JPS62501122A - 組換え肺胞表面活性物質蛋白 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ６、特許請求の範囲第５項に記載の細胞で産生されたＡＳＰ。

７、特許請求の範囲第６項に記載の細胞を培養することを含むＡＳＰ産生法。

８、不純物を実質的に含まない哺乳動物細胞表面活性物質蛋白（ＡＳＰ）。

９、以下の配列から成る群より選ばれたＮ末端アミノ酸配列を有する特許請求の 範囲第８項に記載のΔＳＰ：ｒ　１ｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−八５ｎ−Ｔｈｒ−Ｌｙ ｓ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−１１ｙｐ−Ｇｌｙ−ｒ ｌｅ−）１ｙｐ−Ｇ１ｙ４ｈｒ−１１ｙｐ−Ｇｌｙ−５ｅｒ−１１ｉｓ−Ｇｌｙ −Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ；Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−＾ｓｐ−シａｌ−Ｃｙｓ −Ｖａｌ−Ｇｌｙ−３ｅｒ−１１ｙｐ−Ｇｌｙ−１１ｅ−１１ｙｐ−Ｇｌｙ−Ｔ ｈｒ−１１ｙｐ−Ｇｌｙ； Ｌｅｕ−１ｉｅ−Ｌｙｓ−八ｒｇ−１１ｅ−Ｇｌｅ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−１１ｅ− Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌａｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ− Ｇｌｙ−Ｇｌｎ；および１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｓｅｔ−Ｓ ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ　−１１ｅ−１１ｅ−Ｖａｌ− Ｔｒｐ　。

１０、哺乳動物の呼吸困難症（ＲＤＳ）の治療に有効な製薬組成物であって、特 許請求の範囲第１項あるいは第８項に記載のＡＳＰを製剤的に受け入れ可能な賦 形剤と混合して含む組成物。

１１、哺乳動物の呼吸困難症（ＲＤＳ）の治療に有効な製薬組成物であって、特 許請求の範囲第１項あるいは第８項に記載のＡＳＰをホスホリピド小胞調製物と 混合して含む組成物。

浄書（内容に変更なし） 明細書 却Ｊしりｌ胞１旧霞注主口口り匹 発刊４４Ｅ仙別狂 本発明は、ＸＭＩＡえ蛋白質の産生の分野に関する。特に、ある呼吸疾患の管理 に有効な肺胞表面活性物質蛋白（ＡＳＰ）の産生に関する。

背景孜土 人間の肺は、ガスを血液と肺の空積で交換する多数の小さな気嚢或いは肺胞から 成る。健康な個体では、この交換は■型の肺胞細胞のミクロソーム膜で合成され る表面活性物質複合体を含む蛋白の存在により媒介される。この複合体が適当な レベルで存在していないと、肺は正常に機能できない、即ち肺胞は呼吸時につぶ れ、吸入しても続いて膨張できない。

このように、この複合体の合成不能性が治療されなければ死か或いは厳しい肉体 的損傷に至るかもしれない。

不十分な表面活性物質複合体レベルについて最もよく証明されている例は、未熟 児や複雑な妊娠後に生まれた新生児で起こり、呼吸困難症候群（ＲＤＳ）として 広く知られている。

この症候群の広く公表されている種類は硝子膜症、或いは特発ＲＤＳと呼ばれて いる。ＲＤＳは目下１合衆国内、及び他の先進国内で新生児の死亡率および罹患 率を率いている原因であり、実質的な努力が診断及び治療に向けられている。現 行の治療は機械的に（圧力をかけ）新鮮な空気で浄化することに向けられており 、これはせいぜい侵略的な穴埋め法であって、しばしば肺に対する損傷や、気管 支肺異形成１間質性気腫、及び気胸のような併発症を含む他の有害な副作用を生 じる。精神的な障害も、この治療を用いた際に生じる（Ｉｌａ　ｌ　１ｍａ　ｎ 　＋Ｍ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｐａｄｒａｔｒｉｃ　Ｃ１１ｎｉｃｓ　ｏｆ　Ｎｏｒ ｔｈ　Ａｍｅｒｒｃａ　（１９８２）社：　１０５７−１０７５）。

表面活性物質を置換することによりこの症候群を治療しようとする限られた試み が成されている。これは、一般的にはほんの一回だけの投与が必要であり、損傷 の可能性が減するという選ばれた方法であろう。例えば、　Ｆｕｊｉｗａｒａ、 　ｅｔ　ａｌ−＋Ｌａｎｃｅｔ　（１９８０）土：５５−は、ウシ肺由来の蛋白 を抜いた表面活性物質調製物を用いた。調製物は効果的ではあるが、免疫原であ る。Ｈａｌｌｍａｎ、　Ｍ、、　ｅｔ　ａｌ、　Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ　（１９ ８３）　７１　：４７３−４８２は、ヒト羊水より単離した表面活性物質を用い て限られた数の新生児を治療するのにある程度成功した。ＣｌｅｍｅｎｔｓのＵ 、Ｓ、Ｐａｔｅｎｔ　４，３１２，８６０は、データは示していないがこのアプ ローチでは有効であると言われている。蛋白を含まない人為的な表面活性物質を 開示している。知的には１表面活性物質の置換は医療で広くは使われていない。

好ましい表面活性物質置換体は、肺の表面活性物質複合体それ自身であろう。こ の複合体は、アポ蛋白、多量にある２種のホスホリピド（ジパルミトイルホスホ コリン（ＤＰＰＣ）及びホスファチジルグリセロール（ＰＣ））　、非常に少量 しかない数種の脂質成分、及びカルシウムイオンから成る。アポ蛋白は。

３２、０００ダルトンの桁の分子量の蛋白と約１０．０００ダルトンの桁の非常 に疎水性蛋白を含む（Ｋｉｎｇ、　Ｒ，Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｍ　Ｊ　Ｐｈ 　５ｉｏｌ（１９７３）　２２４　：　７８８−７９５）。３２．０００ダルト ンの蛋白は糖化されており、ハイドキシプロリンを含む。

表面活性物質の置き換え療法の発展が限定されている大きな理由は、複合体の蛋 白部分を利用することを欠いていたことである。置き換え治療は脂質成分だけの 使用の試みに向けられており、そのような治療の功績はアポ蛋白を加えることに より飛躍的に向上し得るようである（Ｈａｌｌｍａｎ、　Ｍ、、　ｅｔ　ａｌ、 。

Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ　Ｃ１１ｎｉｃｓ　ｏｆ　Ｎｏｒｔｈ　Ａｍｅｒｉｃａ　（ １９８２）　（前出））。

しかし、現在、これらの蛋白は正常な成人の肺、及び羊水からのみ入手できる。

効果的な分離手順によっても十分な供給物が提供されることはなかろう。このよ うに、単独で或いは複合体の飽和ホスホリピド部分と結合して使用するために。

実用的な量のアポ蛋白を生産する方法を可能にすることが望ましい。

溌Ｊ塚Ｈ罪丞 本発明は、多量に、しかもその特徴を最も効果的にする条件で、肺の表面活性物 質複合体のアポ蛋白部分を得る手段を提供する。カルシウムイオンとともに、ジ パルミトイルホスホコリン及びホスファチジルグリセロールという複合体の残り の部分はすでに容易に入手可能である。操作可能なアポ蛋白が要求された量利用 できることになり、治療で使用し得る複合体を最も効果的にするための研究努力 が可能となり、呼吸困難症候群の型にはまった置換治療の可能性が開かれる。

このようにある見地では１本発明は組換えて産生した哺乳類の肺胞表面活性物質 蛋白（ＡＳＰ）に関する。これらの蛋白は、比較的高分子、約３２Ｋｄ　（３２ Ｋ　Ａ　Ｓ　Ｐ　）の比較的水溶性の蛋白と、低分子で、約１０〜２０Ｋｄ　（ ＩＯＫ　Ａ　Ｓ　Ｐ）の疎水性の蛋白との混合物である。カルシウムイオン存在 下でホスホリピドと複合体をつくると１両方の蛋白は、被膜を抑える表面張力の 形成を助長する。本発明はさらに、ヒトとイヌの３２にとｌ０Ｋ（７）ＡＳＰを 含むｌ＋１１ｉ乳類（７）ＡＳＰをコートしティるＤＮＡ配列、これらの蛋白を 産生ずるのに適した発現ベクター。

これらのベクターで形質転換された組換え宿主細胞、及び組換えＡＴＰとその前 駆体を産生ずる方法に関する。他の見地では９本発明は、ヒＩ−ＡＳＰを含む製 薬成分及び、それらを使ってのＲＤＳの治療の方法に関係する。

阿皿勿皿垂バ詰皿 第１図は、イヌ３２ＫＡＳＰをコードしているＤＮＡ配列を。

推定されたアミノ酸配列とともに示している。

第２図は、推定アミノ酸配列とともに、イヌｌ０ＫＡＳＰをコードしているｃＤ ＮＡに対して決定したＤＮＡ配列を示している。

第３図は、ヒト３２ＫＡＳＰ遺伝子のヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列を示 している。

第４図は、λ：ｇＨＳ〜１５でトランスフェクションしたＣ　Ｈ○細胞由来の３ ＳＳ−Ｍｅｔ標識分泌蛋白のオートラジオグラフィーである。

第５図は、　ｐＨ５−６に含まれるヒトＡ　Ｓ　Ｐ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの３′末端 側の配列を示している。

第６図は、推定アミノ酸配列とともに、ヒトｌ０ＫＡＳＰをコードしているｃＤ ＮΔに対して決定したＤ　Ｎ　Ａ　配列を示している。

第７図は１発現ヘクターｐＡＳＰｃ−３Ｖ（１０）の関連した連結部とコード配 列を示している。

第８図は３発現ヘクターｐＡＳＰｃｇ−５ν（１０）の関連した連結部とコード 配列を示している。

第９図は９発現ベクターｐＭＴ−Ａｐｏ：ｇＨ５（ＨｉｎｆＩ／ＥｃｏＲＩ）の 関連した連結部とコード配列を示している。

第１０図は、　ｐＭＴ−Ａｐｏ：ｇｌｔｓ（ｌｌｉｎｆｌ／ＥｃｏＲＩ）でトラ ンスフェクションしたＣＩ（０細胞により分泌され、　ｅｎｄｏＦ、で処理した 或いは処理していない　１１３Ｓ標識上清蛋白で行ったＳＯ５ＰＡＧＥの結果を 示している。

第１１図は、　ｐＭＴ−Ａｐｏ：ｇＨ３（Ｈ４ｎｆｌ／ＥｃｏＲＩ）でトランス フェクションしたＣＨ○細胞により分泌され、　ｅｎｄｏＦ、で処理した或いは 処理していない、上清蛋白で行った。ヒト標識抗ＡＳＰによりイムノプロットし たＳＤＳ　ＰＡＧＥの結果を示している。

第１２図は、ホスホリピドで抑えた表面張力を高めるためにＡＳＰの能力をｉｎ 　ｖｉｔｒｏで決定した結果である。

オ溌団４す０口Ｊ） Ａ、定且 ここで用いているように、“肺胞表面活性物質蛋白質（ＡＳＰ）　”は、肺の表 面活性物質複合体に関連し、以下で定義するようなＡＳＰ活性を持つ、アポ蛋白 を指す。調べた全種のＡＳＰは、ここで“３２ＫＡＳＰ”と表している比較的高 分子ｆｆｉ　（３２Ｋｄという桁）の１つ以上の成分と、ここで”ＩＯＫΔｓｐ ”と表している比較的低分子量（１０〜２０Ｋｄという桁）の１つ以上の全く疎 水的な成分とを含む（Ｋｉｎｇ、　Ｒ，Ｊ、、　ｅｔ　ａｌ。

Ｊ　Ａ　Ｉ　Ｐｈ　５ｉｏｌ　（１９７７）　４２　：　４８３−４９１　；　 Ｐｈ１ｚａｃｋｅｒｌｅｙ、　Ｐ。

Ｊ、　Ｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ　（１９７９）　１８３　：　７３１−７３６　 ）　、この用語は。

天然の配列及びそれと等価な修飾物を指す。例えば、ヒ）　３２ＫＡＳＰは、第 ３図で示したアミノ酸配列を有する。イヌ、サル、あるいは他の哺乳動物のよう な他の種に由来する約３２ＫｄのＡＳＰ蛋白は、この配列と実質的な程度の相同 性を持つ（イヌのＡＳＰと関連して第１図を見よ）。他の特別な３２Ｋ　ＡＳＰ （イヌ）およびｌ０ＫＡＳＰ（ヒトおよびイヌ）の追加の配列を以下に開示する 。

本発明の組換えＡＳＰ蛋白は９本来の蛋白に対応するアミノ酸配列を持つ。しか しながら、限定された修飾は活性を破壊することなしに行われ得ること、および 完全な１次構造の一部分だけが、必要であり得ること、が理解されている。例え ば１本発明のヒトＡＳＰ３２に組換え蛋白は、第３図で示したのと実質的に同様 のアミノ酸配列を有するが、活性を破壊しないこの配列の軽い修飾も、３２にヒ トＡＳＰの定義内に。

さらに以下で示すような特許請求した蛋白の定義内にある。

活性を有する第３図の完全な配列を持つ断片も定義内に含まれる。

全ての蛋白の場合と同様に、ＡＳＰ蛋白は調製球式或いはもし溶液状態ならばそ の環境により、中性の形態、或いは塩基性或いは酸性の付加した塩の形態、で存 在できる。一般的には蛋白、およびそれ故に特にどのＡＳＰでも、遊離のアミノ 基を含む酸性塩、或いは遊離のカルボキシル基で形成される塩基性塩の形態で見 出され得る。薬学的に受け入れ可能な塩は、蛋白の機能性を確かに高め得る。適 当な薬学的に受け入れ可能な酸性塩は２例えば、塩酸或いは硫酸のような無機酸 により、或いは酢酸あるいはグリコール酸のような有機酸により１形成されたも のを含む。薬学的に受け入れ可能な塩基は、水酸化カリウム或いは水酸化ナトリ ウムのようなアルカリ水酸化物、或いはピペリジン、グルコサミン、トリエチル アミン、コリン或いはカフェインのような有機塩基、を含む。加えて蛋白は、脂 質や糖のような他の生物学的物質との組み合わせにより、或いはアミノ基のアセ チル化、水酸基側鎖のリン酸化或いはスルフヒドリル基の酸化のような側鎖の修 飾、或いはコードされている一次配列の他の修飾により。

修飾される。確かに、その本来の形態では３２ＫＡＳＰは糖化された蛋白であり 、コードされているあるプロリン残基はヒドロキシプロリンに変換されている。

それはまた、ホスホリピドＤＰＰＣとＰＧに関連して見出されている。糖化ある いは非糖化の形態、ヒドロキシル化或いは非ヒドロキシル化された形態、アポ蛋 白のみのもの、或いは脂質で関連したもの。

要するに、血液と肺の空積間でガスの交換を促し肺胞を再膨張させることのでき る能力を保持している本来の配列と実質的に同様なアミノ酸配列を有するあらゆ る組成物が、ここではあらゆるＡＳＰの定義内に含まれる。

−次アミノ酸配列の小さな修飾により９本来の配列に比べて実質的に同等の或い は高められた活性を持つ蛋白になり得る。これらの修飾は２部位指定変異により 生ずる故意的なものであるが、或いは、ＡＳＰを産生ずる生物宿主の変異のよう な偶然的なものかもしれない。これらの修飾の全ては、ＡＳＰ活性が保持されて いる限り、含まれる。

蛋白の“ＡＳＰ活性”は、単独或いは他の蛋白と組合せて脂質を組合せたとき、 　Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、　Ｂ、　置皿（１９８０）　１５８　：　５７−６８の ｉｎ　ｖｉｖｏ検定において活性を示す能力として定義される。この検定では、 調べる試料は、帝王切開により早産させたウサギ或いは子羊に気管を通じて投与 する。（これらの“未２ツキ児”は自身のＡＳＰを欠いており１通風装置上で維 持している。）肺の受け入れ、血液中のガスおよび通風装置の圧力の測定は、活 性の指標を供する。活性の予備的な査定は。

ｉｎ　ｖｉｔｒｏの検定１例えば、　Ｋｉｎｇ、　Ｒ，Ｊ、、　ｅＬ　ａｌ、Ａ ｍ　Ｊ　ＰＩ＋　５ｉｏｌ−（１９７２）　２２３　：　７１５−７２６のもの 、或いは蛋白をホスホリピド小胞調製物と混ぜたときの空気−水面界での表面張 力の明瞭な測定を利用する。　Ｈａｗｇｏｏｄ、　ｅｔ　ａｌ、の下に示すよう なもの。

