JPS6251591B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は新規好熱性アスパルターゼ、その製造
法および該酵素を生産する能力を有する微生物な
らびに該酵素を利用するＬ−アスパラギン酸の製
造法に関する。 Ｌ−アスパラギン酸は疲労回復剤、アンモニア
解毒剤、アミノ酸輸液等、医薬品、食品添加物ま
たは臨床診断薬として用いられる重要な物質であ
る。現在Ｌ−アスパラギン酸の製造法としては、
北原等によるエシヤリキア・コリを用いる方法
（特公昭38−6588号公報）があり、これを中心に
固定化法による生産についても２、３の報告がな
されている。 （鮫島、木村：Enzyme Engineering２、
131、（1974）Plenum Press、New York and
London、土佐、干畑：Appl Microbiol27、886、
（1974））。公知の事例はすべて常温菌を利用した
ものである。 本発明者等は熱安定なアスパルターゼを得る目
的で種々の好熱性細菌についてアスパルターゼ活
性を調べた結果、バチルス属に属する好熱性細菌
が好熱性のアスパルターゼ活性を有することを見
出し、本発明を完成するに到つた。発酵操作、酵
素反応などを高温条件下で行なえることは、雑菌
汚染防止、酵素反応の迅速性、冷却エネルギーの
節約などの点から極めて有利である。 本発明に係る好熱性アスパルターゼは、該酵素
を生産する能力を有する微生物を栄養培地中に培
養し、培養物中に該酵素を蓄積せしめ、該培養物
から該酵素を採取することにより製造することが
できる。 本発明で使用する微生物は好熱性アスパルター
ゼ生産能力を有するものならいかなる菌株を用い
てもよいが、具体的にはバチルス属に属する菌
株、例えばバチルス・リケニホルミス（Bacillus
licheniformis）Ｔ−514（微工研菌寄第5241号、
NRRL Ｂ−12062）、バチルス・ブレビス
（Bacillus brevis）Ｔ−616（微工研菌寄第5242
号、NRRL Ｂ−12063）、バチルス・アミノゲネ
ス・ノブ・エスピー（Bacillus aminogenes nov
sp）Ｔ−596（微工研菌寄第5240号、NRRL Ｂ−
12061）、バチルス・サーモアミノフイラス・ノ
ブ・エスピー（Bacillus thermoaminophilus nov
sp）Ｔ−585（微工研菌寄第5239号、NRRL Ｂ−
12060）などがあげられる。 本発明者らが分離同定したアスパルターゼ生産
菌株４株の菌学的性質（第１表）および同定の準
拠について以下に示す。

【表】

【表】

【表】 上記の菌学的性質をもとにして、バージーズ・
マニユアル・オブ・デイターミナテイブ・バクテ
リオロジー、第８版（1974）およびR.E.Gordon
ら著。The Genus Bacillus（Agricultural
Research Service、U.S.Department of
Agriculture、（1973））を参考にして公知の菌株
とその異同を検討した。 上記４菌株はグラム陽性、有胞子の好気性ある
いは通性嫌気性の桿状菌である故、いずれも
Bacillus族属である。Ｔ−514菌およびＴ−616菌
は、同定実験に際して対照菌として使用したバチ
ルス・リケニホルミスおよびバチルス・ブレビス
の標準株についての実験結果およびマニユアル中
の記載とほぼ完全に一致するので、バチルス・リ
ケニホルミスおよびバチルス・ブレビスと同定し
た。 Ｔ−596菌は、生育最高温度、スポンジア膨
潤、嫌気的に生育せず、VPテスト陰性、でん粉
加水分解陰性、７％食塩耐性陰性などの点からバ
チルス・ブレビスに類似しているが、上記マニユ
アルの記載およびバチルス・ブレビスATCC8185
についての比較実験結果での相違点が第２表の如
くであること、さらにＴ−596菌は強力なアスパ
ルターゼ活性を有する特徴があること等の根拠か
ら本菌を新種と見做し、バチルス・アミノゲネ
ス・ノブ・エスピー（Bacillus aminogenes nov
sp）と命名した。

【表】 Ｔ−585菌は生育温度範囲、スポランジアの膨
潤、嫌気的に生育せず、VPテスト陰性、７％食
塩耐性陰性などの点からバチルス・ステアロサー
モフイラスに類似しているが、上記マニユアルの
記載およびバチルス・ステアロサーモフイラス
ATCC12980についての比較実験結果での相違点
が第３表の如くであること、さらにＴ−585菌は
