応用に関する。
ポリペプチド鎖伸長因子−２は真核細胞の蛋白合成時に
ベプチヂル転移ＲＮＡをリポソーム上のＡ部位からＰ部
位へ転移させる際に必須の酵素である。 この酵素は、
ジフテリア毒素または緑膿菌外毒素によりＮＡＤ由来の
Ａ Ｄ Ｐ ｒｉｂｏｓｅと共有結合して失活する。
これら毒素で処理した細胞はＥ Ｆ−２が失活するため
蛋白合成が阻害され死滅することになる。 本発明者ら
は、細胞や動物が生き続けていくために必須な働きをし
ているこの酵素のｃ ＤＮＡの全塩基配列を明らかにし
た。
ベプチヂル転移ＲＮＡをリポソーム上のＡ部位からＰ部
位へ転移させる際に必須の酵素である。 この酵素は、
ジフテリア毒素または緑膿菌外毒素によりＮＡＤ由来の
Ａ Ｄ Ｐ ｒｉｂｏｓｅと共有結合して失活する。
これら毒素で処理した細胞はＥ Ｆ−２が失活するため
蛋白合成が阻害され死滅することになる。 本発明者ら
は、細胞や動物が生き続けていくために必須な働きをし
ているこの酵素のｃ ＤＮＡの全塩基配列を明らかにし
た。
このことによりこの蛋白質の一次構造が初めて明らかに
なった。 更に、ＥＦ−２の変異の為に毒素耐性になっ
た細胞からクローニングされた変異Ｅｌ’−２のｃ Ｄ
ＮＡは選択マーカー等として利用価値の高いものである
ことが明らかになった。
なった。 更に、ＥＦ−２の変異の為に毒素耐性になっ
た細胞からクローニングされた変異Ｅｌ’−２のｃ Ｄ
ＮＡは選択マーカー等として利用価値の高いものである
ことが明らかになった。
この変異ｃＤＮＡが動物細胞での発現ベクターに組み込
まれたｐＨＥＤｌを培養細胞へ導入し、毒素で処理する
と、この遺伝子の導入された細胞は毒素耐性となり生き
残る。 さらにこの様な選択マーカーを持たない任意の
遺伝子を任意の細胞内へ導入する際に凧めて良い選択マ
ーカー遺伝子となる。 従来、この様な遺伝子としてｐ
ＳＶ２−ｇｐｔとかｐＳＶ２−ｎｅｏなどがあり、上記
の様な目的に用いられているが、これらより用いる細胞
の幅も広く、また選択培養の日数は上記のものより短く
て充分である。
まれたｐＨＥＤｌを培養細胞へ導入し、毒素で処理する
と、この遺伝子の導入された細胞は毒素耐性となり生き
残る。 さらにこの様な選択マーカーを持たない任意の
遺伝子を任意の細胞内へ導入する際に凧めて良い選択マ
ーカー遺伝子となる。 従来、この様な遺伝子としてｐ
ＳＶ２−ｇｐｔとかｐＳＶ２−ｎｅｏなどがあり、上記
の様な目的に用いられているが、これらより用いる細胞
の幅も広く、また選択培養の日数は上記のものより短く
て充分である。
また、更に、動物細胞を用い有用物質を生産する場合に
、本発明のＥＦ−２ｃＤＮＡを利用することによりその
ような細胞を容易に得ることができる。
、本発明のＥＦ−２ｃＤＮＡを利用することによりその
ような細胞を容易に得ることができる。
本発明は分子遺伝子学、細胞生物学の知見を充分に考慮
した理論的背景を基にして、従来からの研究の積重ねの
上に生まれてきたものである。
した理論的背景を基にして、従来からの研究の積重ねの
上に生まれてきたものである。
背景となった研究として
■ ＥＦ−２の変異のためにジフテリア毒素及び緑膿菌
外毒素耐性となった変異細胞をチャイニーズハムスター
の細胞Ｃ Ｈ Ｏより分離した。
外毒素耐性となった変異細胞をチャイニーズハムスター
の細胞Ｃ Ｈ Ｏより分離した。
■ ＥＦ−２をラット肝から分離精製してその蛋白質の
Ｎ末端から１９個のアミノ酸・配列はＶａｌ−八ｓｎ−
Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−１１ｅ−Ａ
ｒｇ−ＡＩａ４１ｅ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ
−Ａｌａ−Ａｓｎ− ｌｉｅ−Ａｒｇであり、Ｃ末端は
Ｌｅｕであると我々が決定していた。
Ｎ末端から１９個のアミノ酸・配列はＶａｌ−八ｓｎ−
Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−１１ｅ−Ａ
ｒｇ−ＡＩａ４１ｅ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ
−Ａｌａ−Ａｓｎ− ｌｉｅ−Ａｒｇであり、Ｃ末端は
Ｌｅｕであると我々が決定していた。
一方、すてにＥＦ−２蛋白分子がＡ Ｄ Ｐ ｒｉｂｏ
ｓｅと結合する周辺のアミノ酸配列は、ラットではＰｈ
ｅ−Ａｓｐ−Ｖａｔ−ｔｌｉｓ−八５ｐ−Ｖａｌ−Ｔｈ
ｒ−−Ｌｅｕ−１１ｉｓ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−
１１ｅ−Ｘ−Ａｒｇ と決定されていた。 Ｘの部位にＡ Ｄ Ｐ ｒｉｂｏ
ｓｅが結合するのであるが、Ｘはヒスチジンが修飾を受
けてシフタミド（ｄｉｐｈｔｈａｍｉｄｅ ）という構
造をとり、 このシフタミドにＡ Ｄ Ｐ ｒｉｂｏｓ
ｅが結合することが明らかにされていた。 近年、この
シフタミド構造の詳細も報告されている。
ｓｅと結合する周辺のアミノ酸配列は、ラットではＰｈ
ｅ−Ａｓｐ−Ｖａｔ−ｔｌｉｓ−八５ｐ−Ｖａｌ−Ｔｈ
ｒ−−Ｌｅｕ−１１ｉｓ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−
１１ｅ−Ｘ−Ａｒｇ と決定されていた。 Ｘの部位にＡ Ｄ Ｐ ｒｉｂｏ
ｓｅが結合するのであるが、Ｘはヒスチジンが修飾を受
けてシフタミド（ｄｉｐｈｔｈａｍｉｄｅ ）という構
造をとり、 このシフタミドにＡ Ｄ Ｐ ｒｉｂｏｓ
ｅが結合することが明らかにされていた。 近年、この
シフタミド構造の詳細も報告されている。
本発明のＥＦ−２ｃＤＮＡおよびそのジフテリア毒素及
び緑膿菌外毒素耐性変異ＥＦ−２ｃＤＮＡは、それぞれ
、ハムスター培養細胞およびそれ由来の毒素耐性細胞か
ら常法に従いｍＲＮＡを調製し、岡山−ハーグ（Ｂｅｒ
ｇ）らの動物細胞発現用ベクターを用いて、それぞれｃ
ＤＮＡバンクを作成し、これを大腸菌にトランスフオー
ムした後、適当なプローブ、例えば、 ラットのＥＦ−
２ｃＤＮＡのフラグメントあるいは図１．２に示したＥ
Ｆ−２の塩基配列を基に作成した合成オリゴヌクレオチ
ド等を用いコロニーハイブリダイゼーションを行うこと
により目的とするＤＮＡを含むクローンを得、これから
目的のプラスミドあるいはＤＮＡを調製することにより
作成することができる。
び緑膿菌外毒素耐性変異ＥＦ−２ｃＤＮＡは、それぞれ
、ハムスター培養細胞およびそれ由来の毒素耐性細胞か
ら常法に従いｍＲＮＡを調製し、岡山−ハーグ（Ｂｅｒ
ｇ）らの動物細胞発現用ベクターを用いて、それぞれｃ
ＤＮＡバンクを作成し、これを大腸菌にトランスフオー
ムした後、適当なプローブ、例えば、 ラットのＥＦ−
２ｃＤＮＡのフラグメントあるいは図１．２に示したＥ
Ｆ−２の塩基配列を基に作成した合成オリゴヌクレオチ
ド等を用いコロニーハイブリダイゼーションを行うこと
により目的とするＤＮＡを含むクローンを得、これから
目的のプラスミドあるいはＤＮＡを調製することにより
作成することができる。
以下に本発明の実施例を挙げ本発明を更に詳細に説明す
る。 本発明はこの実施例のみに限定されるものではな
く、本発明の技術分野において通常行われる変更をする
ことができる。
る。 本発明はこの実施例のみに限定されるものではな
く、本発明の技術分野において通常行われる変更をする
ことができる。
実施例１
ジフテリア毒素耐性ＥＦ−２ｃＤＮＡの作成（ＩＬ
ｃＤＮＡ合成 ハムスター培養細胞由来（ＣＨＯ）ジフテリア毒素耐性
ＫＥＥ１細胞（下記引用文献参照）からグアニジンチオ
シアネート法（Ｊ、Ｍ、 Ｃｈｉｒｇｍｉｎ、 Ａ。
ｃＤＮＡ合成 ハムスター培養細胞由来（ＣＨＯ）ジフテリア毒素耐性
ＫＥＥ１細胞（下記引用文献参照）からグアニジンチオ
シアネート法（Ｊ、Ｍ、 Ｃｈｉｒｇｍｉｎ、 Ａ。
Ｅ、 Ｐｒｚｙｂｙｌａ、 Ｒ，Ｔ、 ＭａｃＤｎｌｄ
＆ Ｗ、Ｊ、 ＲｕｔｔｅｒＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ １８５２９４−５２９９（１９８３））により８
同調したｍＲＮＡ １０μｇを６５℃、３分熱変性した
のち急冷し、逆転写酵素反応液（５０ｍＭ ） ＩＪス
ス−酸ｐＨ８，３，５ｍ Ｍジチオスレイトール、１０
ｍ Ｍ Ｍ ｇ Ｃｉ２ ｚ、７５ ｍＭ Ｋ ＣＩ
、 ２ ｍＭ ｄＮＴＰ、岡山−バーブ（Ｂｅｒｇ）
の動物細胞発現用ベクタープライマー（Ｉｆ、 Ｏｋａ
ｙａｍａ ＆ Ｐ、 Ｂｅｒｇ。
＆ Ｗ、Ｊ、 ＲｕｔｔｅｒＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ １８５２９４−５２９９（１９８３））により８
同調したｍＲＮＡ １０μｇを６５℃、３分熱変性した
のち急冷し、逆転写酵素反応液（５０ｍＭ ） ＩＪス
ス−酸ｐＨ８，３，５ｍ Ｍジチオスレイトール、１０
ｍ Ｍ Ｍ ｇ Ｃｉ２ ｚ、７５ ｍＭ Ｋ ＣＩ
、 ２ ｍＭ ｄＮＴＰ、岡山−バーブ（Ｂｅｒｇ）
の動物細胞発現用ベクタープライマー（Ｉｆ、 Ｏｋａ
ｙａｍａ ＆ Ｐ、 Ｂｅｒｇ。
Ｍｏ１． Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌ、 β−２８０−２
８９（１９８３）） ２ 、６５μｍｏ ｌ、逆転写酵
素４５ユニツト（ライフ サイエンス社）に加え液量８
０μｌとし、４２℃、３０分反応させた。 ０．５Ｍ
ＥＤＴＡ４μ！、１０％５Ｄ３２μｌを加え反応を停
止し、フェノール抽出、エタノール沈殿を行い、沈渣を
５０μｌの純水に溶解した。
８９（１９８３）） ２ 、６５μｍｏ ｌ、逆転写酵
素４５ユニツト（ライフ サイエンス社）に加え液量８
０μｌとし、４２℃、３０分反応させた。 ０．５Ｍ
ＥＤＴＡ４μ！、１０％５Ｄ３２μｌを加え反応を停
