JPS6257311B2

JPS6257311B2 -

Info

Publication number: JPS6257311B2
Application number: JP17872681A
Authority: JP
Inventors: Junzo Hasegawa; Masahiro Ogura; Hajime Kawarada; Kyoshi Watanabe
Original assignee: Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1981-11-06
Filing date: 1981-11-06
Publication date: 1987-11-30
Also published as: JPS5878593A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、光学活性炭素骨格を有する種々の天
然物または医薬品等の生理活性物質を合成する際
に有用な原料の１つである光学活性なＤ（−）―
β―ヒドロキシイソ酪酸の、微生物を利用した工
業的に有利な製造方法に関するものである。従来、光学活性なＤ（−）―β―ヒドロキシイ
ソ酪酸の調製方法として光学活性アミン類などの
ような分割剤を用いてDL（±）―β―ヒドロキ
シイソ酪酸を光学分割する方法、２―メチル―
１，３―プロパンジオールより酢酸菌を用いて不
斉酸化により得る方法等があるが、これらはいづ
れも収率および製造費用の面から、とうてい工業
的に行ないうるものではない。先に本発明者等は、イソ酵酸あるいはメタクリ
ル酸を原料として、微生物による工業的に有利な
Ｄ（−）―β―ヒドロキシイソ酪酸の製造法を確
立した（公開昭56―68394、公開昭56―68395等）
が、更に研究を重ねた結果、イソ酪酸やメタクリ
ル酸より更に安価なイソブチルアルコールから微
生物によりＤ（−）―β―ヒドロキシイソ酪酸を
製造しうることを見い出し本発明を完成した。即ち、本発明はイソブチルアルコールに、この
ものをＤ（−）―β―ヒドロキシイソ酪酸に変換
する能力を有するキヤンデイダ属、ピキア属、ト
ルロプシス属、アスペルギルス属、コアネホラ
属、ウエンゲア属、またはチゴリンカス属に属す
る微生物を作用せしめ、生成したＤ（−）―β―
ヒドロキシイソ酪酸を採取することを特徴とする
Ｄ（−）―β―ヒドロキシイソ酪酸の製造法に関
するものである。本発明に使用されるイソブチルアルコールをＤ
（−）―β―ヒドロキシイソ酪酸へ変換する能力
を有する微生物としてはキヤンデイダ・ルゴーザ
（Candida rugosa）、キヤンデイダ・パラプシロ
シス（Candida parapsilosis）、ピキア・メンブ
ランアエフアシエンス
（Pichiamembranaefaciens）、トルロプシス・キ
ヤンデイダ（Torulopsis candida）、アスペルギ
ルス・ニガー（Aspergillus niger）、コアネホ
ラ・シルミナンス（Choanephora circinans）、
チゴリンカス・モエレリイ（Zygorhynchus
moelleri）等があり、これらの培養には通常これ
らの菌が資化しうる栄養源ならなんでも使用しう
る。例えば炭素源としてグルコース、シユクロー
ス、マニトール等の炭水化物；エタノールを始め
とするアルコール類；パラフイン、オレフイン類
の炭化水素；酢酸等の有機酸類；大豆油等の単独
又はこれらの混合物、窒素源として硫酸アンモニ
ウム、リン酸アンモニウム等、有機栄養源として
イーストエキス、麦芽エキス、肉エキス、ペプト
ン等、また微量金属塩、ビタミン等、通常の培養
に用いられる栄養源を適宜混合した培地を用いる
ことができる。培養の方法としては、栄養培地の
PHを4.0〜9.5の範囲で好気的に15〜40℃の範囲で
１〜５日間培養する。イソブチルアルコールから、Ｄ（−）―β―ヒ
ドロキシイソ酪酸への変換にはPH6.0〜9.5のPH範
囲が好ましい。また微生物をイソブチルアルコー
ルに作用させる方法としては、菌体の培養と並行
して行なう方法として、例えばイソブチルアルコ
ールと上記の炭素源との共存下でPH4.0〜9.5の範
囲で好気的に培養し、培養液中にＤ（−）―β―
ヒドロキシイソ酪酸を蓄積させる方法があり、ま
た菌体の培養とイソブチルアルコールからＤ
（−）―β―ヒドロキシイソ酪酸への変換反応を
２段階に分けて行なう方法、例えば菌体の生産を
栄養培地でPH4.0〜9.5の範囲で好気的に培養し、
得られた培養液にイソブチルアルコールを添加
し、PHを6.0〜9.5に保持して好気的に反応させる
方法、又は得られた培養液から遠心分離等で菌体
を集め、菌体を適当な組成の液、例えばＭ／15リ
ン酸緩衝液（PH7.0）に懸濁し、イソブチルアル
コールを加え、好気的でPH6.0〜9.5の範囲で反応
を行なう方法がある。この場合、菌体はアルギン
酸ソーダ等による固定化を行なつたものも使用で
きる。培養及び反応で得られたＤ（−）―β―ヒドロ
キシイソ酪酸の採取方法としては、通常の公知の
抽出精製方法が利用しうるが、得られたＤ（−）
―β―ヒドロキシイソ酪酸含有液のPHを硫酸等で
2.0付近まで下げ、更に飽和となるまで硫酸アン
モニウムを加える。しかる後、等量の酢酸エチル
で３回抽出を行なう。これを減圧下溶剤を除くと
Ｄ（−）―β―ヒドロキシイソ酪酸含有物が褐色
油状で得られる。更にこのものを少量のベンゼン
に溶解しベンゼン―アセトン混合溶剤で溶出する
シリカゲルカラムクロマトグラフイーを行なうこ
とにより容易に不純物と分離することができる。
また生成Ｄ（−）―β―ヒドロキシイソ酪酸の定
量は、シマズFAL―M10％／シマライトカラ
ムを用いるガスクロマトグラフイーにより容易に
行なうことができる（長谷川等、ジヤーナル・オ
ブ・フアーメンテーシヨン・テクノロジー59，
203（1981））。次に本発明を実施例によつて説明するが、本発
明は実施例のみに限定されるものではない。実施例１グルコース２％、イーストエキス0.5％、ペプ
トン0.3％、肉エキス0.3％、イソブチルアルコー
ル0.5％を含有する培地（PH7.0）１にキヤンデ
イダ・ルゴーザIFO 0750、キヤンデイダ・パラ
プシロシスIFO 0708、ピキア・メンブランアエ
フアシエンスIAM4904、トルロプシス・キヤン
デイダIFO 0380、アスペルギルス・ニガ―
IAM2532、コアネホラ・シルシナンス
HUT1324、ウインゲア・ロベルツイIFO 1277、
チゴリンカス・モエレリイHUT1305、をそれぞ
れ植菌し、３容ミニジヤーフアメンターで30
℃、通気1vvm、撹拌500rpmで20時間培養した。
その後PHを7.0に維持し、更に24時間培養を行な
つた。このようにして得た培養液中のＤ（−）―β―
ヒドロキシイソ酪酸の含有量をガスクロマトグラ
フイーで分析した結果を表に示す。