を用いても行える。

“作動可能なように連関している”は、成分をその有効なへ 機能を果たせるように形造った連けいを指す。このように。

コード配列に作動可能なように連関している制御配列は、コード配列の発現を行 うことができる。

“制御配列”は、所望のコード配列に正しく連結した場合・そのような配列と和 合可能な宿主でその発現を行うことのできるＤＮＡ配列のことを指す。そのよう な制御配列は、原核生物および真核生物の宿主のいずれのプロモーターも含み。

原核生物ではりボゾーム結合部位配列、また真核生物では終止シグナルも含む。

発現を行うのに必須な或いは役に立つ付加的な因子は、続いて確認し得る。ここ で用いたように、“制御配列”は単に、用いた特別な宿主で発現を行うのに必要 であるＤＮＡ配列にならどのようなものをも指す。

“細胞”、“組換え宿主細胞”或いは“宿主細胞”は９前後関係で明瞭ならば、 しばしば互換性をもって使用する。これらの用語は直接被験細胞、およびもちろ んその子孫を含む。

その親細胞と正確に同じであるとは限らないことが理解されている。しかし、そ のような変化した子孫も、上記の用語が用いられる場合、含まれる。

Ｂ、二瓜ｍ星述 ＡＳＰをコードしているＤＮＡ配列を得るために下に説明した方法は車に説明の ためであり、また、使用される方法の代表的なものである。しかしながら、当該 分野で理解されているような他の方法もまた用いられている。

Ｂ、１１表「−活性′１″′γ合　の１π肺の肺胞表面は、多（の技術を用い多 数のグループにより広く研究されている。肺胞の基礎膜はＩ型およびＨ型の肺胞 細胞から成り、■壁細胞は表面のおよそ３％を占めていると考えられている。■ 壁細胞は基礎膜を覆う内面液層の物質の外分泌をつかさどっており、この物質は 内面の液層と含有容量中の気層との間の表面張力を減少させている。そこで、液 層は１肺胞の毛細血管の血漿から由来している水、および■壁細胞の表面活性物 質の分泌物とから成っている。

■壁細胞は、それ自体、ｌ細胞あたり６０〜１１００ｐの蛋白および約ｔｐｇの リン脂質を含んでおり、■壁細胞のＤＰＰＣとリン含有ＰＣの割合は約８対１で ある。アポ蛋白成分の研究は様々な柿渋浄物に基づいており、上に述べたように １分子量が約１０〜２０Ｋｄおよび３２Ｋｄの主に２つの蛋白を含むことが示さ れている（Ｋｉｋｋａｗａ、　Ｙ、、　ｅｔ　ａｌ、　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｉ ｎｖｅｓｔｉ　ａｔｉｏｎ（１９８３）　４９　：　１２２−１３９　）。アポ 蛋白がホスホリピド成分と結合しているか（Ｋｉｎｇ、　Ｒ，Ｊ、、　ｅｔ　ａ ｌ、　Ａｍ　Ｒｅｖ　Ｒｅｓ　ｉｒ　Ｄｉｓ（１９７４）　１１０　：　２７３ ）　、していないか（Ｓｈｅｌｌｙ、　Ｓ、　Ａ、、　ｅｔ　ａｌ。

Ｊ　Ｌｉ　ｉｄ　Ｒｅｓ　（１９７５）　１６　：　２２４　）ははっきりして いない。

イヌの柿渋浄物から得られゲル電気泳動で分離された分子量の大きい方の蛋白は １分子量が２９，０００．３２．０００および３６．０００ダルトンの３つの主 な成分から成ることがわかった（１９８４年１０月２６日に提出され１本出願人 に譲渡され、参考文献とじてこの中に編入されている米国出願番号６６５，０１ ８を参照）。３２．０００ダルトンの蛋白は、下に述べるように、シークエンス デークを得るために用いられた。しかしながら、これら３つの蛋白は全て、同一 のＮ末端配列を持っており、それらは糖付加程度だけにより異なっていることが 確かめられている。３６Ｋｄと３２Ｋｄのバンドを、炭水化物側鎖を除去するエ ンドグリコシダーゼＦ、で分解すると、　２９Ｋｄの成分と同じ移動度を持つ産 物を得た。２９Ｋｄ成分の移動度は、この処理によっても影響はなかった。３２ Ｋｄの断片は、２量体および３四体になることもわかっている。

分子量の小さい方の蛋白は、より困難はあるが、抽出されており、これらもまた ン昆合吻のようである（Ｐｈｉｚａｃｋｅｒｌｅｙ、　ｅｔａｌ　（前出）；以 下に記述）。

イヌおよびヒトのＡＳＰ３２に蛋白をコードしている配列全体をクローニングし 、以下の０節に示すように、これらは種々の宿主細胞における発現に対して有効 である。加えて、ヒトおよびイヌの両方の供給源から、いくつかの低分子量蛋白 をコードしているＤＮＡ配列も得られた。

イヌの３２に配列は、成人の肺から分離されたｍＲＮＡから調製されたｃ　ＤＮ Ａライブラリーから、２組の合成オリゴヌクレオチドをプローブとして得られた 。１つはＮ末端配列の１から５番目のアミノ酸をコードする可能性がある配列全 てに合わせるように調製し、もう１つはその配列の７から１１番目のアミノ酸を コードするように調製した。同様に、′＠乳動物のコドン選択性を基にして選択 した。１から５番目のアミノ酸をコードする単一の１５マーも調製した。エセリ シア・コリー（Ｅ、ｃｏｌｉ）中で構築されたライブラリーからの固定化ｃＤＮ Ａをこれらのオリゴヌクレオチドのセントを用いて検索した。

偽陽性のものは、１組より多い七ノドに対し、ハイブリダイゼーションを行うこ とによって最小となるようにした。うまくハイブリダイズするクローンは配列決 定を行い、１つは正しいＮ末端配列を含むことがわかった。

成功したクローンからＰｓｔｌで分解して得られたｃＤＮＡ挿入物は１次いで、 もとのイヌｃＤＮＡライブラリーのプローブとして用い、結果として、ＡＳＰの 他の領域をコードしている挿入物を含む２つのクローンがさらに得られ、それら はこのプローブと合わせてイヌ３２ＫＡＳＰの完全なコード配列を含む８４４ヌ クレオチドにわたっていた。３つの適当な挿入物の全体のヌクレオチド配列、お よびそれから推定される２５６アミノ酸配列を第１図に示した。

上記で使われた。この同じ起源から得られたＮ末端コード断片を、再びプローブ として用いて、λフアージシャロン２８中でヒトゲノムライブラリー由来の断片 を得た。ヒトＡＳＰ３２に蛋白の全体をコードしている配列がｊｉｂ−のファー ジプラーク中に含まれ、２つの隣接したＢａｍ１ｌｌ断片、５゛側の１．２Ｋｂ 断片と３゛側の３．５Ｋｂ断片５の中に含まれることがねかった。ヒトＡＳＰを コードし、３つのイントロンを含むこれらの断片の適当な領域を第３図に示す。

それから推定されるヒトＡ　Ｓ　Ｐのアミノ酸配列は２２８７　ミノ酸を含み、 先頭に少な（とも２５アミノ酸のシグナル配列があった。蛋白の全長に対応する ヒト３２ＫＡＳＰのＣＤ　Ｎ　Ａもまた。ヒト胎児と成人の肺のｍＲＮＡに由来 するヒトｃ　ＤＮＡライブラリーを検索することによって得られた。

広範囲での相同性がイヌとヒトの３２にアミノ酸配列の間で存在した。

同様の方法が、続いて、ヒトおよびイヌのｌ０ＫＡＳＰをコードするｃＤＮＡを 得るために用いられた。上記のイヌの肺・ｃＤＮＡライブラリーを１６．５Ｋｄ 　（還元していないゲル上で）のイヌ蛋白のＮ末端アミノ酸配列と一致するよう に作られた２つの合成オリゴマーの混合物を用いて検索し２両方のプローブに対 してハイブリダイズするクローンを回収し、配列決定した。これらのクローンの うち１つは、イヌＡＳＰをコードしている配列を含んでいるが、これを成人の肺 から分離したｍＲＮＡからバクテリオファージｇｔｌｏ中で調製されたｃ　ＤＮ Ａライブラリーを検索するために用いたところ、ヒｌ−１０ＫＡＳＰをコードす るクローンが得られた。

Ｂ、３．　、匁旦」Ｊη１狐 種々のヒト及びイヌのＡＳＰをコードしているヌクレオチド配列が、今有効であ ることがわかったので、これらを０節に記載の種々の系で発現させた。もし原核 生物の系を用いる場合、イントロンのないコード配列が適当な制？１［１配列と ともに用いられる。上記ＡＳＰ蛋白のいずれに対するｃ　Ｄ　Ｎ　／’ｉクロー ンも適当な制限酵素で切り、このような発現のための原核生物ベクターに連結し た。ＡＳＰのゲノムＤＮＡの原核生物での発現では、ＤＮＡは、イントロンを除 くために１部位指定変異によって、或いはｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　領域を取ってきてイ ントロンを含むゲノム配列の代わりにそれらを用いることによって、修飾を加え る必要がある。そのイントロンのないコードＤＮＡを３次に、原核生物での発現 のための発現ベクターに連結した。

以下に例示するように、ＡＳＰをコードしている配列はまた。イントロンをプロ セッシングできるような発現系、普通は、　ｌｌ′ｌｔｉ乳動物宿主細胞培養で 直接使われる。このような発現を行うため、ゲノム配列を、ＣＨＯ細胞中でこれ らの配列の発現を調節する制御可能な哺乳動物プロモーターの下流に連結するこ とができる。

Ｂ、４．　ｚ皇二皿双 へｓｐ蛋白は、成熟蛋白又は、融合蛋白として生産されたり、あるいは分泌のた めにシグナル配列をプロセッシングできるような細胞中でこの配列を持った蛋白 として生産される。

蛋白の分泌を獲得することは有効なことで、それは精製時の困難を最小にするか らである。従って、適当なプロセッシングができるような細胞で１本来のシグナ ル配列のコドンを含むし）ＡＳＰ遺伝子を発現させることが好ましい。培養補乳 動物細胞は、シグナル配列を含む異種の哺乳動物蛋白を切断。

プロセッシングし、それらを培地中に分泌できることが示されている。　（Ｍｃ Ｃｏｒｍｉｃｋ＋　Ｆ、、　ｅｔ　ａｌ、　Ｍｏｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ　（１ ９８４）↓：　１６６） 培地中に分泌されると、ＡＳＰ蛋白は、一般的な蛋白精製技術を用い回収される 。精製過程は簡単で、なぜなら培地中には比較的わずかな蛋白しか分泌されない し１分泌された蛋白の大部分は、それゆえ、すでにＡＳＰであるからである。

しかしながら、方法はもっと苦労するが、この蛋白を細胞内で融合又は成熟な形 で産生じた細胞の超音波破砕物又は溶解物から精製することも当該分野で既知の 方法である。

Ｂ、５．　、配旦ヱ瀝」し砿笠定 ｉｎ　ｖｉｔｒｏでの方法が９表面張力を減少させる（表面圧力の増加と同じ意 味）ことによる機能について、また水／気体界面の膜形成について、ＡＳＰ蛋白 の能力を評価するために。

考え出された。これらの方法を用いた研究は分離された天然のＩＯＫイヌＡＳＰ に関して行われてきた。（Ｂｅｎｓｏｎ、　Ｂ、　Ｊ、。

ｅｔ　ａｌ　Ｐｒｏ　Ｒｅｓ　Ｒｅｓ　（１９８４）　１８　：　８３−９２　 ；　ｌｌａｇｗｏｏｄ、　Ｓ、。

ｅｔ　ａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｓｔｒ　（１９８５）」［：　１８４−１９０　） Ｔａｎａｋａ、　Ｙ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｃｈｅｍ　Ｐｈａｒｍ　Ｂｕｌｌ　（１ ９８３）　３１　：　４１００−４１０９において、ウシ肺から得られた３５Ｋ ｄ蛋白がＤＰＰＣの表面核敗を強めることを開示している。５ｕｚｕｋｉ、　Ｙ 、、　Ｊ玉り佳史ユ邦−（１９８２）　２３　：　６２−６９　；　５ｕｚｕｋ ｉ、　Ｙ、、　ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏ　Ｒｅｓ　Ｒｅ５（１９８４）　１８　： 　９３−１００は、ブタ肺からとれた１５Ｋｄ蛋白が同じ供給源由来の脂質−蛋 白複合体の拡散を強めることを示した。

」　■二での表面活性物質複合体の機能は表面張力を減少させるために気体／水 界面で膜を形成することであるから。

ｉｎ　ｖｉｔｒｏモデルにおける。このような表面での脂質、あるいはリポ蛋白 の拡散により生じる膜形成を高めるＡＳＰ蛋白の能力は明らかにその有効性と関 連している。

Ｂ、６．立並及び且■ 精製蛋白は、幼児や成人の呼吸困難症の治療のために、単独で、また投与に適当 なＦＡ薬組成物と結合させて使用することができる。本発明の組成物および蛋白 産物は、肺炎や気管支炎のような関連した呼吸疾患を治療する際にもまた有効で ある。このような治療において使用するために、成分のどちらか、好ましくは３ ２に成分を、単独で或いはさらに好ましくはヒトのＡＳＰのＩＯＫ成分と結合さ せて、天然または合成の脂質と結合させて７表面活性物質複合体を再構成した。

その複合体は、約５０％からほぼ１００％（ｗｔ／ｗｔ）の脂質および５０％か ら１％以下のＡＳＰを含んでいる。ただしＡＳＰは好ましくは複合体の５％から ２０％である。脂質部分は好ましくは。

８０％から９０％（ｗｔ／ｗｔ）がＤＰＰＣで、残りの部分は非飽和ホスファチ ジルコリン、ホスファチジルグロセロール、トリアジルグリセロール、パルミチ ン酸またはそれらの混合物である。複合体は、ＡＳＰ溶液と脂質リボゾーム懸濁 液との混合により、或いは脂質、蛋白質の溶液を界面活性剤または有機溶媒存在 下で混合することにより、再集合させる。界面活性剤または溶媒は、その後、透 析により除く。

複合体を再構成する際、柿渋浄物の天然の脂質成分を利用し、脂質を適切な量の ＡＳＰ蛋白に添加することは可能であるが１合成脂質の利用の方が明らかに好ま しい。第一に、十分な供給物があるということで、これは明白なことである。

第二に、調製品の純品さ、および伝染性蛋白を含む外来蛋白。

これは天然の脂質を分離してくる肺に存在するものであるが。

による汚染がないこと、は合成品に関してのみ確かなことである。もちろん、有 効な複合体の再構成は１合成成分を用いるとより難しくなる。

３２にヒ）ＡＳＰを組成物の蛋白成分として単独で用いるよりも、３２にとＬＯ Ｋの蛋白と組合せた方が好ましい。蛋白の割合は、典型的には、３２Ｋ　：　Ｉ ＯＫでは８０　：　２０の範囲内である。

３２に蛋白は、水溶液中のホスホリピド水胞水性懸濁液に直接加える；何故なら ＩＯＫ蛋白は非常に疎水性であるので、この蛋白がクロロホルムのような有機溶 媒中の脂質に加えられ。

溶媒を蒸発させ、そして小胞が水和により再形成される。

複合体を含む組成物は、好ましくは、気管内投与に適するものである。すなわち 、概して、液状懸濁液、乾燥粉末“ちり”あるいはエアロゾルのようなものであ る。直接的気管内投与として、複合体を２例えば水、生理食塩水、デキストロー ス或いはグリセロールなどの適当な賦形剤とともに液中に懸濁する。組成物は、 　ｐＨ緩衝剤のような無毒の補助物質１例えば酢酸ナトリウムやリン酸ナトリウ ムなどを少量含んでもよい。“ちり”を調製するために、上記のように随意混合 した複合体を凍結乾燥し、乾燥粉末として回収する。

エアロゾル投与で使用する場合には、複合体を付加的な界面活性剤や推進剤とと もに細かく分離した形で供給する。投与される一般的な界面活性剤は、脂肪酸や エステルであるが。

しかしながら、今回の場合は７表面活性物質複合体の他の成分であるＤＰＰＣや ＰＧを利用することが好ましい。有効な推進剤としては、一般的に、密閉した条 件での気体で、圧縮下で凝縮させる。低級アルカンや、フレオンのようなフン化 アルカンが使われる。エアロゾルは、成分が放出されるまで圧縮下で維持できる ように、適当な弁を備えた容器の内に詰めてお（。