止し、フェノール抽出、エタノール沈殿を行い、沈渣を
５０μｌの純水に溶解した。
１） ジフテリア毒素耐性変異株の分離と性質河野憲二
、内田験、日加田英輔、岡田善雄、生化学 ５４ Ｎ
ｏ、８ ９４５ （１９８２）２） ジフテリア毒素耐
性細胞の単離と耐性機構の解析 −２次元電気泳動法
による毒素耐性ＥＦ−２の検出−河野憲二、内田験、岡
田善雄第３６回日本細胞生物学会大会講演要旨集ｐ１９
４ （１９８３） ３ ） ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｐｅ
ｒｔｉｅｓ ｏｆ ５ｔａｂｌｅｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ
ｔｏｘｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｃｅｌｌｓＫｅｎ
ｎｊｉにｏｈｎｏ＋ Ｔｓｕｙｏｓｈｉ Ｌｌｃｈｉｄ
ａ、 ａｎｄ Ｙｏｓｈｉ。
、内田験、日加田英輔、岡田善雄、生化学 ５４ Ｎ
ｏ、８ ９４５ （１９８２）２） ジフテリア毒素耐
性細胞の単離と耐性機構の解析 −２次元電気泳動法
による毒素耐性ＥＦ−２の検出−河野憲二、内田験、岡
田善雄第３６回日本細胞生物学会大会講演要旨集ｐ１９
４ （１９８３） ３ ） ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｐｅ
ｒｔｉｅｓ ｏｆ ５ｔａｂｌｅｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ
ｔｏｘｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｃｅｌｌｓＫｅｎ
ｎｊｉにｏｈｎｏ＋ Ｔｓｕｙｏｓｈｉ Ｌｌｃｈｉｄ
ａ、 ａｎｄ Ｙｏｓｈｉ。
０ｋａｄａ、 Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅ１
ｌ ［ｌｉｏｌｏｇｙ １９８４（Ａｂｓｔｒａｃｔｓ
ｏｆ ｔｈｅ Ｐａｐｅｒｓ Ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ
ａｔ ｔｈｅｔｈｉｒｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ｏｎ Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ
）ｐ２５９ （１９８４） ４ ） Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ
ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ ｔｏｘｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｔ
ｍｕｔａｎｔｓ ｌａｃｋｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ
ｆｕｎｃｔｉｏｎｏｒ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｎｏ
ｎｒｉｂｏｓｙｌａｔａｂｌｅ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ
ｆａｃｔｏｒ２． Ｋｅｎｎｊ ｉ Ｋｏｈｎｏ
、 Ｔｓｕｙｏｓｈｉ Ｕｃｈｉｄａ。
ｌ ［ｌｉｏｌｏｇｙ １９８４（Ａｂｓｔｒａｃｔｓ
ｏｆ ｔｈｅ Ｐａｐｅｒｓ Ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ
ａｔ ｔｈｅｔｈｉｒｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ｏｎ Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ
）ｐ２５９ （１９８４） ４ ） Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ
ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ ｔｏｘｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｔ
ｍｕｔａｎｔｓ ｌａｃｋｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ
ｆｕｎｃｔｉｏｎｏｒ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｎｏ
ｎｒｉｂｏｓｙｌａｔａｂｌｅ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ
ｆａｃｔｏｒ２． Ｋｅｎｎｊ ｉ Ｋｏｈｎｏ
、 Ｔｓｕｙｏｓｈｉ Ｕｃｈｉｄａ。
Ｅｉｓｕｋｅ Ｍｅｋａｄａ ａｎｄ Ｙｏｓｈｉｏ
０ｋａｄａ、 Ｓｏｍａｔ、 Ｃｅ１１１１ｏ１ｅｃ
、Ｇｅｎｅｔ、 旦（１９８５） ｉｎ ｐｒｅｓｓ
（２）オリゴｄｃ１￥の付加 （１）の溶液４４μｌを用い、反応溶液２２０μｊ２［
２８０ｍＭ カコジル酸ナトリウム−６０ｍＭ ｌ
−リス ｐＨ６，８，２ｍＭジチオスレイトール、２ｍ
ＭｄＣＴＰ、２０ｍＭ塩化コバルト、２．２μｇ ポリ
Ａ、”Ｐ−ｄＣＴＰ５５μＣ１（３０００Ｃｉ ７ｍｍ
ｏ ｌ Ａｍｅｒｓｈａｍ） ）に末端デオキシヌ
クレオチジルトランスフエラーゼ４０ユニット（宝酒造
）を加え、３６℃２分間反応させ、プライマーｃＤＮＡ
の３゛末端にｄＣ鎖を１０〜１５個付加した。 ０．
５Ｍ ＥＤＴＡ９μ！、１０％５ＤＳ４．５μβを加
え反応を停止し、フェノール抽出、エタノール沈殿を行
い、ｄＣ−ｔａｉｌｅｄ−プライマーｃＤＮＡを回収し
、５０μｌの純水に熔解した。
０ｋａｄａ、 Ｓｏｍａｔ、 Ｃｅ１１１１ｏ１ｅｃ
、Ｇｅｎｅｔ、 旦（１９８５） ｉｎ ｐｒｅｓｓ
（２）オリゴｄｃ１￥の付加 （１）の溶液４４μｌを用い、反応溶液２２０μｊ２［
２８０ｍＭ カコジル酸ナトリウム−６０ｍＭ ｌ
−リス ｐＨ６，８，２ｍＭジチオスレイトール、２ｍ
ＭｄＣＴＰ、２０ｍＭ塩化コバルト、２．２μｇ ポリ
Ａ、”Ｐ−ｄＣＴＰ５５μＣ１（３０００Ｃｉ ７ｍｍ
ｏ ｌ Ａｍｅｒｓｈａｍ） ）に末端デオキシヌ
クレオチジルトランスフエラーゼ４０ユニット（宝酒造
）を加え、３６℃２分間反応させ、プライマーｃＤＮＡ
の３゛末端にｄＣ鎖を１０〜１５個付加した。 ０．
５Ｍ ＥＤＴＡ９μ！、１０％５ＤＳ４．５μβを加
え反応を停止し、フェノール抽出、エタノール沈殿を行
い、ｄＣ−ｔａｉｌｅｄ−プライマーｃＤＮＡを回収し
、５０μｌの純水に熔解した。
（３）Ｈｉｎｄｌｌ［による切断
（２）のン容？夜２Ｌｕｎに１０倍濃度のＨｉｎｄｌｌ
＋反応液３ｐｌ、ＨｉｎｄｌＩ＋１２ユニット（宝酒造
）を加え全量を３０μｌとし、３７℃１時間反応させた
。 フェノール抽出、エタノール沈殿を行い、核酸を回
収し、２０μｌの純水に熔かした。
＋反応液３ｐｌ、ＨｉｎｄｌＩ＋１２ユニット（宝酒造
）を加え全量を３０μｌとし、３７℃１時間反応させた
。 フェノール抽出、エタノール沈殿を行い、核酸を回
収し、２０μｌの純水に熔かした。
（４）環状化
（３）で調製したＨ４ｎｄｌ［−カット−ｄＣ−ｔａｉ
ｌｅｄ −ｃ Ｄ Ｎ Ａ−プライマ ０．４２ｐｍｏ
ｌ（１７，５ｐＮ）とｄ Ｇ −ｔａｉｌｅｄ−リンカ
−〔岡山−ハーグ（Ｂｅｒｇ）らの方法に従い調製〕０
．７３ｐｍｏ１とを１７５μｌｉ！の１０ｍＭ）リス−
塩ＭｐＨ７，５，１ｍＭ ＥＤＴＡ、Ｏ，ｉＭＮ ａ
Ｃβに溶かし、６５℃４分処理したのち、４２℃、３
０分放置し、０°Ｃに冷やした。
ｌｅｄ −ｃ Ｄ Ｎ Ａ−プライマ ０．４２ｐｍｏ
ｌ（１７，５ｐＮ）とｄ Ｇ −ｔａｉｌｅｄ−リンカ
−〔岡山−ハーグ（Ｂｅｒｇ）らの方法に従い調製〕０
．７３ｐｍｏ１とを１７５μｌｉ！の１０ｍＭ）リス−
塩ＭｐＨ７，５，１ｍＭ ＥＤＴＡ、Ｏ，ｉＭＮ ａ
Ｃβに溶かし、６５℃４分処理したのち、４２℃、３
０分放置し、０°Ｃに冷やした。
（５）ライゲーション
環状化したベクターｃＤＮＡ５０μｆｆを２０ｍＭ ト
リス−塩酸ｐＨ７，５，４ｍＭ 塩化マグネシウム、
１０ｍＭ硫酸アンモニウム、１００ｍＭ塩化カリウ
ム、０．１ｍＭβ−ＮＡＤ、５０μｇ ／ ｍ Ｉ！牛
血清アルブミンの反応溶液に加え総計５００ＩＩｌ！と
し、ＤＮＡリガーゼ（宝酒造）を２．５ユニット加えた
後、−夜１２℃で放置した。
リス−塩酸ｐＨ７，５，４ｍＭ 塩化マグネシウム、
１０ｍＭ硫酸アンモニウム、１００ｍＭ塩化カリウ
ム、０．１ｍＭβ−ＮＡＤ、５０μｇ ／ ｍ Ｉ！牛
血清アルブミンの反応溶液に加え総計５００ＩＩｌ！と
し、ＤＮＡリガーゼ（宝酒造）を２．５ユニット加えた
後、−夜１２℃で放置した。
（６）ＲＮＡ鎮のＤＮＡ鎖への変換
（５）の？８液５００μｊ？に２ ｍ Ｍ ｄ Ｎ Ｔ
Ｐ（ｄ ＡＴＰ、 ｄ ＴＴＰ、 ｄ ＣＴＰ、、
ｄ ＧＴ Ｐ） ？８液を１ （Ｊｕｌ！、１０ｍＭβ
ＮＡＤを５μｍ、Ｅ。
Ｐ（ｄ ＡＴＰ、 ｄ ＴＴＰ、 ｄ ＣＴＰ、、
ｄ ＧＴ Ｐ） ？８液を１ （Ｊｕｌ！、１０ｍＭβ
ＮＡＤを５μｍ、Ｅ。
（ｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ（宝酒造）１ユニツト、リ
ボヌクレアーゼＨ（宝酒造）２．５ユニツト、Ｅ、ｃｏ
ｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ にューイングランドパ
イオラブズ）１５ユニツトを加え１２℃続いて２５℃で
それぞれ１時間反応させた。
ボヌクレアーゼＨ（宝酒造）２．５ユニツト、Ｅ、ｃｏ
ｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ にューイングランドパ
