JPS6251591B2 - - Google Patents
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- JPS6251591B2 JPS6251591B2 JP54152468A JP15246879A JPS6251591B2 JP S6251591 B2 JPS6251591 B2 JP S6251591B2 JP 54152468 A JP54152468 A JP 54152468A JP 15246879 A JP15246879 A JP 15246879A JP S6251591 B2 JPS6251591 B2 JP S6251591B2
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Description
本発明は新規好熱性アスパルターゼ、その製造
法および該酵素を生産する能力を有する微生物な
らびに該酵素を利用するL−アスパラギン酸の製
造法に関する。 L−アスパラギン酸は疲労回復剤、アンモニア
解毒剤、アミノ酸輸液等、医薬品、食品添加物ま
たは臨床診断薬として用いられる重要な物質であ
る。現在L−アスパラギン酸の製造法としては、
北原等によるエシヤリキア・コリを用いる方法
(特公昭38−6588号公報)があり、これを中心に
固定化法による生産についても2、3の報告がな
されている。 (鮫島、木村:Enzyme Engineering2、
131、(1974)Plenum Press、New York and
London、土佐、干畑:Appl Microbiol27、886、
(1974))。公知の事例はすべて常温菌を利用した
ものである。 本発明者等は熱安定なアスパルターゼを得る目
的で種々の好熱性細菌についてアスパルターゼ活
性を調べた結果、バチルス属に属する好熱性細菌
が好熱性のアスパルターゼ活性を有することを見
出し、本発明を完成するに到つた。発酵操作、酵
素反応などを高温条件下で行なえることは、雑菌
汚染防止、酵素反応の迅速性、冷却エネルギーの
節約などの点から極めて有利である。 本発明に係る好熱性アスパルターゼは、該酵素
を生産する能力を有する微生物を栄養培地中に培
養し、培養物中に該酵素を蓄積せしめ、該培養物
から該酵素を採取することにより製造することが
できる。 本発明で使用する微生物は好熱性アスパルター
ゼ生産能力を有するものならいかなる菌株を用い
てもよいが、具体的にはバチルス属に属する菌
株、例えばバチルス・リケニホルミス(Bacillus
licheniformis)T−514(微工研菌寄第5241号、
NRRL B−12062)、バチルス・ブレビス
(Bacillus brevis)T−616(微工研菌寄第5242
号、NRRL B−12063)、バチルス・アミノゲネ
ス・ノブ・エスピー(Bacillus aminogenes nov
sp)T−596(微工研菌寄第5240号、NRRL B−
12061)、バチルス・サーモアミノフイラス・ノ
ブ・エスピー(Bacillus thermoaminophilus nov
sp)T−585(微工研菌寄第5239号、NRRL B−
12060)などがあげられる。 本発明者らが分離同定したアスパルターゼ生産
菌株4株の菌学的性質(第1表)および同定の準
拠について以下に示す。
法および該酵素を生産する能力を有する微生物な
らびに該酵素を利用するL−アスパラギン酸の製
造法に関する。 L−アスパラギン酸は疲労回復剤、アンモニア
解毒剤、アミノ酸輸液等、医薬品、食品添加物ま
たは臨床診断薬として用いられる重要な物質であ
る。現在L−アスパラギン酸の製造法としては、
北原等によるエシヤリキア・コリを用いる方法
(特公昭38−6588号公報)があり、これを中心に
固定化法による生産についても2、3の報告がな
されている。 (鮫島、木村:Enzyme Engineering2、
131、(1974)Plenum Press、New York and
London、土佐、干畑:Appl Microbiol27、886、
(1974))。公知の事例はすべて常温菌を利用した
ものである。 本発明者等は熱安定なアスパルターゼを得る目
的で種々の好熱性細菌についてアスパルターゼ活
性を調べた結果、バチルス属に属する好熱性細菌
が好熱性のアスパルターゼ活性を有することを見
出し、本発明を完成するに到つた。発酵操作、酵
素反応などを高温条件下で行なえることは、雑菌