表面活性物質複合体は、投薬の形に合うように、気管チューブ、エアロゾル投与 、吸入気体中への懸濁物または、“ちり”の霧状化により、投与する。複合体は 約０．１ｍｇと１０ｍｇの間の量が一回の投与量となるよう投与する。新生児に 使用する場合は一般的に１回の投与で十分である。成人では、十分量の再構成複 合体を投与して、示された欠陥レベルを置き換える（Ｈａｌｌｍａｎ、　Ｍ、、 　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ　Ｃ１１ｎｉｃａｌユｎｖｅｓ山ｌ状匡Ｌ（１９８２）７０ 　：　６７３−６８２）。

Ｃ１環準血星立抜 細胞を形質転換するため、ベクターを構築するため、メツセンジャーＲＮＡを抽 出するため、ＣＤＮＡのライブラリーを調製するために用いられるほとんどの技 術およびその他同種のものは、当該分野で広く行われており、はとんどの当業者 は、特別な状件と操作を記述する標準的な手段の資料をよく知っている。しかし ながら便宜上１次の節を指針として示す。

Ｃ１１，宣工旦巽皿配旦 原核生物系と真核生物系の両方を、ＡＳＰのコード配列を発現するために用いて いる：原核生物宿主はクローニング操作において最も好都合である。原核生物は 、　Ｅ、ｃｏｌｉの様々な株によって最もよく代表される；しかしながら、他の 微生物株もまた用いられる。複製部位と制御配列とを含むプラスミドベクターは 、用いられる宿主と和合性の種から得られた；例えば、　Ｅ、ｃｏｌｉはｐＢＲ ３２２，Ｂｏｌｉｖａｒ、　ａｔ　ａｌ、　Ｇｅｎｅ　（１９７７）　３：９５ によってＥ、ｃｏｌｉ種から得られたプラスミド、の誘導体を用いて典型的に形 質転換される。ｐＢＲ３２２はアンピシリンとテトラサイクリン耐性のための遺 伝子を含んでおり、従って。

所望のベクターを構築する際に残しておくかあるいは壊すかすることのできる付 加的なマーカーを供する。オペレーターを随意に有し、加えてリボゾーム結合部 位配列を伴う転写開始のためのプロモーターを含むとここで定義されている制御 配列は、ベークーラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）とラクトース（ｌａｃ）のプ ロモーター系（Ｃｈａｎｇ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｎａｔｕｒｅ　（１９７７）１９ ８　：　１０５６）　、）リプトフプン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄ ｅｌ。

ｅｔ　ａｌ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ　（１９８０）　８　：　 ４０５７　）およびラムダ由来のＰＬプロモーターとＮ−遺伝子リボゾーム結合 部位（Ｓｈｉｍａｔａｋｅ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｎａｔｕｒｅ　（１９８１）　２ ９２　：　１２８　）のような。

一般に用いられるプロモーターを含む。

バクテリアに加えて、酵母のような真核微生物もまた宿主として用いることがで きる。サツカロマイセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　ｃｅｒｅ ｖｔｓｉａｅ）の研究室株であるＢａｋｅｒの酵母が、たくさんの他の株が、一 般に有用であるけれども、もっとも用いられる。例えば、　Ｂｒｏａｃｈ、　Ｊ 、　Ｒ，＋　Ｍｅむｈ　Ｅｎｚ　（１９８３）１０１　：　３０７の複製の２μ オリジン、或いは他の酵母の和合性復製オリジン（例えばＳＬｉｎｃｈｃｏｍｂ 、　ｅｔ　ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ　（１９７９）　２８２：　３９．　Ｔｓｃｈｅ ｍｐｅ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｇｅｎｅ　（１９８０）　１０　：　１５７およびＣ １ａｒｋｅ。

Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｍｅｔｈ　Ｅｎｚ　（１９８３）　１０１　：　３００参 照）を使用するベクターが、用いられる。酵母ベクターの制御配列は、解糖系酵 素合成のプロモーターを含む（ｔｌｅｓｓ、　ｅｔ　ａｌ、エムＦｊｇ、−（１ ９６８）　７　：　１４９　；　Ｈｏ１ｌａｎｄ、等、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ ｒ　（１９７８）１７　：　４９００　）。当該分野で知られている付加的なプ ロモーターには、３−ホスホグリセレート　カイネース（Ｈｉ　ｔｚｅｍａｎ　 。

ｅｔ　ａｌ、　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　（１９８０）　２５５　：　２０７３ ）のプロモーターおよび他の解糖系酵素のプロモーターが含まれる。他のプロモ ーター、これは生育状況によって転写が制御されるという付加的な有利点を持つ のだが、はアルコール　デバイドロゲナーゼ　２．イソチトクローム　Ｃ２酸ホ スフアターゼ、窒素代謝に関与する分解酵素およびマルトースやガラクトース利 用に任のある酵素のプロモーター領域である。終止配列がコード配列の３°末端 にあることが望ましいこともまた信じられている。このようなターミ皐−ターは 、酵母由来の遺伝子中のコード配列に続く３′非翻訳領域に見いだされる。

もちろん、多細胞生物から得られた真核生物の宿主細胞培養物中で、ポリペプチ ドをコードしている遺伝子を発現することも、可能である。例えば、　Ｔｉ５ｓ ｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ、　ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、　Ｃｒｕｚ　ａｎｄ 　Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ、　ｅｄｉｔｏｒｓ　（１９７３）を見よ。これらの系は 、イントロンをスプライシングできるという付加的な利点を持ち、従って、ゲノ ム断片を発現するために直接用いることができる。有用宿主細胞系には、　ＶＥ ＲＯ，１ｌｅＬａ細胞およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が含ま れる。

このような細胞のための発現ベクターは１通常、プロモーターと１例えば一般に 用いられるシミアン　ウィルス４０　（ＳＶ４０）の早期プロモーターおよび後 期プロモーター（Ｆｉｅｒｓ、　ｅｔａｌ、　Ｎａｔｕｒｅ　（１９７８）　２ ７３　：　１１３　）　、或いはポリオーマ、アデノウィルス　２．ウシ　パピ ローマ　ウィルス或いは、鳥肉腫ウィルス由来のプロモーターのような他のウィ ルス性プロモーターのような、哺乳動物の細胞と和合性の制御配列を含む。制御 可能なプロモーターであるｈＭＴ　ＩＩ　（Ｋａｒｉｎ、　Ｍ、　、　ｅｔａｔ 、　Ｎａｔｕｒｅ　（１９８２）　２９９　：　７９７−８０２　）もまた用い ることができる。哺乳動物細胞宿主系形質転換の一最的な面は、　Ａｘｅｌの米 国特許番号４，３９９，２１６　（特許日１９８３年８月１６日）に記載されて いる。“エンハンサ−”領域が１発現を効果的にするのに重要であることも現在 では明らかである。一般的に、これらは非コードＤ　Ｎ　Ａ　領域中のプロモー ター領域の上流或いは下流に見られる。必要に応して、複製起点がウィルス源か ら得られる。しかしながら、染色体への組み込みは、真核生物でのＤＮＡ複製と 同じ機構である。

Ｃ・２・皿π按艮 用いた宿主細胞に応じて、形質転換はその細胞に適切な標準手法を用いて行われ る。Ｃｏｈｅｎ＋　Ｓ、　Ｎ、、　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　１ｃａｄ　５ｃｉ（Ｕ ＳＡ）　（１９７２）　６９　：　２１１０に記載されているような塩化カルシ ウムによるカルシウム処理、或いは、　Ｍａｎｉａｔｉｓ、　ｅｔ　ａｌ、、前 月ｃｕｌ　ｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　゛　八　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ　（ １９８２）　Ｃｏ１ｄ　５ｐｒｉｎ　ｇｌ（ａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｐ２Ｓ ５に記載のｌ？ｂｃｌＺ法が、原核生物或いは。

実質的な細胞壁の障壁を持つ他の細胞用に用いられる。このような細胞壁のない 哺乳動物細胞には、　Ｇｒａｈａｍ　ａｎｄ　ｖａｎ　ｄｅｒＥｂ、　Ｖｉｒｏ 圏１　（１９７８）　５２　：　５４６のリン酸カルシウム沈澱法を。

随意に、　Ｗｉｇｌｅｒ、　Ｍ、、　ｅｔ　ａｌ、Ｃｅ１ｌ　（１９７９）　１ ６　：　７７７−７８５により手直しされた通りに、用いることができる。酵母 へのＬＩＳＡ）　（１９７９）　７６　：　３８２９の方法に従って１行われる 。

Ｃ０３，ゲノムライブラリーのｃＤＮＡの　、ｃＤＮＡ或いはゲノムライブラリ ーは、コロニーハイブリダイゼーション操作を用いて選別される。各々のマイク ロタイタープレートを二重のニトロセルロースフィルター紙（Ｓ＆ＳタイプＢＡ −８５）へ写す。そしてコロニーを、１５Ｍｇ／ｎ／！テＩ・ライブリーを含む し寒天上で、１４〜１６時間、３７℃で生育させる。コロニーを１０％ＳＤＳで 溶解させ、そのＤＮＡを。

５００ｍＭ　Ｎａ０１ｌ／　］、、５５ＭＮａＣｌで５分９次いで、０．５Ｍ） リス塩酸（ｐ１４８．０）　／１．５Ｍ　ＮａＣ１、続いて２×標準ク工ン酸塩 含有食塩水（ＳＳＣ）、の連続処理によってフィルターに固定する。

フィルターは空気中で乾して、８０℃で２時間焼く。

二ツクトランスレーションしたプローブの場合は、二重のフィルターを、１フイ ルターあたり、ＤＮＡハイブリダイゼーション緩衝液１０ｄ　（５Ｑ％ホルムア ミド（もし結合が弱いなら、４０％ホルムアミド）、５　Ｘ５ＳＣ，ｐＨ７，０ ，５’ｘデンハート溶？（１（ポリビニルピロリドン、フィコールおよびウシ血 清アルブミン；各々ｌ　ｘ　＝０．０２％）　ｐＨ７，０の５０ｍＭ、リン酸す ｌ−リウム季創重ｉ？夜、０．２％Ｓ　Ｄ　Ｓ　、　５０μｍ４７ｍ１．西琴母 ｔＲＮＡ　、　および５０Ｍｇ７ｍｌｌの変性、切断したサケ精子ＤＮＡ）を用 いて。

４２℃で、１６〜１８時間プレハイブリタイプした。サンプルは。

この同じＤＮＡハイブリダイゼーション緩衝液５　ｍｌに含まれる。ニックトラ ンスレーションしたＤＮＡプローブで、同種では４２℃、異種では３７°Ｃで、 １２〜３６時間ハイブリダイズする。

フィルターは、同種のハイブリダイゼーションでは、０．２ＸＳＳＣ，０，１％ ＳＤＳの中で５０°Ｃで、異種のハイブリダイゼーションでは、３ＸＳＳＣ，０ ，１％ＳＤＳの中で５０°Ｃで、３０分間、２回洗う。フィルターは空気中で乾 して、−７０’ｃで１〜３日オートラジオグラフィーにかける。

合成（１５〜３０マー）オリゴヌクレオチドプローブの場合は。

二重のフ、トルターを、■フィルターあたり１０Ｊｒ１．のオリゴ−ハイブリダ イゼーション緩衝液（６，Ｘ５ＳＣ，０，１％ＳＤＳ。

１ｍＭＥＤＴＡ、５ｘデンハート０．０５％ピロリン酸ナトリウムおよび５０Ｍ ｇ／ｍｊ２の変性、切断したサケ精子ＤＮＡ）で。

２〜８時間、４２℃でプレハイブリダイズする。

サンプルを、オリゴヌクレオチドの組成物に応じた条件下で、１５〜３０ヌクレ オチドのリン酸化オリゴヌクレオチドプローブでハイブリダイズする。典型的な 条件としては、プローブを含むこの同じオリゴハイブリダイゼーション緩衝液を フィルターあたり５ｍｊ！、３０〜４２℃の温度、２４〜３６時間、を採用する 。フィルターは、６ｘｓｓｃ、ｏ、ｔ％ＳＤＳ、ｐＨ７の５０ｍＭリン酸ナトリ ウムで、２３℃、１５分、２回洗う。その後、６ｘｓｓｃと０．１％ＳＤＳで、 計算されたハイブリダイゼーション温度で２分、１回洗い、空気中で乾かし、− ７０℃で２〜３日オートラジオグラフィーにかける。

Ｃ，４，ｃＤＮＡ−イブーリーの 二本鎖のｃＤＮＡは、プラスミドベクターｐＢＲ３２２への挿入用にウシ胸腺タ ーミナルトランスフェラーゼによって仲介されるホモボリメリンク　テーリング を用いて合成され調製される　（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ、　Ｊ、　Ｇ、、　Ｎｕｃ ｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ　（１９７８）　５　：　２７２１−２７３２゜第 −鎖のｃＤＮＡは、５．ｕｇのｍＲＮＡに、オリゴ（ｄＴ）１２〜１８をプライ マーとして１鳥骨髄芽球症ウィルス由来のＲＮＡ−依存性ＤＮＡポリメラーゼに よって１合成される。ＲＮＡ鋳型は１次いで、１００℃、５分での変性とそれに 続く水冷によって、生じたＤＮＡ鎖から放す。第二のＤＮＡ鎖は。

Ｅ、ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩの大きい断片を用いて、第一　、 領分子の３゛末端でのそれ自身のプライマーによって合成される。このようにし て、二本鎖のヘアピンＤＮＡが、形成される。これらの分子は、開放終結末端で 平滑末端にし、ヘアピンループ のＳｌヌクレアーゼで切断して開く。二本鎖Ｃ　Ｄ　Ｎ　ＡのＳｌヌクレアーゼ 分解は，　３００ｍＭ　ＮａＣ１．　３０ｍＭ　ＮａＯＡｃ，　ｐ）１４．５お よび３ｍＭ　ＺｎＣ１．中で，　６００−ｆｆ−ニットの酵素で３７°Ｃ，３０ 分行われる。

ｃＤＮＡはフェノール：クロロホルムで抽出し．小さなオリゴヌクレオチドは． 酢酸アンモニウム存在下での３回エタノール沈澱によって除去する。これは次の ように行う；半分容量の７．５Ｍ酢酸アルミニウムと．２倍容量のエタノールと をＣＤＮＡ溶液に加え，−７０°Ｃで沈澱させる。平滑末端の二本鎖ｃＤＮＡを ，次いで，セファロース４Ｂ（ファルマシアファインケミカルズ，ビス力夕ウエ イ，ＮＪ）のカラム（０．３Ｘ１４Ｃｍ）を通したゲル濾過により，大きさによ って分画する。

或いは，５〜２０％のグリセロール勾配中での超遠心分離で。

その勾配を分画する。所望の長さ．例えば３００塩基対，より大まかに大きなｃ ＤＮＡを残し，７０％エタノールで沈澱させて回収する。デオキシシトシンの短 い（１０〜３０ヌクレオチド）重合尾部を，　０．２Ｍカコジル酸カリウム、２ ５ｍＭ）リス、ρ）＋６．９　。

２ｍＭジチオスレイトール、　０．５ｍＭ　ＣｏＣ１ｚ　、　２００ｍＭ　ｃ　 ＤＴ　Ｐ。

４００　μｇ／ｍｆｆＢｓＡおよび４０ユニツトのウシ胸腺ターミナルデオキシ ヌクｌ−：（−ド　トランスフェラーゼを含む，２２℃。

５分の反応により，ｃＤＮＡの３″末端に加える。反応液は。

フェノール：クロロホルムで抽出して．小さなオリゴヌクレオチドは酢酸アンモ ニウムの存在下で３回のエタノール沈澱により除去する。

：）　ｄＣの尾部のついたｃ　Ｄ　Ｎ　Ａは．　Ｐｓｔｌで切断してオリゴｄＧ を尾部につけたｐＢＩ’１３２２でアニールさせる７２．５８ｇのＩ）ＢＲ３２ ２−ｄＧＤＮＡは，５μｇ／ｍｊ！のベクター濃度でｃＤＮＡとアニールさせ２ そしてハイブリッドを，　Ｃａｓａｂａｄａｎ，　Ｍ．、　ｅｔ　ａｌ．。

Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　（１９８０）　１３８　：　１７９　−　２０７に記載のＣ ａＣ１ｇ処理によって，　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＣ１０６１に移す。

Ｃ．５．二又又二盪朶 所望のコード配列と制御配列とを含む適切なベクターの構築には，当該分野でよ く理解されている標準的な連結と制限技術を用いる。単離されたプラスミド、Ｄ ＮＡ配列あるいは合成オリゴヌクレオチドは，切断され，尾部を付けられ，所望 の形に再連結される。