【表】 IAMは東京大学応用微生物研究所有用菌株保
存施設（東京都文京区弥生１丁目１番１号）に、
HUTは広島大学工学部醗酵工学科菌株保存施設
（東広島市西条町下見）に、夫々保存されている
菌株である。得られた培養液を遠心分離で菌体を除去後、
200mlに減圧濃縮し、硫酸でPH1.0とし、更に硫酸
アンモニウムを飽和溶液とした。次に２倍量の酢
酸エチルで抽出し、これを減圧下、50℃以下で溶
剤を除去し黄色油状物質を得た。この油状物質を重量の５倍量のシリカゲル（ワ
コーゲルＱ―50）を用いベンゼンで調製したカラ
ムにかけた。その後、ベンゼン：アセトン（３：
１）溶剤でＤ（−）―β―ヒドロキシイソ酪酸を
溶出した。得られたＤ（−）―β―ヒドロキシイソ酪酸画
分を集め、減圧下で溶剤を除去し、メタノールに
溶解後、その旋光度を測定した結果夫々〔α〕^２５ _Ｄ
＝−15.1〜18.0゜（Ｃ＝３，メタノール）の値を
得、Ｄ（−）体のβ―ヒドロキシイソ酪酸である
ことが確認された。実施例２グルコース２％、イーストエキス0.5％、ペプ
トン0.3％、肉エキス0.3％を含有する培地（PH
7.0）１にキヤンデイダ・ルゴーザIFO0750を
植菌し、３容ミニジヤーフアメンターで30℃、
通気1vvm、撹拌500rpmで20時間培養した。その
後、遠心分離によつて菌体を集め、１％イソブチ
ルアルコール、１％グルコース含有Ｍ／15リン酸
緩衝液（PH7.0）に懸濁し、PHを7.0にカセイソー
ダで維持しながら培養と同一条件で反応を24時間
行なつた。その後、更に10ｇのイソブチルアルコ
ールを添加し、24時間反応を行つた。このように
して得た培養液中のＤ（−）―β―ヒドロキシイ
ソ酪酸の含有量をガスクロマトグラフイーで分析
した結果、9.2mg／mlのＤ（−）―β―ヒドロキ
シイソ酪酸の蓄積が認められた。更に実施例１と
同様にＤ（−）―β―ヒドロキシイソ酪酸の蓄積
が認められた。更に実施例１と同様にＤ（−）―
β―ヒドロキシイソ酪酸をを精製し、旋光度を測
定した結果〔α〕^２５ _Ｄ＝−17.7゜（Ｃ＝３，メタノ
ール）を示し、Ｄ（−）体のβ―ヒドロキシイソ
酪酸であることが確認された。本実施例において、培養液から菌体を分離する
ことなしに、培養液に直接イソブチルアルコール
を添加して反応させた場合においてもほぼ同量の
Ｄ（−）―β―ヒドロキシイソ酪酸の蓄積が認め
られた。

Claims

【特許請求の範囲】１イソブチルアルコールに、このものをＤ
（−）―β―ヒドロキシイソ酪酸に変換する能力
を有するキヤンデイダ属、ピキア属、トルロプシ
ス属、アスペルギルス属、コアネホラ属、ウイン
ゲア属、またはチゴリンカス属に属する微生物を
作用せしめ、生成したＤ（−）―β―ヒドロキシ
イソ酪酸を採取することを特徴とするＤ（−）―
β―ヒドロキシイソ酪酸の製造法。２微生物がキヤンデイダ・ルゴーザ、キヤンデ
イダ・パラプシロシス、ピキア・メンブランアエ
フアシエンス、トルロプシス・キヤンデイダ、ア
スペルギルス・ニガー、コアネホラ・シルシナン
ス、ウインゲア・ロベルツイあるいはチゴリンカ
ス・モエレリイである特許請求の範囲第１項記載
の製造法。３イソブチルアルコールを添加した培地で微生
物を培養することにより、微生物をイソブチルア
ルコールに作用させる特許請求の範囲第１項記載
の製造法。４微生物を栄養培地で培養して得た培養液から
微生物菌体を分離して、菌体懸濁液を調製し、そ
れをイソブチルアルコールに作用させる特許請求
の範囲第１項記載の製造法。５微生物を栄養培地で培養して得た培養液にイ
ソブチルアルコールを添加し、作用させる特許請
求の範囲第１項記載の製造法。