汚染防止、酵素反応の迅速性、冷却エネルギーの
節約などの点から極めて有利である。 本発明に係る好熱性アスパルターゼは、該酵素
を生産する能力を有する微生物を栄養培地中に培
養し、培養物中に該酵素を蓄積せしめ、該培養物
から該酵素を採取することにより製造することが
できる。 本発明で使用する微生物は好熱性アスパルター
ゼ生産能力を有するものならいかなる菌株を用い
てもよいが、具体的にはバチルス属に属する菌
株、例えばバチルス・リケニホルミス(Bacillus
licheniformis)T−514(微工研菌寄第5241号、
NRRL B−12062)、バチルス・ブレビス
(Bacillus brevis)T−616(微工研菌寄第5242
号、NRRL B−12063)、バチルス・アミノゲネ
ス・ノブ・エスピー(Bacillus aminogenes nov
sp)T−596(微工研菌寄第5240号、NRRL B−
12061)、バチルス・サーモアミノフイラス・ノ
ブ・エスピー(Bacillus thermoaminophilus nov
sp)T−585(微工研菌寄第5239号、NRRL B−
12060)などがあげられる。 本発明者らが分離同定したアスパルターゼ生産
菌株4株の菌学的性質(第1表)および同定の準
拠について以下に示す。
【表】
【表】
【表】
上記の菌学的性質をもとにして、バージーズ・
マニユアル・オブ・デイターミナテイブ・バクテ
リオロジー、第8版(1974)およびR.E.Gordon
ら著。The Genus Bacillus(Agricultural
Research Service、U.S.Department of
Agriculture、(1973))を参考にして公知の菌株
とその異同を検討した。 上記4菌株はグラム陽性、有胞子の好気性ある
いは通性嫌気性の桿状菌である故、いずれも
Bacillus族属である。T−514菌およびT−616菌
は、同定実験に際して対照菌として使用したバチ
ルス・リケニホルミスおよびバチルス・ブレビス
の標準株についての実験結果およびマニユアル中
の記載とほぼ完全に一致するので、バチルス・リ
ケニホルミスおよびバチルス・ブレビスと同定し
た。 T−596菌は、生育最高温度、スポンジア膨
潤、嫌気的に生育せず、VPテスト陰性、でん粉
加水分解陰性、7%食塩耐性陰性などの点からバ
チルス・ブレビスに類似しているが、上記マニユ
アルの記載およびバチルス・ブレビスATCC8185
についての比較実験結果での相違点が第2表の如
くであること、さらにT−596菌は強力なアスパ
ルターゼ活性を有する特徴があること等の根拠か
ら本菌を新種と見做し、バチルス・アミノゲネ
ス・ノブ・エスピー(Bacillus aminogenes nov
sp)と命名した。
マニユアル・オブ・デイターミナテイブ・バクテ
リオロジー、第8版(1974)およびR.E.Gordon
ら著。The Genus Bacillus(Agricultural
Research Service、U.S.Department of
Agriculture、(1973))を参考にして公知の菌株
とその異同を検討した。 上記4菌株はグラム陽性、有胞子の好気性ある
いは通性嫌気性の桿状菌である故、いずれも
Bacillus族属である。T−514菌およびT−616菌
は、同定実験に際して対照菌として使用したバチ
ルス・リケニホルミスおよびバチルス・ブレビス
の標準株についての実験結果およびマニユアル中
の記載とほぼ完全に一致するので、バチルス・リ
ケニホルミスおよびバチルス・ブレビスと同定し
た。 T−596菌は、生育最高温度、スポンジア膨
潤、嫌気的に生育せず、VPテスト陰性、でん粉
加水分解陰性、7%食塩耐性陰性などの点からバ
チルス・ブレビスに類似しているが、上記マニユ
アルの記載およびバチルス・ブレビスATCC8185
についての比較実験結果での相違点が第2表の如
くであること、さらにT−596菌は強力なアスパ
ルターゼ活性を有する特徴があること等の根拠か
ら本菌を新種と見做し、バチルス・アミノゲネ
ス・ノブ・エスピー(Bacillus aminogenes nov
sp)と命名した。
【表】
T−585菌は生育温度範囲、スポランジアの膨
潤、嫌気的に生育せず、VPテスト陰性、7%食
塩耐性陰性などの点からバチルス・ステアロサー
モフイラスに類似しているが、上記マニユアルの
記載およびバチルス・ステアロサーモフイラス