部位特異的ＤＮＡ９］断は，一般に当該分野で知られている条件下における，市 販制限酵素の製造者の指示に基づいた。

適切な制限酵素での処理によって行われる。例えば、　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓでの製品カタログを見よ。一般的に，約１μｇのプラスミド或い はＤＮＡ配列は，約２０μｌの緩衝溶液中で１ユニットの酵素によって切断され る。例えば、ここでは典型的に，過剰の制限酵素を用いて，ＤＮＡ基質の完全な 切断を確かにする。変動は大目に見ることができるけれども約３７℃で。

約１時間から２時間の保温時間で実行されうる。各々の保温の後，蛋白はフェノ ール／クロロホルムでの抽出により除去され．続いてエーテル抽出を行ってもよ （核酸をエタノール沈澱によって，水層画分から回収した。必要に応じて，切断 断片の大きさによる分離を，標準的な手法によるポリアクリルアミドゲル或いは アガロースゲル電気泳動によって行ってもよい。大きさによる分離の一般的な記 述は，　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ監Ｕ匹圏■（１９８０）皿：　４９９　−　５６ ０に見られる。制限酵素で切断した断片は４つのデオキシヌクレオチド　トリフ ォスフエイト（ｄＮＴＰｓ）の存在下で５０ｍＭ　）リスｐｌ（７．６．　５０ ｍＭ塩化ナトリウム、６ｍＭ塩化マグネシウム、６ｍＭＤＴＴと５〜１０ｐＭｄ ＮＴＰｓ中で．２０°Ｃから２５℃で約１５分から２５分の保温時間を用いれば Ｅ．ｃｏｌｉＤ　Ｎ　Ａポリメラーゼ１の大きい断片（クレノー）での処理によ って，平滑末端にすることができる。

クレノー断片は，たとえ４つのｄＮＴＰがあっても，５°の粘着末端を埋めるが 突出した３゛の一本鎖も消化する。もし望むなら選択的な修復を粘着末端の性質 によって指示される限定内で，１つだけの或いは選択したｄＮＴＰｓを供給する ことによって実行することができる。クレノーを用いた処理の後，その混合液を フェノール／クロロホルムで抽出しエタノール沈澱を行う。Ｓ１ヌクレアーゼも しくはＢａｔ−３１を用いた適切な条件下での処理は，いかなる−末鎖部分も加 水分解する。

合成オリゴヌクレオチドは．　Ｅｆｉｍｏｖ，　Ｖ．八．、　ｅｔ　ａｌ．　（ ＮｕｃｌｅｔｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ）　（１９８２）　６８７５　−　６８９４ 　）の方法で調整され，そして商業的に入手可能な自動オリゴヌクレオチド合成 機を用いて．調製することができる。アニーリングする前に，或いはラベルする ための一本鎖のリン酸化は，過剰な例えばＩｎ　ｍｏｌ．ｅの基質に対しておよ そ１０ユニツトのポリヌクレオチド　キナーゼを，５０ｍＭ）リス、　ｐｌ＋７ ．６　、　１０ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭジチオスレイトール、１〜２ｍＭ ＡＴＰ．　１．７ｐ　ｍｏｌｅｓｒ３２Ｐ−ＡＴ　Ｐ　（２．９ｍＣｉ／ｍｍｏ ｌｅ）　、　０．１ｍＭスペルミジン、０．１ｍＭＥ　Ｄ　ＴＡの存在下で用い て．達成した。

結合は次の標準的な条件と，温度のもとて１５〜５０μｌ容量で行われる：２０ １１Ｍトリスー塩酸ｐｏ’７．ｓ，　１０ｍＭ塩化マグネシウム、　１０ｍＭＤ ＴＴ，　３３＃ｇ　／ｍｅ　Ｂ　Ｓ　Ａ，　１０ｍＭ〜５０ｍＭ塩化ナトリウム 、そして４０μＭ　Ａ　Ｔ　Ｐ　、　Ｏ．ＯＬ〜０．０２（Ｗｅｉｓｓ）ユニッ トＴ４ＤＮＡリガーゼでＯ　’Ｃにおいて（“粘着末端”の結合のために）或い は，　１　ｍＭＡ　Ｔ　Ｐ　、０．３〜０．６（Ｗｅｉｓｓ）ユニットＴ４ＤＮ Ａリガーゼで１４℃において（“平滑末端ゞの結合のために）。分子間粘着末端 結合は通常，　’ｊ９　Ｄ　Ｎ　Ａ　濃度１ｍｌ当り３３〜１００μｇ　（５〜 １００ｎＭ総末端濃度）にて行われる。分子間の平滑末端結合（ｆ通１０〜３０ 倍ｍｏｌａｒ過剰のυンカーを用いる）は、全体で１μどの末端濃度で行われる 。

“ベクター断片”を用いるベクター構築において，ベクター断片を一般的に５″ のリン酸を取り除きかつベクターの再結合を防ぐために，バクテリアのアルカリ ホスファターゼ（ＢＡＰ）か、或いは牛の腸のアルカリホスファターゼ（ＣＩＰ ）で、処理する。分解はおよそ１５０ｍＭ　ｌ−リス中ｐ１１８にてＮａ”と九 ゛２の存在下で、ベクター１μｇにつきｌユニットのＢＡＰ或いはＣＩＰを用い て、約１時間６０’Ｃで処理される。核酸断片を回収するために、その調製液を フェノール／クロロボルムで抽出し、エタノール沈澱を行う。もしくは、再結合 を必要ではない断片の付加制限酵素による分解によって、二重に分解されたベク ターでは、防ぐことができる。

ＣＤ　Ｎ　Ａから得られたベクターの部分或いは配列の修飾が必要なゲノムＤＮ Ａのために１部位特異的プライマーの直接的な変異が用いられる。これは、所望 の変異を表す限られたミスマツチングを除いては、変異をかけるべき一重鎖ファ ージＤＮＡに相補的なプライマー合成オリゴヌクレオチドを用いて行う。簡単に 言えば１合成オリゴヌクレオチドを５プライマーとして、ファージに相補的な鎖 を、直接合成するために用い、そして得られた二本ＩＸ　Ｄ　Ｎ　Ａをファージ を増殖させる宿主バクテリアに形質転換する。形質転換したバクテリアの培養液 を上層寒天に拡げ、ファージを持つ単一細胞からのプラーク形成を可能にする。

理論的には新しいプラークの５０％が、一本領として変異のかかった形を持つフ ァージであり、　５０％が始めの配列を持っている。得られたプラークはリン酸 化した合成プライマーを用いて、正しいマツチのハイブリダイゼーションができ うる温度であるが、始めの鎖とのミスマツチが、ハイブリダイゼーションを十分 防ぐことのできる温度で、ハイブリダイズさせる。プローブとハイブリダイズし たプラークを次いで釣り上げ、培養し、そしてＤ　Ｎ　Ａを回収する。部位特異 的変異操作の詳細は、以下に特別な例で、記述する。

Ｃ４６，且築旦侃ル 下記構築（ベクター）おいて、プラスミド構築のための正しい結合は初めに、　 Ｍ、　Ｃａ５ａｄａｂａｎ博士から得られたＥ、ｃｏｌｉ株ＭＣ１０６１（Ｃａ ｓａｄａｂａｎ、　Ｍ、、　ｅｔ　ａｔ、　Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　（１９８０ ）　１３８　：１７９−２０７　）或いは他の適した宿主を、結合混合物で、形 質転換することによって、確認される。成功した形質転換株をアンピシリン、テ トラサイクリン、或いは他の抗生物質耐性によってか、或いは、プラスミド構築 の様式による他のマーカーを用いて当該分野で知られているように選択する。形 質転換株からのプラスミドは１次いでＣｌｅｗｅｌｌ、　Ｄ、　Ｂ、、ｅｔ　ａ ｌ、＋Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　（ＵＳＡ）　（１９６９）　６ ２　：　１１５９の方法に従って、そして必要なら、クロラムフェニコールによ る増幅（Ｃｌｅｗｅｌｌ。

Ｄ、　Ｂ、、　Ｊ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　（１９７２）皿：　６６７　）により 、調製される。単離したＤＮＡを制限酵素により分析され、そして／あるいは」 ＩＩ犯二Ｆ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　（ＵＳ Ａ）　（１９７７）７４　：　５４６３　、さらに、　Ｍｅｓｓｉｎｇ　ｅｔ　 ａｌ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ　（１９８１）９　：　３０９に 述べられているように、ジデオキシ法或いはＭａｘａｍ。

ｅｔ　ａｔ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　ｍｏｌｏ　（１９８０）　６５ 　：　４９９の方法により配列決定される。

Ｃ０７，五丞沓土 ここでクローニングと発現で用いられた宿主株は３次のものである： クローニングと配列決定のためと、そしてほとんどのバクテリアのプロモーター の制御下での構築の発現のためにＥ、ｃｏｌｉ株Ｍｃ１０６１を用いた。

Ｍ１３ファージの組み換えのために、　Ｅ、ｃｏｌｉ株ＪＭＩＯＩのようなファ ージに感染しゃすいＥ、ｃｏｌｉ株を用いた。

発現のために用いた細胞はＣｈｉｎｅｓｅ　ｈａｍｓｔｅｒ　ｏｖａｒｙ　（Ｃ Ｈ○）細胞である。

Ｄ、ＡＳＰのクローニングおよび イヌとヒトのＡＳＰ蛋白を精製したかたちで得た。ヒトのＡ’ＳＰの染色体およ びｃＤＮＡのライブラリーのためのプローブを供給するのに、イヌｃＤＮＡを使 った。

Ｄ、１．イヌのＡＳＰの′［！＋ＩＩ＋Ｄ、１．ａ、　Ｓ　人−のバー 肺界面活性物質複合体の血を抜いたイヌから得たイヌの肺から調製した。洗浄を 含めたすべての操作は、４℃で行い。

分離した材料は一１５°Ｃで貯蔵した。

肺のガスを抜き、洗浄１回あたり１１の緩衝液（５ｍＭトリス塩酸、１００１１ １ＦＩ塩化ナトリウム、　ｐＨ７，４）で３回洗浄した。この緩衝液のＣｏ”７ ｎ度は、５×１０−’Ｍ以下だった（ラジオメーターＦ２１１２　Ｃａ；ラジオ メーク−へ／Ｓ、コペンハーゲン　デンマーク）。洗った肺を集め細胞材料を除 くため１５０　Ｘ　ｇａｖで１５分間遠心した。（サラパルＲＣ２−Ｂ）それか ら、上？Ｒ’／（’ｌをタイプ１５０−ター（ベックマン　インストラメント） を用い２００００　Ｘ　ｇａｖで１５時間遠心した。得らたベレットを、　１． ６４Ｍ臭化す）　ＩＪウムを含む緩衝液に懸濁した。１時間平衡させた後、この 懸濁液を鵠２８０−ターで（ベックマン　インストラメント）　１００１０００ ００Ｘ　、４時間遠心した（ベックマンＬ５−５０Ｂ）。

この薄膜を緩衝液に再び懸濁し、　１０００００　Ｘ　ｇａｖ　、１時間遠心し た（ベックマンＬ５−５０Ｂ）。複合体を含むこのベレットを２回蒸留水で再懸 濁した。

Ｄ、１．ｂ、　！　および１０ｋｄＦ白の１０〜１５■リン脂質／ｍｌの濃度で 水に再懸濁したベレットを５０倍容過剰のｎ−ブタノールに注入した（ジグリス ）、Ｈ。

ら、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ　（１９７７） 　７４　：　１７８−１８４）。

そして、室温で１時間攪拌した。１００００　Ｘ　ｇａｖで２０分間の遠心（サ ーバルＲＣ２−８）の後、以下の述べるように、さらに精製するため、ベレット （これは３２Ｋ　ＡＳＰを含む）を回収する。

上澄液（一層よりなる）は、脂質と、低分子量の蛋白を含んでいる。脂質を得る ため、この上澄液を真空下、４０℃で乾燥した。そして脂質を抽出した。（フォ ルテ、Ｊ、ら、　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ（１９５７）　２２６　：　７１９７ −５０９）。

疎水性蛋白を得るため、ブタノールを除くべく、上澄液をロトバソブにかけた。

ロトバップにかえる前にエタノールを加えさらに乾燥した。この乾燥残留物を０ ．ＩＮ塩酸を含む。

再蒸留したクロロホルムに懸濁した。そして、不溶性物質を遠心で除去した。

得られた溶液をＬｌ＋−２０カラム（ファマチア）でクロマトグラフイーにかけ クロロホルムで展開した。（ＬＨ−２０は、セファデックスＧ−５０のヒドロキ シプロピル誘恵体である；これは。

疎水性のゲルで有機溶媒に対し反応性がない。）この蛋白は。

除去される。脂質／リン脂質をその含まれている部分から溶出した。

ボイドボリュームの分画から、窒素存在下でクロロホルムを蒸発させ、蛋白を得 た。そして、ポリアクリルアミドゲルで、そのサイズを調べた。非還元状態で行 うと、　１６．５ｋｄ、　１２ｋｄおよび１０ｋｄの３つのハンドが得られた。

還元状態では、１０ｋｄ〜１２ｋｄのブロードな単一バンドが見られた。

エドマン分解により、非還元のゲルからの１６．５ｋｄおよび１２ｋｄのバンド のＮ末端分析を行い２次の配列を得た。

１６．５ｋｄ　：　？−Ｐｒｏ４１ｅ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−↑ｙｒ−Ｃｙ ｓ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｌｙｓ−へｒ ｇ−Ｔｌｅ−Ｇｌｅ−へｌａ−Ｍｅｔ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｖａ ｌ−Ｌｏｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−？　−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−１２ｋｄ　：　 ｌ１ｅ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ− 八ｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−１１ｅ４１ｅ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ Ｏ，１，ｃ、　！白のへ百およびＡＳＰ３２ｋＦ白であることのＵ上記のｎ−ブ タノール抽出から得た沈澱を窒素下で乾燥し。

２０ｍＭオクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドを含む緩衝液２０ｍ　ｌで２回洗 った。１０００００　Ｘ　ｇａν、１時間の遠心の後、　（ベックマンＬ５−５ ０Ｂ）　、　このペレットを０．３Ｍショートサリチル酸リチウム、　０．０５ Ｍとリジン（ｐＨ８，４）に氷上で懸濁し９等量の水で希釈した。そして水層と 等量の容積のｎ−ブタノールを混合した。９ｎ−ブタノール水分配の全体は、界 面活性物質の水層中の）農度を低くするためなされた。最後の低い、蛋白を含む 水層を１５時間凍結乾燥し、２ｍｌの緩衝液に溶屑し、　１００１０００００Ｘ 　（ベックマンＬ５−５０Ｂ）で、残っている不溶性の物質を除くため遠心した 。３２３ｎｍでの吸光係数４Ｘ１０’という値（マーチェシ、　Ｖ、Ｔ、および アンドリュス、　Ｅ、　Ｐ、、サイエンス（１９７１）　１７４　：　１２４７ −１２４８）から、最終的なサンプルのショートサルチル酸リチウムの濃度を計 算すると、１０μ門に達しなかった。

このように精製したイヌＡＳＰ３２にアポ蛋白を、上記のように精製された界面 活性脂質で再構成した。再構成された物質は１表面圧押で測定すると表面活性を 持っていた。そのインビボでの生物学的活性は、換気装置上に保ったウサギ胎児 への吸気によって測定された。

Ｄ、１．ｄ、　ｅ血久ｉ盃亘猪裂 前項で得た蛋白分画を５０ｍＭＤ　Ｔ　Ｔを加えた１％ＳＤＤ、５０ｍＭ）リス 塩酸、１ｍＭＥＤＴＡのｐＨ７，５溶液と、３７℃で１時間インキュベートする ことにより、還元し、　１００ｍＭヨードアセトアミド（シグマ）で０℃、３０ 分間アルキル化した。そしてレムリー、　Ｕ、　Ｋ、、ネイヂャ−（１９７０） 訂７　：　６８０−６８５の方法でポリアクリルアミドゲルを電気泳動した。４ Ｍ酢酸ナトリウム溶液にこのゲルを浸すことによって蛋白は見えた。そして、　 ３２ｋｄのバンドをカミソリの刃で切り出し、バンカピラー、ｉ、帽　ら、酵素 学の方法（１９８３）　９１　：　２７７−２３５．ニューヨーク　アカデミツ ク　プレスの方法でＣＢＳサイエンティフィック（デルマール　カリフォルニア 州）エレクトロリュージョン装置で電気溶出した。