イオラブズ）１５ユニツトを加え１２℃続いて２５℃で
それぞれ１時間反応させた。
（７） ジフテリア毒素耐性細胞由来ＥＦ−２、−、
Ｄ Ｎ Ａのクローニング ｃＤＮＡライブラリーを大腸菌８８１０１株にトランス
フオームし、ラットＥＦ−２ｃＤＮＡをプローブとしコ
ロニーハイブリダイゼーションを行なった。 その結果
、約２．９ｋｂのインサートを持つｐＨＥＤ５１を得た
。
Ｄ Ｎ Ａのクローニング ｃＤＮＡライブラリーを大腸菌８８１０１株にトランス
フオームし、ラットＥＦ−２ｃＤＮＡをプローブとしコ
ロニーハイブリダイゼーションを行なった。 その結果
、約２．９ｋｂのインサートを持つｐＨＥＤ５１を得た
。
以下にその詳細を示す。
■ コンピテント細胞の調製
大腸菌ＨＢ １０１株のコンピテント細胞は、通常の塩
化カルシウム法により調製した（Ｍａｎｄｅｌ。
化カルシウム法により調製した（Ｍａｎｄｅｌ。
Ｍ、 ＆ Ａ、 Ｈｉｇａ、 Ｊ、 Ｍｏ１． Ｒ４ａ
１．５３１５４（１９７０））。
１．５３１５４（１９７０））。
即ち、５ ｍ ｌのＬＢ培地（１％ハタトドリプトン、
０．５％酵母抽出液、１％ＮａＣ１ｐＨ７゜５）にプレ
ート上に生育させた一つのコロニーから菌をとり３７℃
、１０時間培養しさらにその２ｍｌを５０ｍＮ ＬＢ培
地に接種し３７°Ｃ１２，５時間培養後、余液を１７！
のＬＢ培地に加え、更に３０℃、２００回転／分で培養
を続け５５０ ｎｍにおける吸光度が０．３になるまで
生育させる。
０．５％酵母抽出液、１％ＮａＣ１ｐＨ７゜５）にプレ
ート上に生育させた一つのコロニーから菌をとり３７℃
、１０時間培養しさらにその２ｍｌを５０ｍＮ ＬＢ培
地に接種し３７°Ｃ１２，５時間培養後、余液を１７！
のＬＢ培地に加え、更に３０℃、２００回転／分で培養
を続け５５０ ｎｍにおける吸光度が０．３になるまで
生育させる。
培養後、ただちに液を０℃の氷水につけ急冷し、３００
０回転、７分間の遠心を行い菌体を集め少量（〜８ ｍ
ｌ ）の０℃に急冷しておいた５０ｍＭＣａＣ１２−
ＩＱ％グリセロール液に溶かしたのち総量５００ｍｌの
同腹に溶かす。 ３０００回転、７分間遠心し、菌体
を集めそれを０℃の５０ｍＭｃａｃｌ！２−２０％グリ
セロール？容；夜に再懸濁し、少量ずつ分注し、ドライ
アイス−エタノール中で凍結し、−８０℃のフリーザー
に保存し、コンピテント細胞とする。 この方法のより
調製した細胞は、フオームＩ ｐＢＲ３２２ＤＮＡ１
１１ ｇあたり１〜５ ｘ １０７個の形質転換株を得
ることができる。
０回転、７分間の遠心を行い菌体を集め少量（〜８ ｍ
ｌ ）の０℃に急冷しておいた５０ｍＭＣａＣ１２−
ＩＱ％グリセロール液に溶かしたのち総量５００ｍｌの
同腹に溶かす。 ３０００回転、７分間遠心し、菌体
を集めそれを０℃の５０ｍＭｃａｃｌ！２−２０％グリ
セロール？容；夜に再懸濁し、少量ずつ分注し、ドライ
アイス−エタノール中で凍結し、−８０℃のフリーザー
に保存し、コンピテント細胞とする。 この方法のより
調製した細胞は、フオームＩ ｐＢＲ３２２ＤＮＡ１
１１ ｇあたり１〜５ ｘ １０７個の形質転換株を得
ることができる。
■ 形質転換
（６）で８摺装したｃ ＤＮＡライフ゛ラリ−？容）夜
１５μｍ、１０倍の形質転換用緩衝液（１（１（１ｍＭ
ＣａＣ１２，４００ｍＭ ＭｇＣ６ｚ）１０．ｃｌｊ
！に純水７５μｌをポリスチレンプラスチック試験管に
とり上記の様に調製したコンピテント細胞１００μｌを
加え、氷上に２０分放置する（この試験管を１０本分作
製する）。 その後、室温に１０分間おき、１ｍｎのＬ
Ｂ培地を加え３７℃で１時間培養後閑体を遠心して集め
２００μｌのＬＢ培地に懸濁し、用意したニトロセルロ
ース〔１，５％寒天、アンピシリン５０μｇ ／ ｍ
ｅ 添加ＬＢ培地上にニトロセルロース（径８２ｍｍ、
ミリポア社ＨＡ Ｔ Ｆ ）フィルターをのせたもの〕
上に１００μｐ分播種する（プレート２０枚分に相当）
。 プレート２０枚で約７万個のコロニーが形成された
。 このプレートをマスタープレートとし、このニトロ
セルロースフィルターを用いて新しいフィルターを上に
置き２枚のレプリカを作製する。 マスタープレートは
レプリカ後３７℃約３時間培養後４℃に保存する。 レ
プリカプレートは同様に培養した後、プレート上のフィ
ルターを２０’Ｏｔｔｇ／ｍｌクロラムフェニコール添
加ＬＢ培地上に移し、２０時間３７℃で培養し、プラス
ミドの増幅を行う。
１５μｍ、１０倍の形質転換用緩衝液（１（１（１ｍＭ
ＣａＣ１２，４００ｍＭ ＭｇＣ６ｚ）１０．ｃｌｊ
！に純水７５μｌをポリスチレンプラスチック試験管に
とり上記の様に調製したコンピテント細胞１００μｌを
加え、氷上に２０分放置する（この試験管を１０本分作
製する）。 その後、室温に１０分間おき、１ｍｎのＬ
Ｂ培地を加え３７℃で１時間培養後閑体を遠心して集め
２００μｌのＬＢ培地に懸濁し、用意したニトロセルロ
ース〔１，５％寒天、アンピシリン５０μｇ ／ ｍ
ｅ 添加ＬＢ培地上にニトロセルロース（径８２ｍｍ、
ミリポア社ＨＡ Ｔ Ｆ ）フィルターをのせたもの〕
上に１００μｐ分播種する（プレート２０枚分に相当）
。 プレート２０枚で約７万個のコロニーが形成された
。 このプレートをマスタープレートとし、このニトロ
セルロースフィルターを用いて新しいフィルターを上に
置き２枚のレプリカを作製する。 マスタープレートは
レプリカ後３７℃約３時間培養後４℃に保存する。 レ
プリカプレートは同様に培養した後、プレート上のフィ
ルターを２０’Ｏｔｔｇ／ｍｌクロラムフェニコール添
加ＬＢ培地上に移し、２０時間３７℃で培養し、プラス
ミドの増幅を行う。
■ コロニーハイブリダイゼーション
ニトロセルロースフィルターへＤＮＡの固定プラスミド
を増幅させたフィルターを０．５ＮＮａＯＨ，ＬＭ）リ
スｐＨ７，５，３Ｍ！−リスｐＨ７、５＋ １ 、５
Ｍ Ｎ ａ Ｃ１の順に５分処理、３分乾燥の操作を繰
り返し、その後１時間自然乾燥させたのち７５℃２時間
処理し、ＤＮＡをフィルターに固定する。
を増幅させたフィルターを０．５ＮＮａＯＨ，ＬＭ）リ
スｐＨ７，５，３Ｍ！−リスｐＨ７、５＋ １ 、５
Ｍ Ｎ ａ Ｃ１の順に５分処理、３分乾燥の操作を繰
り返し、その後１時間自然乾燥させたのち７５℃２時間
処理し、ＤＮＡをフィルターに固定する。
プリハイブリダイゼーション
フィルターを３ ｘｓｓｃ （ＳＳＣ： ０．３ＭＮａ
Ｃ１，０，０３Ｍクエン酸３ナトリウム）、０．１％Ｓ
ＤＳ溶液で６０℃、１５分間洗い、次に３ ｘ Ｓ Ｓ
Ｃ，１０ｘＤｅｎｈａｒｄｔ （５０ｘＤｅｎｈａｒ
ｄｔ溶液＝１％フィ、コール、１％ポリビニルピロリド
ン、１％生血清アルブミン）、５０μｇ ／ ｒｎ １
２変性アス精子ＤＮＡ溶液に浸し６０℃で３時間以上処
理する。
Ｃ１，０，０３Ｍクエン酸３ナトリウム）、０．１％Ｓ
ＤＳ溶液で６０℃、１５分間洗い、次に３ ｘ Ｓ Ｓ
Ｃ，１０ｘＤｅｎｈａｒｄｔ （５０ｘＤｅｎｈａｒ
ｄｔ溶液＝１％フィ、コール、１％ポリビニルピロリド
ン、１％生血清アルブミン）、５０μｇ ／ ｒｎ １
２変性アス精子ＤＮＡ溶液に浸し６０℃で３時間以上処
理する。
■ ニックトランスレーションによるプローブの作製
別に得たラットＥＦ−２ｃＤＮＡ ｐＲＥ２ポリ八端
４５０ｂｐ 〜１０００ｂｐのＲｓａ［フラグメント（
プローブＡ）と１１５０ｂｐ〜１３０ＱｂｐのＣ１ａｌ
−ＡｖａＩＩフラグメント（プロー ７’ Ｂ、図４参
照）をニックトランスレーションＣＲｉｇｈｙ、 Ｐ、
Ｗ、Ｊ、、門、 Ｄｉｅｃｋｍａｎｎ、 Ｃ，Ｒｈｏｄ
ｅｓ ＆Ｐ、 Ｂｅｒｇ、 Ｊ、 Ｍｏ＋、 Ｂｉｏｌ
、 １１３ ２３７（１９７７））により標識し、プ
ローブとした（比活性〜ｔｏ’ｃｐｍ／μｇＤＮＡ）。
４５０ｂｐ 〜１０００ｂｐのＲｓａ［フラグメント（
プローブＡ）と１１５０ｂｐ〜１３０ＱｂｐのＣ１ａｌ
−ＡｖａＩＩフラグメント（プロー ７’ Ｂ、図４参
照）をニックトランスレーションＣＲｉｇｈｙ、 Ｐ、
Ｗ、Ｊ、、門、 Ｄｉｅｃｋｍａｎｎ、 Ｃ，Ｒｈｏｄ
ｅｓ ＆Ｐ、 Ｂｅｒｇ、 Ｊ、 Ｍｏ＋、 Ｂｉｏｌ
、 １１３ ２３７（１９７７））により標識し、プ
ローブとした（比活性〜ｔｏ’ｃｐｍ／μｇＤＮＡ）。
■ ハイブリダイゼーション
４０枚のフィルターを２組に分け、プリハイブリダイゼ
ーションと同様の溶液１５ｍ７！にそれぞれ浸し、９０
℃、１０分処理した後急冷し熱変性させたプローブＡ、
Ｂをそれぞれの溶液に加え、６０℃、３０時間反応させ
る。 ６ＳＳＣ＋０．０３％ＳＤＳ溶液でフィルター
をよく洗う。
ーションと同様の溶液１５ｍ７！にそれぞれ浸し、９０
℃、１０分処理した後急冷し熱変性させたプローブＡ、
Ｂをそれぞれの溶液に加え、６０℃、３０時間反応させ
る。 ６ＳＳＣ＋０．０３％ＳＤＳ溶液でフィルター
をよく洗う。
乾燥後、オートラジオグラフィーを行い両方のプローブ
に陽性を示すコロニーをマスタープレートから拾った。
に陽性を示すコロニーをマスタープレートから拾った。
■ 少量培養によるプラスミドの調製上記の様にし
て得ミれた１株を２ｍＡのＬＢ培地で１晩培養し、Ｂｉ
ｒｎｂｏｉｍとＤｏｌｙのアルカリ溶解法（Ｂｉｒｎｂ
ｏｉｍ、 Ｉｌ、Ｃ，＆ Ｊ、 Ｄｏｌｙ＋ Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、７ １５１３（１９７９）
）によりプラスミドを調製し、ＢａｍＨＩまたはＸｈ
ｏＩの制限酵素によりそれぞれのプラスミドを切断した
のち、１％アガロースゲルにより電気泳動を行い、約２
．９ｋｂのインサートを持っているプラスミドｐＨＥＤ
５１を得た。
て得ミれた１株を２ｍＡのＬＢ培地で１晩培養し、Ｂｉ
ｒｎｂｏｉｍとＤｏｌｙのアルカリ溶解法（Ｂｉｒｎｂ