強力なアスパルターゼ活性を有する特徴があるこ
と等の根拠から本菌を新種と見做し、バチルス・
サーモアミノフイラス・ノブ・エスピー
（Bacillus thermoaminophilus nov sp）と命名
した。

【表】 これらの菌株の培養法について以下に述べる。
これらの菌株の培養においては、通常の好熱性細
菌の培養法が一般に用いられる。炭素源として
は、グルコース、フラクトース、マルトース、シ
ユークロース、マニトール、澱粉、糖蜜、グリセ
リン等の糖質および糖・アルコールが単独または
組合せて用いられる。また菌の資化性によつて
は、炭化水素、アルコール類、有機酸等も用いう
る。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸ナトリウ
ム、尿意等の無機窒素源、あるいはポリペプト
ン、ペプトン、イーストエキシ、コーン・スチー
ブ、リカー、アミノ酸等の有機窒素源を単独また
は組合せて用いることができる。またフマール
酸、リンゴ酸、ピルビン酸等有機酸、各種のビタ
ミンおよびMn〓、Co〓、Mg〓、Mo〓を含む各
種塩の添加により菌の生育や酵素の生産が促進さ
れる。培養法としては、液体培養法が適してい
る。培養温度は菌株により異なるが30〜60℃、好
ましくは生育適温以上の温度が望ましい。培養の
PHは５〜８、好ましくは６〜7.5の中性付近で行
なうことが望ましい。 培養終了後、培養液より好熱性アスパルターゼ
を採取するには一般の酵素採取法、例えば次のよ
うな方法で単離することができる。まず、得られ
た菌体を充分洗浄し、50ｇ／程度の濃度で超音
波処理し、無細胞抽出液を得る。この液に硫酸ス
トレプトマイシンまたは硫酸プロタミンを５〜30
mg／ml加え脱核した後、0.1M酢酸を加えてPH5.0
程度に下げて酸処理し、遠沈後、水酸化カリウム
でPH7.0に調整する。 次に硫酸アンモニウムで０〜30％、30〜55％、
55〜75％の塩析を行ない、DEAEセルロース処
理、セフアデツクスＧ−100クロマトグラフイー
などを行つた後最終的に硫酸アンモニウム抽出を
行なつて、凍結乾燥し精製標品を得る。 本酵素の活性の測定は次のようにおこなう。 0.1Mフマール酸アンモニウムと本酵素、菌体
または菌体処理物とを菌体濃度10ｇ・dry・
cell／で接触させ、PH8.0、温度35〜60℃で30分
間反応を行なう。反応液をフマール酸として１〜
10ｇ／程度になるように稀釈し硫酸酸性下過マ
ンガン酸カリウムで滴定する。残存フマール酸よ
りアスパルターゼ活性を測定する。その他
Shodex OH Pakカラムによる高速液体クロマト
グラフイー法、Ｌ−アスパラギン酸−４−脱炭酸
酵素によるワールブルグ法等が使用可能である。
いずれの場合も酵素活性は国際単位（unit／ｇ・
min）で表示する。 次に得られた酵素の性質について述べる。 (1) 作用および基質特異性 フマール酸およびＬ−アスパラギン酸にのみ
作用し、フマール酸とアンモニアからＬ−アス
パラギン酸を生成する反応を特異的に触媒す
る。 (2) 至適PH 0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0〜8.0）、0.1Mトリ
ス・塩酸緩衝液（PH8.0〜9.5）中でフマール酸
アンモニウム15ｇ／を基質とし活性を55℃、
60分間の反応にて測定した。結果は第１図に示
す通りであり、PH8.5〜9.0付近に至適PHがある
一般的な常温菌である。プロピオン酸菌、大腸
菌などのアスパルターゼの至適PHが7.2付近で
あるので好熱性アスパルターゼは若干アルカリ
側にシフトしている。 (3) 安定PH範囲 0.2Mリン酸緩衝液（PH6.0〜8.0）、0.2Mトリ
ス・塩酸緩衝液（PH7.5〜9.5）中、50℃で17時
間各々のPHに処理した後50℃、PH8.5で30分間
反応して活性を測定した。結果は第２図に示す
通りである。図のように7.0〜8.5までは相対的
に安定と思われる。 (4) 至適温度 45℃〜80℃の範囲でPH8.0で30分間反応し
た。結果は第３図に示す通りであり、55℃に至
適温度がある。 (5) 温度安定性 本酵素を0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）に30〜
80℃で60分間処理した後100ｇ／のフマール
酸アンモニウムを加えて50℃、30分間反応して
活性を測定した。結果を第４図に示す。50℃ま