溶出した蛋白を凍結乾燥し、そのＮ末端のアミノ酸配列をＩｎｍｏｌの蛋白から 、アプライド　バイオシステム４７０Ａゲル〜フエーズ　シーケンサ−（アプラ イド　バイオシステム社、フォスター市、ＣＡ）を用い、メーカーの指示に従っ て決定した。ＰＴＨアミノ酸は、　０．４６Ｘ２５ｃｍ　Ｉ　Ｂ　Ｍ　ＣＮ−カ ラムを使って、ベックマン３３４ＴＨＰＬＣで同定した。用いた勾配は、バンカ ピラー、　Ｎ、　Ｗ、、およびフード、　Ｌ、　Ｅ、、酵素学の方法（１９８３ ）　９１　：　４８６−４９２ニユーヨーク　アカデミツクプレスに示された勾 配に次の修整を加えた。２次分の勾配系に代えて、３次分の勾配系を用いた。そ の系では、アセトニトリルとメタノールはセパレートポンプで注ぎ込み、２つの 比は、勾配のプログラムの適当な修整を行いながら勾配の過程全体の時間によっ て変化させた。パーマフェーズＥＴ１１’ガードカラムに代えて、”５ＸＯ０４ ６ｃｍｌＢＭ　ＣＮ″アナリティカル“ミニ−カラム”を用いた。そして、その カラムは、３２°Ｃよりむしろ２８℃に加熱した。

（以下余白） Ｎ末端のアミノ酸配列は。

１１ｅ−Ｇｌｕ−へｓｎ−へ５ｎ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−八５ｐ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ− Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｈｙｐ−Ｇｌ　ｙ−Ｉ　ｌｅ−１１ｙｐ−Ｇ　１ｙ− Ｔｈｒ−ｔｌｙｐ−Ｇ　Ｉｙ−３ｅｒ−１１１ｓ−Ｇ　１ｙ−Ｌｅｕ−１１ｙｐ −Ｇ　撃凵| Ａｒｇ−？−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−？−Ｇ１ｙ、−Ｖａｌ、　。

“１ｌｙｐ　”は、修飾されたアミノ酸ヒドロキシプロリンを示す。

イヌの３２に蛋白のアミノ酸組成のデータは、　Ｇｌｙ−Ｘ−１ｙｐのコラーゲ ンに似たパターンで推論された配列（以下を見よ）中のプロリン残基のヒドロキ シ化と矛盾しないとヒドロキシプロリン含有量を示す。このパターンはヒトのＮ 末端の配列も示しているので、イヌのデータよりの類推によって、多分。

同様に処置されたヒトの配列中のプロリンは、ヒドロキシ化されている。

コラゲナーゼ処理されたイヌＡＳＰの精製および配列決定により、プロセッシン グに関する情報が得られた。

精製したイヌのＡＳＰをバクテリアのコラゲナーゼ（ウォーシングトン　フリー ホールド　ＮＪ）で酵素：基質がに１の比の５ｍＭ）リスｐｌ！　？、４．　５ ｍＭ　ＣａＣ１，中、３７°Ｃで分解さした。

これで、　２２Ｋｄの限定分解産物の生成物をＳＤＳゲルで分析した。

この２２Ｋｄのハンドをゲルから電気溶出し、上記に述べたのと同様のアミノ酸 配列分析にかけた。２つのアミノ酸が各サイクルで同定され１　このことがコラ ゲナーゼ処理がジスルフィド架橋で連結されたままの２つのペプチドを生成する ことを示している。ｃ　ＤＮ　Ａのクローンの配列決定より、２つの配列が完全 な分子中の７８〜１１０および２０３〜２３１アミノ酸に相当すると示し得る。

得られた配列は。

そして、翻訳は完全であり、蛋白のＣ末端が完全であることを示す。

Ｄ、１．ｅ、ヒトのＡＳＰの八−■ ヒト３２におよび、より小さな分子量のＡＳＰを以下の、イヌの蛋白に対し、上 記に記述した方法で、肺胞のプロティノシス（肺に過剰の界面活性物質が存在す る結果性じる症候群）をわずらった患者から、調製した。

（以下余白） ３２ＫＡＳＰは２次のＮ末端配列を持つ。

Ｇｌｕ　−Ｖａ　ｌ−Ｌｙｓ　−Ａｓｐ−Ｖａ　Ｉ−Ｃｙｓ−Ｖａ　ｌ　−Ｇ　 １ｙ−Ｓｅｒ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−１１ｅ−）１ｙｐ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−１１ｙｐ −Ｇｌｙ ヒト配列の３〜１７のアミノ酸は、イヌの３２に蛋白の６〜２０のアミノ酸と、 ９の位置のセリンを除いて正確に一致する。

分離した低分子量の疎水性蛋白は、　１６．５Ｘｄ、　１４Ｋｄおよび１０Ｋｄ に当たるバンドを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に。

非還元状態でかけたときに示される。還元状態では、１０〜１】Ｋｄに相当する ブロードな単一のバンドが得られる。

Ｄ、２．イヌの市のｍＲＮＡの八−１ 全ＲＮＡを成人の肺からチルブラインＪ、　Ｍ、ら、バイオケミストリー　（１ ９７９）　１８　：　５２９４−５２９９の方法で分能した。肺組織を液体窒素 の中で、モーターと乳棒を使って粉砕することにより、粉状にした。そして、６ Ｍグアニジンチオシアネート、　０．０５Ｍ　Ｉ−リス塩酸、　ｐＨ７，００， ＩＭ−β−メルカプトエタノール、０．５％サルコシル溶液中で、ホモジナイズ した。このホモジネートに、　ＣｓＣ１を２．０Ｍ加え、　０．０ＩＦＩエチレ ンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）　、　０．０５Ｍ　トリス塩酸ｐＨ９，０中 の５．７Ｍ　ＣｓＣ１クッションに重層した。このＲＮ　Ａは、　１１５０００ ｘｇ。

１６時間の遠心で、このクッションを通ってベレット化された。

それにより、このＲＮＡは、より高い密度のＣｓＣ１溶液を通って沈降しない細 胞ＤＮＡおよび蛋白から分離される。次いで８こ（７）ＲＮＡを０．ＯＩＭ　ト ＩＪ　ス塩ａｆｐＨ７，４，０，００５Ｍ　ＥＤＴＡ　、　１．０％ドデシル硫 酸ナトリウム（ＳＤＳ）に溶かし、クロロホルムとフェノールの１：１混合液で 抽出し、　７０％エタノールで沈澱させた。このポリアデニル化されたＲＮＡ　 （ポリＡ″ＲＮＡ）の分画をアビブ、Ｈ，，およびレーダー、Ｐ、、プロソクノ トル　アカラド　サイ　（ＵＳＡ）　（１９７２）的：　１８４０−１４’１２ に記述されたようにオリゴ（ｄｉ）セルロースを通すアフィニティークロマトグ ラフィーにより得た。

Ｄ、２０節で調製した成人の肺のポリ　＾”　ＲＮＡを０．４０節で記述したよ うなｃＤＮＡライブラリーを作成するのに使った。

５μｇのｍＲＮＡから、　３００ｂｐ以上のサイズで選択されたＣＤＮＡを約２ ５ｎｇを得た。このライブラリーは、約２００．０００の独立した組み換え体を 含んでいた。それらのうちの４０，０００の組み換え体をニトロセルロースフィ ルター上に置いた。

これらのフィルターは２次のレプリカのマスターとして働く。（ハナハン、Ｄ、 、およびメセルソン門、、ゲーネ（１９８０）−則：　６３−７５の方法による 。） 皿ＬＩ迫］」ニヨセし虹［以及Δ ３つのプローブを作った：次の配列を持つ１〜５のアミノ酸に相補的な２４種の １４量体配列の混合物を作った（プローブａ）： 次の配列を持つ７〜１１のアミノ酸に相補的な６４種の１４量体（プローブｂ） ： そして１種の１５量体で咄乳頚のコドンの好みに基づいて作ったもの５’　ＡＴ ＣＧＡＧＡＡＣＡＡＣＡＣＣ３°　（プローブＣ）。各オリゴヌクレオチド混合 物および、１つの特有なオリゴヌクレオチドをバイオサーチＳＡＭオリゴヌクレ オチド　シンセサイザー（ハ゛イオサー千社、サン　ラフアニル　Ｃ八）で、エ フイモ７、　Ｖ、　Ａ、、　３７−？Ｌ＝−（！Ｉ　７’ｚ＝　）’　ＩｙＺ　 （１９８２）　１０　：　６８７５−６８９４に記述の濃縮剤と同じ濃縮剤とし てＮ−メチルイミダゾールの存在下で、メシチレンスルホニルクロライドを使い 標準トリホスホエステル法の修整によって合成した。

ハイブリダイゼーションには、　ｘｉｘレプリカフィルターをそれぞれのマスタ ーフィルターから調製した。それは、各コロニーを複製中で、おのおの２つのオ リゴヌクレオチドプローブを用いスクリーニングし得るようにするためである。

このマスターフィルターを複製した後２回収したコロニーを１７０Ｍｇ７ｍｌの クロラムフェニコールを含む寒天プレート上に。

１８時間おいた。次いでこのコロニーをハイブリダイゼーション用にグランステ ィン、門、、およびホゲネス、Ｄ、、プロノクナトル　アカ・７ド　サイ　（１ ９７５）ｎ＝３９６１−３９７２の方法に従って調製した。このフィルターを真 空下にて８０℃で２時間焼き１次いで、大量の３ＸＳＳＣ（ＬＸＳＳＣは、　０ ．１５Ｍ　ＮａＣ１゜０．０１釘クエン酸ナトリウム、　ｐｌ！　７．５）　、 　０．１　％ＳＤＳ中で振盪した。このフィルターを５．Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ，０， １％ＳＤＳ、、１ｍＭＥＤＴＡ、５Ｘデンハルドン容？皮（０，１％フィコル、 ０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ウシ血清アルブミン）　０．０５％ビ ロリン酸ナトリウムおよび５０Ｍｇ／ｍｅ変性させたサケ精子ＤＮＡ中で、４２ ℃で最近２時間プレハイブリダイズした。

次いで、複製のフィルターをフィルターあたり、５Ｘ１０６ｃｐｍの３２ｐでラ ベルしたオリゴヌクレオチドプローブ（マニアティス、Ｔ、ら、モレキュラー　 クローニング、　（１９８２）コールド　スプリング　ハーバ−ラボラトリ−ｐ ｐ、　１２２−１２３に従ってリン酸化した。）の１つで、プレハイブリダイゼ ーショ溶液と同一の成分を含むハイブリダイゼーション溶液１０ｍｒ中において 、ハイブリダイズした。フィルターをオリゴヌクレオチドプローブａ、ｂおよび Ｃとともにそれぞれ３７°Ｃ３４５℃および４１”Ｃでハイブリダイズした。１ 時間後、プローブａは２８℃に、プローブｂは３７゛Ｃに、サーモスタットの温 度を下げ、その後、バスを平衡させた。プローブＣとフィルターは低い温度でハ イブリダイズしなかった。このフィルターを６ＸＳＳＣ，０，１％ＳＤＳによっ て、室温で１５分間かけて２回洗浄した。それから５ｘ３ＳＣ０，１％ＳＤＳに よって、３７℃。

４５°Ｃおよび４１°Ｃでそれぞれプローブａ、ｂおよびＣを２分間洗浄した。

この最後の洗浄温度は、サノグスＳ、　Ｖ、ら、精製された遺伝子を用いる発生 生物学（Ｄ、　Ｄ、ブラウンおよびＣ０Ｆ、フォックス著）、アカデミツクブレ ス、　ＮＹ、　ｐｐ、６８３−６９３の経験式、　Ｔｄ＝　４　（Ｇ＋Ｃ）　＋ 　２　（Ａ＋Ｔ）から得た。それから、ハイブリダイズフィルターを乾燥し、コ ダノクＸＡＲフィルム上に、デュポン　クロネソクス強化スクリーンで、完全な 露光が得られるまでオートラジオグラフした。

もし、コロニーが複製で、３つのすべてのオリゴヌクレオチドプローブと、また はａ、ｂ両方のプローブとハイブリダイズすれば、そのコロニーはポジティブと 言えた。数種の潜在的なポジティブクローンのうち、１つは、他と比べてより強 くプローブａ、ｂとハイブリダイズした。このクローンのシーケンスにより、そ れが、イヌの３２ＫＡ　Ｓ　Ｐの配列の一部をコードしていることがわかった。

それをＤＳ−１と名付け、３２にイヌＡＳＰ全体を得るのに使った。

３７５ｂｐの精製されたＤＮＡ挿入を制限酵素Ｐｓｔ　Ｉ　’Ｔ：　ｐＤｓ４か ら切り出し、スモールミニブレツブ法（マニエーティスラ。

前出Ｐ３６６）を用いて調製し、アガロースゲル上で分離した。

次いで、このＤＮＡ挿入全体をバクテリオファージＭ１３にサブクローニングし くメソシング、Ｊ、、およびヴイエイラ、Ｊ、。

遺伝子（１９８２）肥：　２５９−２６８）。サンガーＦ、ら、ブロックナトル 　アカラド　サイ　（ＵＳＡ）　（１９７７）　７４　：　５４６３−５４６９ のジデオキシ法でシーケンスした。その配列は、およそ３００アミノ酸蛋白のＮ 末端部分をコードしていた。すなわち、Ｄ。

１、節の精製したイヌのＡＳＰ蛋白から決定したＮ末端アミノ酸配列３２残基、 および１０１のその下流のアミノ酸をコードしていた。それはまた、　５ｏｂｐ の５′不翻訳領域を含んでいた。

イヌのＡＳＰ配列全体をコードするのに充分な長さの配列の存在を決定するため 、ノーザンブロソトによりｍＲＮＡプールの評価を行った。ハイレイ、　Ｊ’、 　Ｍ、およびダビソドソン。

Ｎ、、アナル　ハイオケム（１９７６）互：　７５−８５．の方法で、メチルメ ルクリンクハイドロキシドを含む１．４％アガロースゲルで電気泳動し１分画し た後、二ツクトランスレーションしたＤＳ−１挿入ＤＮＡを使って、　Ｄ、５． 節のポリＡ”ＲＮＡをノーザンブロソティングにかけた。プローブにハイブリダ イズしたｍＲＮＡは１８００〜２０００ヌクレオチドの長さで、コーディングシ ーケンスに必要な約７００ヌクレオチドより明らかに大きかった。

それゆえ、このＤＳ−１挿入プローブをオリジナルフィルターの１つの複製セン トの再スクリーニングに用いた。そのフィルターは、残存するオリゴヌクレオチ ドプローブを除（ため１００℃で１０分間処理した。０．７５Ｍ塩化す１−リウ ム、　０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム、５０％ホルムアミド、０．５％ＳＤＳ 、０．０２％ウシ血清アルブミン、　０．０２％フィコール−４００，０００、 ０，０２％ポリビニルピロリドン、０．１　％ビロリン酸ナトリウム、５０＃ｇ ／＋ｍｊ！酵母ｔＲＮＡ、５０μｇ　／ｍｇ変性切断サケす子ＤＮＡ中で、フィ ルターを４２℃にて１８時間プレハイブリダイズさせた。ｌ　ｍｌの新鮮なハイ ブリダイズーしヨン緩衝液あたり、５え、その緩衝液中でフィルターを４２℃で １６時間インキュベートした。それから、フィルターを０．０３Ｍ塩化ナトリウ ム、　０．００３Ｍクエン酸ナトリウムおよび０．１％ＳＤＳで２回、それぞれ ５０℃にて３０分間洗浄し、−晩オートラジオグラフィーのため露光した。さら に、２つのクローン、　ＤＳ−４およびＯ５−３１が同定され、それは、　ＤＳ 〜１同様だいたい１７００ｂｐからなっている（第１図）。

ＤＳ−４およびＯ５−３１もまた、　Ｐｓｔ　Ｉを使って切り出し、　Ｍ１３ｍ ｐ９にサブクローニングし、そしてサンガー、Ｆ、（前出）の方法に従ってグイ デオキシシーケンスにより配列決定した。この生体の配列は、２つの内部Ｐｓｔ ｌサイトを持っていた。正しいシーケンスであることの確認は、第１図に示した 。推論される内部の制限サイトから得たフラグメントのダイデオキシシーケンス によって得た。２５６コドンのオーブンリーディングフレームから推論されるＡ ＳＰのアミノ酸配列を含む全ヌクレオチド配列を第１図に示す。