ｏｉｍ、 Ｉｌ、Ｃ，＆ Ｊ、 Ｄｏｌｙ＋ Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、７ １５１３（１９７９）
）によりプラスミドを調製し、ＢａｍＨＩまたはＸｈ
ｏＩの制限酵素によりそれぞれのプラスミドを切断した
のち、１％アガロースゲルにより電気泳動を行い、約２
．９ｋｂのインサートを持っているプラスミドｐＨＥＤ
５１を得た。
（８） ｃＤＮＡの塩基配列の決定ｐＨＥＤ５１
のＢｇ ］ ＩＩ−３ｍａ １部位をｍｐ１８．１９に
組み込みその塩基配列を実施例２と同様の方法で調べ野
生型由来の塩基配列と比較したところ毒素によりＡＤＰ
リボシル化を受けるアミノ酸（）（ｉ ｓが修飾を受け
たアミノ酸でシフタミドと命名されている）近傍のＧＣ
対がシングルポイントミュウテイション（ｓｉｎｇｌｅ
ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を起こしＧＣ−ＡＴ
トランジション（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）を起こしてい
ることが判明した。 この変異により−Ｈ４ｓ−Ａｒｇ
−Ｇｌｙ−という配列が −Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−
（Ｈｉｓ残基が毒素によりＡＤＰリボシル化を受けるシ
フタミドにあたる）に変わり、その結果毒素に耐性を示
すようになったと考えられる。
のＢｇ ］ ＩＩ−３ｍａ １部位をｍｐ１８．１９に
組み込みその塩基配列を実施例２と同様の方法で調べ野
生型由来の塩基配列と比較したところ毒素によりＡＤＰ
リボシル化を受けるアミノ酸（）（ｉ ｓが修飾を受け
たアミノ酸でシフタミドと命名されている）近傍のＧＣ
対がシングルポイントミュウテイション（ｓｉｎｇｌｅ
ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を起こしＧＣ−ＡＴ
トランジション（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）を起こしてい
ることが判明した。 この変異により−Ｈ４ｓ−Ａｒｇ
−Ｇｌｙ−という配列が −Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−
（Ｈｉｓ残基が毒素によりＡＤＰリボシル化を受けるシ
フタミドにあたる）に変わり、その結果毒素に耐性を示
すようになったと考えられる。
実施例２ＥＦ−２ｃＤＮＡの調製
（１） ハムスターｃＤＮＡライブラリーの作成対数
増殖期にあるＣＨＯ−Ｋ １細胞から、グアニジンチオ
シアネート法によりＲＮＡを抽出し、オリゴｄＴセルロ
ースカラムクロマトグラフィーによりｍＲＮＡを調製し
た。 次に、実施例１と同様にして、岡山−バーブの動
物細胞発現用ベクターを用いてｃＤＮＡライブラリーを
調製した。
増殖期にあるＣＨＯ−Ｋ １細胞から、グアニジンチオ
シアネート法によりＲＮＡを抽出し、オリゴｄＴセルロ
ースカラムクロマトグラフィーによりｍＲＮＡを調製し
た。 次に、実施例１と同様にして、岡山−バーブの動
物細胞発現用ベクターを用いてｃＤＮＡライブラリーを
調製した。
即ち、先ず、ｍＲＮＡを６５℃、５分で熱変性し、プラ
イマーとアニールさせたのち逆転写酵素（Ｌｉｆｅ
５ｃｉｅｎｃｅ社）を用いてｃＤＮＡ合成を行った。
３°側にターミナルトランスフェラーゼ（宝酒造）に
より、ｄｃｉＭを付加した後、Ｈｉｎｄ■により切断し
た。 次に、ｄ Ｑ −ｔａｉｌｅｄ リンカ−とＨ
ｉｎｄｌ［ｌ−消化ｃＤＮＡとを環状化した後、Ｅ、（
ｏｌｉ リガーゼ（宝酒造）を用いてライゲーション
を行い、 最後にＥ、ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩ、
リボヌクレアーゼ■１にューイングランドバイオラブズ
）、Ｅ、ｃ。
イマーとアニールさせたのち逆転写酵素（Ｌｉｆｅ
５ｃｉｅｎｃｅ社）を用いてｃＤＮＡ合成を行った。
３°側にターミナルトランスフェラーゼ（宝酒造）に
より、ｄｃｉＭを付加した後、Ｈｉｎｄ■により切断し
た。 次に、ｄ Ｑ −ｔａｉｌｅｄ リンカ−とＨ
ｉｎｄｌ［ｌ−消化ｃＤＮＡとを環状化した後、Ｅ、（
ｏｌｉ リガーゼ（宝酒造）を用いてライゲーション
を行い、 最後にＥ、ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩ、
リボヌクレアーゼ■１にューイングランドバイオラブズ
）、Ｅ、ｃ。
１ｉ リガーゼを用いて２本鎖のｃＤＮＡを作成した
。
。
（２） ハムスターｃＤＮＡライブラリーの検索上記（
１）で調製したｃＤＮＡライブラリーを実施例１と同様
の方法で大腸菌に１２株由来ＨＢ１０１株にトランスフ
オームし、ラフトＲＥ２−１７ラグメントをニックトラ
ンスレーションによりラベルし、これをプローブとして
約７万個のコロニーを検索した。
１）で調製したｃＤＮＡライブラリーを実施例１と同様
の方法で大腸菌に１２株由来ＨＢ１０１株にトランスフ
オームし、ラフトＲＥ２−１７ラグメントをニックトラ
ンスレーションによりラベルし、これをプローブとして
約７万個のコロニーを検索した。
その結果、６２株のポジイティブクローンを得た。
これらのプラスミドを持つ菌を少量培養しプラスミドを
調製し、１３ ａ ｍ ＨＩ、Ｘｈｏｒの制限酵素で切
断し、プラスミド中に挿入されているｃ ＤＮＡの長さ
を調べたところｐＨＥＷｌと命名したプラスミドが約３
ｋｂの長さをもちＥＦ−２ｍ ＲＮ Ａのほぼ全域を含
んでいることが明らかになった。 このプラスミドｐ
ＨＥＷ１を含む大腸菌株をＥ、ｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩ
ｐＨＥＷｌとし、工業技術院微生物工業技術研究所
へ寄託の申請を行った（昭和６０年９月１７日）。
調製し、１３ ａ ｍ ＨＩ、Ｘｈｏｒの制限酵素で切
断し、プラスミド中に挿入されているｃ ＤＮＡの長さ
を調べたところｐＨＥＷｌと命名したプラスミドが約３
ｋｂの長さをもちＥＦ−２ｍ ＲＮ Ａのほぼ全域を含
んでいることが明らかになった。 このプラスミドｐ
ＨＥＷ１を含む大腸菌株をＥ、ｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩ
ｐＨＥＷｌとし、工業技術院微生物工業技術研究所
へ寄託の申請を行った（昭和６０年９月１７日）。
（３）ＥＦ−２ｃＤＮＡの塩基配列
６塩基認識の各種制限酵素（ＢａｍＨＩＸｈｏｌ、Ｐｓ
ｔｌ、ｐｖｕ Ｉ、Ｓａｃ １．Ｈｉｎｄ■、Ｓｍａ
Ｉ、ＢｇｌｌＴ、Ｓａ ｌ Ｉ、ＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＴ
、、Ｃ１ａｌ、Ａｈａｌｌｌ、Ａｔｎ１ｌ、Ｈｐａｌ等
）を用い、ｐＨＥＷｌを１種または２種の制限酵素によ
り切断することによりｐ ＨＥ Ｗ １の制限酵素地図
（図３に記載）を作成した。
ｔｌ、ｐｖｕ Ｉ、Ｓａｃ １．Ｈｉｎｄ■、Ｓｍａ
Ｉ、ＢｇｌｌＴ、Ｓａ ｌ Ｉ、ＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＴ
、、Ｃ１ａｌ、Ａｈａｌｌｌ、Ａｔｎ１ｌ、Ｈｐａｌ等
）を用い、ｐＨＥＷｌを１種または２種の制限酵素によ
り切断することによりｐ ＨＥ Ｗ １の制限酵素地図
（図３に記載）を作成した。
（４） ｃ、ＤＮＡの塩基配列
ｐＨＥＷ１を適当な制限酵素を用い１００ベースから５
００ヘ一ス位のフラグメントにし、ポリアクリアミドゲ
ルにより各フラグメントを調製し、Ｍ１３ファージ由来
のｍｐ １８、ｍｐ１９のマルチクローニングサイトに
リクローニングを試みた。
００ヘ一ス位のフラグメントにし、ポリアクリアミドゲ
ルにより各フラグメントを調製し、Ｍ１３ファージ由来
のｍｐ １８、ｍｐ１９のマルチクローニングサイトに
リクローニングを試みた。
ＲＦＩのｍｐ１８、ｍｐ１９を適当な酵素で切断し、そ
の部位にリクローニングすべきフラグメントを挿入し、
大腸菌ＪＭ１０３株にトランスフェクトした。 目的の
フラグメントが挿入されたか否かは、ＩＰＴＧ存在下で
Ｘ−Ｇａ１が代謝されたはどうか、ずなわら白色のプラ
ークを形成するか否かにより選択した。 このプラーク
から自白のフラグメントを含むファージを培養し、上清
から１本鎖のファージＤＮＡを調製、ジデオキシ法の鋳
型として使用した。
の部位にリクローニングすべきフラグメントを挿入し、
大腸菌ＪＭ１０３株にトランスフェクトした。 目的の
フラグメントが挿入されたか否かは、ＩＰＴＧ存在下で
Ｘ−Ｇａ１が代謝されたはどうか、ずなわら白色のプラ
ークを形成するか否かにより選択した。 このプラーク
から自白のフラグメントを含むファージを培養し、上清
から１本鎖のファージＤＮＡを調製、ジデオキシ法の鋳
型として使用した。
図１にｐＨＥＷｌの塩基配列およびそれから推定される
アミノ酸配列を示す。
アミノ酸配列を示す。
ｐＨＥＷｌのＥＦ−２ｃＤＮＡはポリＡ部分を除くと２
９３２塩基から構成されており、ＥＦ−２ｍＲＮＡのほ
ぼ全域を含むと考えられる。
９３２塩基から構成されており、ＥＦ−２ｍＲＮＡのほ
ぼ全域を含むと考えられる。
ＥＦ−２蛋白は７７番目のＡＴＧを開始コドンとし２６
５１番目のＴＡＧを終始コドンとする２５７４塩基にコ
ードされており、８５７アミノ酸残基（開始のＭｅｔを
除く）より構成されている。
５１番目のＴＡＧを終始コドンとする２５７４塩基にコ
ードされており、８５７アミノ酸残基（開始のＭｅｔを
除く）より構成されている。
ジフテリア毒素によりＡＤＰリボシル化を受ける部位の
アミノ酸１５個とＮ末のアミノ酸１９個。
アミノ酸１５個とＮ末のアミノ酸１９個。
Ｃ末のアミノ酸１個とがラット由来のＥＦ−２を用いて