ATCC12980についての比較実験結果での相違点
が第3表の如くであること、さらにT−585菌は
強力なアスパルターゼ活性を有する特徴があるこ
と等の根拠から本菌を新種と見做し、バチルス・
サーモアミノフイラス・ノブ・エスピー
(Bacillus thermoaminophilus nov sp)と命名
した。
潤、嫌気的に生育せず、VPテスト陰性、7%食
塩耐性陰性などの点からバチルス・ステアロサー
モフイラスに類似しているが、上記マニユアルの
記載およびバチルス・ステアロサーモフイラス
ATCC12980についての比較実験結果での相違点
が第3表の如くであること、さらにT−585菌は
強力なアスパルターゼ活性を有する特徴があるこ
と等の根拠から本菌を新種と見做し、バチルス・
サーモアミノフイラス・ノブ・エスピー
(Bacillus thermoaminophilus nov sp)と命名
した。
【表】
これらの菌株の培養法について以下に述べる。
これらの菌株の培養においては、通常の好熱性細
菌の培養法が一般に用いられる。炭素源として
は、グルコース、フラクトース、マルトース、シ
ユークロース、マニトール、澱粉、糖蜜、グリセ
リン等の糖質および糖・アルコールが単独または
組合せて用いられる。また菌の資化性によつて
は、炭化水素、アルコール類、有機酸等も用いう
る。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸ナトリウ
ム、尿意等の無機窒素源、あるいはポリペプト
ン、ペプトン、イーストエキシ、コーン・スチー
ブ、リカー、アミノ酸等の有機窒素源を単独また
は組合せて用いることができる。またフマール
酸、リンゴ酸、ピルビン酸等有機酸、各種のビタ
ミンおよびMn〓、Co〓、Mg〓、Mo〓を含む各
種塩の添加により菌の生育や酵素の生産が促進さ
れる。培養法としては、液体培養法が適してい
る。培養温度は菌株により異なるが30〜60℃、好
ましくは生育適温以上の温度が望ましい。培養の
PHは5〜8、好ましくは6〜7.5の中性付近で行
なうことが望ましい。 培養終了後、培養液より好熱性アスパルターゼ
を採取するには一般の酵素採取法、例えば次のよ
うな方法で単離することができる。まず、得られ
た菌体を充分洗浄し、50g/程度の濃度で超音
波処理し、無細胞抽出液を得る。この液に硫酸ス
トレプトマイシンまたは硫酸プロタミンを5〜30
mg/ml加え脱核した後、0.1M酢酸を加えてPH5.0
程度に下げて酸処理し、遠沈後、水酸化カリウム
でPH7.0に調整する。 次に硫酸アンモニウムで0〜30%、30〜55%、
55〜75%の塩析を行ない、DEAEセルロース処
理、セフアデツクスG−100クロマトグラフイー
などを行つた後最終的に硫酸アンモニウム抽出を
行なつて、凍結乾燥し精製標品を得る。 本酵素の活性の測定は次のようにおこなう。 0.1Mフマール酸アンモニウムと本酵素、菌体
または菌体処理物とを菌体濃度10g・dry・
cell/で接触させ、PH8.0、温度35〜60℃で30分
間反応を行なう。反応液をフマール酸として1〜
10g/程度になるように稀釈し硫酸酸性下過マ
ンガン酸カリウムで滴定する。残存フマール酸よ
りアスパルターゼ活性を測定する。その他
Shodex OH Pakカラムによる高速液体クロマト
グラフイー法、L−アスパラギン酸−4−脱炭酸
酵素によるワールブルグ法等が使用可能である。
いずれの場合も酵素活性は国際単位(unit/g・
min)で表示する。 次に得られた酵素の性質について述べる。 (1) 作用および基質特異性 フマール酸およびL−アスパラギン酸にのみ
作用し、フマール酸とアンモニアからL−アス
パラギン酸を生成する反応を特異的に触媒す
る。 (2) 至適PH 0.1Mリン酸緩衝液(PH7.0〜8.0)、0.1Mトリ
ス・塩酸緩衝液(PH8.0〜9.5)中でフマール酸
アンモニウム15g/を基質とし活性を55℃、
60分間の反応にて測定した。結果は第1図に示
す通りであり、PH8.5〜9.0付近に至適PHがある
一般的な常温菌である。プロピオン酸菌、大腸
菌などのアスパルターゼの至適PHが7.2付近で
あるので好熱性アスパルターゼは若干アルカリ
側にシフトしている。 (3) 安定PH範囲 0.2Mリン酸緩衝液(PH6.0〜8.0)、0.2Mトリ
ス・塩酸緩衝液(PH7.5〜9.5)中、50℃で17時
間各々のPHに処理した後50℃、PH8.5で30分間
反応して活性を測定した。結果は第2図に示す