イヌのｌ０ＫＡＳＰをコードするｃ　ＤＮＡ咄乳類のコドンの好ましい表をコド ンの選択に用い、　１６．５Ｋｄ蛋白のＮ末端配列に相当する２つのオリゴプロ ーブを作った。プローブ■１９８は３６量体の配列５　’　−ＧＧＴＣＡＣＡＧ ＣＣＡＧＧＣＣＣＴＴＧＧＧＧＡＴＣＡＴＧＧＣＣＴＧＧＡＴ−３”であり、プ ローブ１１９９は４５量体の配列テア−）　タ。５’　−ＣＴＴＧＡＴＣＡＧＧ ＧＴＴＣＴＧＣＡＣＡＧＣＣＡＧＣＡＧＴＡＧＧＧＣＡＧＧＧＧＧＡＴＧＧＧ− ３°両方をカイネシングによってｚｚｐラベルした。

ハイブリダイゼーションのため、このフィルターを真空下で、８０゛−こて２時 間焼き、０．１％ＳＤＳを含む火星の３ＸＳＳＣ中で６８°Ｃにて４時間振盛し 洗浄した。６ＸＳＳＣ，５ｘデンハード、２０％ホルム７　ミｆ’、　０．１　 ％Ｓ　Ｄ　３．　１００μｇ　／ｍｅの切断変性サケ精子ＤＮＡ中で、４２℃に て数時間、このフィルターをプレハイブリダイゼーションした。１３ｎｇ／ｍ　 （！のプローブ１１９８または１６ｎｇ／ｍ　（！のプローブ１１９９を含む、 上記の緩衝液中で、複製フィルターを、最初は６８℃で２次いで４２゛ｃで一晩 ハイブリダイスシタ。６ＸＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ、０．０５％ピロリン酸ナト リウム中で、　１５分間室温で２回フィルターを洗浄した。それから６５°Ｃで ５分間同じ緩衝液で洗浄した。

その後、乾燥し、オートラジオグラフィーをした。

スクリーニングした４０，０００クローンのうち、８つが双方のプローブにハイ ブリダイズした。そして、それの制限分析を行った。組み合わせると１５２０ヌ クレオチドになる２つの重なったクローンをシーケンスした。結果は第２図に示 す。矢印は、成熟した１６．５Ｋｄ蛋白の開始点を示す。

Ｄ、４．旦ト　３２ＫＡＳＰ’　云ニーのｊＬＭ−バクテリオファージシャロン 　２８　（Ｉｌｉｍｍ、　Ｄ、　Ｌ、、　ｅｔ　ａｌ。

Ｇｅｎｅ　（１９８０）　１２　：　３０１．−３１０）は、　Ｔ、　Ｍａｎｉ ａｔｉｓ博士、バーバード大学から得た。Ｅｚｃｏｌｉ　Ｋ２Ｏ２で約１．５　 Ｘ　１０’のファージを増殖させ、溶菌したプラークをＢｅｎｔｏｎ、　Ｗ、　 Ｄ、、　ｅｔ　ａｌ。

５ｃｉｅｎｃｅ　（１９７７）ユ９６　：　１８０−１８２に記載のニトロセル ロースフィルターに移した。フィルターは、　Ｒｉｇｂｙ、　Ｐ、　Ｗ、　Ｊ、 、　ｅｔａｔ、　Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　（１９７７）旦３　：　２３７−２５ １の二ツクトランスレーション法によりリン酸化されたＤＳ−１ｃＤＮＡでプロ ーブした。フィルターを４２°ｃ、１時間で、ハイブリダイゼーション緩衝液（ ０，７５Ｍ　ＮａＣｌ、　０．７５Ｍ硝酸ナトリウム、４０％ホルムアミド、　 ０．０５％ＳＤＳ、０．０２％ウシ血清アルブミン、　０．０２％フィコール− ４００，０００、０，０２％ポリビニルピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリ ウム、５０Ｍｇ／ｍｊ！醇母ｔＲＮＡ、５０μｇ／　ｍＡの変性し切断したサケ 精子ＤＮＡ）で前洗浄した。新しいハイブリダイゼーション緩衝液Ｌ　ｍｌあた り５　ｘｉｏ５ｃｐｍプローブを加え、フィルターを３７°Ｃで１６時間、この 緩衝液で保温した。次いで、これを０．４５Ｍ　ＮａＣ１，０，０４５Ｍクエン 酸ナトリウムおよび０．１％ＳＤＳで５０℃で２回洗い、−晩オートラジオグラ フィーにかけた。ＤＳ−１ｃＤＮＡにハイブリダイズする配列を含む可能性のあ る６つのクローンを得た。最も強くハイブリダイズするクローン、　ｇｌｌｓ− １５，を調べた。

ｇＩＩＳ−１，５の７００ｂｐ　ＥｃｏＲＩ断片がＤＳ−１プローブとハイブリ ダイズし、配列分析に選ばれた。このＥｃｏＲＩ断片を精製し、　Ｍ１３ｍｐ９ の中に挿入して配列決定したところ、対応するイヌの配列と相同性があることが わかった。全ヒトコード領域は、５゛側の１．２Ｋｂ断片と３゛側の３．５Ｋｂ 断片との２つの隣接するＢａｍＨＩ断片を含んでいた。両方の［ｌａｍＨＩ断片 をＭ１３ｍｐ８のＢａｍ１１１部位に各々、サブクローン化し、配列決定した。

付加的な断片は。

第３図に示す手順に従って同様に配列決定された。配列情報は、製造業者の指示 に従って、いろいろな遺伝情報（パロアルト、　ＣＡ）コンピュータープログラ ムを使用して分析された。シグナルペプチド、前駆体配列および成熟アポ蛋白を 含む領域はイヌＡ　Ｓ　Ｐ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａと比較することで同定した。配列分 析から、遺伝子の５゛末端は１．２Ｋｂ　Ｂａ１Ｉ＋旧断片内にコードされてお り、３゛末端は３．５Ｋｂ　Ｂａｍ旧断片内にコードされている。遺伝子は、　 １．２Ｋｂ　ＢａｍＨＴ断片の最初のｂｐを１とした時の１２１８ｂｐ、　１６ ５１ｂｐ、そして２４８２ｂｐの３つのイントロンによってさえぎられている。

推定されたヒ１−ＡＳＰ蛋白のアミノ酸配列を含む全配列を第３図に示す。

Ｄ、５．見上」駄人盈ヱ■発咀 全ヒトＡ　Ｓ　Ｐ遺伝子を含む約１６Ｋｐの挿入を持っているものとしてり、５ 節で同定されたｇＨ３−１５車離’ファージは、　ｐＳＶ２：ＮＥＯとともに形 質転換によって、１０％ウシ胎児血清を含むマツコイ５八培地で増殖させたＣ　 Ｈ○細胞内に移された（Ｓｏｕ　ｔｈｅｒｎ　。

Ｐ、、　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ　Ｍｏｌ　Ａ　Ｉ　ＧｅｎｅＬ　（１９８２）上：　 ３２７−３４１）　、このプラスミドは、咄乳動物細胞に有毒であるネオマイシ ンアナログＧ１４８に対する耐性を与える機能遺伝子を含む。形質転換において 、λ：ｇｌ１５４５１５Ｍｇ　（！：ｐＳＶ２：ＮＥＯ２，ｃ＋ｇが、　Ｗｉｇ ｉｅｒＭ、、　ｅｔ　ａｌ、　Ｃｅ１ｌ　（１９７９）　１６　：　７７７−７ ８５の方法に従って。

リン酸カルシウム／ＤＮＡ共沈澱でＣＨＯ細胞の１００龍皿に加えられた。

これには、ＤＮＡにさらした４時間後の、２分間の１５％グリセロール“ショッ ク”が含まれる。細胞は１μｇ　／ｍｅ　６４１８を含む培地に移し、　１００ 　＋ｕ皿あたり約５０個の安定な形質転換体が得られた。

標識する前に、安定な形質転換体を、　０．２５ｍＭアスコルビン酸を添加した 培地で培養した。安定な形質転換体の２つのプールとＣＨＯ細胞で処理していな い１つのプールとを１通常の１７１０のメチオニン濃度を含む培地で１時間培養 し９次いで８〜１６時間、３５Ｓ−メチオニンで標識し、　”５−ｎｅｔで標識 した全分泌蛋白をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した。結果を第 ４図に示す。通常のＣＨＯ分泌蛋白をレーン１に示す。λ：ｇＨＳ−１５分泌蛋 白をレーン２と３に表す。

その両方ともが１発現されたＡＳＰ蛋白に相当する付加的な３０〜３６Ｋｄの蛋 白を持っている。３０〜３６Ｋｄ蛋白の同一性をさらに証明するために、イヌＡ ＳＰ抗体で全分泌蛋白標品を免疫沈降させることができる。ベクターλ：ｇｔｌ Ｓ−１５は１９８４年１２月７日にＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒ ｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎに寄託され、　ＡＴＣＣ４０１４６で受理された。

Ｄ、６．３２におよびＩＯＫの正目に、　るヒトｃＤＮＡクローン傅淵Ｍ ヒ　ト３２ＫＡＳＰ ヒト肺を２２週間目と２４週間目の２胎児から得た。最初に７ｇの肺組織を液体 窒素で凍結させ、モーターですりつぶし粉粒にした。そして全ポリＡ’ＲＮＡを り、２１節（前出）の方法で調製した。

ｃＤＮＡライブラリーをＣ，４節で述べた方法でｍＲＮＡから調製した。５μｇ の肺ポリ　１Ｎ″　ＲＮ　Ａから約２５ｎｇσ）（：ＤＮＡができ、　５００　 塩基対辺」−）も０’）カＵＩＲすり、　３００，０００　ノ個々の組み換え体 ライブラリーを得た。

ヒｈ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリーの６０．０００個を、遺伝子ライブラリーの スクリーニングのためＱこ上で述べた方法で、イヌＤＳＩＣＤ　Ｎ　Ａでスクリ ーニングした。＆Ｉ’ｌみ（桑え体ニア０−一は、２（■のレプリカに対してマ スターとなる二１−ロセ／ｌ／　ｌ：ｌ−スフイルターの上に置かれた。コロニ ーフィルター；：　、　次ｐ　ｓでＧｒｕｎｓｔｅｉｎ　；”：＋、、　ａｎｄ 　Ｉｌｏｇｎｅｓｓ、　Ｄ、（前出）の方法に従ってハイブリダイゼーションの ために調製された。フィルターは、真空下、８０°Ｃで２時間焼き、大量の３ｘ ＳＳＣと０．１％ＳＤＳで振盪しながら６８°Ｃで４時間洗浄した。次に、フィ ルターを０．７５Ｍ　ＮａＣ１゜０、Ｑ７５Ｍｆｉｉ’ｉ酸ナト’Ｊ　ラム、　 ４０％ホＪｌｚム７　ミｔ’、０．５％Ｓ　ＯＳ。

０．０２％ウシ血゛清アルブミン、　０．０２％フィコール−４００，０００。

０．０２ポリビニルピロリドン、５０Ｍｇ　／ｍＱｓ’ｉ母ｔＲＮ八、５０．へ ｇ／　ｍｌの変性、切断したサケ精子ＤＮＡで、１８時間３７°Ｃでプレハイブ リダイゼーションした。新しいノλイブリダイゼーシシン緩街液１ｄあたり、１ 　ｘｔｏ６Ｃｐｍの３２Ｐ−標識０３−１ブローフ゛を加え２次いで３７℃で１ ６時間保温した。次Ｑこフィルターを０．４５？１ｊｌａｃＩ、　０．０４５Ｍ クエン酸ナトリウムおよび０．０１％ＳＤＳで２２回、各々５０℃で３０分間洗 い、−晩、オートラジオグラフィーにさらした。

１個の正にハイブリダイゼーションしたクローン、　Ｈ３−６゜は、さらに塩基 配列決定によって分析された。Ｉｔｓ−６は、　Ｐｓｔ　１切Ｉ析によってベク ターから放出され得、また内部Ｅｃｏ［部位を有する。　１．２Ｋｂ挿入断片を 持っている。挿入断片からの両Ｐｓｔ　１ＥｃｏＲＩ断片が、　Ｍ１３ｍｐ８と ｍｐ９のＰｓｔ　１ＥｃｏＲ丁部位にり“ブク［フーン化され１部用的な配列が 得られた。配列決定された２００ｂｐを越えろ部））′Ｊがｇｌｌｓ−１５の３ ゛　−末端に完全に対、応した。Ｈ３−６のヌクレオチド配列を第５図に示す。

Ｉｔｓ−６ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ挿入断片はＡＳＰｍＲＮへの３゛　−末Ｖ：’ｊ　領 域のみしか含んでいないので、プローブとしてＩｔｓ−６を使用して残りのクロ ーンを表面活性物質の隣接配列を捜すためにスクリーニングした。ライブラリー の残りにクローンは見つからなかった。

ヒト３２ＫＡＳＰをコードしている完全なｃＤＮＡを得るために、成人の肺から 、無秩序に入れたｃＤＮＡを調製し、　Ｈｕｙｎｈ。

Ｔ、、　ｅｔ　ａｔ、　ｃ　ＤＮＡ　Ｃ１ｏｎｉｎ　Ｔｅｃｈｎｉ　ｕｅｓ：　 Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａ　ｒｏａｃｈ（Ｇｌｏｖｅｒ、　ｏ−＋　ｅｄ）　 ｉＲＬ、　０ｘｆｏｒｄの方法によってＥｃｏＲ［リンカ−を使用してバクテリ オファージベクターｇｔｌＯにクローン化した。成人の肺は、胎児の肺細胞に比 べてＡＳＰ転写物に富んでいる（私たちの観察による）ので、完全なＡＳ　Ｐ　 ｃ　ＤＮＡを得る頻度を非常に上げる。

ファージプラークは、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ，０，０５％ＳＤＳ、５ Ｘデンハート、ｔＲＮＡおよびサケ精子ＤＮＡ中、１６時間、４２“Ｃで　３２ ｐで標識されたｐ＋ｌ５−６挿入断片の５Ｘ　１１０−５ｃｐ／　ｍｅを使い、 スクリーニングした。フィルターを０．２Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ，０，１％ＳＤＳで、 各々３０分間、５０℃で２回洗い、乾燥させ、オートラジオグラフィーにかけた 。

２つの正にハイブリダイズするクローン（ｐＨｓ−２およびｐ）Ｉｓ−５と称す る）が単離された。各々は、３２ＫＡＳＰの全コード配列と、５゛の非翻訳領域 のほとんどを含んでいた。各々は。

はとんどの３゛　−非翻訳領域を含むＩｔｓ−６と重なった。各クローンの３” 末端はコード領域内のＥｃｏＲ１部位に対応する。

ヒトｌ０ＫＡＳＰ ラムダｇｔｌＯ中の同じｃ　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリーを、前述のように、４０％ ホルムアミド、５ｘＳＳＣ，０，０５％ＳＤＳ、５ｘデンハート。

５０ｐｇ／−酵ｆｌｔＲＮＡ、および５０ｐｇ／ｍ６サケ精子ＤＮＡ中、３７° Ｃで１６時間、先のイヌクローンｐｏｌｏに−１１ＸＩＯ６ｃｐｍを使用して、 ニトロセルロースフィルターでスクリーニングした。フィルターを、２ｘｓｓｃ 、ｏ、ｔ％ＳＤＳで３０分間。

５０℃で２回洗浄し、乾燥させ、オートラジオグラフィーにかけた。４０，００ ０プラークのうち２つが正のクローンで、そのうちの１つ、　１．５Ｋｂの挿入 を含むラムダ）１１０に−１と名付けられたものを、配列決定のために選択した 。仮の部分配列の結果を第６図に示す。下線部分のアミノ酸残基は、イヌの蛋白 と相同性があることを示している。

Ｄ、７．発現さＬ又二Ω且簗 咄乳動物細胞におけるゲノム上ｌ−３２ＫＡＳＰコード配列の発現に対して安定 なベクターを、これはイントロンを含むＤＮＡをプロセシングできるものである が、構築した。Ｋａｒｉｎ＋Ｍ、、　ｅｔ　ａｌ、　Ｎａｔｕｒｅ　（１９８２ ）　２９９　：　７９７−８０２で述べられているように２発現はメタロチオネ インｎ　（ＶＴ　ＩＩ　）制御配列によって制マ卸される。