決定されているが、これらはすべてハムスターのＥＦ〜
２から予想されるアミノ酸配列と一致した。
決定されているが、これらはすべてハムスターのＥＦ〜
２から予想されるアミノ酸配列と一致した。
実施例３
組換ＤＮＡを利用した単−塩基置換ジフテリア毒素耐性
ＥＦ−２ｃＤＮＡの製作 ｐＨＥＷｌおよびｐＨＥＤ５１それぞれをＢｇｌ［１、
Ｓｍａ Ｉにより切断し、ｐＨＥＷｌのベクター側断片
とｐ ＨＥ Ｄ ５１山来のＢｇｌｌｌ−３ｍａｌ断片
（５２０ｂｐ）とをリガーゼにより結合し、ＢｇｌＵ−
３ｍａｌ断片のみを毒素耐性細胞由来の遺伝子で置換し
たｐＨＥＤＬを作成した。
ＥＦ−２ｃＤＮＡの製作 ｐＨＥＷｌおよびｐＨＥＤ５１それぞれをＢｇｌ［１、
Ｓｍａ Ｉにより切断し、ｐＨＥＷｌのベクター側断片
とｐ ＨＥ Ｄ ５１山来のＢｇｌｌｌ−３ｍａｌ断片
（５２０ｂｐ）とをリガーゼにより結合し、ＢｇｌＵ−
３ｍａｌ断片のみを毒素耐性細胞由来の遺伝子で置換し
たｐＨＥＤＬを作成した。
ｐＨＥＤｌの塩基配列およびそれから推定されるアミノ
酸配列を図２に示す。
酸配列を図２に示す。
このｃＤＮＡは、ＥＦ−２のうち１塩基のみが変化した
遺伝子である。 このｐ ＨＥ Ｄ １を保持する大腸
菌Ｈ８１０１株をＥ、ｃｏｌｉ ＨＢＩＯｌ−ｐＨＥ
Ｄｌ株と命名し、工業技術院微生物工業技術研究所へ寄
託申請を行った。（昭和６０年９月１７日） 参考例 う、トＥＦ ２ｃＤＮＡの調製 ■ 合成オリゴヌクレオチドの作成 数に明らかになっているラットＥＦ−２（Ｊ白の一部の
アミノ酸配列１５個〔シフタマイトを含むベブタイド：
図５ ： Ｅ、Ａ、 Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、 Ｏ，ｔｌｅ
ｎｒｉｋｓｅｎ。
遺伝子である。 このｐ ＨＥ Ｄ １を保持する大腸
菌Ｈ８１０１株をＥ、ｃｏｌｉ ＨＢＩＯｌ−ｐＨＥ
Ｄｌ株と命名し、工業技術院微生物工業技術研究所へ寄
託申請を行った。（昭和６０年９月１７日） 参考例 う、トＥＦ ２ｃＤＮＡの調製 ■ 合成オリゴヌクレオチドの作成 数に明らかになっているラットＥＦ−２（Ｊ白の一部の
アミノ酸配列１５個〔シフタマイトを含むベブタイド：
図５ ： Ｅ、Ａ、 Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、 Ｏ，ｔｌｅ
ｎｒｉｋｓｅｎ。
＆ Ｅ、Ｓ、 Ｍａｘｗｅｌｌ、 Ｊ、 Ｂｉｏｌ、
Ｃｈｅｍ、、２４９５０８８−５０９３（１９７４）
］のｍＲＮＡに対応するオリゴヌクレオチドヲｃ Ｄ
Ｎ Ａのクローニングに為のプローブとして図５に示し
た様に’ Ｐｈｅから５＾ｓｐをコードする１ ４ ｍ
ｅ ｒ ３２種と１１Ａｓｐから１４１１ｉｓをコー
ドする１１ｍｅｒ２４種を化学合成した。
Ｃｈｅｍ、、２４９５０８８−５０９３（１９７４）
］のｍＲＮＡに対応するオリゴヌクレオチドヲｃ Ｄ
Ｎ Ａのクローニングに為のプローブとして図５に示し
た様に’ Ｐｈｅから５＾ｓｐをコードする１ ４ ｍ
ｅ ｒ ３２種と１１Ａｓｐから１４１１ｉｓをコー
ドする１１ｍｅｒ２４種を化学合成した。
■ラットｃ ＤＮＡライブラリーのスクリーニングラッ
ト肝臓由来のｍＲＮＡを基に岡山−バーブのクローニン
グ ベクターＣＩ１． Ｏｋａｙａｍａ ＆ Ｐ、 Ｂ
ｅｒｇ Ｍｏ１． Ｃｅ１１． Ｂｉｏｌ、、 ２１６
１−１７０（１９８２））を使用しｃＤＮＡライブラリ
ーを岡山−バーブの方法により作製した（Ｉｌ、 Ｏｋ
ａｙａｍａ ＆ Ｐ、 Ｂｅｒｇ Ｍｏ１． Ｃｅ１ｌ
。
ト肝臓由来のｍＲＮＡを基に岡山−バーブのクローニン
グ ベクターＣＩ１． Ｏｋａｙａｍａ ＆ Ｐ、 Ｂ
ｅｒｇ Ｍｏ１． Ｃｅ１１． Ｂｉｏｌ、、 ２１６
１−１７０（１９８２））を使用しｃＤＮＡライブラリ
ーを岡山−バーブの方法により作製した（Ｉｌ、 Ｏｋ
ａｙａｍａ ＆ Ｐ、 Ｂｅｒｇ Ｍｏ１． Ｃｅ１ｌ
。
Ｂｉｏｌ、、３ ２８０−２８９（１９８３））。
次に、図５に示したＯｌｉｇｏ １．２の５′端を３２
ｐで標識した合成オリゴヌクレオチドをプルーブとして
ラットＥＦ−２ｃＤＮＡのスクリーニングを行った。
約５万個のコロニーから５個のポジイティブクローン（
ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｌｏｎｅｓ）が得られ、サザン
プロノトハイブリダイゼーション・プライマー伸長法を
利用した塩基配列解析によりラットＥＦ−２ｃＤＮＡを
含むｐＲＦ２を得た。 図４にｐＲＦ２の制限酵素地図
を示す。
ｐで標識した合成オリゴヌクレオチドをプルーブとして
ラットＥＦ−２ｃＤＮＡのスクリーニングを行った。
約５万個のコロニーから５個のポジイティブクローン（
ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｌｏｎｅｓ）が得られ、サザン
プロノトハイブリダイゼーション・プライマー伸長法を
利用した塩基配列解析によりラットＥＦ−２ｃＤＮＡを
含むｐＲＦ２を得た。 図４にｐＲＦ２の制限酵素地図
を示す。
■ラット及びハムスターｍＲＮＡの解析ＥＦ−２ｍＲＮ
Ａの長さ及びラットとハムスターＥＦ−２の塩基配列の
相同性を調べる為に、ラット肝由来ｍＲＮＡ、ハムスタ
ー培養細胞（ＣＨＯ−に１）由来ｍＲＮＡ、ジフテリア
毒素耐性ＣＨＯ−に１変異細胞（ＫＥＥＬ）由来ｍＲＮ
Ａをグアニジンチオシアネート法により調製し、ｐＲＥ
２のＲｓａＩフラグメントＲＥ２−１ （３°端４５０
ｂｐ〜１０００ｂｐの間）をプローブとしてノーザンブ
ロンティングを行った。 その結果、ラットとハムスタ
ーのＥＦ−２ｍＲＮＡは約３ｋｂの長さであること、及
び相同性が高いことが判明した。
Ａの長さ及びラットとハムスターＥＦ−２の塩基配列の
相同性を調べる為に、ラット肝由来ｍＲＮＡ、ハムスタ
ー培養細胞（ＣＨＯ−に１）由来ｍＲＮＡ、ジフテリア
毒素耐性ＣＨＯ−に１変異細胞（ＫＥＥＬ）由来ｍＲＮ
Ａをグアニジンチオシアネート法により調製し、ｐＲＥ
２のＲｓａＩフラグメントＲＥ２−１ （３°端４５０
ｂｐ〜１０００ｂｐの間）をプローブとしてノーザンブ
ロンティングを行った。 その結果、ラットとハムスタ
ーのＥＦ−２ｍＲＮＡは約３ｋｂの長さであること、及
び相同性が高いことが判明した。
実施例４
ｐＨＥＤｌの動物細胞での発現
Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ■ マウ
スＬ細胞での発現 マウスＬ細胞を８ ｘ １０ ’ｃｅｌｌｓずつ３５ｍ
ｍ径のプラスチック培養用ペトリ皿に播種し、３７℃１
日ＣＯｚインキュベーターで培養後、ｐ ＨＥＤｌ、ｐ
ＨＥＷｌ、マウス精子ＤＮＡを最終濃度１０μｇ ／
ｍ ｊ２の濃度となるようにリン酸カルシウム共沈殿液
法（０，４，５ｐａｎｄｉｄｏｓ ＆ Ｎ、Ｍ、Ｗｉｌ
ｋｉｅ”Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｊｏｎ ａｎｄ ｔｒａ
ｎｓｌａｔｉｏｎ” ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ、
ｂｙ Ｂ、ｄ、 Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ、Ｊ、 １１１
ｇｇ１ｎｓ、 １−４８（１９８４））に従い作成した
。
スＬ細胞での発現 マウスＬ細胞を８ ｘ １０ ’ｃｅｌｌｓずつ３５ｍ
ｍ径のプラスチック培養用ペトリ皿に播種し、３７℃１
日ＣＯｚインキュベーターで培養後、ｐ ＨＥＤｌ、ｐ
ＨＥＷｌ、マウス精子ＤＮＡを最終濃度１０μｇ ／
ｍ ｊ２の濃度となるようにリン酸カルシウム共沈殿液
法（０，４，５ｐａｎｄｉｄｏｓ ＆ Ｎ、Ｍ、Ｗｉｌ
ｋｉｅ”Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｊｏｎ ａｎｄ ｔｒａ
ｎｓｌａｔｉｏｎ” ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ、
ｂｙ Ｂ、ｄ、 Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ、Ｊ、 １１１
ｇｇ１ｎｓ、 １−４８（１９８４））に従い作成した
。
１７０μβずつを細胞上にまぶし２４時間細胞に取り込
ませた後、培養液で細胞を良（洗い新しい細胞増殖用培
地（αＭＥＭ＋８％ＦＣ３）に交換した。 さらに２４
時間培養後、ジフテリア毒素（ＤＴ）と同じ毒作用を示
す緑膿菌外毒素Ａ（ＰＡ）を０．１〜０．５μｇ／ｍｎ
になるように培地に加え培養を続けた。 １．２．３
．７日目に２ｕＣｉ／ｍｊ！の〔３Ｈ〕−ロイシンを含
むＦ１２＋１０％ＦＣ３培地に２時間培養し、各時期で
の蛋白合成を調べた。 ｐＨＥＤｌでは毒素耐性形質を
発現したが野生型のｃＤＮＡおよびマウス精子ＤＮＡで
は毒素による蛋白合成阻害が顕著に観察された。
ませた後、培養液で細胞を良（洗い新しい細胞増殖用培
地（αＭＥＭ＋８％ＦＣ３）に交換した。 さらに２４
時間培養後、ジフテリア毒素（ＤＴ）と同じ毒作用を示
す緑膿菌外毒素Ａ（ＰＡ）を０．１〜０．５μｇ／ｍｎ
になるように培地に加え培養を続けた。 １．２．３
．７日目に２ｕＣｉ／ｍｊ！の〔３Ｈ〕−ロイシンを含
むＦ１２＋１０％ＦＣ３培地に２時間培養し、各時期で
の蛋白合成を調べた。 ｐＨＥＤｌでは毒素耐性形質を
発現したが野生型のｃＤＮＡおよびマウス精子ＤＮＡで
は毒素による蛋白合成阻害が顕著に観察された。
■ 他の培養細胞での発現
同様にサルＣＶＩ由来のＣＯ３−１細胞、ハムスター由
来ＣＨＯ細胞、ヒト由来２倍体繊維芽細胞、ＦＬ細胞、
ＨｅＬａ細胞などで蛋白合成を指標に調べた結果、程度
の差は認められるが同様の毒素耐性形質の発現を確認し
た。 表１にその結果を示した。
来ＣＨＯ細胞、ヒト由来２倍体繊維芽細胞、ＦＬ細胞、