通りである。図のように7.0〜8.5までは相対的
に安定と思われる。 (4) 至適温度 45℃〜80℃の範囲でPH8.0で30分間反応し
た。結果は第3図に示す通りであり、55℃に至
適温度がある。 (5) 温度安定性 本酵素を0.1Mリン酸緩衝液(PH7.0)に30〜
80℃で60分間処理した後100g/のフマール
酸アンモニウムを加えて50℃、30分間反応して
活性を測定した。結果を第4図に示す。50℃ま
では安定である。 (6) 活性化・安定化作用 本酵素は基質フマール酸アンモニウム、生成
物L−アスパラギン酸の存在下安定化され非常
に安定である。2価の金属イオンMg〓、Mo
〓、Co〓、Zn〓により若干の活性化と安定性
の向上が認められた。 (7) 分子量 内部標準蛋白としてチトクローム・C、オバ
ルブミン、γ−グロブリンを使用してセフアデ
ツクスG−200によるゲル過を行なつた結果
分子量は約17.5万であつた。 (8) アミノ酸組成(%) リジン:7.78 アルギン:5.48 ヒスチジン:2.15 アスパラギン酸:11.37 アラニン:7.16 スレオニン:5.39 セリン:3.83 グルタミン酸:13.13 プロリン:5.64 グリシン:5.00 バリン:6.77 メチオニン:3.00 イソロイシン:5.28 ロイシン:8.90 チロシン:3.42 フエニルアラニン:4.56 トリプトフアン:1.18 シスチン:0 (9) 蛋白変性温度(Tm値):70℃ 本酵素、本酵素を含有する菌体または該菌体の
処理物をフマール酸アンモニウムまたはフマール
酸とアンモニアとの混合物に作用させることによ
り、L−アスパラギン酸を製造することができ
る。反応は通常35〜60℃、PH7.0〜8.5で行なう。
反応に際してのフマール酸アンモニウム、フマー
ル酸、アンモニアの濃度は0.2〜2.0モル程度が適
当である。また酵素濃度は1〜10unit/ml程度が
適当である。反応に際しては、酵素、菌体処理物
を固定化して用いるとより実用的にL−アスパラ
ギン酸を製造することができる。これらの固定化
は、酵素、菌体等の固定化に用いられる一般的方
法により行なうことができる。たとえば、酵素液
はアスパルターゼを吸着しうる一般的な陰イオン
交換樹脂と接触させればよく、菌体の固定化に
は、エチルセルロース、酢酸・酪酸セルロース等
によるマイクロカプセル化、アクリルアミド系単
量体によるゲル包括法、ポリビニールアルコール
による包括、コラーゲンによる膜状包括等が用い
られる。また、単に菌体を充填混合剤と混合し架
橋剤等で処理する方法、たとえばゼラチン・グル
タールアルデヒド法、キトサン・グルタールアル
デヒド法、カラゲーニン・グルタールアルデヒド
法、アルブミン・ジアルデヒドデンプン法などが
利用できる。 反応液からのL−アスパラギン酸の採取は、固
定化酵素の場合、単に反応液を等電点PH2.77程度
に硫酸酸性とし冷却熟成して結晶L−アスパラギ
ン酸を得る。純度を良好にするためには(加温
下)300g/程度の濃度にリスラリーして冷却
熟成して標品を得る。 実施例 1 1/2濃度のブイヨン培地にて活性化スラントと
したバチルス・アミノゲネスT−596、バチル
ス・ブレビスT−616、バチルス・サーモアミノ
フイラスT−585、バチルス・リケニホルミスT
−514、をポリペプトン8g/、イースト・エ
キス4g/、食塩2g/の組成のPH7.0に調
整した培地30mlを含む300ml容量フラスコに接種
し、第4表に示す温度で18時間種培養する。次に
この種培養液全量をグルコース30g/、ペプト
ン25g/、肉エキス4g/、炭酸カルシウム
5g/、大豆油1ml/の組成を有し、PH7.2
に調整した培地300mlを含む容量バツフル付フラ
スコに植替えて第4表に示した温度で24時間培養
した結果、第4表に示す量の菌体が得られた。得
られた菌体を8000Gで遠心分離を行ない。0.001M
リン酸緩衝液(PH7.2)で洗浄した。この湿潤細
胞を10g/の菌体濃度で1モルのフマール酸ア
ンモニウムと接触させ、各々の至適温度で30分間
反応し、生成するL−アスパラギン酸よりアスパ
ルターゼ活性を測定した結果をまとめてと第4表
に示す。
これらの菌株の培養においては、通常の好熱性細
菌の培養法が一般に用いられる。炭素源として
は、グルコース、フラクトース、マルトース、シ
ユークロース、マニトール、澱粉、糖蜜、グリセ
リン等の糖質および糖・アルコールが単独または