では安定である。 (6) 活性化・安定化作用 本酵素は基質フマール酸アンモニウム、生成
物Ｌ−アスパラギン酸の存在下安定化され非常
に安定である。２価の金属イオンMg〓、Mo
〓、Co〓、Zn〓により若干の活性化と安定性
の向上が認められた。 (7) 分子量 内部標準蛋白としてチトクローム・Ｃ、オバ
ルブミン、γ−グロブリンを使用してセフアデ
ツクスＧ−200によるゲル過を行なつた結果
分子量は約17.5万であつた。 (8) アミノ酸組成（％） リジン：7.78 アルギン：5.48 ヒスチジン：2.15 アスパラギン酸：11.37 アラニン：7.16 スレオニン：5.39 セリン：3.83 グルタミン酸：13.13 プロリン：5.64 グリシン：5.00 バリン：6.77 メチオニン：3.00 イソロイシン：5.28 ロイシン：8.90 チロシン：3.42 フエニルアラニン：4.56 トリプトフアン：1.18 シスチン：０ (9) 蛋白変性温度（Tm値）：70℃ 本酵素、本酵素を含有する菌体または該菌体の
処理物をフマール酸アンモニウムまたはフマール
酸とアンモニアとの混合物に作用させることによ
り、Ｌ−アスパラギン酸を製造することができ
る。反応は通常35〜60℃、PH7.0〜8.5で行なう。
反応に際してのフマール酸アンモニウム、フマー
ル酸、アンモニアの濃度は0.2〜2.0モル程度が適
当である。また酵素濃度は１〜10unit／ml程度が
適当である。反応に際しては、酵素、菌体処理物
を固定化して用いるとより実用的にＬ−アスパラ
ギン酸を製造することができる。これらの固定化
は、酵素、菌体等の固定化に用いられる一般的方
法により行なうことができる。たとえば、酵素液
はアスパルターゼを吸着しうる一般的な陰イオン
交換樹脂と接触させればよく、菌体の固定化に
は、エチルセルロース、酢酸・酪酸セルロース等
によるマイクロカプセル化、アクリルアミド系単
量体によるゲル包括法、ポリビニールアルコール
による包括、コラーゲンによる膜状包括等が用い
られる。また、単に菌体を充填混合剤と混合し架
橋剤等で処理する方法、たとえばゼラチン・グル
タールアルデヒド法、キトサン・グルタールアル
デヒド法、カラゲーニン・グルタールアルデヒド
法、アルブミン・ジアルデヒドデンプン法などが
利用できる。 反応液からのＬ−アスパラギン酸の採取は、固
定化酵素の場合、単に反応液を等電点PH2.77程度
に硫酸酸性とし冷却熟成して結晶Ｌ−アスパラギ
ン酸を得る。純度を良好にするためには（加温
下）300ｇ／程度の濃度にリスラリーして冷却
熟成して標品を得る。 実施例 １ 1/2濃度のブイヨン培地にて活性化スラントと
したバチルス・アミノゲネスＴ−596、バチル
ス・ブレビスＴ−616、バチルス・サーモアミノ
フイラスＴ−585、バチルス・リケニホルミスＴ
−514、をポリペプトン８ｇ／、イースト・エ
キス４ｇ／、食塩２ｇ／の組成のPH7.0に調
整した培地30mlを含む300ml容量フラスコに接種
し、第４表に示す温度で18時間種培養する。次に
この種培養液全量をグルコース30ｇ／、ペプト
ン25ｇ／、肉エキス４ｇ／、炭酸カルシウム
５ｇ／、大豆油１ml／の組成を有し、PH7.2
に調整した培地300mlを含む容量バツフル付フラ
スコに植替えて第４表に示した温度で24時間培養
した結果、第４表に示す量の菌体が得られた。得
られた菌体を8000Gで遠心分離を行ない。0.001M
リン酸緩衝液（PH7.2）で洗浄した。この湿潤細
胞を10ｇ／の菌体濃度で１モルのフマール酸ア
ンモニウムと接触させ、各々の至適温度で30分間
反応し、生成するＬ−アスパラギン酸よりアスパ
ルターゼ活性を測定した結果をまとめてと第４表
に示す。

【表】 実施例 ２ バチルス・アミノゲネスＴ−569菌を実施例１
と同様の培地で種培養し、さらに30容量ジヤー
フアーメンターにて大量培養した。ジヤーフアー
メンター培養の培地は、グルコース20ｇ／、フ
マール酸アンモニウム10ｇ／、ペプトン25ｇ／
、肉エキス４ｇ／、硫酸マグネシウム0.25
ｇ／、モリブテン酸ナトリウム0.25ｇ／、塩
化カルシウム1.4ｇ／、大豆油1.2ml／の組成
のものを用い、培養は回転数200r.p.m.通気量
0.8v.v、m.で46℃、17.5時間の条件で行つた。菌
体量は9.0ｇ／でアスパルターゼ活性
2000unit／ｇ・dry・cellの活性のものが得られ
た。培養液を12000Gでシヤープレスにかけ菌体
分離し、PH8.0の0.01Mリン酸緩衝液で２度洗浄