宿主ベクターｐＭＴは、プロモーターをｐＵｃ８と連結することによって得られ た。

ｈＭＴ　Ｕ遺伝子を運ぶプラスミド８４１１　（Ｋａｒｉ、　Ｍ、、　ｅｔ　ａ ｌ、（前出））をＢａｍ旧で完全に切断し、エギソヌクレアーゼＢａｔ−３１で 処理して終止ヌクレオチドを取り除き１次いでｌ１ｉｎｄＩ［Ｉ切断をおこなっ て−７６５から＋７０のｔ＋ＭＴＩＩ遺伝子ヌクレオチド（転写される最初のヌ クレオチドを＋１とする）を含む８４０　ｂの断片を遊離した。８４０ｂｐ断片 を単ぬｌシ、　ｌｌ１ｎｄｌＩ［／旧ｎｃＩＩ切断ｐＵＣ８（Ｖｉｅｉｒａ、　 Ｊ、、　ｅｔ　ａｔ、　Ｇｅｎｅ　（１９８２）　１９　：　２５９−２６８　 ）と連結し、この連結混合物をＥ、ｃｏｌｉ　ＭＣｌ０Ｃ）１へ形質転換した。

９Ｍ’Ｔの正しい構築物をジデオキシヌクレオチドシーフェンスによって確認し た。

さらに、Ｃ末端制御シグナルを含むｐＭＴの誘導体、　ｐＭＴ−Ａｐ。

が調製された。ｐＭＴ−Ａｐｏは、３゛末端制御シグナルを含むヒト肝臓蛋白Ａ ｐｏＡ、　Ｊ伝子の一部（Ｓｈｏｕｌｄｅｒｓ、　Ｃ，Ｃ，、ｅｔ　ａｌＮｕｃ ｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ；　（１９８３）　１１　：　２８２７−２８３７ 　）を持っている。ＡｐｏＡ、遺伝子のＰｓｔ　Ｉ　／Ｐｓｔ　Ｉ　２．２Ｋｂ 断片（平滑末端）をｐＭＴポリリンカー領域のＳｍａ　Ｉ　部位にクローン化し 、　ＢａｍＨＩ切断でＡｐｏＡ、遺伝子のほとんどの部分を取り除き、クレノー で平滑末端にし、　Ｓｔｕ　Ｉで切断し、再連結した。ジデオキシジクエンス分 析法によって確かめると、得られたー・フタ−は。

３′末端からざっと５００ｂｐの＾ｐｏＡ　＋　ａ転子を含んでいる。

ヒトＡＳＰ遺伝子、　ｐｈｉおよびｐＭＴ−Ａρ０発現発現ベクタ一つの構築物 は、　ｇａｓ−１５の１．２Ｋｂと３．５ＫｂのＢａｍ１ｌｌ断片を使用して調 製された。すべての構築物は単＾１ｔされ制限分析とジデオキシジクエンスとの 両方によって確認された。これらの構築物は９以下のようにして調製された。

１．１．２Ｋｂと３．５ＫｂのＢａｍ１ｌ！断片をｐｑＴのＢａｍ１１１部位に クローン化してｐＭＴ：ｇｌｌｓを得た；２、１．２Ｋｂ　Ｂａｍ１ｌｌ断片を 旧ｎｆ　Ｉ　（９５０位置）で切断することによって５゛末端で断ち切り、クレ ノーで埋めた。切断された断片を３．５Ｋｂ断片とともにｐＭＴのＢａｍｔ１１ 部位へクローン化して、　ｐＭＴ：ｇＨＳ（Ｈｉｎｆ　Ｉ　）を得た；３、第２ 節の断片を代わりにｐＭＴ−ＡｐｏのＢａｍｌｌＩ部位にクローン化して、　ｐ ＭＴ−Ａｐｏ：ｇＨＳ　（Ｈｉｎｆ　Ｉ　）を得た。

４、３．５Ｋｂ　ＢａｍＨＴ断片をＥｃｏＲＩ　（３４３４４３４位置断するこ とによって、３゛末端を断ち切り、クレノーで埋めた。この切断された断片を、 上記のｌｌ１ｎｆＩで切断した１、２Ｋｂ切断片とともにｐＭＴ−＾ｐｏのＢａ ｍＨ１部位へクローン化して、　ｐＭＴ−Ａｐｏ：ｇＨｓ（Ｉｌｉｎｆ　Ｉ　／ ＥｃｏＲＴ　）を得た。

５、１．２Ｋｂ断片を３５６位置のＢｓｔＥＩＩ部位で切断し、　３．５Ｋｂ断 片を４０２４０２４位置ｔＥＩｒ部位で切断した。これらの断片をｐＭＴ−Ａｐ ｏのＢａｍ１ｌ　１部位にクローン化して、　ｐＭＴ−Ａｐｏ：ｇｌｌｓ（Ｂｓ ｔＣＩ［）を得た。

得られたｐＭＴ：ｇｌｌｓ構築物を　ｆｆ５Ｓ−メチオニンとともに１０−’Ｍ ＺｎＣ１ｚを加える以外は、Ｄ、６節の方法でＣＨＯ細胞に移し。

メクロチオネインプロモーターを誘導し、産生された蛋白を１１費識した。

８〜１６時間後、イヌのＡＳＰ抗体で免疫沈降する”Ｓ　−ｍｅｔ標識全分泌蛋 白を培地中で分析した。非免疫１ｇＧが対照として使用された。

０．８　発１υＬｍ化 発現の条件を最適化し、　ＳＶ４０ウィルスのエンハンサ−を含む付加的な発現 ベクターを、ＣＨＯ細胞中の発現量の増加のために、用いた。３つのベクターを 用いた：これは、上記の。

そして以下でさらに特徴を述べるｐＭＴ−Ａｐｏ：（ＨＩＩＳ（Ｂｉｎ　ｆ／Ｅ ｃｏ　Ｒ１）　。

そして下記のように構築したｐＡＳＰｃ−５ν（１０）とｐＡｓＰｃｇ−５Ｖ　 （１０）である。

孟彰ヱと３並：」１１Ｕ企ｙｙ− ＭＴ−ＩＩプロモーターに発現可能なように連結したＳＶ４０エンハンサ−を含 む宿主発現ベクターを得るために、　１１００ｂｐの５ｖ４０ＤＮＡ断片をｐＭ Ｔ中のＭＴ−ＩＩプロモーター配列の上流の旧ｎｄ■部位に挿入した。このＳＶ ４０　Ｄ　Ｎ　Ａ断片はＳＶ４０の複製オリジンにわたっており、ヌクレオチド ５１７１から５２４３まで（オリジンにおける）、つまりヌクレオチド１０７− ２５０からの重複した７２ｂｐの繰り返しを含んでいる。これは、オリジン側に 後期ウィルスｍＲＮＡの５゛末端を含む、ヌクレオチド１０４６まで続いている 。

このｌ１ｉｎｄ　ｍ　１１００ｂｐ断片はＳＶ４０のＤＮＡの旧ｎｄｎＩ分解か ら得られ（Ｂｕｃｈｍａｎ、　Ａ、　Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、ＤＮＡ　Ｔｕｍｏｒ　 Ｖｉｒｕｓｅｓ、　２ｎｄｅｄ（Ｊ、Ｔｏｏｚｅ、　ｅｄ）　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ ｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（’１９８ １Ｌ　ｐｐ、　７９９−８４１　）　、増幅のためにｐＢＲ３２２にクローン化 する。クローニングベクターを旧ｎｄｌＩＩで分解し、ゲル電気泳動により１１ ００ｂｐＳＶ４０　Ｄ　Ｎ　Ａ断片を分離し、　ｌ１ｉｎｄｌＩ！　”分解しＣ ＩＰ処理したｐＭＴに連結した。その結果得られるベクター、　ｐＭＴ−３Ｖ　 （９）とｐＭＴ−３Ｖ　（１０）　、はＭＴ−ＩＩプロモーターの前に断片を逆 方向で含んでいる。ｐＭＴ−３Ｖ（９）では、エンハンサ−は５゛側のｍ　ＲＮ 　Ａ開始部位から約１６００ｂｐ離れており、逆方向のものでは、５゛側のｍ　 ＲＮ　Ａ開始部位から約９８０　ｂｐ離れている。

両方向ともに発現可能であるが、エンハンサ−配列が開始部位に近い方の向きの 方がより高い発現量を与える。

ｐＡＳＰｃ−３Ｖ（１０）　：　Ａ　Ｓ　Ｐのコード配列を、宿主ベクターｐＭ Ｔ−５Ｖ（１０）の上記のように修飾した形のものに挿入した。最初に５００ｂ ｐのＡｐｏＡＩ断片は、この断片の分離により、　ｐＭＴ−ＳＶ（１０）に挿入 され、　ｐＭＴ−Ａｐｏ（上記）の分解およびＥｃｏ　ＲＩ／Ｒａｍ　ＩＩＩで 分解したｐＭＴ−ＳＶ　（１０）への連結により得られる。修飾したベクターを Ｂａｍ旧で分解し、平滑末端化し、この平滑末端化したＥｃｏ　ＲＩ分解物とし てｐＨ５−５から得られたｃＤＮＡ配列（Ｗｈｉｔｅ。

Ｒ，Ｔ、、ｅｔ　ａｌ　、　Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）　３１７：３６１−３６ ３）に連結した。このｃＤＮＡ断片は５゛の翻訳されない領域に連結したＥｃｏ 　Ｒ１リンカ−から３”の翻訳されない領域に元から存在するＥｃｏ　Ｒｒ部位 まで及ぶ（９００ｂｐ）。この関連したヌクレオチド配列を第７図に示す。ここ で、星印を付けたアミノ酸は、アミノ酸−次配列と、　ｐＭＴ−Ａｐｏ：ｇＨｓ （Ｈｉｎ　ｆ／Ｅｃｏ　Ｒ１）から得られた蛋白の配列との相違を表す。（この 相違はヒトのｃＤＮＡとゲノム配列との間の塩基置換から生じる。）翻訳の開始 は９元の配列と同じく、ヌクレオチド５６からである。

ｐＡｓＰｃｇ−ＳＶ　（１０）　：付加的な修飾は、　ｐＡＳＰｃ−５Ｖ（１０ ）とｐＭＴ−Ａｐｏ：ｇＨＳ　０１ｉｎｆＩ／ＥｃｏＲｒ　）配列を組込むこと により調整された。

プラスミドｐＡＳＰｃ−３Ｖ（１０）をＢａｍ　ＩＩＩとＥｃｏＲＩで分解し１ 分離した大きい方の、断片を、　ｐＭＴ−Ａｐｏ：ｇｌｌｓ　（Ｈｉｎｆｌ／Ｅ ｃｏＲＩ　）のＢａｍ１１１／ＥｃｏＲＩ　（部分）分解により得られたＡＳＰ 遺伝子の３゛部分に連結した。これは１　ヌクレオチド１１５４から始まり、ヌ クレオチド３４３２まで伸びているヒトＡＳＰ遺伝子部分を表し。

これを上記のごと（ＡｐｏＡＩ遺伝子断片に連結した。この構築によりｐＭＴ− Ａｐｏ：ｇｌｌｓ　（Ｈｉｎｆｌ／ＥｃｏＲＩ　）から得られる蛋白と同一の蛋 白が生成する。しかし、これはアミノ酸部位２５．３０および３４がｐＡＳＰｃ −ＳＶ（１０）から得られた蛋白とは異なる。関連する挿入のヌクレオチド配列 を第８図に示す。

ｐＭＴ−Ａ　ｏ：　Ｈ３（ＨｉｎｆＴ／ＥｃｏＲＴ　）ゲノムＤＮＡを含むベク ター、　ｐＭＴ−Ａｐｏ：ｇｌｌｓ　（ＨｉｎｆＩ／ＥｃｏＲＩ　）のために、 エキソン２．３および４とエキソン５の一部を含む、ヌクレオチド９５０からヌ クレオチド３４３２までの遺伝子旧ｎｆＩ／ＥｃｏＲＴ　ｌ！Ｊ′ｒ片として得 られた。Ｗｈｉｔｅ、　Ｒ，Ｔ、らＮａｔｕｒｅ　（１９８５）３１７　：　３ ６１−３６３も参照せよ。この断片を前述のポリアゾニレ−ジョン・シグナルと ポリアゾニレ−ジョン配列を含むヒトＡｐｏＡＩ　３１１伝子　（Ｓｈｏｕｌｄ ｅｒｓ、Ｃ，Ｃ，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ　（１９８３）旦：　２ Ｂ２１−２８３７）の３′末端からの５００ｂｐ断片に連結した。

この完全なＡＳＰをコードするゲノム挿入物を、ＭＴ−ＩＩプロモーターに連結 した形で第９図に示す。

このベクターから：土本来のプレ蛋白（これはソゲナル配列を含む）より２３ア ミノ酸だけ長いタンパクが生成する。この構築では、エキリンｌを欠き、よって 翻訳は１通常は最初のイントロン中にある１本来のプレ蛋白のｍＲＮＡに相補的 なゲノム配列のヌクレオチド９８７から始まるＡＴＧから開始するのであろう。

本来のプレ蛋白の生成において、エキリン１がヌクレオチド１０２２でエキリン ２と連結され、この開始コドンが欠落し、そして翻訳がヌクレオチド１０４６か ら開始するようになる。しかし、この付加的な残基は分泌を阻害しないようであ り１通常の成Ｗ）蛋白が、この修飾した形の遺伝子を発現する細胞から分泌され る。

星箕転且ｑ工段 上述のベクターの各々を用いて１次に述べるようにしてＣＨＯ細胞を形質転換し た：チャイニーズ・ハムスターの卵巣（ＣＨ○）−に１細胞を１０％ウシ胎児血 清を含むＣｏｏｎ’ｓ　Ｆ１２培地およびＤＭＥ　２１培地のｌ：１の混合物か らなる培地で増殖させた。感受性細胞を、目的のベクターとｐＳＶ２：ＮＥＯで 共形性転換した（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、　ｐ、Ｉ　ら、　Ｊ　Ｍｏｌ　Ａ　Ｉ　Ｇ ｅｎｅｔ　（１９８２）上：　３２７−３４１　）　。ｐＳＶ２：ＮＥＯはネオ マイシンノアナログＧ４１８ニ対する耐性を与える機能の遺伝子を含む。典型的 な形質転換では、０．５μｇのｐＳＶ２−ＮＥＯと５μｇまたはそれ以上の発現 ベクターＤＮＡを１００龍皿の細胞に加える。唱ｇｌｅｒ　Ｍ、、らＣｅ１ｌ（ １９７９）　１６　：　７７７−７８５の方法に従って、リン酸カルシウム−Ｄ ＮＡの共沈澱を、４時間ＤＮＡ５こさらした後に１５％グリセロールを含むＰＢ Ｓにより２分間の“ショック”を与えることを含めて、用いた。

要約すれば、細胞を１／１０足で植菌し、−晩培養して２ＸＰＢＳで洗浄し、　 ＣａＰＯ４・ＤＮＡ共沈澱物を含むＱ、５ｍｌ　１ｌｅｐｅｓ−バッファー食塩 溶液中に１５分間置き１次いで１０−の培地を加える。この培地を吸引により除 き、１５％グリセロールを含むＰＢＳに換え、１．５〜３分間置く。このショッ クを与えた細胞を洗浄し、培養培地を加える。ＭＴ−Ｈに制御された発現が誘導 されるまで、この培地は、１０％ＦＢＳを含むＦ１２／ＤＩ’ｌＥＭ２１の１： １混合液を有している。１日ｊＬ　Ｇ４１８耐性コロニーのプールを得るために 、細胞に１　ｒｒｇ／　ｍＩ！Ｇ４１８を加える。

所望のプラスミドの安定した形質も保持する好ましい形質転換体を、その後クロ ーン単体の精製のために低濃度でプレートにまく。

ＡＳＰ産生Ｈの桧 所望蛋白の産生のために、まずプールについて１次いで単一のクローンについて マルチウェルプレート中で、形質転換体を検定した。このプレートでの検定量は 、ウェルの大きさに多少依存する。例えば、２４ウエルのプレートの結果は９６ ウエルのプレートの結果とは直接には比較できない。プレート検定により十分な 量の蛋白を産生ずることが分かったクローンは５次に回転ビン中での産生操作で 培養できる。典型的には、スケール・アンプを行えば、この産生量は増加する。

しかし、プレート検定と回転ビンの操作との間には絶対的な相関はない。すなわ ち、プレート検定で一番良い産生を示すものの培養は、スケール・アップ後では 必ずしも一番良いものではない。この理由から、典型的には１００〜２００また はそれ以上の個々のクローンをプレート上で種々の選別方法により検定し、最も 高い産生を示すものの５から１０コを産生条件下（回転ビン）で検定する。

工２二上腋淀 ＡＳＰをコードする種々のプラスミドにより形質転換した。

細胞のプールをマルチウェルプレートで増殖させ１次いでＡｓｐの産生を誘導す るために、５Ｘ１０−５〜ｌＸｌ０−’濃度の亜鉛イオンにさらした。ＡＳＰ検 定は、ウサギ抗−ヒトＡＳＰポリクローナル抗血清での免疫沈澱、それにｔＥ＜ 　１２ＪプロテインＡとオートラジオグラフィーを使用するウェスタンプロフト を用いて行った。