組合せて用いられる。また菌の資化性によつて
は、炭化水素、アルコール類、有機酸等も用いう
る。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸ナトリウ
ム、尿意等の無機窒素源、あるいはポリペプト
ン、ペプトン、イーストエキシ、コーン・スチー
ブ、リカー、アミノ酸等の有機窒素源を単独また
は組合せて用いることができる。またフマール
酸、リンゴ酸、ピルビン酸等有機酸、各種のビタ
ミンおよびMn〓、Co〓、Mg〓、Mo〓を含む各
種塩の添加により菌の生育や酵素の生産が促進さ
れる。培養法としては、液体培養法が適してい
る。培養温度は菌株により異なるが30〜60℃、好
ましくは生育適温以上の温度が望ましい。培養の
PHは5〜8、好ましくは6〜7.5の中性付近で行
なうことが望ましい。 培養終了後、培養液より好熱性アスパルターゼ
を採取するには一般の酵素採取法、例えば次のよ
うな方法で単離することができる。まず、得られ
た菌体を充分洗浄し、50g/程度の濃度で超音
波処理し、無細胞抽出液を得る。この液に硫酸ス
トレプトマイシンまたは硫酸プロタミンを5〜30
mg/ml加え脱核した後、0.1M酢酸を加えてPH5.0
程度に下げて酸処理し、遠沈後、水酸化カリウム
でPH7.0に調整する。 次に硫酸アンモニウムで0〜30%、30〜55%、
55〜75%の塩析を行ない、DEAEセルロース処
理、セフアデツクスG−100クロマトグラフイー
などを行つた後最終的に硫酸アンモニウム抽出を
行なつて、凍結乾燥し精製標品を得る。 本酵素の活性の測定は次のようにおこなう。 0.1Mフマール酸アンモニウムと本酵素、菌体
または菌体処理物とを菌体濃度10g・dry・
cell/で接触させ、PH8.0、温度35〜60℃で30分
間反応を行なう。反応液をフマール酸として1〜
10g/程度になるように稀釈し硫酸酸性下過マ
ンガン酸カリウムで滴定する。残存フマール酸よ
りアスパルターゼ活性を測定する。その他
Shodex OH Pakカラムによる高速液体クロマト
グラフイー法、L−アスパラギン酸−4−脱炭酸
酵素によるワールブルグ法等が使用可能である。
いずれの場合も酵素活性は国際単位(unit/g・
min)で表示する。 次に得られた酵素の性質について述べる。 (1) 作用および基質特異性 フマール酸およびL−アスパラギン酸にのみ
作用し、フマール酸とアンモニアからL−アス
パラギン酸を生成する反応を特異的に触媒す
る。 (2) 至適PH 0.1Mリン酸緩衝液(PH7.0〜8.0)、0.1Mトリ
ス・塩酸緩衝液(PH8.0〜9.5)中でフマール酸
アンモニウム15g/を基質とし活性を55℃、
60分間の反応にて測定した。結果は第1図に示
す通りであり、PH8.5〜9.0付近に至適PHがある
一般的な常温菌である。プロピオン酸菌、大腸
菌などのアスパルターゼの至適PHが7.2付近で
あるので好熱性アスパルターゼは若干アルカリ
側にシフトしている。 (3) 安定PH範囲 0.2Mリン酸緩衝液(PH6.0〜8.0)、0.2Mトリ
ス・塩酸緩衝液(PH7.5〜9.5)中、50℃で17時
間各々のPHに処理した後50℃、PH8.5で30分間
反応して活性を測定した。結果は第2図に示す
通りである。図のように7.0〜8.5までは相対的
に安定と思われる。 (4) 至適温度 45℃〜80℃の範囲でPH8.0で30分間反応し
た。結果は第3図に示す通りであり、55℃に至
適温度がある。 (5) 温度安定性 本酵素を0.1Mリン酸緩衝液(PH7.0)に30〜
80℃で60分間処理した後100g/のフマール
酸アンモニウムを加えて50℃、30分間反応して
活性を測定した。結果を第4図に示す。50℃ま
では安定である。 (6) 活性化・安定化作用 本酵素は基質フマール酸アンモニウム、生成
物L−アスパラギン酸の存在下安定化され非常
に安定である。2価の金属イオンMg〓、Mo
〓、Co〓、Zn〓により若干の活性化と安定性
の向上が認められた。 (7) 分子量 内部標準蛋白としてチトクローム・C、オバ
ルブミン、γ−グロブリンを使用してセフアデ
ツクスG−200によるゲル過を行なつた結果
分子量は約17.5万であつた。 (8) アミノ酸組成(%) リジン:7.78 アルギン:5.48 ヒスチジン:2.15 アスパラギン酸:11.37 アラニン:7.16 スレオニン:5.39 セリン:3.83 グルタミン酸:13.13 プロリン:5.64 グリシン:5.00 バリン:6.77 メチオニン:3.00 イソロイシン:5.28 ロイシン:8.90 チロシン:3.42 フエニルアラニン:4.56 トリプトフアン:1.18 シスチン:0 (9) 蛋白変性温度(Tm値):70℃ 本酵素、本酵素を含有する菌体または該菌体の