して凍結乾燥を行ない、菌体標品とした。 実施例 ３ 実施例２で得られた凍結乾燥菌体500ｇを
0.05Mリン酸緩衝液（PH8.5）10に懸濁し、菌
体破砕機であるダイノーミル（シンマルエンター
プライス社製）にかけ、8000Gで遠心分離を行な
い無細胞抽出液を得た。抽出液６を弱塩基性陰
イオン交換樹脂デユオライト−A7（米国ダイヤ
モンドシヤムロツケリミカル社製）1.2を充填
したカラムに流速15／hr室温でチヤージした。
蛋白負荷量は約20mg／ml・Ｒで行つた。次に20
ｇ／のフマール酸アンモニウムを含む0.1Mリ
ン酸緩衝液（PH8.5）３と0.4％グルタールアル
デヒド３を含む溶液で30分間架橋し、グルター
ルアルデヒドを十分洗浄して固定化酵素を作成し
た。この固定化酵素を50ml容量のカラムに充填
し、１モル・フマール酸アンモニウム（PH8.5）
を基質とし、SV＝1.0〜1.1で連続運転を実施した
ところ、50℃で約20日間転換率98％以上で安定し
たＬ−アスパラギン酸の生産が可能であつた。反
応液は完全清澄液であり、酵素の洩れもなく、ま
た高温操作の為雑菌汚染もなく非常に効率のよい
Ｌ−アスパラギン酸の生産が可能であつた。 実施例 ４ 実施例１と同種の培地組成でバチルス・サーモ
アミノフイラスＴ−585を60℃で24時間培養し、
得られた菌体を遠心分離後洗浄を十分行なつてか
ら凍結乾燥菌体とした。アスパルターゼ活性
400unit／ｇ・dry・cellの菌体が得られた。これ
を用いて次のごとくして固定化微生物を生成し
た。 分散媒として水60mlに分散剤としてエマルゲン
−985（花王アトラス社製）を0.72ｇ、セロゲン
−PR（第一工業製薬社製）0.3ｇを溶解し、強撹
拌下５〜10℃に冷却しておく。一方、凍結乾燥菌
体1.5ｇを0.9％生理食塩水５と菌体凝集剤であ
る１％キトサン1.5mlに均一に懸濁しておき、酢
酸・酪酸セルロース381−20（イーストマンケミ
カルインターナシヨナル社製）1.5ｇと分散剤と
してアルラセル−83（花王アトラス社製）0.3ｇ
を13.5ｇの酢酸イソブチルに溶かしたものを十分
に撹拌し、均一なＷ／Ｏエマルジヨンとする。こ
の菌体懸濁液と酢酸・酪酸セルロースによるＷ／
Ｏエマルジヨンを冷却撹拌下先の分散媒中に滴下
し、滴下後ｎ−ヘキサン120mlを徐々に定量ポン
プで添加する。その結果、酢酸・酪酸セルロース
内に菌体が包括された。強固で均一な粒径に固体
化微生物が液中に析出する。これを布等で別
し、十分に洗浄して反応に使用する。得られた固
定化微生物を用いて1Mフマール酸アンモニウム
からＬ−アスパラギン酸への転換を50℃、SV＝
1.0で連続カラム運転したところ95％以上の転換
率で約１週間、Ｌ−アスパラギン酸の生産が可能
であつた。得られた反応液を硫酸でPH2.77に調整
し、等電点沈殿させたところ、Ｌ−アスパラギン
酸の結晶が得られた。 実施例 ５ バチルス・アミノゲネスＴ−596を実施例２と
同様に培養する。得られた菌体を50ｇ／の濃度
で超音波破砕する。この破砕液上澄を30mg／mlの
硫酸プロタミンで処理し、沈殿を遠心分離する。
さらに、0.1M酢酸を加えてPH5.0に調整し生じた
沈殿を遠心分離してから上澄を得、このPHを水酸
化カリウムで7.0にする。次に硫酸アンモニウム
で０〜30、30〜55、55〜75％の３段階で濃度勾配
で塩析する。得られた溶液をDEAE・セルロース
カラムで処理し、活性区分を集めて硫酸アンモニ
ウムにより沈殿させ、酵素標品とした。得られた
アスパルターゼの蛋白当りの比活性は無細胞抽出
液の約100倍であつた。ここで得られたアスパル
ターゼを蛋白換算１mg／の濃度で1Mフマール
酸アンモニウムと50℃、PH8.5で18時間接触させ
たところ約95％の転換率でＬ−アスパラギン酸が
得られた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本酵素の至適PHを示す。第２図は、
本酵素の安定PH範囲を示す。第３図は、本酵素の
至適温度を示す。第４図は、本酵素の温度安定性
を示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ バチルス属に属し、アスパルターゼ生産能を
   有する微生物を栄養培地に培養し、培養物中にア
   スパルターゼを生成蓄積させ、該培養物から該ア
   スパルターゼを採取することを特徴とするアスパ
   ルターゼの製造法。