ＨｅＬａ細胞などで蛋白合成を指標に調べた結果、程度
の差は認められるが同様の毒素耐性形質の発現を確認し
た。 表１にその結果を示した。
（：ｌ） Ｌｏｎｇ Ｔｅｒｍ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａ
ｔｉｏｎマウスし細胞を５ ｘ １０ ’ｃｅｌｌｓ／
１００ ｍｍベト９皿に播種し、２４時間培養後ｐＨ
ＥＤＩ、ｐＨＥＷＩ ＤＮＡを上記■と同様、リン酸
カルシウム共沈殿法でトランスフェクトし２４時間後、
培養液を除き良く細胞を洗った後新しい培地で２４時間
培養を続けた。 次に、０．０５ｐｇ／ｍｌの濃度にな
るようにＰＡを加え３週間毒素存在下で培養後コロニー
数を算定した。 ｐＨＥＷｌをトランスフェクトした細
胞では全くコロニーは検出されなかったが、ｐＨＥＤｌ
をトランスフェクトした細胞では、プレートあたり約８
０個のコロニーが形成された。 表２にその結果を示し
た。
ｔｉｏｎマウスし細胞を５ ｘ １０ ’ｃｅｌｌｓ／
１００ ｍｍベト９皿に播種し、２４時間培養後ｐＨ
ＥＤＩ、ｐＨＥＷＩ ＤＮＡを上記■と同様、リン酸
カルシウム共沈殿法でトランスフェクトし２４時間後、
培養液を除き良く細胞を洗った後新しい培地で２４時間
培養を続けた。 次に、０．０５ｐｇ／ｍｌの濃度にな
るようにＰＡを加え３週間毒素存在下で培養後コロニー
数を算定した。 ｐＨＥＷｌをトランスフェクトした細
胞では全くコロニーは検出されなかったが、ｐＨＥＤｌ
をトランスフェクトした細胞では、プレートあたり約８
０個のコロニーが形成された。 表２にその結果を示し
た。
表２ 毒素存在下でのコロニー形成数ＤＮＡ
コロニー数／１００ｍｍ ｄｉｓｈｐＨＥ
Ｄｌ ８７ ７８ （平均
）ｐＨＥＷＩ ＯＯ（平均）ＬＴ
Ｋ−細胞を５ Ｘ １０ ’ｃｅｌｌｓ／１１００ｎ
ｄｉｓｈ播種し、常法に従いリン酸カルシウム共沈殿法
により各プラスミドを細胞にトランスフェクトし、ＰＡ
ｏ、０５μｇ７ｍｌ存在下で３週間培養後のコロニー形
成数 ■ ＴＫ遺伝子とｐＨＥＤｌとの共形質転換マウスＬＲ
ＴＫ−細胞を５ ｘ １０ ’ｃｅｌｌｓ／ １００ｍ
ｍペトリ皿に播種し、２４時間培養後、ｐＨＥＤ １お
よびヘルペスシンプレックスＴ Ｋ ｉｆｆ 伝子とを
最終濃度おのおの１０μｇ ／ ｍ １となるようにリ
ン酸カルシウム共沈殿を行い２４時間培養後よく細胞を
洗い新鮮な増殖培地に交換し、２４時間培養した。 次
に、ＰＡを０． １μｇ／ｍｌの濃度になるように加え
■と同様に更に３週間培養し、コロニーを作らせた。
その後培地をＨＡＴ培地に交換しＴＫ遺伝子がどの程度
同じ細胞に取り込まれ発現するか調べたところ２０〜３
０％のコロニーがＴＫ遺伝子も発現していることが判っ
た。
コロニー数／１００ｍｍ ｄｉｓｈｐＨＥ
Ｄｌ ８７ ７８ （平均
）ｐＨＥＷＩ ＯＯ（平均）ＬＴ
Ｋ−細胞を５ Ｘ １０ ’ｃｅｌｌｓ／１１００ｎ
ｄｉｓｈ播種し、常法に従いリン酸カルシウム共沈殿法
により各プラスミドを細胞にトランスフェクトし、ＰＡ
ｏ、０５μｇ７ｍｌ存在下で３週間培養後のコロニー形
成数 ■ ＴＫ遺伝子とｐＨＥＤｌとの共形質転換マウスＬＲ
ＴＫ−細胞を５ ｘ １０ ’ｃｅｌｌｓ／ １００ｍ
ｍペトリ皿に播種し、２４時間培養後、ｐＨＥＤ １お
よびヘルペスシンプレックスＴ Ｋ ｉｆｆ 伝子とを
最終濃度おのおの１０μｇ ／ ｍ １となるようにリ
ン酸カルシウム共沈殿を行い２４時間培養後よく細胞を
洗い新鮮な増殖培地に交換し、２４時間培養した。 次
に、ＰＡを０． １μｇ／ｍｌの濃度になるように加え
■と同様に更に３週間培養し、コロニーを作らせた。
その後培地をＨＡＴ培地に交換しＴＫ遺伝子がどの程度
同じ細胞に取り込まれ発現するか調べたところ２０〜３
０％のコロニーがＴＫ遺伝子も発現していることが判っ
た。
図１ （その１〜その５）は、ｐＨＥＷｌの塩基配列お
よびそれから推定されるアミノ酸配列を示す図である。 図中、７７番目のＡＴＧを開始コドンとし２６５１番
目のＴＡＧを終始コドンとする領域がＥＦ−２蛋白をコ
ードする領域である。 図２（その１〜その５）は、ｐＨＥＤＬの塩基配列およ
びそれから推定されるアミノ酸配列を示す図である。 図中、７７番目のＡＴＧを開始コドンとし２６５１番目
のＴＡＧを終始コドンとする領域がジフテリア毒素およ
び緑膿菌外毒素耐性ポリペプチド鎖伸長因子−２をコー
ドする。 図３はｐＨＥＷｌの制限酵素地図を表す図である。 図４はラットＥＦ−２ｃＤＮ’Ａを含むＩ）ＥＦ２の制
限酵素地図およびプローブとして用いたフラグメントＡ
およびＢをを表す図である。 図５（その１〜その２）はＥＦ−２蛋白分子がＡＤＰｒ
ｉｂｏｓｅと結合する周辺のアミノ酸配列およびプロー
ブとして用いた合成オリゴヌクレオチドの配列を示す図
である。 （完） 図１ （その５） 旧ｓ Ｔｒｐ Ｇｌｎ ｌｉｅ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌ
ｙ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｓｅｒ
Ｓｅｒ ＡｒＧｌｕ Ｇｌｙ ＩＩｓ Ｐｒｏ
Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｐｈｅ
Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｌｅｕ ＊＊傘
、。 ＣＡＣＣＴＴ ＧＡＧ ＡＣＴ ＧＴＣＣＣＣＡ
ＴＡ ＡＴＧ ＣＴＧ ＣＴＣＴＧＧ ＡＧＧ
丁ＧＧ ＣＴＧ ＧＧＧＴＣＡ ＧＡＧ
ＧＧ＾ ＡＡＡ ＡＴＣＣＴＣＡＧＡ ↑＾Ｔ
ＣＡＡ ＡＣＡ ＴＣＴ ＡＡＡ ＴＡＡ
ＡＴＧ ＣＡＴｇ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｇｌｎ
Ｖａｌ ＶａＬ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｔｈｒ
Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｇｌｙ
Ｌｅｕ Ｌｙｓ＾ＧＧ ＣＴＴ ＧＣＡ ＣＡ
Ｇ ＣＣＡ ＣＡＣＡｃｔ ＧＣＡ ＣＡＧ Ｔ
ＧＣＣＣＡ ＣＣＣＡＴＣＡＧＡ ＡＧＡＣＣＡ
ＣＣＣＴＧＣＣＡＴ ＴＣＡ ＧＣＡ ＣＴＡ
ＡＣＡ ＣＴＴ ＧＡＴ ＧＣＣＧＡＣ丁Ｃ
Ｔ ＡＴＴ ＴＡＴＧＧＣＴＧＧ ＣＧＧ Ｇ
ＣＣＡＴＧ ＧＧＧ ＴＧＧ ＧＣＡ ＧＧＡ
ＣＡＣＡＧＣＴＣＴ ＴＴＡ ＴＣＡ ＴＴ
Ｔ図２ （その５） ＩＬ；Ａ ＬｉＡｌ１ １ｉＬｉＡ ＡＡＡ Ａ
ＴＩＪＣＴＣ＾ら八 Ｔ＾Ｔ ＣＡＡ ＾ＣＡ
ＴＣＴ ＾へＡＴ＾Ａ ＾ＴＧ２５７０
２５８０’ ２５９０ ２６００
２６１０：Ｇ ＴＣＣＣＡＧ ＣＣＡ
ＡＧＴ ＧＧＴ ＧＧＣＴＧＡ ＧＡＣＣＣ
Ｇ ＣＡＡ ＧＣＧ ＣＡＡ ＡＧＧ ＴＣ
Ｔ ＡＡＡ図５（その１） Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｖａ １−Ｈｉ ５−Ａｓｐ−Ｖａ
１−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−ＨｉＵＵＵ−ＧＡＵ−ＧＵＵ−Ｃ
ＡＵ−ＧＡＵ−ＧＵＵ−ＡＣＵ−ＵＵＡ−ＣＡＣＣＣＣ
ＣＣＣＧ Ａ ＡＡＣＵＵ Ｇ ＧＧＣ １４ｍｅｒｓ ３２
Ｇ１７ｍｅｒｓ ６４ １ｓ ｓ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−１１ｅ−Ｘ −Ａｒｇ
Ｕ−ＧＣＵ−ＧＡＵ−ＧＣＵ−ＡＵＵ−ＣＡＵ−ＣＣＵ
ｃｃｃｃｃｃｃ Ａ ＡＡ ＡＧ
Ｇ ＧＧＡ １１ｍｅｒｓ ２４ Ｇ図５
（その２） １ ２
３ ４ ５（Ａ）
Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｖ
ａｌ Ｈｉｓ Ａｓｐ５° ＵＵＵ ＧＡＵ
ＧＵＵ ＣＡＵ ＧＡＵｃｃｃｃ 八 Ｏｌｉｇｏ ｌ ３°
ＡＡＡ ＣＴＡ ＣＡＡ ＧＴＡ ＣＴＧＴＧ ０１ｉｇｏ ２ ３° Ａ
ＡＡ ＣＴＡ ＣＡＧ ＧＴＡ ＣＴ０ＣＧ （Ｂ） Ａ
ｓｐ Ａｌａ ｌｉｅ ＨｉｓｍＲＮＡ
５’ ＧＡＵ ＧＣＵ
ＡＵＵ ＣＡＵ ３゜ｃｃｃ ＡＡ ０１ｉｇｏ ３ ３° Ｃ
ＴＡ ＣＧＡ ＴＡＡ ＧＴ ５゜ＴＧ ０１ｉｇｏ ４ ３’
ＣＴＡ ＣＧＧ ＴＡＡ ＧＴ ５゜ＣＧＧ 手続補正書（自発） 昭和６１年１０月２８日 ３、 特許庁長官 黒 １）明 雄 殿１、事 ５′ ２、発 ５、 ポリペプチド鎖伸長因子−２ＣＤＮＡとその
利用法 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 大阪市東区北浜５丁目１５番地 （２０９）住友化学工業株式会社 １ 代表者 森 英 雄 ４、代理人 大阪市東区北浜５丁目１５番地 イ ５、補正により増加する発明の数 ０６６補正の対
象 明細書の発明の詳細な説明の欄および図面の簡単な説明
の欄並びに図面 ７、補正の内容 （１）明細書第８頁第１行目に、 ｒ１８５２９４−５２９９（１９８３）） Ｊとあるを
１．８５２９４−５２９９（１９７９）） Ｊと訂正す
る。 （２）同第９頁第１３行目に、ｒ ｆａｃｔｏｒ２．
Ｊとあるをｒｆａｃｔｏｒ ＃ ２． Ｊと訂正する。 （３）同行にｒＫｅｎｎｊｉＪとあるをｒ Ｋｅｎｊ
ｉ Ｊと訂正する。 （４）同頁筒１５行目に「ｉｌ （１９８５） ｉｎ
ｐｒｅｓｓＪとあるを ｒｌｌ ４２１−４３１ （１
９８５） Ｊと訂正する。 （５）同第１３頁第５行目に「急冷して」とあるを「冷
して」と訂正する。 （６） 同第１２２行目「この方法のより」とあるを「
この方法により」と訂正する。 （７）同第１５頁第１６行目に「アス精子ＤＮＡＪとあ
るを「マス精子ＤＮＡＪと訂正する。 （８）同第１６頁第５行目に［Ｒ４ｇｈｙ、ｊとあるを