処理物をフマール酸アンモニウムまたはフマール
酸とアンモニアとの混合物に作用させることによ
り、L−アスパラギン酸を製造することができ
る。反応は通常35〜60℃、PH7.0〜8.5で行なう。
反応に際してのフマール酸アンモニウム、フマー
ル酸、アンモニアの濃度は0.2〜2.0モル程度が適
当である。また酵素濃度は1〜10unit/ml程度が
適当である。反応に際しては、酵素、菌体処理物
を固定化して用いるとより実用的にL−アスパラ
ギン酸を製造することができる。これらの固定化
は、酵素、菌体等の固定化に用いられる一般的方
法により行なうことができる。たとえば、酵素液
はアスパルターゼを吸着しうる一般的な陰イオン
交換樹脂と接触させればよく、菌体の固定化に
は、エチルセルロース、酢酸・酪酸セルロース等
によるマイクロカプセル化、アクリルアミド系単
量体によるゲル包括法、ポリビニールアルコール
による包括、コラーゲンによる膜状包括等が用い
られる。また、単に菌体を充填混合剤と混合し架
橋剤等で処理する方法、たとえばゼラチン・グル
タールアルデヒド法、キトサン・グルタールアル
デヒド法、カラゲーニン・グルタールアルデヒド
法、アルブミン・ジアルデヒドデンプン法などが
利用できる。 反応液からのL−アスパラギン酸の採取は、固
定化酵素の場合、単に反応液を等電点PH2.77程度
に硫酸酸性とし冷却熟成して結晶L−アスパラギ
ン酸を得る。純度を良好にするためには(加温
下)300g/程度の濃度にリスラリーして冷却
熟成して標品を得る。 実施例 1 1/2濃度のブイヨン培地にて活性化スラントと
したバチルス・アミノゲネスT−596、バチル
ス・ブレビスT−616、バチルス・サーモアミノ
フイラスT−585、バチルス・リケニホルミスT
−514、をポリペプトン8g/、イースト・エ
キス4g/、食塩2g/の組成のPH7.0に調
整した培地30mlを含む300ml容量フラスコに接種
し、第4表に示す温度で18時間種培養する。次に
この種培養液全量をグルコース30g/、ペプト
ン25g/、肉エキス4g/、炭酸カルシウム
5g/、大豆油1ml/の組成を有し、PH7.2
に調整した培地300mlを含む容量バツフル付フラ
スコに植替えて第4表に示した温度で24時間培養
した結果、第4表に示す量の菌体が得られた。得
られた菌体を8000Gで遠心分離を行ない。0.001M
リン酸緩衝液(PH7.2)で洗浄した。この湿潤細
胞を10g/の菌体濃度で1モルのフマール酸ア
ンモニウムと接触させ、各々の至適温度で30分間
反応し、生成するL−アスパラギン酸よりアスパ
ルターゼ活性を測定した結果をまとめてと第4表
に示す。
【表】
実施例 2
バチルス・アミノゲネスT−569菌を実施例1
と同様の培地で種培養し、さらに30容量ジヤー
フアーメンターにて大量培養した。ジヤーフアー
メンター培養の培地は、グルコース20g/、フ
マール酸アンモニウム10g/、ペプトン25g/
、肉エキス4g/、硫酸マグネシウム0.25
g/、モリブテン酸ナトリウム0.25g/、塩
化カルシウム1.4g/、大豆油1.2ml/の組成
のものを用い、培養は回転数200r.p.m.通気量
0.8v.v、m.で46℃、17.5時間の条件で行つた。菌
体量は9.0g/でアスパルターゼ活性
2000unit/g・dry・cellの活性のものが得られ
た。培養液を12000Gでシヤープレスにかけ菌体
分離し、PH8.0の0.01Mリン酸緩衝液で2度洗浄
して凍結乾燥を行ない、菌体標品とした。 実施例 3 実施例2で得られた凍結乾燥菌体500gを
0.05Mリン酸緩衝液(PH8.5)10に懸濁し、菌
体破砕機であるダイノーミル(シンマルエンター
プライス社製)にかけ、8000Gで遠心分離を行な
い無細胞抽出液を得た。抽出液6を弱塩基性陰
イオン交換樹脂デユオライト−A7(米国ダイヤ
モンドシヤムロツケリミカル社製)1.2を充填
したカラムに流速15/hr室温でチヤージした。
蛋白負荷量は約20mg/ml・Rで行つた。次に20
g/のフマール酸アンモニウムを含む0.1Mリ
ン酸緩衝液(PH8.5)3と0.4%グルタールアル
デヒド3を含む溶液で30分間架橋し、グルター