もっと詳しく言えば、１０％ＦＢＳを含むＭｃＣｏｙの５Ａ培地で増殖させた個 々の細胞系統の半融合１１１層をリン酸塩バッファー食塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ）で洗 浄し、１０％ＦＢＳを含むＭ　ｃ　Ｃｏ　ｙの培地、ｌＸｌ０−’の塩化亜鉛お よび０．２５ｍＭのアスコルビン酸ナトリウムを加えた。（アスコルビン酸塩は 、プロリン残基のヒドロキシル化の促進を助けうる。）誘導後２４時間で、細胞 をＰＢＳで洗浄し、再び塩化亜鉛とアスコルビン酸とを含む回収し、トリス中ｐ Ｈ８で２０ｍＭにして、ＢＲＬド−／　ト・プロット器具中でニトロセルロース を通して濾過した。このニトロセルロース・フィルターを５％脱脂粉乳を含む５ ０ｍＭ　）　’Ｊス。

ｐＨ７，５、１５０ｍＭＮａＣ１（）リス／食塩）、で封鎖し１次イテ封鎖溶液 中に、　５０００倍希釈のウサギ抗ヒトＡＳＰポリクローナル抗血清を加えてイ ンキュベートし、上記トリス／食塩で数回洗浄し、そして２５μＣｉの１２５Ｉ プロテインＡを封鎖溶液に加えてインキュベートし、洗浄してオー１−ラジオグ ラフィーをとった。

ＡＳＰをコードするベクターにより形質転換されたもののプールのほとんどは、 この検定において検出可能なＡＳＰを生産しなかった。しかし、明確にＡＳＰを 分泌する細胞系統（Ａ−３８と称する）をｐ　ＭＴ　−Ａｐｏ：ｇｌｌｓ　（Ｉ ｌｉｎｆｌ／ＥｃｏＲＩ　）形質転換体から選別した。さらにｐＡＳＰｃ−３Ｖ （１０）で形質転換された細胞のあるプール（ＡＳＰ−１と称する）またはｐＡ ＳＰｃｇ−５Ｖ（１０）で形質転換された細胞のあるプール（Ａ　Ｓ　Ｐ　−Ｆ およびＡＳＰ−Ｇと称する）は、下記のＤ−４と称する細胞系統により生産され る旦（〜２−５μｇ／ｍ１）と比較し得るＡＳＰを生産した。

人ΣＬｌ肛Δ七丸ｉ久久史叉ニヱエ２ このＡ−３８，ｔ［ＩＩ胞（上記）を１０％ＦＢＳを含むＭｃＣｏｙの５Ａ培地 中で２５％集合体となるまで増殖させ２次いで、１０％ＦＢＳと０．２５ｍごア スコルビン酸ナトリウムを含むＭ　ｃ　Ｃｏ　’／　’ｒｓ地中の１０−’Ｍ塩 化亜鉛で語意した。（細胞の半分は、　１０−’・閃のデキサメサゾンでも処理 した。）２４時間後に、この細胞をＰＢＳで洗浄し、そして１０％透析ＦＢＳ、 ｌＸｌ０−’ヒ塩化亜鉛、　０．２５ｍＭアスコルビン酸ナトリウム、および０ ．５ｍＣ１／ｍＦ、の″′Ｓ−メヂオニンを含むＲＰＭＩ培地を再び加えた。

１８１１　間ｉ＆に、この細胞上澄液を１　ｍＦフェニルメチルスルホニルフル オライドとし、ウサギ抗イヌＡＳＰ抗血清を用いてプロティン八を担体として免 疫沈澱させた。沈澱した蛋白の半分を５Ｏ３−ＰＡＧＥ試料バッファー中で沸騰 させ、そして残りの半分を０．７５％トリトンＸ−１００，０，０７５％ＳＤＳ 、０．７５％２−メルカプトエタノール、　３０ｍＭＥＤＴＡ、　７５ｍＭリン 酸ナトリウム、ｐｉｌｌ　中に溶出し、０．５単位のエンドグリコシダーゼ−Ｆ （エンド−Ｆ）を加えて３７°Ｃで１時間インキュベートした。エンド−Ｆで処 理されたおよび未処理の蛋白の画分を５ＤＳ−ＰＡＣ；Ｅにかけた。その結果を 第１０図に示す。このエンド−Ｆ処理された両分は、未処理の両分の３８Ｋｄの 蛋白（レーンＥ）に比べて、　３０Ｋｄの蛋白（レーンＦ）を示した。

（レーンＭはサイズマーカーを含み、レーン八とＢは非形質転＋０　ＣＨＯｇｌ 胞の上澄液、そしてレーンＣとＤは、各々デキサメサゾンで処理されたまたは未 処理のＡ−３８細胞からの上澄液を含む。） ！のための３度のｌ・ランスフェクションＤ−４と名付けた付加的な細胞系統を 、ｐＭＴ　−Ａｐｏ：ｇｌｌｓ（ｌｌｉｎｆｌ／ＥｃｏＲＩ　）　（２０μｇ　 ）およびｐＳＶ２：　（Ｊ　Ｐ　Ｔ　（１／’　ｇ　＞の混合物を用いて、Ａ− ３８を過度にトランスフェクションすることにより得た。１０％ＦＢＳを含むＦ １２／Ｉ）ＭＥＭ　２１中で増殖させたＡ−３８の半融合単層を、上記のように 共にトランスフェクションした。１１８時間後に、この細胞を５分の１ずつに分 けて、　１０％ＦＩ３ＳとＩ−Ｉ　Ａ　Ｔ選択薬剤とを含む１７１２／ＤＭＥ！ １２１中に加えた。ＨＡ　Ｔ　Ｊ択の１７日後、生存している耐性コロニーのプ ール へ９８４）　８２−８７の免疫フィルター選択方法により，高レベルのＡＳＰを 生産する個々のクローンについて選択した。簡単に言えば，　１０（Ｊａｍ皿に １００個の細胞の割合で，この細胞をＦ１２／ＤＭＥＭ　２１，　１０％ＦＢＳ 中に植菌した。５日後において，　（コロニーに各々５０−　２００個の細胞を 含むとき）この細胞をＰＢＳで洗浄し，無血清Ｆ１２／ＤＭＥＭ　２１を加え， そして殺菌テフロン・メツシュを重ねた。メソシュの上に，ニトロセルロースフ ィルターを置き，８時間そのままにしておいた。このニトロセルロースを取り除 き，イミュノブロソトとして，初めにウサギ抗イヌＡＳＰポリクローナル抗血清 を用い，次いで＋ｚｓ■プロティンＡ，それに続いてオートラジオグラフィーす ることにより処理した。約２０００個の選別したコロニーから，２個の検出可能 なシグナルが得られ，Ｄ−４と名付けたものは。

ＡＳＰ遺伝子をＡ−３８の１０−２０倍量．すなわち計算すれば２〜５μｇ　／ ｍβ　ＡＳＰに対応する量の発現を示した。

Ｄ−４細胞系より分泌されたＡＳＰをアフィニティークロマトグラフィーで無血 清培地より単離し，気相ミクロシークエンサーでＮ末端の配列を決めた。１６ア ミノ酸の配列の決定では，肺の洗浄により単離した蛋白のＮ末端部分と完全に相 同性を示した：全体の７０％はＮ末端Ｇｌｕ残基を含んでいた：残りの３０％は ，Ｎ末端Ｖａｔ．　（Ｇｌｕに関して２位）を含むように削られた。これは、単 離された洗浄蛋白と同じ組成である。

ヒドロキシプロリンは，　１０．　１３および１６位に存在し，翻訳後のプロセ ッシングを表す細胞の能力を示している。

加えて，プールＡＳＰＩ　（上記）由来およびプールＡＳＰ２　（上記）由来の 分泌された蛋白画分とともにＩ）−４により分泌された蛋白をウェスタンプロッ トを用いて，ヒトの蛋白症の肺の洗浄物の蛋白と比較した。語意された細胞由来 の無血清培地をＴＣＡ沈澱させ，　Ｅｎｄｏ．Ｆで処理しくあるいは処理せずに ）、そして１２．５％のゲル中でＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。このゲルをエレク トロプロットし，ウサギの抗ヒｌ−　Ａ　ＳＰポリクローナル抗血清，続いて１ ２５Ｉ−プロティンＡとドツトで保温した。この結果を第１１図に示す。

レーンＡおよびＦは，　Ｅｎｄｏ．Ｆに分解する前およびその後の１μｇの肺胞 の蛋白症の蛋白を含む。レーンＢ，ＣおよびＤは，それぞれＥｎｄｏ．Ｆ未処理 のＤ−４，ＡＳＰ−Ｉプール、およびＡＳＰ−〇プール由来の培地を示す。レー ンＧ，Ｈおよび■は，　Ｅｎｄｏ．Ｆで処理したこれらの上澄液由来の蛋白を示 す。

Ｅｎｄｏ．Ｆ処理は全ての蛋白の見かけの分子量を減じており，より分離したバ ンドを生じることが明らかである。

生童勿尖止 ｐＭＴ−Ａｐｏ：ｇＨＳ　（ＨｉｎｆＩ／ＥｃｏＲＩ　）の多コピーを含む過度 にトランスフェクションした細胞系（細胞系Ｄ−４）を、ローラーボトル中で生 産レベルの実施において用いた。８５０ｃｍ四方のローラーボトルに，１０％Ｆ 　Ｃ　Ｓ，　１５ｍＭ　Ｉｌｅｐｅｓ，　ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ　。

およびグルタミン中で，２Ｘ１０ｂの細胞を含む１０ｃｍの皿で植菌した。この 細胞が集密的に達すると（２〜３日）、ＰＢＳで２度洗浄し，ＦＣＳのない２５ ０滅のＦ１２／ＤＭＥＭ　２１，　１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓに置き換えた。次の日 は，この細胞に２５０ｍｌのＦ１２／ＤＭＥＭ　２１。

１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ，　５　ｘｘｏ−’塩化亜鉛，　１０−６Ｍデキサメタシ ン、および０．２５ｍＭアスコルビン酸．を加えた。この細胞を２日ごとに取り 出し．　１０００ｒｐｍで１０分間遠心し．　−２０℃で凍結させた。

生産は，　１　〜５　μｇ　７ｍｅ　／ｄａｙで２上記で述べたように，　５０ ００倍希釈でポリクローナル抗イヌＡＳＰ抗血清を用いてドツトプロットウェス タンで分析した。生産は約１４〜１７日後に低下する。

Ｄ．９．　」止 単離したＡＳＰ成分の空気／水の界面で脂質膜を形成するのを高める能力を，　 ＩＩａｇｗｏｏｄ，　Ｓ＋ら，　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　（１９８５）　２４ ：　１８４　−　１９０に記述の方法を用いて，（７　ビトロで分析した。節単 に言うと，試験蛋白を適当な比率で持つリン脂質小胞の調製物を，水成の緩衝液 ，磁性攪拌器，およびプラチナ板を含むテフロン皿の底に，微量を，注意深く加 える。このプラチナ仮は緩衝液の表面に取り付けられ、ストレインゲージに付着 している。ストレインゲージに表示される表面張力の変化は、攪拌器を始動する とすくに時間の関数として記録される。

１０に蛋白を含むクロロボルム溶液と５脂質の２　＋　Ｉ　Ｖ／Ｖクロロホルム ：メタノール溶液と混ぜることにより、ＩＯＫ蛋白をリン脂質に加えた。この溶 媒を草発させ、小胞を得るために緩衝液中に固体を水和させた。３２に蛋白は、 小胞の’、’ｊ、　濁液となるように直接水性溶液に加えられ得る。これは、小 胞の会合に関連して、濁度の測定により検出され得る。

Ｉｌａｗｇｏｏｄら（上記）が報告したように、リン脂質がイヌの肺の表面活性 物質の複合体から得られると、３２にイヌのＡＳＰはリン脂質小胞を会合させ得 、リン脂質小胞に含まれると膜の形成を高め得る。本発明の蛋白の活性は、　Ｈ ａｗｇｏｏｄが先に述べたのと同じ、会合や膜形成を測定する方法を用いて評価 される。

上記で述べたように調製したイヌの肺由来のリン脂質調製物（３００ｇｇ）およ びリン脂質の合成混合液の両方を用いた。

この合成リン脂質は、２４０ｇの市販のＤＰＰＣおよび６０μｇの卯のＰＣを含 んでいた。これは、天然の脂質よりもずっと膜を形成しにくい。しかしながら、 この試験リン脂質は、蛋白の活性を最も効果的に表現するように選択された。

この３２に蛋白とｌ０ＫＡ　Ｓ　Ｐの混合液とは、上記で述べたように、イヌの 肺から単離された。この３２に蛋白を６０μｇ加えると、肺より得た°′天然” のリン脂質による膜の形成を、複合体それ自体で示されるのとほぼ同レベルにま で高め得るのに対し、それだけでも適度に合成脂質を用いての膜形成が高められ る。同じような結果が１１３ｇｇのＩＯＫ蛋白だけを加えて得られた。しかしな がら、１３μｇのｘｏＫｊ周製１勿を、　６０μｇの３２に蛋白を加える前に１ 合成リン脂質小胞と保温すると。

天然の複合体自体のそれと比較できる速さで、および程度で。

膜形成が起こった。これらの結果を第１２図に示した。

図面の簡単な説明 レーン 第４０ 詩表昭６２−５００２２　（２１） ８１０口 ｍａｂ−Ｃｄ　ｆｓｈｉ 扇　１２　口 手続補正器（自発） 昭和６１年１０月３０８ ＰＣＴ／ＵＳ８５１０２４４５ ２、発明の名称 組換え肺胞表面活性物質蛋白 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　アメリカ合衆国　カリフォルニア　９４０４３マウンテン　ビュー、ベイ ショアー フロンテージ　ロード　２４５０ 名称　カリフォルニア　バイオテクノロジーインコーホレイテッド 代表者　ニューマン、ジョン　エイチ。

国籍　アメリカ合衆国 ４、代理人 住所　〒５３０大阪府大阪市北区西天満６丁目１番２号５、補正の対象 特許法第１８４条の５第１項の規定による書面の６、補正の内容 （１）書面の特許出願人の代表者の欄および委任状および翻訳文については、別 紙のとおり。

（２）明細書の翻訳文については、タイプ印書により鮮明に浄書するために全文 を補正いたしました（内容に変更なし）。

国際調査報告 Ｉｎ＋ａ＋ｎｏＩｌａｎ耐＾峠ｌｌｅ＋１ｌｏｎｌ＋６．　ＰＣＴ／ＵＳ／８＜ １０２４．４へ

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．組換え肺胞表面活性物質蛋白（ＡＳＰ）。
2. ２．ヒト３２ＫＡＳＰ，イヌ３２ＫＡＳＰ，ヒト１０ＫＡＳＰ，１６．５Ｋｄの イヌ１０ＫＡＳＰおよび１２Ｋｄのイヌ１０ＫＡＳＰから成る群より選ばれた特 許請求の範囲第１項に記載のＡＳＰ。
3. ３．特許請求の範囲第２項に記載のＡＳＰをコードする組換えＤＮＡ配列。
4. ４．和合可能な宿主細胞で特許請求の範囲第３項に記載のＤＮＡ発現を行うのに 有効な組換えＤＮＡ配列。
5. ５．特許請求の範囲第４項に記載のベクターあるいは特許請求の範囲第３項に記 載のＤＮＡ配列で形質転換された組換え宿主細胞。
6. ６．特許請求の範囲第５項に記載の細胞で産生されたＡＳＰ。
7. ７．特許請求の範囲第６項に記載の細胞を培養することを含むＡＳＰ産生法。
8. ８．不純物を実質的に含まない哺乳動物細胞表面活性物質蛋白（ＡＳＰ）。
9. ９．以下の配列から成る群より選ばれたＮ末端アミノ酸配列を有する特許請求の 範囲第８項に記載のＡＳＰ：【配列があります】
10. １０．哺乳動物の呼吸困難症（ＲＤＳ）の治療に有効な製薬組成物であって，特 許請求の範囲第１項あるいは第８項に記載のＡＳＰを製剤的に受け入れ可能な賦 形剤と混合して含む組成物。
11. １１．哺乳動物の呼吸困難症（ＲＤＳ）の治療に有効な製薬組成物であって，特 許請求の範囲第１項あるいは第８項に記載のＡＳＰをホスホリピド小胞調製物と 混合して含む組成物。