ｒＲｉｇｂｙ、 ｊと訂正する。 （９）同第１９真下から２行目から第２０頁第２行に「
このプラスミドｐ ＨＥ Ｗ １を・・・昭和６０年９
月１７日）。」とあるを削除する。 （１０）同第２０頁第１０行目と１１１行目間に以下の
文章を挿入する。 「なお、ＥＣｏＲＩ％ Ｋｐｎ Ｉ 、 Ｃ１ａ
Ｉ ％ Ｂａｍ１ｌｌ、 Ｘｈｏ ｒ、 Ａｈａ
ｍ 、 八ａｔ ■、 Ｈｐａ Ｉ Ｓ ＢＣ
Ｉ Ｉ 、 Ｍｓｔ Ｉ 、 ＮａｅＴ、
Ｐｖｕ Ｉ 、 Ｓａｃ ＵおよびＳｃａ Ｉに
関しては、切断部位が無いことが判明した。」 （１１）同第２１頁第２行目に「たはどうか、」とある
を「たかどうか、」と訂正する。 （１２）同第１０行目にｒ２９３２塩基」とあるをｒ２
９３３塩基」と訂正する。 （１３）同第１２２行目「７７番目」とあるを「７８番
目」と訂正する。 （１４） 同第１３３行目ｒ２６５１番目」とあるをｒ
２６５２番目」と訂正する。 （１５）同第２２真第１４行目から１８８行目「このｐ
ＨＥ Ｄ １を６０００００１．昭和６０年９月１７
日）」とあるを削除する。 （１６）同第２３頁第３行目に「シフタマイト」とある
を「シフタミド」と訂正する。 （１７）同第７行目に「クローニングに為」とあるを「
「クローニングの為」と訂正する。 （１８）同第１９９行目「プルーブ」とあるを「プロー
ブ」と訂正する。 （１−９＞同第２４頁第５および６行目にｒｐＲＦ２」
とあるをｒｐＲＥ２Ｊと訂正する。 （２０）同第２５頁第７行目に「マウス」とあるを「マ
ス」を訂正する。 （２１）同第３０頁第１８行目に「７７番目」とあるを
「７８番目」と訂正する。 （２２）同第１９９行目ｒ２６５１番目」とあるをｒ２
６５２番目」と訂正する。 （２３）同第３１頁第４行目に「７７番目」とあるを「
７８番目」と訂正する。 （２４）同第４行目から５行目にｒ２６５１番目」をあ
るをｒ２６５２番目」と訂正する。 （２５）同第８行目と第９行目の間、および第１１行目
と１２２行目間に、以下の文章を挿入する。 「図中、黒色ボクッスは、ＡＤＰリボシル化サイトを表
す。」 （２６）図１（その１〜その５）、図２（その１〜その
５）、図３、図４および図５（そのｌ）を別紙のとおり
に訂正する。 以上 図１ （その５） １し＾ ［ｉＡ［Ｊ １ｊＩＪＡ ＡＡＡ Ａｉ’
［ｉ ＬＩＴＵ ＡＬｉＡ ｉ’Ａ’ｒ ＵＡ
Ａ ＡＵ＾ １１：Ｔ ＡＡＡ ＴＡＡ ＡＴ
らＣＣＧ ＴＣＣＣＡＧ ＣＣＡ ＡＧＴ ＧＧＴ Ｇ
ＧＣＴＧＡ ＧＡＣＣＣＧ ＣＡＡ ＧＣＧ ＣＡＡ
ＡＧＧ ＴＣＴ ＡＡＡしＡＩ ＩＬＡ ＬＩＡＬ
Ｉ ＬＩＡＡ へハ＾ へへへ ＾＾ Ｊ図５（そ
の１） Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｖａ １−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−
ＴｈｒＵＵＵ−ＧＡＵ−ＧＵＵ−ＣＡＵ−ＧＡＵ−ＧＵ
Ｕ−ＡＣＵｃｃｃｃｃｃｃ Ａ ＡＡ Ｇ ＧＧ １４ｍｅｒｓ ３２ １ｓ −Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−１１ｅ−
Ｘ −Ａｒｇ−ＵＵＡ−ＣＡＵ−ＣＣＵ−ＧＡＵ−Ｃ
ＣＵ−ＡＵＵ−ＣＡＵ−ＣＣＵＧＣＣＣＣＣＣＣ
よびそれから推定されるアミノ酸配列を示す図である。 図中、７７番目のＡＴＧを開始コドンとし２６５１番
目のＴＡＧを終始コドンとする領域がＥＦ−２蛋白をコ
ードする領域である。 図２（その１〜その５）は、ｐＨＥＤＬの塩基配列およ
びそれから推定されるアミノ酸配列を示す図である。 図中、７７番目のＡＴＧを開始コドンとし２６５１番目
のＴＡＧを終始コドンとする領域がジフテリア毒素およ
び緑膿菌外毒素耐性ポリペプチド鎖伸長因子−２をコー
ドする。 図３はｐＨＥＷｌの制限酵素地図を表す図である。 図４はラットＥＦ−２ｃＤＮ’Ａを含むＩ）ＥＦ２の制
限酵素地図およびプローブとして用いたフラグメントＡ
およびＢをを表す図である。 図５（その１〜その２）はＥＦ−２蛋白分子がＡＤＰｒ
ｉｂｏｓｅと結合する周辺のアミノ酸配列およびプロー
ブとして用いた合成オリゴヌクレオチドの配列を示す図
である。 （完） 図１ （その５） 旧ｓ Ｔｒｐ Ｇｌｎ ｌｉｅ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌ
ｙ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｓｅｒ
Ｓｅｒ ＡｒＧｌｕ Ｇｌｙ ＩＩｓ Ｐｒｏ
Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｐｈｅ
Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｌｅｕ ＊＊傘
、。 ＣＡＣＣＴＴ ＧＡＧ ＡＣＴ ＧＴＣＣＣＣＡ
ＴＡ ＡＴＧ ＣＴＧ ＣＴＣＴＧＧ ＡＧＧ
丁ＧＧ ＣＴＧ ＧＧＧＴＣＡ ＧＡＧ
ＧＧ＾ ＡＡＡ ＡＴＣＣＴＣＡＧＡ ↑＾Ｔ
ＣＡＡ ＡＣＡ ＴＣＴ ＡＡＡ ＴＡＡ
ＡＴＧ ＣＡＴｇ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｇｌｎ
Ｖａｌ ＶａＬ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｔｈｒ
Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｇｌｙ
Ｌｅｕ Ｌｙｓ＾ＧＧ ＣＴＴ ＧＣＡ ＣＡ
Ｇ ＣＣＡ ＣＡＣＡｃｔ ＧＣＡ ＣＡＧ Ｔ
ＧＣＣＣＡ ＣＣＣＡＴＣＡＧＡ ＡＧＡＣＣＡ
ＣＣＣＴＧＣＣＡＴ ＴＣＡ ＧＣＡ ＣＴＡ
ＡＣＡ ＣＴＴ ＧＡＴ ＧＣＣＧＡＣ丁Ｃ
Ｔ ＡＴＴ ＴＡＴＧＧＣＴＧＧ ＣＧＧ Ｇ
ＣＣＡＴＧ ＧＧＧ ＴＧＧ ＧＣＡ ＧＧＡ
ＣＡＣＡＧＣＴＣＴ ＴＴＡ ＴＣＡ ＴＴ
Ｔ図２ （その５） ＩＬ；Ａ ＬｉＡｌ１ １ｉＬｉＡ ＡＡＡ Ａ
ＴＩＪＣＴＣ＾ら八 Ｔ＾Ｔ ＣＡＡ ＾ＣＡ
ＴＣＴ ＾へＡＴ＾Ａ ＾ＴＧ２５７０
２５８０’ ２５９０ ２６００
２６１０：Ｇ ＴＣＣＣＡＧ ＣＣＡ
ＡＧＴ ＧＧＴ ＧＧＣＴＧＡ ＧＡＣＣＣ
Ｇ ＣＡＡ ＧＣＧ ＣＡＡ ＡＧＧ ＴＣ
Ｔ ＡＡＡ図５（その１） Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｖａ １−Ｈｉ ５−Ａｓｐ−Ｖａ
１−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−ＨｉＵＵＵ−ＧＡＵ−ＧＵＵ−Ｃ
ＡＵ−ＧＡＵ−ＧＵＵ−ＡＣＵ−ＵＵＡ−ＣＡＣＣＣＣ
ＣＣＣＧ Ａ ＡＡＣＵＵ Ｇ ＧＧＣ １４ｍｅｒｓ ３２
Ｇ１７ｍｅｒｓ ６４ １ｓ ｓ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−１１ｅ−Ｘ −Ａｒｇ
Ｕ−ＧＣＵ−ＧＡＵ−ＧＣＵ−ＡＵＵ−ＣＡＵ−ＣＣＵ
ｃｃｃｃｃｃｃ Ａ ＡＡ ＡＧ
Ｇ ＧＧＡ １１ｍｅｒｓ ２４ Ｇ図５
（その２） １ ２
３ ４ ５（Ａ）
Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｖ
ａｌ Ｈｉｓ Ａｓｐ５° ＵＵＵ ＧＡＵ
ＧＵＵ ＣＡＵ ＧＡＵｃｃｃｃ 八 Ｏｌｉｇｏ ｌ ３°
ＡＡＡ ＣＴＡ ＣＡＡ ＧＴＡ ＣＴＧＴＧ ０１ｉｇｏ ２ ３° Ａ
ＡＡ ＣＴＡ ＣＡＧ ＧＴＡ ＣＴ０ＣＧ （Ｂ） Ａ
ｓｐ Ａｌａ ｌｉｅ ＨｉｓｍＲＮＡ
５’ ＧＡＵ ＧＣＵ
ＡＵＵ ＣＡＵ ３゜ｃｃｃ ＡＡ ０１ｉｇｏ ３ ３° Ｃ
ＴＡ ＣＧＡ ＴＡＡ ＧＴ ５゜ＴＧ ０１ｉｇｏ ４ ３’
ＣＴＡ ＣＧＧ ＴＡＡ ＧＴ ５゜ＣＧＧ 手続補正書（自発） 昭和６１年１０月２８日 ３、 特許庁長官 黒 １）明 雄 殿１、事 ５′ ２、発 ５、 ポリペプチド鎖伸長因子−２ＣＤＮＡとその
利用法 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 大阪市東区北浜５丁目１５番地 （２０９）住友化学工業株式会社 １ 代表者 森 英 雄 ４、代理人 大阪市東区北浜５丁目１５番地 イ ５、補正により増加する発明の数 ０６６補正の対
象 明細書の発明の詳細な説明の欄および図面の簡単な説明
の欄並びに図面 ７、補正の内容 （１）明細書第８頁第１行目に、 ｒ１８５２９４−５２９９（１９８３）） Ｊとあるを
１．８５２９４−５２９９（１９７９）） Ｊと訂正す
る。 （２）同第９頁第１３行目に、ｒ ｆａｃｔｏｒ２．
Ｊとあるをｒｆａｃｔｏｒ ＃ ２． Ｊと訂正する。 （３）同行にｒＫｅｎｎｊｉＪとあるをｒ Ｋｅｎｊ
ｉ Ｊと訂正する。 （４）同頁筒１５行目に「ｉｌ （１９８５） ｉｎ
ｐｒｅｓｓＪとあるを ｒｌｌ ４２１−４３１ （１
９８５） Ｊと訂正する。 （５）同第１３頁第５行目に「急冷して」とあるを「冷
して」と訂正する。 （６） 同第１２２行目「この方法のより」とあるを「
この方法により」と訂正する。 （７）同第１５頁第１６行目に「アス精子ＤＮＡＪとあ
るを「マス精子ＤＮＡＪと訂正する。 （８）同第１６頁第５行目に［Ｒ４ｇｈｙ、ｊとあるを
ｒＲｉｇｂｙ、 ｊと訂正する。 （９）同第１９真下から２行目から第２０頁第２行に「
このプラスミドｐ ＨＥ Ｗ １を・・・昭和６０年９
月１７日）。」とあるを削除する。 （１０）同第２０頁第１０行目と１１１行目間に以下の
文章を挿入する。 「なお、ＥＣｏＲＩ％ Ｋｐｎ Ｉ 、 Ｃ１ａ
Ｉ ％ Ｂａｍ１ｌｌ、 Ｘｈｏ ｒ、 Ａｈａ
ｍ 、 八ａｔ ■、 Ｈｐａ Ｉ Ｓ ＢＣ
Ｉ Ｉ 、 Ｍｓｔ Ｉ 、 ＮａｅＴ、
Ｐｖｕ Ｉ 、 Ｓａｃ ＵおよびＳｃａ Ｉに
関しては、切断部位が無いことが判明した。」 （１１）同第２１頁第２行目に「たはどうか、」とある
を「たかどうか、」と訂正する。 （１２）同第１０行目にｒ２９３２塩基」とあるをｒ２