ルアルデヒドを十分洗浄して固定化酵素を作成し
た。この固定化酵素を50ml容量のカラムに充填
し、1モル・フマール酸アンモニウム(PH8.5)
を基質とし、SV=1.0〜1.1で連続運転を実施した
ところ、50℃で約20日間転換率98%以上で安定し
たL−アスパラギン酸の生産が可能であつた。反
応液は完全清澄液であり、酵素の洩れもなく、ま
た高温操作の為雑菌汚染もなく非常に効率のよい
L−アスパラギン酸の生産が可能であつた。 実施例 4 実施例1と同種の培地組成でバチルス・サーモ
アミノフイラスT−585を60℃で24時間培養し、
得られた菌体を遠心分離後洗浄を十分行なつてか
ら凍結乾燥菌体とした。アスパルターゼ活性
400unit/g・dry・cellの菌体が得られた。これ
を用いて次のごとくして固定化微生物を生成し
た。 分散媒として水60mlに分散剤としてエマルゲン
−985(花王アトラス社製)を0.72g、セロゲン
−PR(第一工業製薬社製)0.3gを溶解し、強撹
拌下5〜10℃に冷却しておく。一方、凍結乾燥菌
体1.5gを0.9%生理食塩水5と菌体凝集剤であ
る1%キトサン1.5mlに均一に懸濁しておき、酢
酸・酪酸セルロース381−20(イーストマンケミ
カルインターナシヨナル社製)1.5gと分散剤と
してアルラセル−83(花王アトラス社製)0.3g
を13.5gの酢酸イソブチルに溶かしたものを十分
に撹拌し、均一なW/Oエマルジヨンとする。こ
の菌体懸濁液と酢酸・酪酸セルロースによるW/
Oエマルジヨンを冷却撹拌下先の分散媒中に滴下
し、滴下後n−ヘキサン120mlを徐々に定量ポン
プで添加する。その結果、酢酸・酪酸セルロース
内に菌体が包括された。強固で均一な粒径に固体
化微生物が液中に析出する。これを布等で別
し、十分に洗浄して反応に使用する。得られた固
定化微生物を用いて1Mフマール酸アンモニウム
からL−アスパラギン酸への転換を50℃、SV=
1.0で連続カラム運転したところ95%以上の転換
率で約1週間、L−アスパラギン酸の生産が可能
であつた。得られた反応液を硫酸でPH2.77に調整
し、等電点沈殿させたところ、L−アスパラギン
酸の結晶が得られた。 実施例 5 バチルス・アミノゲネスT−596を実施例2と
同様に培養する。得られた菌体を50g/の濃度
で超音波破砕する。この破砕液上澄を30mg/mlの
硫酸プロタミンで処理し、沈殿を遠心分離する。
さらに、0.1M酢酸を加えてPH5.0に調整し生じた
沈殿を遠心分離してから上澄を得、このPHを水酸
化カリウムで7.0にする。次に硫酸アンモニウム
で0〜30、30〜55、55〜75%の3段階で濃度勾配
で塩析する。得られた溶液をDEAE・セルロース
カラムで処理し、活性区分を集めて硫酸アンモニ
ウムにより沈殿させ、酵素標品とした。得られた
アスパルターゼの蛋白当りの比活性は無細胞抽出
液の約100倍であつた。ここで得られたアスパル
ターゼを蛋白換算1mg/の濃度で1Mフマール
酸アンモニウムと50℃、PH8.5で18時間接触させ
たところ約95%の転換率でL−アスパラギン酸が
得られた。
と同様の培地で種培養し、さらに30容量ジヤー
フアーメンターにて大量培養した。ジヤーフアー
メンター培養の培地は、グルコース20g/、フ
マール酸アンモニウム10g/、ペプトン25g/
、肉エキス4g/、硫酸マグネシウム0.25
g/、モリブテン酸ナトリウム0.25g/、塩
化カルシウム1.4g/、大豆油1.2ml/の組成
のものを用い、培養は回転数200r.p.m.通気量
0.8v.v、m.で46℃、17.5時間の条件で行つた。菌
体量は9.0g/でアスパルターゼ活性
2000unit/g・dry・cellの活性のものが得られ
た。培養液を12000Gでシヤープレスにかけ菌体
分離し、PH8.0の0.01Mリン酸緩衝液で2度洗浄
して凍結乾燥を行ない、菌体標品とした。 実施例 3 実施例2で得られた凍結乾燥菌体500gを
0.05Mリン酸緩衝液(PH8.5)10に懸濁し、菌
体破砕機であるダイノーミル(シンマルエンター
プライス社製)にかけ、8000Gで遠心分離を行な
い無細胞抽出液を得た。抽出液6を弱塩基性陰
イオン交換樹脂デユオライト−A7(米国ダイヤ
モンドシヤムロツケリミカル社製)1.2を充填
したカラムに流速15/hr室温でチヤージした。
蛋白負荷量は約20mg/ml・Rで行つた。次に20
g/のフマール酸アンモニウムを含む0.1Mリ
ン酸緩衝液(PH8.5)3と0.4%グルタールアル