９３３塩基」と訂正する。 （１３）同第１２２行目「７７番目」とあるを「７８番
目」と訂正する。 （１４） 同第１３３行目ｒ２６５１番目」とあるをｒ
２６５２番目」と訂正する。 （１５）同第２２真第１４行目から１８８行目「このｐ
ＨＥ Ｄ １を６０００００１．昭和６０年９月１７
日）」とあるを削除する。 （１６）同第２３頁第３行目に「シフタマイト」とある
を「シフタミド」と訂正する。 （１７）同第７行目に「クローニングに為」とあるを「
「クローニングの為」と訂正する。 （１８）同第１９９行目「プルーブ」とあるを「プロー
ブ」と訂正する。 （１−９＞同第２４頁第５および６行目にｒｐＲＦ２」
とあるをｒｐＲＥ２Ｊと訂正する。 （２０）同第２５頁第７行目に「マウス」とあるを「マ
ス」を訂正する。 （２１）同第３０頁第１８行目に「７７番目」とあるを
「７８番目」と訂正する。 （２２）同第１９９行目ｒ２６５１番目」とあるをｒ２
６５２番目」と訂正する。 （２３）同第３１頁第４行目に「７７番目」とあるを「
７８番目」と訂正する。 （２４）同第４行目から５行目にｒ２６５１番目」をあ
るをｒ２６５２番目」と訂正する。 （２５）同第８行目と第９行目の間、および第１１行目
と１２２行目間に、以下の文章を挿入する。 「図中、黒色ボクッスは、ＡＤＰリボシル化サイトを表
す。」 （２６）図１（その１〜その５）、図２（その１〜その
５）、図３、図４および図５（そのｌ）を別紙のとおり
に訂正する。 以上 図１ （その５） １し＾ ［ｉＡ［Ｊ １ｊＩＪＡ ＡＡＡ Ａｉ’
［ｉ ＬＩＴＵ ＡＬｉＡ ｉ’Ａ’ｒ ＵＡ
Ａ ＡＵ＾ １１：Ｔ ＡＡＡ ＴＡＡ ＡＴ
らＣＣＧ ＴＣＣＣＡＧ ＣＣＡ ＡＧＴ ＧＧＴ Ｇ
ＧＣＴＧＡ ＧＡＣＣＣＧ ＣＡＡ ＧＣＧ ＣＡＡ
ＡＧＧ ＴＣＴ ＡＡＡしＡＩ ＩＬＡ ＬＩＡＬ
Ｉ ＬＩＡＡ へハ＾ へへへ ＾＾ Ｊ図５（そ
の１） Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｖａ １−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−
ＴｈｒＵＵＵ−ＧＡＵ−ＧＵＵ−ＣＡＵ−ＧＡＵ−ＧＵ
Ｕ−ＡＣＵｃｃｃｃｃｃｃ Ａ ＡＡ Ｇ ＧＧ １４ｍｅｒｓ ３２ １ｓ −Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−１１ｅ−
Ｘ −Ａｒｇ−ＵＵＡ−ＣＡＵ−ＣＣＵ−ＧＡＵ−Ｃ
ＣＵ−ＡＵＵ−ＣＡＵ−ＣＣＵＧＣＣＣＣＣＣＣ
Claims (14)
- （１）ポリペプチド鎖伸長因子−２ｃＤＮＡおよびその
ジフテリア毒素あるいは緑膿菌外毒素抵抗性変異体。 - （２）図１に記載のアミノ酸配列で特定される特許請求
の範囲第１項記載のポリペプチド鎖伸長因子−２ｃＤＮ
Ａおよびそのジフテリア毒素あるいは緑膿菌外毒素抵抗
性変異体。 - （３）図２に記載のアミノ酸配列で特定される特許請求
の範囲第１項記載のジフテリア毒素あるいは緑膿菌外毒
素抵抗性変異ポリペプチド鎖伸長因子−２ｃＤＮＡ。 - （４）ポリペプチド鎖伸長因子−２ｃＤＮＡもしくはそ
のジフテリア毒素あるいは緑膿菌外毒素抵抗性変異体を
組み込んだプラスミド。 - （５）図１に記載のアミノ酸配列で特定されるポリペプ
チド鎖伸長因子−２ｃＤＮＡもしくはそのジフテリア毒
素あるいは緑膿菌外毒素抵抗性変異体を組み込んだ特許
請求の範囲第４項記載のプラスミド。 - （６）図２に記載のアミノ酸配列で特定される変異ポリ
ペプチド鎖伸長因子−２ｃＤＮＡを組み込んだ特許請求
の範囲第４項記載のプラスミド。 - （７）ポリペプチド鎖伸長因子−２ｃＤＮＡもしくはそ
のジフテリア毒素あるいは緑膿菌外毒素抵抗性変異体を
組み込んだプラスミドを保持する微生物あるいは動物細
胞。 - （８）図１に記載のアミノ酸配列で特定されるポリペプ
チド鎖伸長因子−２ｃＤＮＡもしくはそのジフテリア毒
素あるいは緑膿菌外毒素抵抗性変異体を組み込んだプラ
スミドを保持する特許請求の範囲第７項記載の微生物あ
るいは動物細胞。 - （９）図２に記載のアミノ酸配列で特定される変異ポリ
ペプチド鎖伸長因子−２ｃＤＮＡを組み込んだプラスミ
ドを保持する特許請求の範囲第７項記載の微生物あるい
は動物細胞。 - （１０）図１に記載のアミノ酸配列で特定されるポリペ
プチド鎖伸長因子−２ｃＤＮＡを組み込んだプラスミド
を保持する特許請求の範囲第７項記載の菌Ｅ．ｃｏｌｉ
ＨＢ１０１−ｐＨＥＤ１株。 - （１１）図２に記載のアミノ酸配列で特定される変異ポ
リペプチド鎖伸長因子−２ｃＤＮＡを組み込んだプラス
ミドを保持する特許請求の範囲第７項記載の菌Ｅ．ｃｏ
ｌｉＨＢ１０１−ｐＨＥＷ１株。 - （１２）ジフテリア毒素あるいは緑膿菌外毒素抵抗性の
ポリペプチド鎖伸長因子−２変異体ｃＤＮＡから成る選
択マーカー。 - （１３）図２に記載のアミノ酸配列で特定される変異ポ
リペプチド鎖伸長因子−２ｃＤＮＡから成る特許請求の
範囲第１２項記載の選択マーカー。 - （１４）ジフテリア毒素あるいは緑膿菌外毒素耐性ポリ
ペプチド鎖伸長因子−２遺伝子を選択マーカーとして用
いることを特徴とする異種遺伝子導入細胞の選択培養方
法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60219545A JPS6283888A (ja) | 1985-09-30 | 1985-09-30 | ポリペプチド鎖伸長因子−２ｃＤＮＡとその利用法 |
| DE19863688643 DE3688643T2 (de) | 1985-09-30 | 1986-09-29 | Für eine Variante des Elongationsfaktors 2 kodierende DNS-Sequenz. |
| EP86113349A EP0217327B1 (en) | 1985-09-30 | 1986-09-29 | Dna sequence encoding variant elongation factor 2 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60219545A JPS6283888A (ja) | 1985-09-30 | 1985-09-30 | ポリペプチド鎖伸長因子−２ｃＤＮＡとその利用法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6283888A true JPS6283888A (ja) | 1987-04-17 |
Family
ID=16737175
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60219545A Pending JPS6283888A (ja) | 1985-09-30 | 1985-09-30 | ポリペプチド鎖伸長因子−２ｃＤＮＡとその利用法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0217327B1 (ja) |
| JP (1) | JPS6283888A (ja) |
| DE (1) | DE3688643T2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7696338B2 (en) | 1995-10-30 | 2010-04-13 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Immunotoxin fusion proteins and means for expression thereof |
| AU736501B2 (en) * | 1997-03-05 | 2001-07-26 | Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The | Novel vectors and expression methods for producing mutant proteins |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1231303A (en) * | 1983-08-05 | 1988-01-12 | Robert J. Carrico | Detection of bacteria by nucleic acid hybridization |
-
1985
- 1985-09-30 JP JP60219545A patent/JPS6283888A/ja active Pending
-
1986
- 1986-09-29 DE DE19863688643 patent/DE3688643T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1986-09-29 EP EP86113349A patent/EP0217327B1/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| BIOLOGICAL ABSTRACTS * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3688643D1 (de) | 1993-08-05 |
| EP0217327A3 (en) | 1988-09-07 |
| DE3688643T2 (de) | 1994-01-20 |
| EP0217327B1 (en) | 1993-06-30 |
| EP0217327A2 (en) | 1987-04-08 |
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