デヒド3を含む溶液で30分間架橋し、グルター
ルアルデヒドを十分洗浄して固定化酵素を作成し
た。この固定化酵素を50ml容量のカラムに充填
し、1モル・フマール酸アンモニウム(PH8.5)
を基質とし、SV=1.0〜1.1で連続運転を実施した
ところ、50℃で約20日間転換率98%以上で安定し
たL−アスパラギン酸の生産が可能であつた。反
応液は完全清澄液であり、酵素の洩れもなく、ま
た高温操作の為雑菌汚染もなく非常に効率のよい
L−アスパラギン酸の生産が可能であつた。 実施例 4 実施例1と同種の培地組成でバチルス・サーモ
アミノフイラスT−585を60℃で24時間培養し、
得られた菌体を遠心分離後洗浄を十分行なつてか
ら凍結乾燥菌体とした。アスパルターゼ活性
400unit/g・dry・cellの菌体が得られた。これ
を用いて次のごとくして固定化微生物を生成し
た。 分散媒として水60mlに分散剤としてエマルゲン
−985(花王アトラス社製)を0.72g、セロゲン
−PR(第一工業製薬社製)0.3gを溶解し、強撹
拌下5〜10℃に冷却しておく。一方、凍結乾燥菌
体1.5gを0.9%生理食塩水5と菌体凝集剤であ
る1%キトサン1.5mlに均一に懸濁しておき、酢
酸・酪酸セルロース381−20(イーストマンケミ
カルインターナシヨナル社製)1.5gと分散剤と
してアルラセル−83(花王アトラス社製)0.3g
を13.5gの酢酸イソブチルに溶かしたものを十分
に撹拌し、均一なW/Oエマルジヨンとする。こ
の菌体懸濁液と酢酸・酪酸セルロースによるW/
Oエマルジヨンを冷却撹拌下先の分散媒中に滴下
し、滴下後n−ヘキサン120mlを徐々に定量ポン
プで添加する。その結果、酢酸・酪酸セルロース
内に菌体が包括された。強固で均一な粒径に固体
化微生物が液中に析出する。これを布等で別
し、十分に洗浄して反応に使用する。得られた固
定化微生物を用いて1Mフマール酸アンモニウム
からL−アスパラギン酸への転換を50℃、SV=
1.0で連続カラム運転したところ95%以上の転換
率で約1週間、L−アスパラギン酸の生産が可能
であつた。得られた反応液を硫酸でPH2.77に調整
し、等電点沈殿させたところ、L−アスパラギン
酸の結晶が得られた。 実施例 5 バチルス・アミノゲネスT−596を実施例2と
同様に培養する。得られた菌体を50g/の濃度
で超音波破砕する。この破砕液上澄を30mg/mlの
硫酸プロタミンで処理し、沈殿を遠心分離する。
さらに、0.1M酢酸を加えてPH5.0に調整し生じた
沈殿を遠心分離してから上澄を得、このPHを水酸
化カリウムで7.0にする。次に硫酸アンモニウム
で0〜30、30〜55、55〜75%の3段階で濃度勾配
で塩析する。得られた溶液をDEAE・セルロース
カラムで処理し、活性区分を集めて硫酸アンモニ
ウムにより沈殿させ、酵素標品とした。得られた
アスパルターゼの蛋白当りの比活性は無細胞抽出
液の約100倍であつた。ここで得られたアスパル
ターゼを蛋白換算1mg/の濃度で1Mフマール
酸アンモニウムと50℃、PH8.5で18時間接触させ
たところ約95%の転換率でL−アスパラギン酸が
得られた。
第1図は、本酵素の至適PHを示す。第2図は、
本酵素の安定PH範囲を示す。第3図は、本酵素の
至適温度を示す。第4図は、本酵素の温度安定性
を示す。
本酵素の安定PH範囲を示す。第3図は、本酵素の
至適温度を示す。第4図は、本酵素の温度安定性
を示す。
Claims (1)
- 1 バチルス属に属し、アスパルターゼ生産能を
有する微生物を栄養培地に培養し、培養物中にア
スパルターゼを生成蓄積させ、該培養物から該ア
スパルターゼを採取することを特徴とするアスパ
ルターゼの製造法。
Priority Applications (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP15246879A JPS5675097A (en) | 1979-11-27 | 1979-11-27 | Thermophilic aspartase and its preparation |
US06/209,494 US4391910A (en) | 1979-11-27 | 1980-11-24 | Processes for producing thermophilic aspartase |
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